CN111647524A - 一株乳源嗜冷菌及其分泌的胞外酶 - Google Patents
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Abstract
一株乳源嗜冷菌及其分泌的胞外酶。本发明属于乳品加工领域。本发明的目的在于提供一株耐热性较差的乳源嗜冷菌及其分泌的具有一定耐热性的胞外酶。本发明的一株乳源嗜冷菌的分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)W3菌株，其保藏编号为CGMCC No.14540，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017.08.21。本发明菌株产胞外蛋白酶的活力约为7.0‑8.2U/mL，产胞外脂肪酶的活力约为6.8‑7.5U/mL，且本发明菌株所产生的胞外蛋白酶和脂肪酶具有一定程度的耐热性，具备原料乳中的优势嗜冷菌的重要特征，且本发明菌株的来源为原料乳，可以用于嗜冷菌对乳及乳制品的危害及控制办法的研究。
Description
技术领域
本发明属于乳品加工领域，具体涉及一株乳源嗜冷菌及其分泌的胞外酶。
背景技术
随着低温贮藏和运输的发展，使得影响原料乳品质的绝大部分嗜温菌能在低温条件下有效的抑制其生长繁殖，从而减少对原料乳品质产生负面影响。尽管原料乳中存在的微生物中绝大部分都会受到低温环境的抑制而无法正常生长繁殖，但有一类在低温条件下仍能正常繁殖的细菌(嗜冷菌)，它能够在低温环境下继续生长繁殖，从而污染原料乳。绝大部分的嗜冷菌对热的抵抗能力很差，常规的原料乳加热灭菌方式可以有效的将其灭活。然而尽管菌体被灭活，但以荧光假单胞菌为代表的嗜冷菌能够分泌耐热的胞外蛋白酶和脂肪酶，这些酶在加热灭菌后仍能残留部分活性，并在乳及乳制品的储存过程中继续分解乳中的蛋白质和脂肪，使乳及乳制品产生凝块、异味、脂肪分层等不利影响。
嗜冷菌作为危害乳及乳制品品质的一个重要原因，研究嗜冷菌对乳品质的影响机理及预防控制成为一个急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一株耐热性较差的乳源嗜冷菌及其分泌的具有一定耐热性的胞外酶。
本发明的一株乳源嗜冷菌的分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)W3菌株，其保藏编号为CGMCC No.14540，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2017.08.21。
进一步限定，所述W3菌株对热处理的抵抗能力较弱，在原料乳的常规加热灭菌过程中能够很有效的将其杀死，具体的：在60～70℃、30min的热处理条件下可以杀死80％～85％的W3菌株；在85～95℃、5min的热处理条件下可杀死95％～98％的W3菌株；在130～140℃、5s的热处理条件下可杀死98％～100％的W3菌株。
进一步限定，所述胞外酶为胞外蛋白酶、胞外肽酶和胞外脂肪酶。
进一步限定，所述胞外蛋白酶为蛋白酶AprX、金属蛋白酶、巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和锌蛋白酶。
进一步限定，所述胞外肽酶为肽酶M48、肽酶M20、肽酶M16、肽酶M24和金属氨肽酶。
进一步限定，所述胞外脂肪酶为三酰甘油脂肪酶、α水解酶和β水解酶。
进一步限定，其分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的培养基为脱脂乳培养基、乳糖肉汤培养基或MRS培养基。
进一步限定，其分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的环境参数为：温度为20～30℃、转速为100rpm～150rpm，培养时间为5d～10d。
进一步限定，其分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的产量分别为7.0U/m～8.2U/mL和6.8U/m～7.5U/mL。
进一步限定，所述胞外蛋白酶和胞外脂肪酶具有一定程度的耐热性，具体的：在60～70℃、30min的热处理条件下，胞外蛋白酶的残余活力为45％～52％、胞外脂肪酶的残余活力为40％～46％；在85～95℃、5min的热处理条件下，胞外蛋白酶的残余活力为37％～41％、胞外脂肪酶的残余活力为27％～33％；在130～140℃、5s的热处理条件下，胞外蛋白酶的残余活力为29％～36％、脂肪酶的残余活力为15％～19％。
进一步限定，所述胞外蛋白酶在25℃～30℃条件下，3d～5d时间内将乳中的游离氨基酸浓度从0.3μmol/mL～0.6μmol/mL增加到1.0μmol/mL～1.6μmol/mL。
本发明的技术效果如下：
本发明提供的菌株能够分泌多种蛋白酶和脂肪酶，利用蛋白质组学技术对W3菌株的乳发酵液与空白乳培养基进行比对分析，发现W3菌株能够分泌多种蛋白酶、肽酶和脂肪酶，其中关于嗜冷菌分泌胞外耐热蛋白酶研究最多的蛋白酶ApxX也在W3菌株培养液中发现，除此之外一些对乳制品存在潜在危害的成分也有发现。
本发明提供的菌株接入到牛乳中会对牛乳品质产生危害。菌株的加入使得牛乳在保藏过程中出现游离脂肪酸和游离氨基酸含量上升，乳中脂肪上浮分层、乳凝块、出现哈喇味、苦味等不良影响。
附图说明
图1为具体实施方式一的荧光假单胞菌W3菌株分泌胞外蛋白酶能力柱形图；
图2为具体实施方式一的荧光假单胞菌W3菌株分泌胞外脂肪酶能力柱形图；
图3为具体实施方式一的荧光假单胞菌W3菌株的耐热能力柱形图；
图4为具体实施方式一的荧光假单胞菌W3菌株分泌的胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的耐热能力柱形图；
图5为具体实施方式四的荧光假单胞菌W3菌株污染的牛乳在UHT灭菌条件后蛋白酶活力图；
图6为具体实施方式四的荧光假单胞菌W3菌株污染的牛乳在UHT灭菌条件后游离氨基酸含量变化图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一株乳源嗜冷菌的分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)W3菌株，其保藏编号为CGMCC No.14540。
本实施方式所述的荧光假单胞菌W3菌株的获得过程为：该菌株是从哈尔滨地区的原料乳中分离出来的具有高产胞外蛋白酶和脂肪酶的菌株，将筛选出的乳源嗜冷菌分别进行产蛋白酶的透明圈实验的验证和产脂肪酶的荧光圈实验的验证，并根据透明圈和荧光圈的直径来反应菌株产蛋白酶和脂肪酶的能力，筛选出高产蛋白酶/脂肪酶的菌株荧光假单胞菌W3菌株。
本实施方式所述的荧光假单胞菌W3菌株分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的具体过程为：
将活化好的W3菌株按照2％的接种量接入到乳糖肉汤培养基(蛋白胨5.0g/L、乳糖5.0g/L、牛肉浸粉3.0g/L)中，分别在在30℃、150r/min和4℃、150r/min条件下培养72h，每隔12h测定培养基中蛋白酶和脂肪酶活力。
结果：得到如图1所示的分泌胞外蛋白酶能力的柱形图和如图2所示的分泌胞外脂肪酶能力的柱形图，从图1和图2可以看出，W3菌株在乳糖肉汤培养基中的胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的产量可达8.0U/mL和7.2U/mL。
对本实施方式的荧光假单胞菌W3菌株的耐热性进行研究，具体过程如下：
将使用乳糖肉汤培养基培养过W3菌株的菌液分别于65℃下热处理30min、90℃下热处理5min、137℃下热处理5s，来验证W3菌株的耐热性，统计加热处理前后菌体的数量，分析不同加热处理前后活菌的剩余率。
结果：得到如图3所示的荧光假单胞菌W3耐热能力柱形图，从图3可以看出，在65℃、30min的热处理条件下可以杀死84％的该菌株；在90℃、5min的热处理条件下可杀死97％的该菌株；在137℃、5s的热处理条件下可杀死99％的该菌株。在原料乳的常规加热灭菌过程中能够很有效的将其杀死。
对本实施方式的荧光假单胞菌W3菌株分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的耐热性进行研究，具体过程如下：
将培养过W3菌株的上述乳糖肉汤培养基分别于65℃下热处理30min、90℃下热处理5min、137℃下热处理5s，来验证热处理后蛋白酶活力和脂肪酶活力的残存率。
结果：得到如图4所示的荧光假单胞菌W3菌株分泌的胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的耐热能力柱形图，从图4可以看出，在65℃、30min的热处理条件下其分泌的胞外蛋白酶和脂肪酶的残余活力为47％和42％；在90℃、5min的热处理条件下其分泌的胞外蛋白酶和脂肪酶的残余活力为39％和28％；在137℃、5s的热处理条件下其分泌的胞外蛋白酶和脂肪酶的残余活力为31％和16％。
具体实施方式二：本实施方式的一株乳源嗜冷菌的分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)W3菌株，其保藏编号为CGMCC No.14540。
本实施方式所述的荧光假单胞菌W3菌株的获得过程为：该菌株是从哈尔滨地区的原料乳中分离出来的具有高产胞外蛋白酶和脂肪酶的菌株，将筛选出的乳源嗜冷菌分别进行产蛋白酶的透明圈实验的验证和产脂肪酶的荧光圈实验的验证，并根据透明圈和荧光圈的直径来反应菌株产蛋白酶和脂肪酶的能力，筛选出高产蛋白酶/脂肪酶的菌株荧光假单胞菌W3菌株。
本实施方式所述的荧光假单胞菌W3菌株分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的具体过程为：
将活化好的W3菌株按照2％的接种量接入到脱脂乳当中，在30℃、150r/min条件下培养72h，每隔12h测定培养基中蛋白酶和脂肪酶活力。
结果：数据表明W3菌株在脱脂乳培养基中的胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的产量可达8.7U/mL和7.5U/mL。
对本实施方式的荧光假单胞菌W3菌株的耐热性进行研究，具体过程如下：
将使用脱脂乳培养过W3菌株的菌液分别于70℃下热处理30min、95℃下热处理5min、135℃下热处理5s，来验证W3菌株的耐热性，统计加热处理前后菌体的数量，分析不同加热处理前后活菌的剩余率。
结果显示，在70℃、30min的热处理条件下可以杀死83％的该菌株；在95℃、5min的热处理条件下可杀死96％的该菌株；在135℃、5s的热处理条件下可杀死99％的该菌株。在原料乳的常规加热灭菌过程中能够很有效的将其杀死。
对本实施方式的荧光假单胞菌W3菌株分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的耐热性进行研究，具体过程如下：
将使用脱脂乳培养过W3菌株的菌液分别于70℃下热处理30min、95℃下热处理5min、135℃下热处理5s，来验证热处理后蛋白酶活力和脂肪酶活力的残存率。
结果显示，在70℃、30min的热处理条件下其分泌的胞外蛋白酶和脂肪酶的残余活力为49％和46％；在95℃、5min的热处理条件下其分泌的胞外蛋白酶和脂肪酶的残余活力为41％和29％；在135℃、5s的热处理条件下其分泌的胞外蛋白酶和脂肪酶的残余活力为32％和18％。
具体实施方式三：本实施方式的一株乳源嗜冷菌的分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)W3菌株，其保藏编号为CGMCC No.14540。
本实施方式所述的荧光假单胞菌W3菌株的获得过程为：该菌株是从哈尔滨地区的原料乳中分离出来的具有高产胞外蛋白酶和脂肪酶的菌株，将筛选出的乳源嗜冷菌分别进行产蛋白酶的透明圈实验的验证和产脂肪酶的荧光圈实验的验证，并根据透明圈和荧光圈的直径来反应菌株产蛋白酶和脂肪酶的能力，筛选出高产蛋白酶/脂肪酶的菌株荧光假单胞菌W3菌株。
对本实施方式的荧光假单胞菌W3菌株分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的耐热性进行研究，具体过程如下：
将活化好的W3菌株按照2％的接种量接入到脱脂乳当中，在30℃、150r/min条件下培养72h，将使用脱脂乳培养过W3菌株的菌液分别于65℃下热处理30min、90℃下热处理5min、137℃下热处理5s，来验证热处理后蛋白酶活力和脂肪酶活力的残存率。
结果显示，在65℃、30min的热处理条件下其分泌的胞外蛋白酶和脂肪酶的残余活力为50％和48％；在90℃、5min的热处理条件下其分泌的胞外蛋白酶和脂肪酶的残余活力为43％和30％；在137℃、5s的热处理条件下其分泌的胞外蛋白酶和脂肪酶的残余活力为33％和19％。
具体实施方式四：本实施方式的一株乳源嗜冷菌的分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)W3菌株，其保藏编号为CGMCC No.14540。
本实施方式所述的荧光假单胞菌W3菌株的获得过程为：该菌株是从哈尔滨地区的原料乳中分离出来的具有高产胞外蛋白酶和脂肪酶的菌株，将筛选出的乳源嗜冷菌分别进行产蛋白酶的透明圈实验的验证和产脂肪酶的荧光圈实验的验证，并根据透明圈和荧光圈的直径来反应菌株产蛋白酶和脂肪酶的能力，筛选出高产蛋白酶/脂肪酶的菌株荧光假单胞菌W3菌株。
对本实施方式的荧光假单胞菌W3菌株对牛乳品质影响的研究，具体过程如下：
将活化好的W3菌株按照2％的接种量接入到灭菌后的牛乳中，在30℃、150r/min条件下培养4d后，于137℃下灭菌5s，灭菌后的牛乳于25℃下保存。
结果：得到如图5所示的荧光假单胞菌W3菌株污染的牛乳在UHT灭菌条件后蛋白酶活力图和如图6所示的荧光假单胞菌W3菌株污染的牛乳在UHT灭菌条件后游离氨基酸含量变化图。
结果显示，牛乳于保存的第三天开始出现乳清分离现象，四天后开始出现凝块和沉淀现象，牛乳中的游离氨基酸和游离脂肪酸含量也在升高。这也表明W3菌株分泌的胞外蛋白酶和胞外脂肪酶在灭菌后依然具有部分活力，可以继续分解乳中的蛋白质和脂肪，对乳品质产生负面影响。
Claims (8)
1.一株乳源嗜冷菌，其特征在于，该乳源嗜冷菌的分类命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)W3菌株，其保藏编号为CGMCC No.14540。
2.如权利要求1所述的一株乳源嗜冷菌分泌的胞外酶，其特征在于，所述胞外酶为胞外蛋白酶、胞外肽酶和胞外脂肪酶。
3.根据权利要求2所述的一株乳源嗜冷菌分泌的胞外酶，其特征在于，所述胞外蛋白酶为蛋白酶AprX、金属蛋白酶、巯基蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和锌蛋白酶。
4.根据权利要求2所述的一株乳源嗜冷菌分泌的胞外酶，其特征在于，所述胞外肽酶为肽酶M48、肽酶M20、肽酶M16、肽酶M24和金属氨肽酶。
5.根据权利要求2所述的一株乳源嗜冷菌分泌的胞外酶，其特征在于，所述胞外脂肪酶为三酰甘油脂肪酶、α水解酶和β水解酶。
6.根据权利要求2所述的一株乳源嗜冷菌分泌的胞外酶，其特征在于，其分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的培养基为脱脂乳培养基、乳糖肉汤培养基或MRS培养基。
7.根据权利要求2所述的一株乳源嗜冷菌分泌的胞外酶，其特征在于，其分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的环境参数为：温度为20～30℃、转速为100rpm～150rpm，培养时间为5d～10d。
8.根据权利要求2所述的一株乳源嗜冷菌分泌的胞外酶，其特征在于，其分泌胞外蛋白酶和胞外脂肪酶的产量分别为7.0U/mL～8.2U/mL和6.8U/mL～7.5U/mL。
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