CN101031656A - 检测生物毒素和抗生素残留物的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测抗生素残留物的试剂盒，包括可诱导的细菌孢子，其在萌发和诱导后产生诱导酶；引发所述孢子快速萌发的萌发剂；引发目标特异性酶产生的诱导剂；所述酶作用的底物；和所述酶对所述底物活性的检测剂。

Description

检测生物毒素和抗生素残留物的方法和试剂盒

本发明涉及检测生物毒素和抗生物残留物的方法和试剂盒。更具体地，本发明涉及适于视觉和自动化分析的用于检测牛奶、水、食品和其他消费品中的抗生素残留物和毒性物质的方法和试剂盒。

存在对用于检测牛奶以及牛奶和食品生产的各个阶段中的抗生素残留物的简单、快速、单一测试的需要。

目前采用两种基本方法。一种方法力求借助特定的传感物检测预定的残留物。传感物通常是结合所述残留物的特异性抗体或报道分子。存在多种检测这种结合的方法，我们可以将相应的方法称为SAM(特异性测定方法)。

SAM的主要优点是速度：基于SAM的测试可以在几分钟内完成。主要的缺点是狭窄的特异性：基于SAM的测试只能检测计划检测的残留物而不能检测任何其他的东西。每种残留物需要不同的传感物，因此期望任何基于这种方法的商业上可行的测试能提供试样是否无抗生素问题的答案是不现实的。

相反，通过基于可替换方法的方法可以回答该问题，即微生物测定法(MAS)可检测抗生素对试验生物体的生物效应。使用该方法，可以询问试样是否含有任何抗菌物质，且根据定义其包括各种抗生素。因此，试验生物体的合适选择将允许检测相关的全部范围的抗生素，并且可以使用单一测定法来检测该生物体易感的任何污染物。

基于MAS的测试非常普及但是相对缓慢。最快和最广泛使用的测试需要数小时的孵育。当必须尽快地作出决定且任何延误都很可能是代价非常高的时候，这是令人非常不满意的。

在本发明中，我们将MAS方法与SAM方法的速度相结合。

本发明的生物学原理是在本发明人的两个在先专利(美国专利4,381,343和美国专利5,614,375)中所应用的那些原理。简而言之，这些原理如下：

1.将产青霉素酶的细菌菌株用作抑制剂(抗生素和一般的生物毒素污染物)的传感物。

2.提供有利于启动青霉素酶产生的条件。

3.将在测试样品的存在下在这样的条件下产生的青霉素酶的水平与无污染物对照的水平相比较。

4.在优选的实施方案中，该比较是基于蓝黑淀粉-碘复合物被青霉噻唑酸(penicilloic acid)的脱色，青霉噻唑酸是青霉素酶作用于它的底物青霉素的产物。

这两个专利的第一个中使用了可诱导的青霉素酶产生者的对数期培养物，使得能够构成可检测抑制剂(和以上第1款中的相同)的试剂盒以及用于检测青霉素和其他β-内酰胺抗生素的试剂盒，青霉素和其他β-内酰胺抗生素可以作为通过该菌株青霉素酶形成的诱导剂而不是抑制剂来检测。

由于发现只有新鲜生长的对数培养物响应诱导剂的存在，因此该系统的主要缺陷是不适用于提供干燥、稳定且有力的试剂盒。

在所述专利的第二个中，使用洗过的、基本上无预先形成的青霉素酶的激活孢子。后者在组成型产青霉素酶芽孢杆菌的孢子的萌芽时形成。这是设计用来检测生物毒素污染物，但是明显不适于检测青霉素和其他β-内酰胺抗生素的干燥、有力试剂盒的基础。

根据本发明，提供了用于检测抗生素残留物的试剂盒，包括：

一)在萌发和诱导后产生诱导酶的可诱导的细菌孢子；

二)引发所述孢子快速萌发的萌发剂；

三)引发目标特异性酶产生的诱导剂；

四)所述酶作用的底物；和

五)所述酶对所述底物活性的检测剂。

本发明的另一方面中，提供了用于检测抗生素残留物的方法，包括

一)将样品和对照试样置于分开的用于孵育的试管中；

二)将所述试管置于约35℃的培养箱中；

三)将底物加入所述培养箱中的含所述样品的试管和含所述对照的试管中。

四)将指示剂溶液加入所述培养箱中的含所述样品的试管和含所述对照的试管中；和

五)注意这两个试管中的结果。

从以下的描述和实施例中将清楚本发明以构思上和技术上全新的方式应用了那些原理，能够构成结合所需优点，同时避免了上述局限性的试剂盒，这样的试剂盒：

a.在单个测试中检测β-内酰胺抗生素和非β-内酰胺抗生素以及其他毒性化合物；

b.由干燥且稳定的试剂构成，在环境温度下有力且耐储存。

c.不需要准备，比以前可用的试剂盒作用更快且使用更简单。

表1中概括了本发明和前述专利中那些之间的差异。

表1

	美国专利4,381,343	美国专利5,614,375	本发明
				测试系统	对数期细菌培养物	组成型孢子	诱导型孢子
测试准备	接种：2个阶段	无	无
				试剂盒	湿	干	干
诱导	分开的步骤	未应用	内在的
				底物添加	分开的步骤	未应用	内在的或分开的步骤
萌发	未应用	引发测试	引发测试
				检测的抗生素	BLAX或非BLAXX	仅非BLAXX	BLAX和非BLAXX两者
手动步骤	6-7	2	1-2
				总的测试时间	＞120分钟	＜30至＜60分钟	20-25分钟

x)BLA＝β-内酰胺抗生素

xx)非-BLA＝非β-内酰胺抗生素

设计本发明的系统使得能够在单个测试程序中结合分别用于检测BLA和非BLA的两种方法。必须强调这样的结合决不是显而易见的，因为这两种方法是内在矛盾的。非BLA是作为青霉素酶形成的抑制剂来检测的，在它们不存在的条件下，将会形成所述酶，而BLA是通过它们诱导青霉素酶形成的能力来检测的，在它们不存在的条件下，不会形成所述酶。而且，BLA检测系统引入大量青霉素形式的BLA作为其主要的试剂，青霉素是青霉素酶催化的酶促反应的底物。

在本发明中，通过基于创造性构思的设计完全满足了上述相互矛盾的必要条件，该创造性的构思是一组准确定时的按序步骤可以分开不相容的相互作用并提供单个测试系统形式的解决方案。

系统的特性

系统使用了酶作为[a]诱导剂和[b]抑制剂存在的指示剂，诱导剂是酶产生所必需的，而抑制剂甚至在诱导剂存在下仍阻止酶产生。

系统由以下成分构成：

1.诱导型细菌孢子，根据定义，其只在萌发和诱导后产生诱导酶。

2.引发上述孢子快速萌发的萌发剂。

3.引发目标特异性酶产生的诱导剂。

4.所述酶作用的底物。

5.所述酶对所述底物活性的检测剂。

在此呈现的具体情况中，酶是青霉素酶，且青霉素既是所述酶的诱导剂又是所述酶的底物。在此的特定的检测剂是淀粉-碘化物-碘的蓝黑溶液或浸渍了检测剂溶液的吸收性条带。

将所有五种成分干躁存储，且可以合并并作为预制的试剂盒存储，因为在干燥状态下不发生相互作用。然而，在所有试剂盒中，青霉素最初必须与其他成分在物理上隔开。加入待测试的液体样品时激活该系统。引发[且在30-40℃下加速]的事件的次序如下：

1.将萌发剂溶解，孢子萌发并响应液体样品的内含物。

i.如果样品含有青霉素或任何其他BLA，则诱导青霉素酶产生。

ii.如果样品含有抑制剂如非BLA，则抑制青霉素酶产生。

iii.必须包括与测试样品相同但已知既不含有诱导剂也不含有抑制剂的对照。

2.简短孵育后[参见实施例]，将青霉素释放至反应中。释放可以是完全自动的或者部分手动的。对于任何诱导酶活性，最初的接触引入青霉素作为诱导剂，而随后青霉素作为饱和，并因此产生最大速度所需要的底物。

3.通过检测催化反应的产物青霉素噻唑酸可以监控青霉素酶的产生，青霉素噻唑酸和完整的底物青霉素不同，从碘与淀粉的复合物中除去碘。这将导致溶液中检测剂的脱色，或接触含青霉素噻唑酸溶液时，在接近黑色的检测剂条带上形成白色区域。

4.测试的结果是基于测试样品与对照的脱色步骤的比较。可以通过电学或手动(目测)来进行比较，如以下实施例中所说明的。

5.结果的分析：

i.对照提供了测试中间加入诱导剂后预期的青霉素酶含量[参见以上的{2}]。

ii.测试样品中较高的水平意味着在加入青霉素之前就开始产生青霉素酶了，因此肯定是通过污染样品的BLA所诱导的。

iii.低于对照的水平由污染样品的微量抑制剂[例如，非BLA]产生的部分抑制引起的。较重的污染将不产生青霉素酶。

尽管将结合以下实施例中的某些优选实施方案来描述本发明，使得可以更全面地理解和认识它的各个方面，但并非想要将本发明限于这些具体的实施方案。相反，打算涵盖可能包括于如所附权利要求所限定的本发明的范围内的所有备选方案、改变和等价物。因此，以下包括优选实施方案的实施例将用来说明本发明的实施，应当理解显示的细节只是作为实例，目的是说明性讨论本发明的优选实施方案，并且是为了提供认为最有用的和易于理解的规化程序以及本发明的原理和构思方面的描述而呈现。

具体实施例

实施例1：

A.定义

1.样品是等分的液体试样，如牛奶或血液或其中收集和储存固体试样的液体。

2.测试用具是试管，样品和对照试样被递送到其中(各自被递送到分开的管中)，并在到达时，启动一个或多个生物或化学反应。每个试管底部被干燥的试剂的覆盖，该试剂由萌发剂和可诱导的产青霉素酶细菌菌株孢子的混合物组成。

3.自动装置、移液管或分配器是测试过程中用于将样品运送至测试用具和/或将底物和/或指示剂溶液运送至测试用具的装置。

4.分析仪是与能够成像处理、记录和保存测试结果的电子处理器(例如PC)连接的任何电光学装置。通常可以目测分析测试结果。

B.测试程序和结果

1.将样品和对照(各自0.25ml)同时置于各自的试管中，用于在37℃孵育。

2. 15分钟时，将β-内酰胺释放或加入到样品和对照管中作为诱导剂，随后作为诱导酶的底物。

3. 20分钟时，将指示剂溶液释放或加入到样品和对照管中。

4.然后通过系列数码照片或肉眼观察来进行分析。

将样品所引起的指示剂脱色速率与对照的相比较。

当受到BLA污染时，样品较快。

当受到非-BLA污染时，样品较慢。

当无任何可检测的抗菌活性时，样品等于对照。

实施例2：

A.定义

1.样品是等分的液体试样，如以上实施例1中所述的。

2.位置是样品被递送或输送[见下文]并在到达时启动一个或多个生物或化学反应的场所。

3.传送器是通过毛细作用将样品从一个位置运送至另一个位置的装置。通过原棉或通过吸收材料的条带如滤纸，或通过任何惰性组成的纱布条或通过上述的任意组合来介导运送。

B.传送器的特性

最简单形式的传送器由双头原棉拭子构成，用吸收性条带连接两个头。

1.在这个实施例中，将传送器的性状和大小设计成适合55×11cm的试管。管的底物被干燥的孢子和试剂的覆盖，并作为样品被递送至此的位置A。

2.在传送器中引入位置B-D。将可以用试剂浸渍的原棉拭子下面的头作为位置B。

3.将吸收性条带用指示剂染料浸渍并作为样品通过所述条带的毛细作用从位置B转移至此的位置C。

4.连接传送器两端的条带现在将样品递送至浸渍了另一种试剂并因此作为位置D的原棉拭子上面的头。

5.在每个位置花费的时间对于测试程序是关键性的。可以设计传送器来自动化控制样品到达和离开的时限。这可以以几种方式来进行，例如按照需要调节位置之间的距离或阻止样品的吸收或流动。

6.可以设计传送器来减缓流动[见上一段]而不干扰小分子如底物和许多酶促反应产物的扩散[请参阅以下的具体实施例]。这可以通过以下方法来实现：使用惰性凝胶[例如，琼脂]浸渍条带中或沿着条带的接触区域并形成相似的屏障来延缓流动但允许自由扩散。

实施例3：牛奶中抗生素残留物的检测：单步测试试剂盒

在这个说明性的实施例中，试管和传送器配置如上所述。

试管：每个试管底部[位置A]被干燥的试剂所覆盖，该试剂由萌发剂和可诱导的产青霉素酶细菌菌株孢子的混合物组成。

样品：0.5mL待测试的牛奶

对照：0.5mL无抗生素的牛奶

传送器：下端用pH指示剂浸渍[位置B]。上端用青霉素浸渍[位置D]。将样品从位置B传送至D的条带用蓝黑淀粉-碘化物-碘溶液浸渍。

测试

1.准备测试：

将样品和对照置于以上的试管中，向每个管中加入传送拭子，并在37℃孵育25分钟。

2.阅读结果：

观察各自的传送器上样品和对照条带的脱色水平。

如果样品水平高于对照水平，则表明样品受到BLA[β内酰胺抗生素]的污染。

如果样品水平低于对照水平，则表明样品含有其他[非BLA]污染物。

如果样品和对照水平相似，则表明样品没有可检测的抗生素残留物。

注释

1.将液体样品置于试管[位置A]中激活系统：孢子萌发并立即响应样品中存在的可以诱导或抑制青霉素酶形成的任何抗生素。

2.将传送器浸入所述液体中，随之发生的条带的毛细作用启动反应物从位置A至位置D的转移。

3.调整该实施例中的转移速率，使得在11分钟内到达位置D。在该位置，青霉素开始逐渐扩散，并在随后的4分钟内，发生诱导，除非存在抑制剂。

实施例4：牛奶中抗生素残留物的检测：自动记录试剂盒

在该实施例中，试管以及样品和对照如上。然而，传送器由2个部件替代：

i.测试棒：浸渍了青霉素并用于递送诱导剂和底物以及用于检查进程[见下文]的拭子。

ii.测试卡：浸渍了淀粉-碘化物-碘蓝黑溶液的卡片。

测试：

1.将样品和对照置于试管中，在37℃孵育。启动定时器。

2.15分钟时，将测试棒加入到每个试管中。

3.20分钟时，使用各个测试棒润湿测试卡上的标记斑点来检查进程。

4.观察被润湿的点中发生的变化。

结果

如果样品和对照的斑点以相同的速率脱色，则表明样品无可检测的抗生素残留物。

如果样品较快-则测试的牛奶中存在BLA，而

如果对照较快-则测试的牛奶中存在非BLA。

记录

空气干燥的测试卡提供了可存储的结果记录。

注释

1.该实施例中的测试棒具有三个截然不同的功能，即：

诱导剂的递送

底物的递送

用于测试卡上的斑点测试的取样工具

2.由于浸渍了青霉素的测试棒头部的设计，通过青霉素的逐渐释放使诱导剂的递送不同于底物的递送成为可能。

实施例5：根据本发明的测试用具

测试用具套装由两个检测测试试样中抗生素残留物存在的组成部件。一个组成部件对β内酰胺类的抗生素较敏感(此后称为BL)，而第二个组成部件对属于非β内酰胺的其他类的抗生素较敏感(此后称为NBL)。每个测试用具由两个反应试管A和B组成：

样品是等分的液体试样，如牛奶或血液或其中收集和储存固体试样的液体。

1.BL是生物反应管，其底部被冻干的试剂所覆盖，该试剂由石英颗粒、萌发剂和可诱导的产青霉素酶细菌菌株孢子的混合物组成。样品和对照试样被递送到测试用具生物反应管BL中(各自被递送到分开的管中)，并在到达时，启动一个或多个生物或化学反应。

2.NBL是生物反应管，其底部被冻干的试剂所覆盖，该试剂由石英颗粒、萌发剂、β内酰胺和可诱导的产青霉素酶细菌菌株孢子的混合物组成。样品和对照试样被递送到测试用具生物反应管NBL中(各自被递送到分开的管中)，并在到达时，启动一个或多个生物或化学反应。

3.反应管A和B是酶底物色原相互作用管，其中各个试管的底部被作为底物试剂的干燥的β内酰胺所覆盖。

3.1.将测试中每个BL管中“处理过”的等分样品和对照置于分开的A管中，将外部液体(淀粉-碘-碘化物复合物)色原-指示剂试剂也递送到相同的A管中，启动一个或多个生化反应。

3.2.将测试中每个NBL管中“处理过”的等分样品和对照置于分开的B管中和外部的液体(淀粉-碘-碘化物复合物)色原-指示剂试剂也递送到相同的B管中，启动一个或多个生化反应。

3.3.另一种选择是各个A和/或B管含有干燥形式的(例如冻干的)淀粉-碘-碘化物复合物色原-指示剂试剂。

4.液体操作辅助设备：自动仪、移液管或分配器是将样品运送至测试用具和将BL和NBL管中的“处理过的”等分样品和对照分别运送至A和B管和/或将外部液体色原-指示剂试剂递送至A和B管来启动测试过程中相关测试用具装置中一个或多个生化反应的装置。

5.分析装置：分析仪是与能够成像处理、记录和保存测试结果的电子处理器(例如PC)连接的任何电光学装置CD照相机。肉眼观察测试结果也是一种选择方案。

6.振荡培养箱：在其中进行所有测定阶段的封闭舱式装置。将振荡培养箱内的两个主要函数保持稳定和不变；1.温度；37℃，2.恒定旋转半径的固定振荡速度(RPM)。将电光学装置(CD照相机)和照明装置置于振荡培养箱内。以所需的时间间隔拍摄A和B管内含物的照片，并将影像在线传输至分析装置(数据处理器)用于分析测试结果。

本领域技术人员显而易见的是本发明不限于前面的说明性实施例的详细内容，且可以以其他特定形式来具体化本发明而不背离其基本的属性，因此期望将本发明的所有实施方案和实施例都认为是说明性和非限制性的，参照所附的权利要求，而不是前面的描述，且因此所有落入权利要求的意图和等同范围内的改变都将包括在本发明中。

权利要求书

(按照条约第19条的修改)

1.用于检测抗生素残留物的试剂盒，包括：

a)可诱导的细菌孢子，其在萌发和诱导后产生诱导酶；

b)引发所述孢子快速萌发的萌发剂；

c)作为引发目标特异性酶产生的诱导剂且同时作为目标特异性酶底物的化合物；和

d)所述酶对所述底物活性的检测剂。

2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述酶是β-内酰胺酶，而β-内酰胺同时作为所述酶的诱导剂和底物，且所述底物和所述酶最初是彼此分开的。

3.根据权利要求1的试剂盒，其中所述检测剂是淀粉-碘化物-碘的蓝黑溶液。

4.根据权利要求1的试剂盒，其中所述检测剂是浸渍了淀粉-碘化物-碘蓝黑溶液的吸收性条带。

5.根据权利要求1的试剂盒，其中所述试剂盒中的所有组成部分a、b、c和d都以干燥状态存储。

6.根据权利要求1的试剂盒，其中所述检测剂以液体状态储存，并在测试过程中加入。

7.根据权利要求2的试剂盒，其中所述青霉素通过包被与所述的其他成分在物理上分开。

8.根据权利要求1的试剂盒，进一步包含惰性机械混合单元，用于与分析物溶液组合来物理上促进其均质化。

9.根据权利要求8的试剂盒，其中所述惰性机械混合单元包含硼硅酸盐玻璃球。

10.检测抗生物残留物的方法，包括：

a)将可诱导的细菌孢子置于含有萌发剂的分开的试管中；

b)将样品和对照试样加入各自的试管中并将所述试管置于约37℃的培养箱中；

c)加入作为萌发孢子的诱导剂同时作为由所述化合物所诱导的酶的底物的化合物；

d)将指示剂溶液加入所述培养箱中含所述样品的试管和含所述对照的试管中；并将所述样品和对照试样在约37℃继续孵育；和

e)注意所述孵育的结果。

11.根据权利要求10的方法，其中在将所述样品加入所述用于孵育的试管中后约10-20分钟时段中，在步骤c)中加入所述化合物。

12.根据权利要求10的方法，其中在将所述底物加入所述试管中后约15-25分钟时段中，在步骤d)中将所述指示剂溶液加入所述样品中。

Claims (12)

1.用于检测抗生素残留物的试剂盒，包括：

a)可诱导的细菌孢子，其在萌发和诱导后产生诱导酶；

b)引发所述孢子快速萌发的萌发剂；

c)引发目标特异性酶产生的诱导剂；

d)所述酶作用的底物；和

e)所述酶对所述底物活性的检测剂。

2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述酶是青霉素酶，而青霉素是所述酶的诱导剂和底物。

3.根据权利要求1的试剂盒，其中所述检测剂是淀粉-碘化物-碘的蓝黑溶液。

4.根据权利要求1的试剂盒，其中所述检测剂是浸渍了淀粉-碘化物-碘蓝黑溶液的吸收性条带。

5.根据权利要求1的试剂盒，其中所述试剂盒中的所有组成部分a、b、c和d都以干燥状态存储。

6.根据权利要求1的试剂盒，其中所述检测剂以液体状态储存，并在测试过程中加入。

7.根据权利要求2的试剂盒，其中所述青霉素通过包被与所述的其他成分在物理上隔开。

8.根据权利要求1的试剂盒，进一步包含惰性机械混合单元，用于与分析物溶液组合以物理上促进其均质化。

9.根据权利要求8的试剂盒，其中所述惰性机械混合单元包含硼硅酸盐玻璃球。

10.用于检测抗生物残留物的方法，包括：

a)将样品和对照试样置于分开的用于孵育的试管中；

b)将所述试管置于约37℃的培养箱中；

c)将底物加入所述培养箱中的含所述样品的试管和含所述对照的试管中；

d)将指示剂溶液加入所述培养箱中的含所述样品的试管和含所述对照的试管中；和

e)注意这两个试管中的结果。

11.根据权利要求10的方法，其中将所述样品加入所述用于孵育的试管中后约10-20分钟时段中，在步骤c)中加入所述底物。

12.根据权利要求10的方法，其中将所述底物加入所述试管中后约15-25分钟时段中，在步骤d)中将所述指示剂溶液加入所述样品中。