CN107937577A - 快速检测原料乳中产耐热脂肪酶的荧光假单胞菌的lamp引物组及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种原料乳中产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的LAMP检测引物组及方法，属于食品安全检测领域。发明以荧光假单胞菌脂肪酶基因为目的基因，设计和筛选了一套特异性检测的引物组，以及适用于该引物组的LAMP检测体系和反应条件。现有的传统检测方法用时长，耗费人力物力，本发明采用的检测方法灵敏度高，特异性强，用时短；而且成本低，操作过程简单，反应过程中不需要PCR仪和电泳仪；结果判定方面无需任何仪器。该发明在一定程度上解决了传统方法的弊端，对于快速检测原料乳的品质具有重要意义，该方法适合于基层在线监测和现场检测使用。

Description

快速检测原料乳中产耐热脂肪酶的荧光假单胞菌的LAMP引物 组及方法

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种原料乳中产耐热脂肪酶的荧光假单胞菌的检测引物组及检测方法。

背景技术

低温运输和加工控制了原料乳中污染的嗜温菌的生长，但是并不能有效控制嗜冷菌生长，因此嗜冷菌在冷链贮运过程中成为原料乳中的优势微生物。虽然多数嗜冷菌在巴氏灭菌和其他高温灭菌过程中已经死亡，即使尚有残留活菌体也不足以危及乳制品的货架期，但是嗜冷菌能够分泌大量胞外的耐热脂肪酶，这些脂肪即使经过高温处理，仍会留有残余。残余的耐热脂肪酶在乳制品储藏的过程中继续分解其中的脂肪，释放出游离脂肪，粘合脂肪球，产生脂肪球簇，使乳脂肪上浮；同时分解脂肪球膜，导致脂肪球的聚集，加剧了乳中脂肪上浮；脂肪的氧化还会诱发蛋白质的交连，导致乳制品结构的改变。脂肪酶的氧化过程中产生短链和挥发性脂肪酸，使乳制品在保质期内失去乳香味，营养价值随之降低，最终引发酸败。受嗜冷菌污染严重的原料乳中含有大量耐热脂肪酶，导致乳制品尤其是长保质期的乳制品在保质期内整体质量受到破坏，控制原料乳中嗜冷菌数量对于保障乳制品质量极其重要。在污染的嗜冷菌中，假单胞菌属以其世代周期间隔短的特点占据了其中绝大多数。其中，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)具有很强的分泌耐热脂肪酶的能力，是研究最广泛的嗜冷菌。所以检测原料乳中产耐热脂肪酶的P.fluorescens能够衡量原料乳的品质。

目前国际标准的乳品嗜冷菌计数方法为IDF Standard 101A和IDF Standard132A，前者是将原料乳在6.5℃培养10天，然后进行平板计数；后者是将原料乳在21℃培养25h，然后进行平板计数。前者的试验周期太长；后者虽然试验周期短，但是结果并不十分准确。两种方法均不能满足基层在线监测和现场检测的要求。

近年来，不少学者对原料乳中嗜冷菌的检测方法进行了研究，其中包括氨肽酶法和PCR法。氨肽酶法的依据是：革兰氏阴性菌是原料乳中嗜冷菌的主要组成，且绝大多数革兰氏阴性菌的细胞壁上都有氨肽酶，氨肽酶的活力与嗜冷菌数量成线性关系，以此判断嗜冷菌的数量。PCR方法虽然在检测的特异性和灵敏度方面有显著提高，但是需要大型贵重仪器，而且对操作人员的试验技能有一定要求，因此限制了使用的范围，无法应用于现场检测。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)针对靶基因的6个区域设计4条特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在恒温条件(65℃左右)孵育几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有高特异性和等温快速的特点。LAMP可在1h之内，将靶基因扩增10⁹-10¹⁰倍。同时，在DNA延伸合成过程中，脱氧核酸三磷酸基质(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，会产生一种焦磷酸镁的衍生物，高效扩增的LAMP相应生成大量该衍生物，衍生物可以与显色剂SYBR Green I反应，发生颜色变化，肉眼即可判定检测结果。该方法检测特异性强，灵敏度高，并且所用仪器设备简单，具有应用于现场检测的潜力。但是在应用于原料乳中产耐热脂肪酶的P.fluorescens的检测方面还未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种用时短、成本低、灵敏度高、特异性强，并且操作简单的原料乳中产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的引物组和检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

原料乳中产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的检测引物及其快速检测方法，其具体步骤如下：

1.LAMP引物设计：根据荧光假单胞菌的脂肪酶编码基因序列的保守区，用PrimerexplorerV4设计特异性扩增引物对，引物序列如下：

上游外引物F3：5’-CGAAGCGTGCAGAAGGC-3’，(SEQ ID NO：1)

下游外引物B3：5’-GTGCCGCGAAAACCGA-3’，(SEQ ID NO：2)

上游内引物FIP：

5’-CTTTTCGCCGAAGAACGTGCCCTTTTCATCAGCGCCAGCACTCTT-3’，(SEQ IDNO：3)

下游内引物BIP：

5’-GCTATACCACGGCCCAGGTCTTTTTGCCGATTTCCTGCAACTG-3’，(SEQ IDNO：4)

2.LAMP检测原料乳中产耐热脂肪酶荧光假单胞菌体系的建立：

1)基因组DNA的提取可采用试剂盒法。

2)原料乳中产耐热脂肪酶荧光假单胞菌脂肪酶基因的LAMP扩增

A.在反应管中加入下列成分：英国New England Bio labs公司的Bst聚合酶(8U/μL)，1μL，10×ThermoPol Buffer，2.5μL，外引物，F3+B3，5μmol/L，1μL；内引物FIP+BIP，40μmol/L，1μL；模板2μL；dNTP，10mM，4μL；Mg²⁺，100mM，2μL，灭菌ddH₂O，9.5μL，反应体系共25μL；

B.反应管于64℃水浴中温育50min；

C.将水浴温度调至80℃终止反应，5min后取出待检。

扩增时设置阴性对照(ddH2O)。

3)LAMP反应的显色检测

在待检的每个反应管中加入1μL SYBR Green I显色剂，直接用肉眼观察颜色变化。在对照反应成立的前提下(即阴性对照反应管中无扩增产物，加入显色剂后，体系颜色呈橙色)；如果反应管中扩增反应液颜色变为绿色，说明待检样品检出产耐热脂肪酶的荧光假单胞菌浓度高于4.8×10¹cfu/反应管；如果颜色为橙色，则说明待检样品中产耐热脂肪酶的荧光假单胞菌浓度低于4.8×10¹cfu/反应管。

本发明采用上述技术方案所带来的效果在于设计一种检测原料乳中产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的引物对和方法。本发明的检测方法速度快，结果准确可靠，操作简单，检测成本低。本发明的检测靶点是通过比较基因组学、生物信息学筛选并经过生物学验证而得到的，具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单。本发明的检测方法可以用于食品样品的检测。

附图说明

图1为采用原料乳中产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的LAMP检测方法检测原料乳中常见的其他6株常见污染菌的显色反应；图中1-6号反应管中分别是金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌，克罗诺杆菌，单增李斯特菌和福内志贺氏菌；7号反应管为阴性对照，8号反应管为阳性对照。

图2为LAMP检测不同浓度产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的显色反应。图中1号反应管为阴性对照的显色结果。2-8号反应管依次为荧光假单胞菌DNA模板为4.8×10⁶-4.8×10⁰cfu/反应管的显色结果图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1：原料乳中产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的特异性检测

1)通过比较基因组和生物信息学分析获得荧光假单胞菌的脂肪酶基因序列中的保守区；

将保守区序列输入到引物设计软件Primer explorer V4中设计引物，引物序列如下(引物由上海生工生物工程有限公司合成)：

F3：5’-CGAAGCGTGCAGAAGGC-3’，(SEQ I D NO：1)

B3：5’-GTGCCGCGAAAACCGA-3’，(SEQ ID NO：2)

FIP：5’-CTTTTCGCCGAAGAACGTGCCCTTTTCATCAGCGCCAGCACTCTT-3’，(SEQID NO：3)

BIP：5’-GCTATACCACGGCCCAGGTCTTTTTGCCGATTTCCTGCAACTG-3’，(SEQID NO：4)

2)将1株分离自原料乳中的产脂肪酶的荧光假单胞菌菌株和6株原料乳中常见的污染菌株接种至LB培养基中复苏18h，按照基因组试剂盒说明书提取基因组。获得的菌株的基因组作为反应模板添加到体系中进行扩增反应。

在反应管中加入英国New England Bio labs公司的Bst酶(8U/μL)，1μL，10×ThermoPol Buffer，2.5μL，外引物，F3+B3，5μmol/L，1μL；内引物FIP+BIP，40μmol/L，1μL；模板2μL；dNTP，10mM，4μL；Mg²⁺，100mM，2μL，灭菌ddH₂O，9.5μL，反应体系共25μL。

将反应管放入63℃水浴锅中温育50min。

然后加热水浴锅至80℃持续5min，终止反应。

3)在待检反应管中加入1μL显色剂SYBR Green I，观察反应结果。管1-6均无扩增产物，反应体系显橙色；管7阴性对照没有发生扩增反应，体系显橙色。管8产脂肪酶的荧光假单胞菌发生扩增反应，体系显绿色。

该组引物经在线检测的结果证实，具有很高的特异性，不会与其他物种发生交叉反应。荧光假单胞菌为原料乳中常见菌株，因此在特异性实验中选择原料乳中其他常见菌株大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，福内志贺氏菌，克罗诺杆菌以及单增李斯特菌等进行试验。经验证，除荧光假单胞菌基因组出现阳性扩增，反应液颜色呈绿色外，其他菌株均无扩增，反应液颜色为橙色；与预期相符，表明该组引物有良好的特异性，与上述菌株没有交叉反应。

本实施例中分离自原料乳中的产脂肪酶的荧光假单胞菌菌株(Pseudomonasfluorescens)RM lwzhang为荧光假单胞菌，属于假单胞菌属；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.14540，保藏日期为2017年8月21日。

实施例2：原料乳中产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的灵敏度检测

1)将1株分离自原料乳中产耐热脂肪酶的荧光假单胞菌接入LB中复苏18h，取1mL菌液采用10倍浓度梯度稀释法稀释7个梯度，每个稀释梯度各取3mL按照基因组试剂盒的说明书提取基因组。同时对原始菌液进行平板计数。

2)依实例1中的反应体系和反应条件进行LAMP扩增。

3)反应结束后，在LAMP反应体系中加入1μL显色剂SYBR Green I，观察反应结果。

图2中，反应管2-6(产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的DNA含量分别为4.8×10⁶-4.8×10²cfu/反应管)显绿色，即阳性反应；反应管7和8(产耐热脂肪酶荧光假单胞菌的DNA含量分别为4.8×10¹和4.8×10⁰cfu/反应管)显橙色，即阴性反应；说明本发明的检测灵敏度为4.8×10²cfu/反应管。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 快速检测原料乳中产耐热脂肪酶的荧光假单胞菌的LAMP引物组及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgaagcgtgc agaaggc 17

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgccgcgaa aaccga 16

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttttcgccg aagaacgtgc ccttttcatc agcgccagca ctctt 45

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctataccac ggcccaggtc tttttgccga tttcctgcaa ctg 43

Claims (4)

1.用于LAMP检测原料乳中产耐热蛋白酶荧光假单胞菌的引物组，其特征在于由下列引物组成，

上游外引物F3：5’-GGCCGTGATTTCCTCAGC-3’，(SEQ ID NO：1)

下游外引物B3：5’-CAGGTAAGCGAAAGCCGC-3’，(SEQ ID NO：2)

上游内引物FIP：

5’-TGGGTGAAACCGGAGAAGTCCATTTTGTCAAGCGACAAACGTGGT-3’，(SEQ ID NO：3)

下游内引物BIP：

5’-GACGTTCTTTCTCCGACGTGGTTTTTGTTCTCGATGGTGACGCC-3’，(SEQ ID NO：4)。

2.权利要求1所述的原料乳中产耐热蛋白酶假单胞菌的LAMP检测引物的应用方法，其特征在于：采用上述引物组进行LAMP检测，检测体系具体为：反应体系共25μL，英国NewEngland Bio labs公司的Bst酶(8U/μL)，1.2μL，10×ThermoPol Buffer，2.5μL，外引物，F3+B3，5μmol/L，1μL；内引物FIP+BIP，40μmol/L，1μL；模板2μL；dNTP，10mM，4μL；Mg²⁺，100mM，2μL，灭菌ddH₂O，9.3μL，反应体系共25μL。

3.权利要求2中所述的LAMP反应体系的反应条件，其特征在于：63℃温育60min。

4.根据权利要求3中所述的原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌的检测引物的应用方法，其特征在于向反应的扩增体系中加入显色剂SYBR Green I 1μL，当纯培养的原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌菌数高于3×10²cfu/mL，显色结果为绿色，低于3×10²cfu/mL，显色结果为橙色。