CN114544468A - 一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法。针对现有技术中，针对现有技术中对固定床生物反应器中的细胞进行计数的方法的准确性和实时性较差的问题，本发明包括如下步骤：(1)测试固定床生物反应器中两个内电极之间的电容值P；(2)通过如下公式计算得到固定床生物反应器中的细胞密度N：N＝KP，式中：K为细胞密度与细胞电容值间的正相关常数；所述K的值的确定方法为：将已知细胞密度的细胞悬液接种到固定床生物反应器，并测试两个内电极之间的电容值，通过已知的细胞密度和测得的电容值计算得到K。本发明用于进行准确、实时、连续和无需取样的固定床生物反应器中的细胞计数。
Description
技术领域
本发明生物化学技术领域，具体涉及一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法。
背景技术
目前，市场上主流疫苗厂家的细胞、病毒大规模培养，普遍采用微载体生物反应器、片状载体生物反应器、转瓶或者细胞工厂等培养方式。在固定床生物反应器中，片状载体被固定在一个篮子形状的区域，搅拌桨置于中间空腔，不与细胞直接接触，桨叶的转动使培养液通过载体装载区向上流动，并从中间空腔回流到底部，形成回路，通氧、pH调节均在中间空腔进行。固定床(片状载体)生物反应器培养的结构如图1所示。此类固定床生物反应器，搅拌系统不与细胞直接接触，对细胞的剪切力小；细胞完全处于液面以下，减少液面产生的泡沫对细胞的损伤；通气、pH调节在中间空腔进行，因为通气产生的气泡也在空腔，不会进入细胞载体区域，避免了气泡对细胞的损伤。因此固定床生物反应器在贴壁细胞大规模培养中的运用越来越广泛。
固定床生物反应器大规模细胞培养技术中，细胞贴壁在片状载体上，片状载体装载在反应器内腔固定区域，一般在生物反应器中间部分。由于生物反应器结构、片状载体的特性所限，在实际生产中难以无菌取出片状载体进行细胞计数。
目前，国内、外使用固定床生物反应器的疫苗厂家大多通过“糖耗法”进行反应器内细胞数量的估算。该方法原理为：假设每个细胞每24小时消耗的葡萄糖量是一致的，即在24小时内消耗1g葡萄糖的Vero细胞数量是固定的，因此可以得到下列公式：
细胞总数＝24小时糖耗(g)×Y(cells/g)
公式中“Y”是常数，代表Y个细胞生长24小时，需要消耗1g葡萄糖。
然而，不同厂家、不同细胞株、不同的培养液所得出的常数“Y”不同，各个厂家通常会根据经验采用不同的Y值进行计算。例如：已公开的文献中，两个不同厂家的Vero细胞的“Y”值分别为7.71×108cells/g(生物反应器培养Vero细胞的生长代谢与限制因素研究[J].中国热带医学，2006年，第6卷，第一期)、5.35×108cells/g(一种篮式生物反应器内Vero细胞计数方法的建立[J]；大连工业大学学报，2018，37(3))。这导致了此方法得到的细胞计数仅为估算值，不能准确反映细胞数量，误差较大。此外，“糖耗法”需要测试细胞24小时的糖耗，不能对细胞生长进行实时监控。
在细胞悬液的计数方法中，有一种通过测试电容得到细胞密度的方法。其原理是：活细胞在电场中被极化而形成电容，此电容值会被电容法在线细胞计数仪准确检测。不同的细胞种类会有不同的电容值，其大小和细胞的体积也呈一定比例。而死细胞、气泡、细胞碎片均无法形成一个电容，所以不会被电容法在线细胞计数仪检测到。因而，只要知道了某种细胞的电容值与其悬液中的密度的正相关系数，即可通过测试细胞悬液的电容值计算细胞悬液中的细胞密度。
然而，在固定床生物反应器中，细胞都是贴壁生长的，因而不再适用于同类细胞的细胞悬液密度与电容值之间的正相关系数；且固定床生物反应器的形状、大小及片状载体在固定床生物反应器中的分布均会显著影响测试得到的电容值与细胞密度之间的关系，使得二者的关系具有较强的不确定性。
基于上述问题和困难，本领域还未有电容法测试固定床生物反应器中细胞密度的相关研究报道。
发明内容
针对现有技术中对固定床生物反应器中的细胞进行计数的方法的准确性和实时性较差的问题，本发明提供一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法，其目的在于：为了实现实时监测生物反应器内细胞生长情况，为病毒接种提供准确的细胞数量(或密度)以及建立更加稳定的病毒接种工艺，提供实时、准确的细胞计数方法。
一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法，包括如下步骤：
(1)测试固定床生物反应器中两个内电极之间的电容值P；
(2)通过如下公式计算得到固定床生物反应器中的细胞密度N：
N＝KP，
式中：K为细胞密度与细胞电容值间的正相关常数；
所述K的值的确定方法为：将已知细胞密度的细胞悬液接种到未培养细胞的固定床生物反应器，并测试两个内电极之间的电容值，通过已知的细胞密度和测得的电容值计算得到K，所述细胞悬液中的细胞种类与固定床生物反应器拟培养的细胞的种类相同；所述固定床生物反应器中，细胞贴壁在片状载体上。
优选的，测试两个内电极之间的电容值的方法为采用电容法在线细胞计数仪进行检测。
优选的，K的值的确定方法具体包括如下步骤：
(A)取体积为V0的已知密度N0的细胞悬液，换算得到接种到工作体积为V的固定床生物反应器内以后的细胞密度Nk，换算公式为：
Nk＝V0N0/V；
(B)将步骤(A)中的细胞悬液注入固定床生物反应器内，等待细胞完全贴壁在片状载体上以后，测试两个内电极之间的电容值Pk；
(C)通过已知的细胞密度Nk和测得的电容值Pk计算得到K的值。
优选的，所述K的值的确定方法中，细胞悬液的细胞密度通过细胞计数仪进行细胞计数得到。
优选的，步骤(B)中细胞完全贴壁在片状载体上的判断标准为固定床生物反应器内细胞悬液变澄清。
优选的，步骤(B)中测试不同细胞密度的细胞悬液接种后对应的电容值，所述步骤(C)中通过将细胞密度与电容值进行线性拟合，得到K的值。
优选的，固定床生物反应器的工作体积为30～150L。
申请人通过实验发现，虽然在固定床生物反应器中，有固定床生物反应器的形状、大小及片状载体在固定床生物反应器中的分布等多种因素对测试得到的电容值产生影响，但电容值与细胞密度之间，仍然能够保持良好的线性关系。因而，本发明通过将已知细胞密度的细胞悬液接种到固定床生物反应器中并测试其电容值来计算得到该型号的固定床生物反应器中电容值与细胞密度之间的正相关常数K。之后对相同型号的固定床反应器，只需要实时测量两个内电极之间的电容值即可实施监控固定床反应器内的细胞密度。该技术方案消除了细胞固载、反应器形状和体积不同等因素导致的电容值无法与细胞密度关联的问题，实现了准确、实时和连续对细胞进行计数的目的。该方法在操作上不需要取样，也不需要消化计数，在操作更简单的同时避免了取样等操作带来的无菌风险。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1固定床(片状载体)生物反应器的结构示意图；
图2为实施例1中细胞密度与细胞电容值线性关系曲线；
图3为实施例2中各批次电容法在线细胞计数细胞密度与细胞悬液的细胞密度检测曲线；
图4为实施例3中结晶紫染色细胞核计数结果与电容法在线细胞计数结果的线性关系曲线。
具体实施方式
以下实施例采用上海日泰医药设备工程有限公司生产的CELLIPOWER09型30L(工作体积)不锈钢生物反应器(以下简称固定床生物反应器)，英国Aber公司生产的StandardRemote futura(SRF)型电容法在线细胞计数仪，Countstar IC 1000型全自动细胞计数仪进行实验。
实施例1：K值的获得
本实施例的具体步骤为：
(1)取细胞悬液，所述细胞悬液的细胞种类与拟在固定床生物反应器中培养的细胞种类相同，使用Countstar IC 1000型全自动细胞计数仪进行细胞计数，换算成接种到固定床生物反应器内以后的细胞密度，换算公式为：
Nk＝V0N0/V。
其中，V0为细胞悬液体积，N0为细胞悬液密度，V为固定床生物反应器的工作体积，Nk为细胞悬液接种到固定床生物反应器中以后在固定床生物反应器中的密度。
(2)将细胞悬液注入固定床生物反应器内，待澄清后记录电容法在线细胞计数仪测量出的电容值。
(3)使用4个不同批次细胞悬液测试其细胞密度与接种到固定床生物反应器细中以后的电容值数据得到反应器内细胞密度与电容值正相关常数“K”。
结果如下表所示：
表1细胞悬液密度与电容值对比
注1：电容值单位pF—皮法拉。
根据表1数据，绘制细胞密度与电容值线性关系图(图2)。如图所示细胞密度与测量的电容值之间存在良好的线性关系，且相关系数R2＝0.9991。根据线性公式y＝1E-05x(即y＝10-5x)，通过公式N(细胞密度)＝K(常数)P(电容值)，确定常数K＝1.0×105。
实施例2：固定床生物反应器内细胞接种阶段电容法计数的准确性
为了验证本方法的准确性，我们对细胞悬液接种到固定床生物反应器后的七个批次电容法计数的细胞密度数据与接种前的细胞悬液的细胞密度数据进行比较。
首先，使用Countstar IC 1000自动细胞计数仪对细胞悬液进行计数。然后，将计数后的细胞悬液接种到固定床生物反应器。当细胞完全贴壁在片状载体上时，记录电容法在线细胞计数仪检测到的细胞密度，将测试得到的固定床生物反应器中的细胞密度换算为接种前的细胞悬液的密度。
结果如下表所示：
表2电容法计数细胞密度与细胞悬液的细胞密度对比
对上述七批次细胞悬液的密度数据与在线细胞计数法测量的密度数据进行统计学分析，得到F＝0.00025，P＝0.99。将两组密度数据做成曲线进行对比如图3所示。结合统计学分析结果和对图3曲线的比较，证明七批次细胞悬液密度数据与在线细胞计数测量的密度数据没有显著差异，几乎一致。说明本发明测试接种到固定床生物反应器后的贴壁的细胞的密度的方法准确性强。
实施例3：固定床生物反应器内细胞培养阶段电容法计数的准确性
结晶紫染色细胞核计数(J.Natl.Cancer Inst.11,773–795(1951))是一个常用的细胞计数方法。本实施例，通过结晶紫染色细胞核计数的方法对固定床生物反应器内细胞培养阶段的细胞进行结晶紫染色细胞核计数，并与本发明提供的与电容法细胞计数结果进行对比，分析生物反应器细胞培养阶段电容法计数的准确性。
在固定床生物反应器接种阶段，细胞接种贴壁完成后，取出部分载体，使用结晶紫染色细胞核法进行细胞计数，同时记录电容法在线细胞计数数据。此后，每日取样进行结晶紫染色细胞核法计数并记录电容法在线细胞计数数据。
本实施例中，作为对比验证的结晶紫染色细胞核计数的方法如下：
结晶紫消化液配方如下：
结晶紫1.00g/L；
柠檬酸21.00g/L；
曲拉通X-100 1.00ml/L。
进行细胞计数的具体过程为：
1)提前在水浴锅内加适量注射用水，接通电源，设置温度37℃。
2)待水浴锅温度达到37℃后，将结晶紫染色液置于水浴锅内，预热30min。
3)取样细胞培养后的片状载体10片置于50ml离心管内，加入上述结晶紫消化液10ml，摇匀，置于水浴锅内，37℃水浴30min，每10min取出用力摇晃一次。
4)步骤3)完成后，取离心管中染色液1ml加入9ml水进行10倍稀释，摇匀。
5)取稀释后的染色液滴加至细胞计数板上，在显微镜下观察计数板8个大方格中的细胞核并计数，计数时在方格边线上的细胞核遵循“计上不计下，计左不计右”原则。
6)显微镜下观察计数后，对记得的数据进行处理，得出细胞密度。
细胞密度的计算公式为：
式中:X为8大方格中的细胞核总数，Z为每克载体的片数，Y为培养容器中载体总重量，V为固定床生物反应器的工作体积。
结果如下表所示：
表3结晶紫染色细胞核计数与电容法在线细胞计数结果对比表
对电容法在线细胞计数法和结晶紫染色细胞核计数法检测的两组细胞密度数据做统计学分析，两者呈典型的正相关关系，其线性关系如图4所示，其相关系数R2＝0.9828，证明电容法在线细胞计数法准确可靠。
通过实施例1-3的实验可知，在K值得计算过程中，细胞悬液的细胞密度与测得的电容值具有良好的线性关系，因而得到的K值能够在较大的细胞密度范围内用于计算固定床生物反应器内的细胞密度。且在固定床生物反应器内细胞的接种及培养过程中，电容法计数均能够准确地反映固定床生物反应器内细胞的密度。因而，本发明的技术方案实现了准确、实时、连续和无需取样的固定床生物反应器中的细胞计数。
Claims (7)
1.一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)测试固定床生物反应器中两个内电极之间的电容值P；
(2)通过如下公式计算得到固定床生物反应器中的细胞密度N：
N＝KP，
式中：K为细胞密度与细胞电容值间的正相关常数；
所述K的值的确定方法为：将已知细胞密度的细胞悬液接种到未培养细胞的固定床生物反应器，并测试两个内电极之间的电容值，通过已知的细胞密度和测得的电容值计算得到K，所述细胞悬液中的细胞种类与固定床生物反应器拟培养的细胞的种类相同；所述固定床生物反应器中，细胞贴壁在片状载体上。
2.按照权利要求1所述的一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法，其特征在于：所述测试两个内电极之间的电容值的方法为采用电容法在线细胞计数仪进行检测。
3.按照权利要求1所述的一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法，其特征在于，所述K的值的确定方法具体包括如下步骤：
(A)取体积为V0的已知密度N0的细胞悬液，换算得到接种到工作体积为V的固定床生物反应器内以后的细胞密度Nk，换算公式为：
Nk＝V0 N0/V；
(B)将步骤(A)中的细胞悬液注入固定床生物反应器内，等待细胞完全贴壁在片状载体上以后，测试两个内电极之间的电容值Pk；
(C)通过已知的细胞密度Nk和测得的电容值Pk计算得到K的值。
4.按照权利要求1所述的一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法，其特征在于：所述K的值的确定方法中，细胞悬液的细胞密度通过细胞计数仪进行细胞计数得到。
5.按照权利要求1所述的一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法，其特征在于：所述步骤(B)中细胞完全贴壁在片状载体上的判断标准为固定床生物反应器内细胞悬液变澄清。
6.按照权利要求1所述的一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法，其特征在于：所述步骤(B)中测试不同细胞密度的细胞悬液接种后对应的电容值，所述步骤(C)中通过将细胞密度与电容值进行线性拟合，得到K的值。
7.按照权利要求1所述的一种用于固定床生物反应器中的电容法细胞计数方法，其特征在于：所述固定床生物反应器的工作体积为30～150L。
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