CN112538532A - 一种松材或拟松材线虫的荧光定量pcr检测引物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法，其中，松材线虫的荧光定量PCR检测引物，包括PCR扩增引物一；所述PCR扩增引物一包括PCR扩增上游引物一，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(5’‑GTTCCGCCTACTGATGGTTC‑3’)，以及PCR扩增下游引物一，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(5’‑CGGGCTTTTCAATCCTACGC‑3’)；拟松材线虫的荧光定量PCR检测引物，包括PCR扩增引物二；所述PCR扩增引物二包括PCR扩增上游引物二，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示(5’‑TTCTACGCACTGTTTGTCCG‑3’)，以及PCR扩增下游引物二，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示(5’‑TTCACGACGAAGCTCAACAA‑3’)。本发明具有良好的DNA提取效果，操作简单、耗时短(1小时内)，结果准确可靠，最低可检出单条线虫，具有灵敏度高和特异性强的特点。

Description

一种松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测引物、试剂盒及 方法

技术领域

本发明涉及林业虫害检测技术领域，具体涉及一种松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法。

背景技术

松材线虫和拟松材线虫属蠕形动物门、线虫纲、垫刃目、滑刃总科、伞刃属，是危害松树的虫害。松材线虫病又称松枯萎病，是通过松墨天牛等媒介昆虫传播于松树体内引发松树病害。被松材线虫和拟松材线虫感染后的松树，针叶黄褐色或红褐色，萎蔫下垂，树脂分泌停止，树干可观察到天牛侵入孔或产卵痕迹，病树整株干枯死亡，最终腐烂。因此，线虫检测是林业虫害防治的重要基础。目前实验室所采用的检测方法是简单的线虫分离后的形态学鉴定，但分离线虫的过程较长，非成虫无法通过形态学进行鉴定，需要进行培养至成虫才能鉴定，而形态学鉴定结果也依赖于检测人员的经验。目前也有采用普通PCR进行检测的案例，但检测方法较为复杂，且耗时长，再加上引物设计的不合理性，导致应用并不广泛。此外，CN104673926公开了一种荧光定量PCR检测技术，在一定程度上拓展了对松材线虫检测技术，但仍然存在不能准确检测拟松材线虫、检测用时长、棉拭子取样存在较大误差及灵敏度一般等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法，该技术具有特异性强、灵敏度高的优点，并且在线虫生长的任何阶段均能准确鉴定。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种松材线虫的荧光定量PCR检测引物，包括PCR扩增引物一；所述PCR扩增引物一包括PCR扩增上游引物一，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(5’-GTTCCGCCTACTGATGGTTC-3’)，以及PCR扩增下游引物一，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(5’-CGGGCTTTTCAATCCTACGC-3’)。

第二个方面，本发明提供一种松材线虫的荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述的检测引物、探针一和其他试剂一。

进一步地，所述探针一为Taqman水解探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示(5’-FAM-TGGAAGCCGAGAGGCGACCGTGCAACGGTG-BHQ-3’)。

进一步地，所述其他试剂一包括DNA提取试剂一，所述DNA提取试剂一包括十二烷基硫酸钠、pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇，并且在所述DNA提取试剂一中各成分的浓度为：十二烷基硫酸钠1～3％，pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液1～2M、乙二胺四乙酸0.1～1M、二硫苏糖醇0.1～0.3M。

进一步地，所述DNA提取试剂一还包括1～2mg/ml的蛋白酶K。

进一步地，所述其他试剂一还包括阳性对照品一和阴性对照品一。

第三个方面，本发明一种拟松材线虫的荧光定量PCR检测引物，包括PCR扩增引物二；所述PCR扩增引物二包括PCR扩增上游引物二，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示(5’-TTCTACGCACTGTTTGTCCG-3’)，以及PCR扩增下游引物二，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示(5’-TTCACGACGAAGCTCAACAA-3’)。

第四个方面，本发明提供一种拟松材线虫的荧光定量PCR检测试剂盒，包括上述的检测引物、探针二和其他试剂二。

进一步地，所述探针二为Taqman水解探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示(5’-FAM-CGAGTACGAAAGGGCTTCGGCTCGATTGTG-BHQ-3’)。

进一步地，所述其他试剂二包括DNA提取试剂二，所述DNA提取试剂二的成分同所述DNA提取试剂一。

进一步地，所述DNA提取试剂二还包括1mg/ml的蛋白酶K。

进一步地，所述其他试剂二还包括阳性对照品二和阴性对照品二。

第五个方面，本发明提供一种松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测方法，采用的是上述松材线虫或者拟松材线虫的荧光定量PCR检测试剂盒，该检测方法包括以下步骤：

步骤一，取PCR反应预混液与松材线虫或拟松材线虫引物探针混合液进行预混；

步骤二，在松材线虫或者拟松材线虫分离液中加入DNA提取试剂一或者DNA提取试剂二，混匀后于60～65℃加热25min后于95℃加热5min，12000g离心3分钟，保留DNA提取上清液；

步骤三，将DNA提取上清液、相应的阳性对照品及阴性对照品与步骤一中的反应液混合，进行荧光定量PCR扩增和信号检测；

步骤四，根据相应的质控标准、Cq值判读标准分析检测结果。

优选地，所述PCR反应预混液与松材线虫或拟松材线虫引物探针混合液的体积比为5:1。

优选地，所述荧光定量PCR扩增的循环参数为：第一阶段，95℃扩增30秒；第二阶段，95℃扩增15秒，60℃扩增30秒，循环35次。

进一步地，所述质控标准为同时满足阳性质控和阴性质控，实验有效，否则无效，其中：所述阴性质控为：FAM通道Cq值大于或等于35或0或未检测到；所述阳性质控为：FAM通道Cq值小于35且有典型S型扩增曲线。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明具有良好的DNA提取效果，操作简单、耗时短(1小时内)，结果准确可靠，最低可检出单条线虫，具有灵敏度高和特异性强的特点。

2.本发明还可以对拟松材线虫进行检测，满足了实际应用中对拟松材线虫快速鉴定的需要。

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附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1是本发明的松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测方法的工艺流程图。

图2是本发明的松材或拟松材线虫的扩增子序列比对图。

图3是本发明实施例1及实施例2中松材线虫及拟松材线虫的荧光定量PCR检测技术灵敏度示意图，其中，3-1为松材线虫的灵敏度示意图，3-2为拟松材线虫的灵敏度示意图。

图4是本发明松材线虫或拟松材线虫的荧光定量PCR检测技术特异性示意图，其中，4-1为松材线虫的特异性示意图，4-2为拟松材线虫的特异性示意图。

图5是实施例1及实施例2中松材线虫及拟松材线虫的荧光定量PCR检测技术动态线性范围示意图，其中，5-1为松材线虫的动态线性范围示意图，5-2为拟松材线虫的动态线性范围示意图。

图6是CN104673926公开的PCR检测技术灵敏度示意图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，并不用以限制本发明，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例提供一种松材线虫的荧光定量PCR检测方法，采用的试剂盒包括松材线虫荧光定量PCR检测引物、探针一和其他试剂一。其中，松材线虫荧光定量PCR检测引物包括PCR扩增引物一；所述PCR扩增引物一包括PCR扩增上游引物一，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(5’-GTTCCGCCTACTGATGGTTC-3’)，以及PCR扩增下游引物一，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示(5’-CGGGCTTTTCAATCCTACGC-3’)。探针一为Taqman水解探针，其核苷酸序列如SEQID NO:3所示(5’-FAM-TGGAAGCCGAGAGGCGACCGTGCAACGGTG-BHQ-3’)。其他试剂一包括DNA提取试剂一，所述DNA提取试剂一包括十二烷基硫酸钠、pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇，并且在所述DNA提取试剂一中各成分的浓度为：十二烷基硫酸钠2％，pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液1M、乙二胺四乙酸0.5M、二硫苏糖醇0.2M。所述DNA提取试剂一还包括1mg/ml的蛋白酶K。其他试剂一还包括阳性对照品一和阴性对照品一。该检测方法包括以下步骤：其工艺流程如图1所示。

(1)原材料准备：

1)十二烷基硫酸钠：生化试剂级，纯度≥97％，pH(10％；H2O)7.0-10.5(25℃)，水分≤1％，熔点206℃，杂质最高含量合格；

2)三羟甲基氨基甲烷：分析纯，含量99.7％，红外合格，pH(5％；H2O)10.3-10.9，水份0.3，熔点167-171℃，吸收系统合格，杂质最高含量合格；

3)二胺四乙酸：白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不低于99.5％，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高峰含量合格；

4)盐酸：分析纯；

5)二硫苏糖醇：水中最大溶解度为50mg/mL，纯度>99％；

6)PCR级超纯水：纯净水，经纯水机处理，电阻率18.2MΩ，经120℃高压灭菌；

7)合成的引物和探针。图2提供了松材或拟松材线虫的扩增子序列比对图。在GeneBank中将若干具代表性的松材线虫和拟松材线虫ITS基因序列进行比对，将松材线虫和拟松材线虫出现明显核苷酸碱基差异的区域作为各自靶基因序列设计引物和探针，可确保检测无任何交叉干扰，确保了双重反应的准确性，是最佳的设计方案。用于PCR反应的上下游引物，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，于-20℃保存；荧光探针，在寡核苷酸5’端标记FAM，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在FAM荧光素的激发波长494nm处有吸收峰，于-20℃保存。

引物和探针的稀释：取出合成的引物和探针，在高速离心机上于12000g/min离心2分钟，向管中加入适量的超纯水稀释引物探针浓度至10μM，在涡旋振荡器上振荡混匀，后瞬时离心。

8)蛋白酶K：≥350活性单位/ml，在37℃，pH7.5的条件下，一分钟内生成相当于1μM络氨酸的folin positive amino acid所需的酶量定义为一个活性单位U；使用纯水将其稀释为1mg/ml的工作浓度。

9)DNA提取试剂一：按十二烷基硫酸钠2％、1M三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.0)、0.5M乙二胺四乙酸、0.2M二硫苏糖醇浓度配制成提取试剂，充分混匀后4℃保存。

10)阳性对照品：含有1.0E+06copies/ml～1.0E+07copies/ml含目的片段质粒DNA，经紫外分光光度计精确定量的含有目的片段的高浓度质粒，使用TE缓冲液以10倍梯度稀释至1.0E+06copies/ml～1.0E+07copies/ml。

11)阴性对照品：PCR级超纯水，纯净水，经纯水机处理，电阻率18.2MΩ，经120℃高压灭菌。

(2)取2XPCR反应预混液与松材线虫引物探针混合液按照体积比为5:1进行预混并分装于PCR反应管待用，于4℃避光保存。2X预混PCR反应液为市售产品，主要包含Ex TaqHS、dNTP混合物、Mg²⁺离子、Tli RNaseH等。

(3)取20μl的线虫分离液装入1.5ml螺盖离心管，加入预冷的20μl DNA提取试剂一，再加入2μl蛋白酶K，混匀后于65℃加热30min后于95℃加热5min，12000g离心3分钟，保留DNA提取上清液。

(4)将DNA提取上清液、相应的阳性对照品及阴性对照品与步骤一中的反应液混合，按10μl每管的体积分装PCR反应管，盖好管盖后瞬时离心；进行荧光定量PCR扩增和信号检测；所述荧光定量PCR扩增的循环参数为：第一阶段，95℃扩增30秒；第二阶段，95℃扩增15秒，60℃扩增30秒，循环35次。

(5)根据相应的质控标准、Cq值判读标准分析检测结果；所述质控标准为同时满足阳性质控和阴性质控，实验有效，否则无效，其中：所述阴性质控为：FAM通道Cq值大于或等于35或0或未检测到；所述阳性质控为：FAM通道Cq值小于35且有典型S型扩增曲线。

松材线虫PCR反应液的配方如下表1所示。

表1

序号	组分	使用浓度	体积(ul)
				1	2X PCR预混液	/	5
2	松材线虫ITS上游引物	10uM	0.25
				3	松材线虫ITS下游引物	10uM	0.25
4	松材线虫ITS探针	10uM	0.5

本实施例的结果分析：

1.结果分析条件设定

ABI Step One基线设定：取2到最小Cq值前3个循环值作为基线，阈值线设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，即阴性对照的Cq＝35或0或“Undet”。

2.质控标准：

阴性质控：FAM通道Cq值大于或等于35或0或未检测到；

阳性质控：FAM通道Cq值小于35且有典型S型扩增曲线；

3.结果判读：

不含松材或拟松材线虫：FAM通道Cq＝35或0或“Undet”

含松材线虫：FAM通道Cq值小于35且有典型S型扩增曲线；

反应无效：对照品数据失控。

另外，本实施例对上述方法的检测下限、特异性、动态线性范围、适用机型、精密度及方法学比对进行了性能评估，包含以下内容：

1.松材线虫DNA参考品的制备：取松材线虫标准样(国家林业和草原局林草防治总站研究中心提供)提取基因组DNA，使用核酸定量分析仪进行核酸浓度测定，然后通过公式(I)将基因组DNA浓度单位转换成X copy/ml。最后使用基质(线虫分离液)将其稀释成为1.0E+08copies/ml。

Copy/μl＝ng/μl÷(MW×660)×6.02×10¹⁴，(I)

2.检测下限验证：将松材线虫DNA参考品作为初始样本，使用基质分别梯度稀释至400copies/ml、300copies/ml、200copies/ml、100copies/ml，50copies/ml，然后用三个批次的试剂进行测试，测试仪器为ABI StepOne荧光定量PCR仪；每个不同来源的样本每个浓度各检测5次，每个浓度总计检测20次。设定检测限的可接受标准为：将具有95％以上阳性检出率的松材线虫DNA水平作为检测限。测试数据如表1所示：

表1检测限测试数据

试验结果表明，本试验测试的400-50copies/ml这四个浓度松材线虫DNA样本，除50copies/ml浓度阳性检出率小于95％不符合设定要求外，试剂盒的阳性检出率都为100％，因此，根据试验结果，最终将本试剂盒的定量限定为100copies/ml。

3.特异性验证：评估试剂盒对于松材线虫种属相近、感染部位相同或感染症状相似的病毒样本的检测反应。本研究选取拟松材线虫、伞滑刃线虫、长尾线虫、松毛虫、油松、天牛等样品(国家林业和草原局林草防治总站研究中心提供)，提取上述样品的基因组DNA，取其中2ul添加到18ul线虫分离液中制备成待测样本，使用三个批次的试剂盒(20190201，20190202，20190203)，在ABI StepOne荧光定量PCR仪上进行检测，最后统计阴阳性检出率。设定检测限的可接受标准为：上述样品检测结果均为阴性。测试数据如表2所示：

表2特异性测试数据

批号

拟松材线虫

伞滑刃线虫

长尾线虫

松毛虫

油松

天牛

20190201

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

20190202

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

20190203

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

本试剂盒对上述样品均没有检出阳性结果，表明本试剂盒的对上述样品具有特异性。

4.线性范围验证：将松材线虫DNA参考品作为初始样本，使用线虫分离液分别梯度稀释至1.0E+07copies/ml，1.0E+06copies/ml，1.0E+05copies/ml，1.0E+04copies/ml，1.0E+03copies/ml，1.0E+02copies/ml，1.0E+01copies/ml，样本分别标记为S1-S7。然后按照试剂盒说明书用ABI StepOne荧光定量PCR仪进行检测，每个样本重复测试3次，在ABIStepOne荧光定量PCR仪上进行检测。最后根据数据精密度检验后，进行多项式回归分析，其直线回归方程：Y＝b0+b1X。设定线性范围的可接受标准为：批内样本检测Ct值变异系数(CV，％)≤5％且要求线性相关系数(r)>0.98。测试数据如表3～6所示：

表3样本测试CT均值(重复一次)

表4样本测试CT均值(重复二次)

表5样本测试CT均值(重复三次)

表6线性分析：

试验结果表明，对于1.00E+07～1.00E+01copies/ml范围的样本，低值样本1.00E+01copies/ml由于精密度已经偏离(CV，％)≤5％的要求，线性相关系数均满足要求，因此将1.00E+01copies/ml排除在符合线性标准之外。因此，本试剂盒的线性范围确定为1.00E+07～1.00E+02IU/ml。

5.适用机型验证：按照上述线性范围的验证方法在不同品牌荧光定量检测仪器(ABI StepOne、Bio-Rad CFX96)进行测试，以验证不同机型检测性能的差异，设定线性范围的可接受标准为：要求线性相关系数(r)>0.98，测试数据如7～8所示：

表7 ABI StepOne荧光定量PCR仪

表8 Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪

表7和表8的数据表明，不同机型检测性能无明显差异。

6.精密度验证：取松材线虫DNA参考品，使用线虫分离液分别稀释为强阳性对照品Q1(1.0E+06copies/ml)、弱阳性对照品Q2(1.0E+04copies/ml)、临界阳性质控品Q3(1.0E+02copies/ml)和阴性质控品Q4。上述样品作为精密度考察的测试样品，精密度样本考察总计27天，每个批次使用不同的机型共测试九天。每个样本重复测试20次，每天安排2人进行两次测试，最终统计各个质控品的批内和批间的精密度。设定精密度的可接受标准为：阴性对照品Q4未检出率为100％；临界阳性对照品Q3阳性检出率应高于95％；弱阳性对照品Q2：首先检测结果应符合弱阳性的定值范围，其次阳性检出率为100％，同时批内浓度对数变异系数(CV)≤5.0％，批间浓度对数变异系数(CV)＜15.0％。强阳性对照品Q1：首先检测结果应符合强阳性的定值范围，其次强阳性检出率为100％，同时批内浓度对数变异系数(CV)≤5.0％。测试数据如表9～11所示。

表9阳性对照品Q1测试结果

表10阳性对照品Q2测试结果

表11临界阳性对照品Q3和阴性对照品Q4测试结果

精密度试验结果表明，三种机型的精密度比较一致，精密度批内的变异系数全都≤5％，批间的变异系数<15％，达到试剂盒的精密度设计要求。

7.方法学比对：将本实施例的试剂盒与国内普遍认为质量较好的同类试剂盒进行比对，通过分析两种不同试剂盒间的相关性，来了解本试剂盒与参比试剂方法间的一致性。以南京生兴公司的松材线虫DNA检测试剂盒作为参比试剂，同时检测20例线虫分离液样本(国家林业和草原局林草防治总站研究中心提供)，在ABI StepOne荧光定量PCR仪上进行检测。最后统计阴阳性符合率。设定方法学比对的可接受标准为：阴阳性符合率为100％。测试数据如表12～13所示。

表12初始检测数据

表13阴/阳性符合率检测结果：

项目	阴性	阳性
			南京生兴生物	4	16
本发明	4	16
			阴/阳性符合率	100％	100％

表12和13的试验结果表明，参比试剂和本发明的阴阳性符合率为100％，一致性良好。

此外，图2～5还给出了本实施例的松材线虫和拟松材线虫的扩增子序列对比图、荧光定量PCR检测技术灵敏度示意图、特异性示意图和动态线性范围示意图。其中扩增子序列对比图显示了松材线虫和拟松材线虫的ITS序列存在差异的一些区域，本发明期望获得松材线虫和拟松材线虫的双通道检测技术，并且未从本领域常规思路出发(本领域常规设计PCR引物的思路是从目标物的功能基因着手)，而是选择了ITS基因序列进行引物和探针的设计，旨在探寻将ITS基因作为靶基因能否产生和功能基因相同乃至更好的检测效果。图3～5说明本实施例荧光定量PCR检测松材线虫的灵敏度、特异性和动态线性范围均较好。同时，本发明的检测时间较短，整体耗时低于60分钟。

实施例2

本实施例提供一种拟松材线虫的荧光定量PCR检测方法，采用的试剂盒包括拟松材线虫荧光定量PCR检测引物、探针二和其他试剂二。其中，拟松材线虫荧光定量PCR检测引物包括PCR扩增引物二；所述PCR扩增引物二包括PCR扩增上游引物二，其核苷酸序列如SEQID NO:4所示(5’-TTCTACGCACTGTTTGTCCG-3’)，以及PCR扩增下游引物二，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示(5’-TTCACGACGAAGCTCAACAA-3’)。探针二为Taqman水解探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示(5’-FAM-CGAGTACGAAAGGGCTTCGGCTCGATTGTG-BHQ-3’)。其他试剂二包括DNA提取试剂二，所述DNA提取试剂二同实施例1的DNA提取试剂一。其他试剂二还包括阳性对照品一和阴性对照品一。该检测方法包括以下步骤：

(1)原材料准备：

1)十二烷基硫酸钠：同实施例1；

2)三羟甲基氨基甲烷：同实施例1；

3)二胺四乙酸：同实施例1；

4)盐酸：同实施例1；

5)二硫苏糖醇：同实施例1；

6)PCR级超纯水：同实施例1；

7)合成的引物和探针。图2提供了拟松材线虫的扩增子序列比对图。在GeneBank中将若干具代表性的松材线虫和拟松材线虫ITS基因序列进行比对，将松材线虫和拟松材线虫出现明显核苷酸碱基差异的区域作为各自靶基因序列设计引物和探针，可确保检测无任何交叉干扰，确保了双重反应的准确性，是最佳的设计方案。用于PCR反应的上下游引物，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，于-20℃保存；荧光探针，在寡核苷酸5’端标记FAM，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在FAM荧光素的激发波长494nm处有吸收峰，于-20℃保存。

引物和探针的稀释同实施例1。

8)蛋白酶K：同实施例1。

9)DNA提取试剂二：同实施例1。

10)阳性对照品：含有1.0E+06copies/ml～1.0E+07copies/ml含目的片段质粒DNA，经紫外分光光度计精确定量的含有目的片段的高浓度质粒，使用TE缓冲液以10倍梯度稀释至1.0E+06copies/ml～1.0E+07copies/ml。

11)阴性对照品：同实施例1。

(2)取2XPCR反应预混液与拟松材线虫引物探针混合液按照体积比为5:1进行预混并分装于PCR反应管待用，于4℃避光保存。2X预混PCR反应液为市售产品，主要包含Ex TaqHS、dNTP混合物、Mg²⁺离子、Tli RNaseH等。

(3)取20μl的线虫分离液装入1.5ml螺盖离心管，加入预冷的20μl DNA提取试剂一，再加入2μl蛋白酶K，混匀后于65℃加热25min后于95℃加热5min，12000g离心3分钟，保留DNA提取上清液。

(4)将DNA提取上清液、相应的阳性对照品及阴性对照品与步骤一中的反应液混合，按10μl每管的体积分装PCR反应管，盖好管盖后瞬时离心；进行荧光定量PCR扩增和信号检测；所述荧光定量PCR扩增的循环参数为：第一阶段，95℃扩增30秒；第二阶段，95℃扩增15秒，60℃扩增30秒，循环35次。

(5)根据相应的质控标准、Cq值判读标准分析检测结果；所述质控标准为同时满足阳性质控和阴性质控，实验有效，否则无效，其中：所述阴性质控为：FAM通道Cq值大于或等于35或0或未检测到；所述阳性质控为：FAM通道Cq值小于35且有典型S型扩增曲线。

拟松材线虫PCR反应液的配方如下表14所示。

表14

序号	组分	使用浓度	体积(ul)
				1	2X PCR预混液	/	5
2	拟松材线虫ITS上游引物	10uM	0.25
				3	拟松材线虫ITS下游引物	10uM	0.25
4	拟松材线虫ITS探针	10uM	0.5

本实施例的结果分析：同实施例1

另外，本实施例对上述方法的检测下限、特异性、动态线性范围、适用机型、精密度及方法学比对进行了性能评估，包含以下内容：

1.拟松材线虫DNA参考品的制备：采用拟松材线虫标准样(国家林业和草原局林草防治总站研究中心提供)，具体过程同实施例1。

2.检测下限验证：具体过程同实施例1。设定检测限的可接受标准为：将具有95％以上阳性检出率的拟松材线虫DNA水平作为检测限。测试数据如表15所示：

表15检测限测试数据

试验结果表明，本试验测试的400-50copies/ml这四个浓度拟松材线虫DNA样本，除50copies/ml浓度阳性检出率小于95％不符合设定要求外，试剂盒的阳性检出率都为100％，因此，根据试验结果，最终将本试剂盒的定量限定为100copies/ml。

3.特异性验证：评估试剂盒对于拟松材线虫种属相近、感染部位相同或感染症状相似的病毒样本的检测反应。本研究选取松材线虫、伞滑刃线虫、长尾线虫、松毛虫、油松、天牛等样品(国家林业和草原局林草防治总站研究中心提供)，提取上述样品的基因组DNA，取其中2ul添加到18ul线虫分离液中制备成待测样本，使用三个批次的试剂盒(20190201，20190202，20190203)，在ABI StepOne荧光定量PCR仪上进行检测，最后统计阴阳性检出率。设定检测限的可接受标准为：上述样品检测结果均为阴性。测试数据如表16所示：

表16特异性测试数据

批号

松材线虫

伞滑刃线虫

长尾线虫

松毛虫

油松

天牛

20190201

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

20190202

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

20190203

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

阴性

本试剂盒对上述样品均没有检出阳性结果，表明本试剂盒的对上述样品具有特异性。

4.线性范围验证：将拟松材线虫DNA参考品作为初始样本，具体过程同实施例1。测试数据如表17～20所示：

表17样本测试CT均值(重复一次)

表18样本测试CT均值(重复二次)

表19样本测试CT均值(重复三次)

表20线性分析：

试验结果表明，对于1.00E+07～1.00E+01copies/ml范围的样本，低值样本1.00E+01copies/ml由于精密度已经偏离(CV,％)≤5％的要求，线性相关系数均满足要求，因此将1.00E+01copies/ml排除在符合线性标准之外。因此，本试剂盒的线性范围确定为1.00E+07～1.00E+02IU/ml。

5.适用机型验证：按照上述线性范围的验证方法在不同品牌荧光定量检测仪器(ABI StepOne、Bio-Rad CFX96)进行测试，以验证不同机型检测性能的差异，设定线性范围的可接受标准为：要求线性相关系数(r)>0.98，测试数据如21～22所示：

表21 ABI StepOne荧光定量PCR仪

表22 Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪

表21和22的数据表明，不同机型检测性能无明显差异。

6.精密度验证：取拟松材线虫DNA参考品，使用线虫分离液分别稀释为强阳性对照品Q1(1.0E+06copies/ml)、弱阳性对照品Q2(1.0E+04copies/ml)、临界阳性质控品Q3(1.0E+02copies/ml)和阴性质控品Q4。具体过程及设定精密度的可接受标准同实施例1。测试数据如表23～25所示：

表23阳性对照品Q1测试结果

表24阳性对照品Q2测试结果

表25临界阳性对照品Q3和阴性对照品Q4测试结果

精密度试验结果表明，三种机型的精密度比较一致，精密度批内的变异系数全都≤5％，批间的变异系数<15％，达到试剂盒的精密度设计要求。

7.方法学比对：在现有技术中，还未出现拟松材线虫的商业化PCR检测技术，因此将本实施例的试剂盒与目前实验室的金标准拟松材线虫形态学鉴定进行比较，通过分析两种不同方法，来了解本试剂盒与金标准方法间的一致性。以经过国家林业和草原局林草防治总站研究中心形态学鉴定的，同时检测10例线虫分离液样本(国家林业和草原局林草防治总站研究中心提供)，在ABI StepOne荧光定量PCR仪上进行检测。最后统计阴阳性符合率。设定方法学比对的可接受标准为：阴阳性符合率为100％。

测试数据如表26和27所示。

表26初始检测数据

样本	形态学鉴定	本发明
			样本1	含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阳性
样本2	含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阳性
			样本3	含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阳性
样本4	含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阳性
			样本5	含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阳性
样本6	不含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阴性
			样本7	含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阳性
样本8	含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阳性
			样本9	含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阳性
样本10	含拟松材线虫	拟松材线虫DNA阳性

表27阴/阳性符合率检测结果：

项目	阴性	阳性
			形态学鉴定	1	9
本发明	1	9
			阴/阳性符合率	100％	100％

表26和27的试验结果表明，金标准方法和本发明的阴阳性符合率为100％，一致性良好。

此外，图2～5还给出了本实施例的松材线虫和拟松材线虫的扩增子序列对比图、荧光定量PCR检测技术灵敏度示意图、特异性示意图和动态线性范围示意图。其中扩增子序列对比图显示了松材线虫和拟松材线虫的ITS序列存在差异的一些区域，本发明期望获得松材线虫和拟松材线虫的双通道检测技术，并且未从本领域常规思路出发(本领域常规设计PCR引物的思路是从目标物的功能基因着手)，而是选择了ITS基因序列进行引物和探针的设计，旨在探寻将ITS基因作为靶基因能否产生和功能基因相同乃至更好的检测效果。图3～5说明本实施例荧光定量PCR检测松材线虫的灵敏度、特异性和动态线性范围均较好。同时，本发明的检测时间较短，整体耗时低于60分钟。

对比例1

CN104673926公开了松材线虫PCR检测试剂盒及其检测方法，但其检测的松材线虫基因组DNA靶基因为松材线虫外毒素A基因，这是目前比较常规的设计引物和探针的方式。而本发明中检测的松材线虫基因组DNA靶基因为ITS序列。此外，申请人还考察了该专利和本发明对于灵敏度及动态范围的验证结果，CN104673926(图6)与本发明(图3和5)公开出来的数据如下：

从阳性信号的扩增循环数可以看出，比较动态范围的宽度和最低检出的循环数大小，本发明明显均优于CN104673926；本发明在样本类型上支持线虫分离液，相较于CN104673926采用棉拭子，取样误差比较小。

综上，本方法具有以下特点：DNA提取效果好；具有很高的灵敏度、特异性及较宽的动态线性范围；操作简单，无需电泳，耗时短(少于60分钟)；可快速鉴定拟松材线虫。因此，本发明检测松材及拟松材线虫明显优于传统形态学鉴定以及现有的荧光定量PCR检测技术，适用于松材线虫感染的鉴定。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 公司名称：沈阳知物检测技术有限公司 国家林业和草原局森林和草原病虫害防治总站 辽宁省林业发展服务中心 沈阳工学院

<120> 一种松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测引物、试剂盒及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttccgccta ctgatggttc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggcttttc aatcctacgc 20

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggaagccga gaggcgaccg tgcaacggtg 30

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttctacgcac tgtttgtccg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttcacgacga agctcaacaa 20

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgagtacgaa agggcttcgg ctcgattgtg 30

Claims (10)

1.一种松材线虫的荧光定量PCR检测引物，其特征在于，包括PCR扩增引物一；所述PCR扩增引物一包括PCR扩增上游引物一，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示(5’-GTTCCGCCTACTGATGGTTC-3’)，以及PCR扩增下游引物一，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(5’-CGGGCTTTTCAATCCTACGC-3’)。

2.一种松材线虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物、探针一和其他试剂一。

3.如权利要求2所述的一种松材线虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针一为Taqman水解探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示(5’-FAM-TGGAAGCCGAGAGGCGACCGTGCAACGGTG-BHQ-3’)。

4.如权利要求2所述的一种松材线虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述其他试剂一包括DNA提取试剂一，所述DNA提取试剂一包括十二烷基硫酸钠、pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液、乙二胺四乙酸、二硫苏糖醇，并且在所述DNA提取试剂一中各成分的浓度为：十二烷基硫酸钠1～3％，pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液1～2M、乙二胺四乙酸0.1～1M、二硫苏糖醇0.1～0.3M。

5.一种拟松材线虫的荧光定量PCR检测引物，其特征在于，包括PCR扩增引物二；所述PCR扩增引物二包括PCR扩增上游引物二，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示(5’-TTCTACGCACTGTTTGTCCG-3’)，以及PCR扩增下游引物二，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示(5’-TTCACGACGAAGCTCAACAA-3’)。

6.一种拟松材线虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述的检测引物、探针二和其他试剂二。

7.如权利要求6所述的一种拟松材线虫的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述探针二为Taqman水解探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示(5’-FAM-CGAGTACGAAAGGGCTTCGGCTCGATTGTG-BHQ-3’)。

8.一种松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：采用的是权利要求2所述的松材线虫荧光定量PCR检测试剂盒或者权利要求6所述的拟松材线虫荧光定量PCR检测试剂盒，该检测方法包括以下步骤：

步骤一，取PCR反应预混液与松材线虫或拟松材线虫引物探针混合液进行预混；

步骤二，在松材线虫或者拟松材线虫分离液中加入DNA提取试剂一或者DNA提取试剂二，混匀后于60～65℃加热30min后于95℃加热5min，12000g离心3分钟，保留DNA提取上清液；

步骤三，将DNA提取上清液、相应的阳性对照品及阴性对照品与步骤一中的反应液混合，进行荧光定量PCR扩增和信号检测；

步骤四，根据相应的质控标准、Cq值判读标准分析检测结果。

9.如权利要求8所述的一种松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR扩增的循环参数为：第一阶段，95℃扩增30秒；第二阶段，95℃扩增15秒，60℃扩增30秒，循环35次。

10.如权利要求8所述的一种松材或拟松材线虫的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述质控标准为同时满足阳性质控和阴性质控，实验有效，否则无效，其中：所述阴性质控为：FAM通道Cq值大于或等于35或0或未检测到；所述阳性质控为：FAM通道Cq值小于35且有典型S型扩增曲线。

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