CN111826448A

CN111826448A - 用于松材线虫鉴定的引物对探针组合产品、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111826448A
Application number: CN201910301395.1A
Authority: CN
Inventors: 陈凤毛; 胡振新; 郜安国; 谭卓
Original assignee: Suzhou Clickgene Biotechnology Co ltd; Nanjing Forestry University
Current assignee: Suzhou Clickgene Biotechnology Co ltd; Nanjing Forestry University
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2020-10-27

Abstract

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体而言，涉及一种用于松材线虫鉴定的引物对探针组合产品、试剂盒及方法。该组合产品里包括用于扩增松材线虫ITS基因部分序列的上下游引物，以及检测探针。本发明所提供的引物对探针组合产品检测特异性强、准确率高，且可以结合特定的扩增体系在常温下进行反应，能够实现快速、准确、低成本地检测松材线虫。

Description

用于松材线虫鉴定的引物对探针组合产品、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体而言，涉及一种用于松材线虫鉴定的引物对探针组合产品、试剂盒及方法。

背景技术

松材线虫病(Pine wilt disease)，又被称为松树萎蔫病、枯萎病，是一种毁灭性虫害。松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起，主要通过墨天牛属(Monochamus)昆虫进行自然传播或通过病木、病木加工木的运输进行长距离传播。林区内松材线虫的传播媒介主要是松墨天牛，被松材线虫感染后，松树针叶变成黄褐色或红褐色，萎蔫下垂，树脂分泌停止，病树整株干枯死亡，最终腐烂。

线虫种类常规鉴定的标准方法为形态学鉴定，形态学主要依据成虫的形态特征对松材线虫进行鉴定。但是，对非专业人员而言，通过形态学准确鉴定松材线虫成虫相当困难，且形态学无法对幼虫进行准确鉴定。

由于形态学方法鉴定松材线虫的限制，分子生物学方法被应用到松材线虫的鉴定上。分子生物学技术的引入，克服了形态学鉴定的限制，实现准确、快速的鉴定。松材线虫分子检测技术的开发，有利于及时发现早期疫点，有效控制松材线虫病发生范围，减少松材线虫病的发生，同时为松材线虫病的总体预警与控制策略提供依据。

目前，对松材线虫的检测与鉴定以分子生物学的方法为主。其中，RAPD技术在区分松材线虫与近似种上效果较差；RFLP技术可以区分松材线虫和拟松材线虫，但内切酶价格昂贵、耗时较长；PCR技术及荧光PCR技术可以灵敏、快速检测并鉴定松材线虫，但需要配备昂贵的仪器，且耗时较长。

中国专利《环介导等温扩增反应检测松材线虫的方法》(公开号：CN 107043820 A，公开日：2017年08月15日)公布了一种环介导等温扩增检测松材线虫的方法，该方法扩增温度为65℃左右，易造成污染，该方法用SYBR GreenⅠ进行荧光定量检测，但SYBR GreenⅠ对核酸的结合不具有特异性，因此不能很好地区分非特异扩增。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种引物对探针组合产品，所述引物对选自a)-c)所组成的组：

a)包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和2所示的上游引物和下游引物；

b)包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和6所示的上游引物和下游引物；

c)包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7和8所示的上游引物和下游引物；

所述探针为：5’-SEQ ID NO：3/标记有荧光发射基团的dT/g/idSp/g/标记有淬灭基团的dT/SEQ ID NO：4-间臂修饰-3'。

本发明的引物组序列可以是这样得到的：从NCBI中下载松材线虫基因组的ITS基因序列，通过oligo7软件设计引物，通过凝胶电泳筛选得到最适引物。筛选标准：引物灵敏度至少到质粒8(10-⁶ng/μL)、副反应尽量少。筛选好引物后，以上下游引物中间的序列设计一条探针，要求是二级结构少。

本发明所提供的引物对探针组合产品检测特异性强、准确率高，且可以结合特定的扩增体系在常温下进行反应，能够实现快速、准确、低成本地检测松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的组合产品。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种鉴定松材线虫的方法，包括：

以松材线虫基因组DNA为模板，使用如上所述的组合产品或如上所述的试剂盒对所述模板进行扩增；

若在扩增时，能够检测到所述探针的荧光信号增加，则判断为阳性结果；反之则为阴性结果。

本发明中核酸扩增产物可以不进行开盖操作，降低了污染的风险。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的方法在区分松材线虫和拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中的检测时间-荧光信号图；①为阳性结果，②为阴性结果；

图2为本发明一个实施例中的三对引物在两种浓度线虫液下的检测时间-荧光信号图。

具体实施方式

其中，“idSp”指碱基缺失，即脱碱基核酸。

所述引物对和探针可以根据本领域的现有技术合成，也可以委托专业的公司制备。

在一些实施方式中，所述间臂修饰选自乙二醇、C9间臂(Spacer 9)、C18间臂(Spacer 18)、双脱氧间臂[1’,2’-Dideoxyribose(dSpacer)]、C3间臂(C3 Spacer)中的任一种。

在一些实施方式中，所述间臂修饰选自C3间臂。

间臂(Spacer)可为寡核苷酸标记提供必要的间隔以减少标记基团与寡核苷酸间的相互作用，主要应用于DNA发夹结构和双链结构研究。C3 spacer主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。3'-Spacer C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。

在一些实施方式中，所荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、TexasRed、TFAM、SYBR Green I、VIC或JOE中的任一种；

在一些实施方式中，所荧光发射基团选自FAM；

在一些实施方式中，所荧光发射基团选自6-FAM；

在一些实施方式中，所淬灭基团选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse或NFQ-MGB中的任一种；

在一些实施方式中，所荧光发射基团选自BHQ；

在一些实施方式中，所荧光发射基团选自BHQ1。

在一些实施方式中，还包括下列a)-e)试剂中的至少一种：

a)用于常温扩增技术的扩增缓冲液；

b)用于常温扩增技术的反应试剂：选自DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、ATP再生蛋白、DNA限制性内切酶、辅助蛋白、磷酸肌酸钠、ATP、dNTP、pH8.0的Tris-Ac、海藻糖以及KAc中的至少一种；

c)阳性对照品；

d)水；以及

e)核酸提取试剂。

在一些实施方式中，所述常温扩增技术的扩增缓冲液以每80ml计，包含0.1-2M的MgAc₂ 2～2.5ml、0.1-2M的KAc 2.2～2.6ml、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 6～10ml以及1％-50％的PEG8K 20～30ml，pH＝7.8～8.2。

在一些实施方式中，所述常温扩增技术的扩增缓冲液以每80ml计，包含0.1-2M的MgAc₂ 2.24ml、0.1-2M的KAc 2.4ml、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac8ml以及1％-50％的PEG8K24ml，pH＝7.8～8.2。

在一些实施方式中，所述常温扩增技术的扩增缓冲液的溶剂为水。

在一些实施方式中，所述水为无核酸酶的水，例如双蒸水或去离子水。水为反渗水(Reverse osmosis Water)、蒸馏水(Distilled Water)、去离子水(Deionized Water)、反渗水(Reverse osmosis Water)。

水可以作为溶液体系的溶剂，也可以作为阴性对照使用。

在一些实施方式中，所述引物和/或所述探针与所述主反应试剂混合包装在一起。

在一些实施方式中，所述用于常温扩增技术的反应试剂，每4ml中含有120-150ng/ul DNA解旋酶200μL、400-450ng/ul单链DNA结合蛋白240μL、90-100ng/ul DNA聚合酶96μL、5-10ng/ul ATP再生蛋白80μL、15-20ng/ulDNA限制性内切酶200μL、15-20ng/ul辅助蛋白60μL、1M磷酸肌酸钠115μL、80-100mM ATP 115μL、25mM dNTP 20μL、1-2M pH8.0的Tris-Ac40ul、2-5％海藻糖8μL、KAc 0.02g；

如果将探针、引物和反应试剂一起包装的话，则还含有100μM上游引物6μL、100μM下游引物6μL、10μM探针10μL。

在一些实施方式中，所述反应试剂为冻干试剂。

本发明中反应试剂经过冻干处理，可常温运输，免去了低温保存、冷链运输的设备要求。

本发明操作简单，仅需加入扩增缓冲液和松材线虫核酸即可进行扩增，无需复杂配液操作。

在一些实施方式中，所述扩增的温度为37-45℃，也可以选择38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃。

本发明中核酸扩增条件为37℃到45℃，对温度要求低，对设备要求低。

在一些实施方式中，所述扩增的时间为10-30分钟。

本发明的检测方法反应时间短，仅需30分钟以内，结果报告清晰明了。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的方法在区分松材线虫和拟松材线虫中的应用。

本发明使用常温核酸扩增技术，通过DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下，10-30分钟内使目的DNA扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检DNA的快速检定。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1松材线虫核酸的快速检测

采用松材线虫核酸快速检测试剂进行松材线虫的快速检测。所述松材线虫核酸快速检测试剂包括：

1.复溶液：每80ml含有：

2.含引物的主反应试剂4ml；

其中，引物对及探针的序列如下：

所述上游引物是：5’-ttaaactcgagcagaaacgccgacttg-3’；

所述下游引物是：5’-ctccaaacattctcatccgaacgtccct-3；

所述探针是：ccctctcgccccgcacggacaaacag/i6-FAMdT/g/idSp/g/iBHQ1dT/agaagatattggtc(3’C3Spacer)。

阴性对照品为水。

阳性对照品为含目的基因序列的质粒干粉，按说明书溶解后浓度是0.5pg/μL，所述目的基因序列是指松材线虫基因组ITS基因序列。

松材线虫核酸快速检测步骤如下：

(1)取10μL松材线虫核酸提取液，加入到主反应试剂中；

(2)取10μL复溶液加入主反应试剂中，颠倒混匀3次，充分复溶；

(3)将复溶的主反应试剂管放入核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次；采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；

(4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果

检测结果如图1，①具有典型“S”型，为阳性结果，②为水平线，不具有典型“S”型特征，为阴性结果。

按上述方法重复实验并验证SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8三对引物的检测效果。将三对引物分别按照如上的生产规程配置反应试剂，取两种浓度线虫液分别提取，提取后分别用3种主反应试剂检测，检测结果如图2所示，三对引物检测结果无明显差别，其中第一对引物(SEQ ID NO：1和2)扩增效果略好与后两对(SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8)。

实施例2临床样本的检测：

采用松材线虫核酸快速检测试剂进行松材线虫和拟松材线虫的临床样本检测。所述松材线虫核酸快速检测试剂包括：

1、复溶液：每80ml含有：

2、含引物的主反应试剂4ml；

其中，引物对及探针的序列如下：

所述上游引物是：5’-ttaaactcgagcagaaacgccgacttg-3’；

所述下游引物是：5’-ctccaaacattctcatccgaacgtccct-3；

3、阴性对照品为水。

4、阳性对照品为含目的基因序列的质粒干粉，按说明书溶解后浓度是0.5pg/μL，所述目的基因序列是指松材线虫基因组ITS基因序列。

取松材线虫核酸提取液5例，拟松材线虫核酸提取液5例，采用松材线虫核酸快速检测试剂进行快速检测：

(1)取10μL松材线虫核酸提取液，加入主反应试剂；

(2)取10μL复溶液加入主反应试剂中，颠倒3次，充分复溶；

(4)结果分析：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，则判断为阳性结果；反之，则为阴性结果。

结果检出松材线虫的阳性样本5例、阴性样本5例。

同时用两个市售品牌的PCR法检测试剂盒做为对比例，本发明与两个市售品牌的PCR法检测试剂盒检验一致率均为100％。证明本发明灵敏度与特异度与市售产品一致，但是本发明不必进行PCR扩增，因此在耗时及成本上，本发明更具有优势，且本发明更适合于现场处置。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学；苏州点晶生物科技有限公司

<120> 用于松材线虫鉴定的引物对探针组合产品、试剂盒及方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaaactcga gcagaaacgc cgacttg 27

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctccaaacat tctcatccga acgtccct 28

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccctctcgcc ccgcacggac aaacag 26

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaagatatt ggtc 14

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caagtttctg cacgttgtga cagtcgtctc 30

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttcacgacga agctcaacaa accgcagcc 29

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcaatgtta ggcaccatct gttttacgc 29

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacaacactg cccgcaagag cttcacga 28

Claims

1.引物对探针组合产品，其特征在于，所述引物对选自a)-c)所组成的组：

2.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，所述间臂修饰选自乙二醇、C9间臂、C18间臂、双脱氧间臂、C3间臂中的任一种；

优选的，所荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBRGreen I、VIC或JOE中的任一种，优选为FAM，更优选为6-FAM；

优选的，所淬灭基团选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse或NFQ-MGB中的任一种，优选为BHQ，更优选为BHQ1。

3.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的组合产品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括下列a)-e)试剂中的至少一种：

a)用于常温扩增技术的扩增缓冲液；

c)阳性对照品；

d)水；以及

e)核酸提取试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述常温扩增技术的扩增缓冲液以每80ml计，包含0.1-2M的MgAc₂ 2～2.5ml、0.1-2M的KAc 2.2～2.6ml、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 6～10ml以及1％-50％的PEG8K 20～30ml，pH＝7.8～8.2。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和/或所述探针与所述主反应试剂混合包装在一起；

优选的，所述主反应试剂为冻干试剂或液体试剂。

7.鉴定松材线虫的方法，其特征在于，包括：

以松材线虫基因组DNA为模板，使用权利要求1或2所述的组合产品或权利要求3～6任一项所述的试剂盒对所述模板进行扩增；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增的温度为37-45℃。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述扩增的时间为10-30分钟。

10.权利要求7～9任一项所述的方法在区分松材线虫和拟松材线虫中的应用。