ES2656098T3 - Método para el aislamiento de células - Google Patents
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Abstract
Método para el aislamiento de células bacterianas a partir de una muestra compleja que comprende las etapas de: a) proporcionar una muestra compleja, b) incubar dicha muestra con una solución de extracción que comprende MgCl2 en concentraciones entre 0,5 y 3 M c) aislar dichas células de la mezcla de la etapa b) mediante centrifugación, afinidad de unión y/o filtración.
Description
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3. Inoculación de alimentos
Para la contaminación artificial de alimentos se transfiere un mililitro del cultivo de toda la noche a un mililitro de medio fresco y se incuba a la respectiva temperatura de cultivo óptima durante tres horas. Posteriormente, se añaden a las muestras 100 µl de las diluciones apropiadas en PBS (tampón fosfato salino). El método de recuento de colonias y placas de triptona soja agar complementadas con 0,6% (p/v) de extracto de levadura (TSA-Y; Oxoid, Hampshire, Reino Unido) se utilizan para la cuantificación de todas las cepas bacterianas utilizadas. Las placas de agar se incuban a la temperatura óptima respectiva durante 24 horas. Todas las matrices de las muestras se adquieren en supermercados locales. Todas las muestras utilizadas para la contaminación artificial se someten a ensayo para asegurar que son negativas a L. monocytogenes y S. Typhimurium, utilizando el protocolo de lisis de la matriz y los ensayos de PCR en tiempo real tal como se describe a continuación. Todos los experimentos de inoculación se realizan por duplicado.
4 A. Lisis de la matriz con solución de extracción que comprende líquidos iónico.
Se utiliza una solución acuosa al 5% (v/v) de tiocianato de 1-etil-3-metilimidazolio ([emim]SCN; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) para helados y huevos. Una solución acuosa al 7,5% (v/v) de [emim]SCN se utiliza para leche con tratamiento de temperatura ultra alta (UHT). Si no se indica de otro modo, la lisis de la matriz se realiza tal como sigue a continuación: 12,5 g de líquido o 6,25 g de producto alimenticio sólido se mezclan con 10 ml de tampón de lisis y son homogeneizados dos veces cada uno en el mezclador de laboratorio Stomacher 400 (Seward, London, Reino Unido) durante 3 minutos cada uno. El homogenado se transfiere a tubos de polipropileno de 50 ml (Corning, NY, USA). El tampón de lisis se añade para llevar el volumen a 45 ml. Las muestras son incubadas horizontalmente en un baño de agua (a 37 ºC para L. monocytogenes o a 42 °C para S. Typhimurium, respectivamente), y se agitan a 200 rpm durante 30 min. Las muestras a continuación se centrifugan a 3.220 x g durante 30 min a temperatura ambiente. El pellet es resuspendido en 40 ml de tampón de lavado (1% Lutensol AO-07, y PBS) y se incuba horizontalmente en un baño de agua, se agita a 200 rpm durante 30 min a las temperaturas utilizadas durante la etapa de lisis. Después de ello, las muestras se centrifugan a 3.220 X g durante 30 min a temperatura ambiente y el sobrenadante se desecha cuidadosamente. El pellet es resuspendido en 500 µl de PBS, transferido a un tubo de plástico de 1,5 ml (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) y lavado dos veces en 1 ml de PBS con centrifugación adicional durante 5 min a 5.000 X g.
4 B. Lisis de la matriz con solución de extracción que comprende MgCl2.
El tampón de lisis (=solución de extracción) contiene 0,5 a 3 M de MgCl2, 1 x tampón de Tris, pH 5-7.
Se mezclan 12 g de producto alimenticio líquido o 6 g sólido con 10 ml de tampón de lisis y se homogeneiza dos veces cada uno en el mezclador de laboratorio Stomacher 400 (Seward, London, Reino Unido). El homogenado es transferido a tubos de polipropileno de 50 ml (Corning, NY, EE.UU.). El tampón de lisis se añade para llevar el volumen a 45 ml. Las muestras son incubadas horizontalmente en un baño de agua (a 37 ºC para L. monocytogenes
o a 42 °C para S. Typhimurium, respectivamente), y se agitan a 200 rpm durante 30 min. Las muestras a continuación se centrifugan a 3.220 x g durante 30 min a temperatura ambiente. El sobrenadante es cuidadosamente eliminado dejando aproximadamente 500 µl de la muestra en el tubo. La muestra restante y el pellet se resuspende en 40 ml de tampón de lavado (1% Lutensol AO-07, y 1 x PBS) y se incuba horizontalmente en un baño de agua, se agita a 200 rpm durante 30 min a las temperaturas utilizadas durante la etapa de lisis. Después de ello, las muestras se centrifugan a 3.220 X g durante 30 min a temperatura ambiente y el sobrenadante se desecha cuidadosamente para dejar aproximadamente 250 µl de la muestra en el tubo. La muestra restante y el pellet se resuspende en 500 µl de 1 x PBS, se transfiere a un tubo de plástico de 1,5 ml (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Después, las muestras se centrifugan durante 5 min a 5.000 X g a temperatura ambiente y el sobrenadante se desecha cuidadosamente. El pellet restante se lava dos veces en 1 ml de PBS con centrifugación adicional durante 5 min a 5.000 X g.
5. Aislamiento del ADN.
El aislamiento del ADN del pellet bacteriano restante a continuación de la lisis de la matriz, se realiza utilizando el kit de tejidos NucleoSpin® (Machery-Nagel, Düren, Alemania) y el protocolo de soporte para las bacterias Grampositivas. La etapa final del protocolo se modifica y por lo tanto se utilizan dos veces 50 µl de agua doble destilada para eluir el ADN de la columna.
6. Cuantificación de células viables.
La cuantificación de células viables a partir del pellet bacteriano restante a continuación de la lisis de la matriz, se lleva a cabo utilizando el método de recuento de colonias (PCM, por sus siglas en inglés) en ambos, placas de triptona soja agar no selectivas complementadas con 0,6% (p/v) de extracto de levadura (TSAY; Oxoid, Hampshire,
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