KR101628047B1 - 직접 핵산 증폭용 조성물 및 이를 이용한 직접 핵산의 증폭방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 직접 핵산 증폭용 조성물 및 이를 이용한 직접 핵산의 증폭방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 직접 핵산 증폭용 조성물 및 이를 이용한 직접 핵산의 증폭방법에 관한 것이다.

Description

직접 핵산 증폭용 조성물 및 이를 이용한 직접 핵산의 증폭방법{Composition for the direct nucleic acid amplification and nucleic acid amplifying method using the same}
본 발명은 직접 핵산 증폭용 조성물 및 이를 이용한 직접 핵산의 증폭방법에 관한 것이다.
분자생물학적 기법 및 유전체학의 발달로 인하여 방대한 유전체 정보를 활용한 맞춤 의학 시대의 도래와 종래의 진단 기법에서 유전 정보를 이용한 분자 진단 기법은 놀라운 기술적 발전을 거듭하여 수 천 가지 진단 반응 및 여러 수준의 돌연변이들을 동시에 검사할 수 있게 되었다. 일반적인 분자 진단방법은 특정 시료로부터 핵산 정제 과정을 거친 다음 정제된 핵산을 이용하여 핵산 증폭 과정을 통해 이루어 진다. 그러나 핵산 정제 과정은 특수한 장비(예, 원심분리 등)를 사용해야 하는 복잡함과 대량의 시료를 처리하기에는 많은 시간이 필요하고 번거롭기 때문에 신속한 진단을 위해서 방대한 양의 시료를 처리하기에 부적합하다. 물론 최근에 쉽고 빠르고 핵산을 정제할 수 있는 제품 및 핵산 정제를 위한 자동화 장비가 많이 개발되어 있지만 이 또한 어느 정도 이상 시료들을 처리하기에 번거롭기는 마찬가지이다. 그래서 이러한 문제들을 해결하고 신속한 분자진단 실현을 위해서는 핵산 정제 과정없이 시료로부터 직접 핵산 증폭이 가능한 방법이 필요하다.
혈액 시료는 증폭 반응, 특히 PCR에 의해 분석되는 시료로 사용된다. 그러나 혈액 내에 존재하는 다양한 중합효소 억제제들 때문에 혈액을 직접적인 시료로 사용하는 데는 한계가 있다. 혈액 내에 본래부터 고유하게 존재하는 활성 억제제들로는 헴(heme), 면역글로블린 G([Ig G), 염(예컨대, K+ 및 Na+), 담즙염과 혈액 세포에 내재되어 있는 DNA 분해효소와 단백질 분해효소가 있다. 더욱이, EDTA, 헤파린 및 구연산나트륨과 같은 혈액 응고 억제제는 중합 반응, 특히 PCR에 대한 강한 억제작용을 나타낸다.
일반적인 핵산 증폭 버퍼 조건에서는 혈액 및 여러 조직 시료로부터 핵산 정제 과정 없이 직접 핵산증폭을 하면 시료 내에 존재하는 여러 핵산증폭 억제제들에 의해 핵산증폭 반응이 약하거나 거의 일어나지 않는다. 최근에 혈액이나 혈액 조성물과 같은 정제되지 않은 시료로부터 핵산 정제 과정 없이 핵산을 증폭하기 위하여 트레할로스(trehalose), 카르니틴(carnitine), 비이온성 세제(non-ionic detergent) 및 헤파린(heparin)을 첨가하여 직접 핵산 증폭이 가능한 조성물을 제시하고 있다.
상기의 방법들은 혈액 시료를 직접적으로 이용한 중합효소 연쇄반응의 가능성을 제시하고는 있지만, 특별한 전처리 과정이 필요하다거나 직접적 증폭 반응의 실제적인 환경을 반영하지 못하였다.
KR 10-2000-0075140 A, 2000년 12월 15일
본 발명자들은 생물학적 시료를 직접적으로 이용한 핵산 분자의 직접적인 효소 반응을 실시하는 독특한 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였으며, 그 결과, 특정 성분의 종류 및 그 특정 성분의 농도가 생물학적 시료 내 핵산 분자의 정제 없이도 PCR 반응을 가능하게 한다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 직접 핵산 증폭용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 직접 핵산 증폭용 조성물을 생물학적 시료에 직접적으로 적용하는 직접 핵산을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 직접 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 직접 핵산 증폭용 조성물을 생물학적 시료에 직접적으로 적용하는 직접 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, ‘직접 핵산 증폭’이란 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산을 추출 또는 정제와 같은 어떠한 전처리 과정을 거치치 않고 생물학적 시료를 직접 이용하는 증폭 반응을 의미한다.
본 발명에 있어서, ‘증폭 반응’은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 ‘PCR’이라 한다.)을 의미한다.
본 발명에 있어서, ‘PCR’이란, 특정의 DNA 영역을 사이에 둔 2종류의 프라이머와 DNA 중합효소(내열성 DNA 폴리머라아제)를 이용하여 시험관 내에서 반복적인 DNA 합성반응을 통해 특정 DNA 영역을 증폭하는 방법이며, 유전자공학분야에서 일반적으로 이용되고 있는 주지기술을 의미한다.
본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 핵산 증폭용 조성물에 있어서,
상기 조성물은 트리신(tricine) 반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하는 직접 핵산 증폭용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 트리신(tricine) 반응 완충용액은 전형적으로 물에 트리신 염기를 녹이고, HCl를 첨가하여 원하는 pH를 얻어 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 반응 완충용액의 완충성분으로는 트리신(tricine)을 사용할 수 있고, 바람직하게는 트리신 반응 완충용액 특히 pH 8.0 내지 9.0의 반응 완충용액을 사용한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 트리신 반응 완충용액은 통상의 PCR 반응시 이용되는 반응 완충용액의 성분인 트리스(Tris) 사용시 보다 PCR 반응시 안정성을 증대시키고, PCR 반응의 억제요인(inibitor)을 제어하여 PCR 반응이 효율적으로 이루어질 수 있도록 하는 장점이 있다.
보다 상세하게는 혈액 시료를 사용하여 트리스(Tris) 반응 완충용액과 트리신(tricine) 반응 완충용액을 사용하여 PCR을 진행하여 반응 완충용액에 따른 PCR 반응의 효율을 확인하였다. 그 결과 트리스(Tris) 반응 완충용액을 사용했을 때는 혈액 1 ul를 사용했을 경우에만 약하게 타겟 핵산증폭이 되었지만, 트리신(tricine) 반응 완충용액을 사용했을 경우 혈액의 양을 약 5 ul까지 사용하여도 PCR이 진행되어, 우수한 타겟 핵산의 증폭 효과를 확인하였다.
상기의 결과를 통하여 트리신(tricine) 반응 완충용액이 트리스(Tris) 반응 완충용액 보다 혈액의 양이 증가하여도 PCR 반응의 억제요인(inibitor)을 제어하여 PCR 반응이 효율적으로 이루어질 수 있도록 하는 것을 확인하였다. 도 2를 참조한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 dNTPs는 핵산의 증폭 반응 시 GATC 합성을 위해 첨가되는 것으로서, 구아노신, 아데노신, 티미딘, 유리딘 및 시티딘으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 포함할 수 있다.
상기 dNTPs는 최종 반응액을 기준으로 0.05 내지 1.0 mM, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 mM 농도를 포함한다. 만약 농도가 0.05 mM 미만 또는 1.0 mM를 초과할 경우 핵산 증폭반응에 의한 핵산 증폭이 원활하게 수행되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 DNA 중합효소로는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소, Tfl DNA 중합효소, Hot Tub DNA 중합효소, Ultma DNA 중합효소, Pfu DNA 중합효소, Vent DNA 중합효소, Tli DNA 중합효소, Pwo DNA 중합효소 등(이상 제품명)이 그 예로 제시될 수 있으나 본 발명이 이에만 국한되지 않음은 당연하다.
본 발명에 있어 지시약은 전기영동시 DNA의 진행 정도를 가늠하고 젤에 부하 (loading)하기 쉽게 하기위한 구성을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 지시약은 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 페놀 레드(phenol red), 크레졸 레드(cresol red), 쿠마시 블루(coomassie blue), 레마졸 블루(remazol blue), 및 레마졸 바이올엣(Remazol violet)으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 지시약의 최종 농도는 최종 반응액을 기준으로 0.001 내지 0.5%(w/v), 바람직하게는 0.002 내지 0.09%(w/v)를 포함할 수 있다.
만약 지시약의 최종 농도가 0.001%(w/v) 미만으로 포함할 경우 타겟 핵산의 증폭 효율이 미비하며, 0.5%(w/v)를 초과할 경우 오히려 PCR 반응 효율이 낮아지거나 억제되는 문제점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 지시약은 혈액을 직접 사용한 PCR 반응에서 혈액 내에 존재하는 많은 PCR 반응의 근본적인 억제요인(inibitor)을 근본적으로 감소시키고, 비특이적 반응을 제어하여 타겟 핵산의 증폭효율을 개선시켜주는 증진제(enhancer) 역할을 한다.
보다 상세하게는 혈액을 직접 사용한 PCR 반응에서 지시약의 존재여부에 따른 핵산의 증폭량을 확인한 결과, 지시약의 일 예인 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)를 첨가한 경우, 첨가하지 않았을 때 보다 타겟 핵산의 증폭량이 더 많아지는 것을 확인할 수 있었다. 도 3을 참고한다.
본 발명의 직접 핵산 증폭용 조성물은 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 혈액을 이용한 PCR 반응시 트리신(tricine) 반응 완충용액 내에 증폭효율의 개선을 위하여 베타인(betaine)을 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 베타인(betaine)은 DNA 헬릭스 불안정화에 관련된 물질이며, 이는 트리신(tricine) 반응 완충용액과 함께 PCR 증진제(enhancer) 역할을 한다.
보다 상세하게는 트리스(Tris) 반응 완충용액과 트리신(tricine) 반응 완충용액에 베타인(betaine)의 첨가 유무에 따른 PCR 반응의 증폭효율을 조사하였다. 그 결과 트리스(Tris) 반응 완충용액을 사용했을 때는 베타인 첨가 유무에 상관없이 지시약에 의한 직접 핵산의 증폭 증대효과는 나타나지 않았으며, 베타인의 첨가없이 지시약만을 첨가한 경우 베타인을 첨가하지 않았을 때보다 오히려 PCR 억제현상이 두드러지는 것을 확인하였다.
반면, 트리신(tricine) 반응 완충용액에 베타인 및 지시약을 모두 첨가하여 PCR 반응을 수행할 경우, PCR 반응의 안정성을 높일 수 있을 뿐만 아니라 나아가 직접 핵산의 증폭 효과를 증대할 수 있음을 확인하였다.
상기의 결과는 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 핵산 증폭 반응시 트리신(tricine) 반응 완충용액, 베타인, 그리고 지시약 모두의 상호작용에 의해 우수한 직접 핵산의 증폭 증대효과가 나타나는 것을 확인한 것이다. 도 8을 참고한다.
상기 본 발명에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 별개로 포장되거나 또는 성분의 어느 조합된 하나 이상의 혼합물로 포장된 추출 조성물의 성분들을 함유하는 키트로 제공될 수 있다.
이와 같이, 키트는 예를 들어 별도의 용기에 각각이 포장된 추출 용액 및 시료 제조 용액을 함유할 수 있다.
임의로, 다른 성분, 예를 들어 중성화 용액도 키트 내에 포함될 수 있다. 추가로, 키트도 키트 형태로 상업적으로 구입가능 한, PCR 증폭을 수행하기 위한 성분을 함유할 수 있다.
본 발명은 다음 단계를 포함하는 직접 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다.
(a) Tricine 반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하는 직접 핵산 증폭용 조성물을 생물학적 시료에 혼합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 반응 혼합물을 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟 핵산을 증폭하는 단계;
본 발명의 일 실시예에 따른 직접 핵산을 증폭하는 방법은 PCR 결과에 영향을 미치는 요인이 특정 성분의 종류일 수도 있고, 그 특정 성분의 농도일 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 최종 반응액을 기준으로 dNTPs 0.05 내지 1.0 mM, MgCl2 1 내지 10 mM, 베타인 0.05 내지 1 M, DNA 중합효소 1 내지 10 unit/㎕, 및 0.001 내지 0.5%(w/v) 지시약을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 최종 반응액을 기준으로 dNTPs 0.1 내지 0.5 mM, MgCl2 2 내지 6 mM, 베타인 0.1 내지 0.5 M, DNA 중합효소 3 내지 7 unit/㎕, 및 0.002 내지 0.09%(w/v)의 지시약을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물을 사용함으로써 생물학적 시료에 존재하여 효소 반응을 억제하는 물질들에 의한 장애를 극복할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 생물학적 시료는 (a) 단계의 반응 혼합물을 제조하기 전, 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 것으로, 상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서 혈액은 반응 혼합물에 첨가되기 전에, 헤파린, EDTA(ethylene diaminetetraacetic acid) 및 구연산과 같은 항응고제로 전처리 하는 것이 바람직하다. 그러나, 항응고제는 효소 반응, 특히, PCR 작용을 억제하기 쉬우며, 이러한 이유로 항응고제는 PCR 반응에 첨가되는 혈액의 양을 결정하는데 제한 요소가 된다. 본 발명에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 항응고제에 의한 상기 결점을 극복할 수 있으며, 직접 증폭에 있어서 기존에 사용하는 혈액 양보다 많은 양의 혈액을 사용 가능하게 하는 장점이 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명은 추출하고자 하는 대상이 되는 혈액 1 내지 5 ㎕에 접 핵산 증폭용 조성물 30 내지 100 ㎕를 첨가하여 사용할 수 있으며, 40 내지 60 ㎕가 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명에 일 실시예에 따른 직접 핵산을 증폭하는 방법은 프라이머 종류, 프라이머의 농도, PCR 반응시간, PCR 반응 주기 수, 및 PCR 적용 온도의 조정을 통해서, 타겟 핵산의 증폭에 가장 잘 맞는 PCR 조건의 확인 및 설정은 물론, 적합 PCR 제품을 선택할 수도 있다.
혈액 시료는 핵산 정제 과정을 거칠 경우 많은 시간과 노력이 필요로 하며 정제 과정 중에 샘플의 손실 또는 샘플들 간의 오염이 발생할 수도 있다. 본 발명에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 혈액으로부터 DNA를 정제과정을 거치지 않고 혈액을 바로 핵산 증폭반응에 사용할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 직접 핵산 증폭용 조성물은 핵산 증폭 반응의 주형인 DNA를 혈액으로부터 정제 과정없이 바로 핵산 증폭 반응에 이용할 수 있으므로 다량의 샘플들을 처리하기 위해 드는 시간과 비용 및 소요되는 인력을 절감할 수 있는 장점이 있다. 또한 DNA 정제 과정을 거치지 않기 때문에 신속하고 간편하게 분자 진단을 위한 상황에서 재빨리 결과를 얻을 수도 있고 외부에서 시료를 채취하여 진단을 위한 핵산 증폭 반응을 진행할 경우 핵산 정제 과정에 필요한 많은 장비와 시약이 필요로 하지 않아도 되는 장점이 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Tris-반응 완충용액을 사용하여 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 아가로스 젤 사진이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Tris-반응 완충용액과 Tricine-베이스 완충액을 사용하여 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이며,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 농도별로 첨가하여 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가하여 혈액 양별로 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이며,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue, BPB)를 첨가하여 DNA 중합효소(polymerase) unit 수별로 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 크레졸 레드(cresol red), 페놀 레드(phenol red), 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie vrilliant blue R-250), 레마졸 브릴리안트 블루(Remazol Brilliant Blue R), 레마졸 브릴리안트 바이올렛(Remazol Brilliant Violet 5R)을 각각 첨가하여 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이며,
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue, BPB), 크레졸 레드(cresol red), 페놀 레드(phenol red), 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie vrilliant blue R-250), 레마졸 브릴리안트 블루(Remazol Brilliant Blue R), 레마졸 브릴리안트 바이올렛(Remazol Brilliant Violet 5R)을 각각 첨가하여 혈액 양별로 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이고,
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 Tris-반응 완충용액와 Tricine-반응 완충용액을 각각 사용하여 지시약 및 베타인(betaine) 첨가유무에 따른 직접 핵산을 증폭한 PCR 결과를 보여주는 젤 사진이다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
[실시예 1] 혈액을 직접 사용한 유전자 증폭가능 여부 확인
(1) Tris-반응 완충용액을 이용한 직접 핵산 증폭가능 여부 확인
일반적으로 사용되는 PCR 반응 조건에서는 혈액 시료를 직접 첨가하여 PCR을 수행할 경우, 혈액 내 존재하는 많은 핵산 증폭 반응 억제인자들에 의해 PCR 반응이 거의 일어나지 않는다.
먼저 비 응고 혈액시료로부터 일반적인 Taq DNA 중합효소를 이용한 PCR 반응액을 사용하여 핵산증폭이 가능한지 테스트 하였다. 최종 반응액 50 ul을 기준으로 5 ul 10x Tris-반응 완충용액과 최종 농도 0.2 mM dNTPs, 4 mM MgCl2, 사람 SOX21 유전자로부터 디자인된 프라이머 세트 각각 20 pmoles의 정방향 프라이머(Forward primer) 5'-GTTAGGATTGTGCACTTCTTCT-3'와 역방향 프라이머(Reverse primer) 5'-GCATTCTAATGCTAATCTAGCGT-3', 1.25 units 또는 5 units의 HelixAmpTM Taq DNA polymerase(Nanohelix, 한국), 그리고 EDTA가 처리된 혈액을 각각 1, 3, 5 ul를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다.
PCR 반응 조건은 초기 95℃에서 5분간 반응 후 95℃(20초)- 58℃(20초)-72℃(30초)을 40회 반복하고 추가로 72℃에서 5 분간 반응으로 수행하였다. PCR 반응이 끝난 후, 10 ul의 PCR 산물을 1% Agarose gel에서 전기영동을 통해 결과를 분석하였다.
그 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 일반적으로 사용되는 PCR 반응시 1.25 units의 DNA 중합효소를 사용했을 경우 PCR 반응이 일어나지 않았고, 5 units의 중합효소를 사용했을 경우 1 ul의 혈액을 첨가 했을 때만 타겟 핵산의 증폭을 확인할 수 있었다.
상기의 결과는 일반적인 PCR 반응 조성물에서 혈액을 이용한 직접핵산 증폭이 DNA 중합효소의 양을 늘리면 약하게나마 직접 핵산 증폭이 가능함을 보여주는 결과이다. 이는 혈액 내에 존재하는 많은 억제요인(inibitor)에 기인한 PCR 반응 억제 현상을 중합효소의 양을 늘림으로써 어느 정도는 극복이 가능하다는 것을 보여주는 것이기는 하지만 증폭된 PCR 산물의 양이 낮고, 혈액의 첨가량이 늘어남에 따라 PCR 반응이 일어나지 않는 근본적인 문제점이 있다.
(2) Tricine-반응 완충용액을 이용한 직접핵산 증폭가능 여부 확인
상기 (1)의 결과로부터 일반적으로 사용되는 PCR 반응 조성물에 중합효소의 unit수를 높이는 것으로 핵산증폭이 약하게는 가능하다는 것은 확인하였지만 효율이 높지 않고 혈액 첨가량을 늘리면 PCR 반응이 일어나지 않는 단점이 있어 이를 극복하기 위해 Tris-반응 완충용액(pH 9.0) 대신 Tricine(N-Tris(hydroxymethyl)methylglycine)-반응 완충용액(pH 8.6)을 사용하여 혈액으로부터 PCR 증폭 여부 정도를 비교하였다.
PCR 반응은 50 ul 반응으로 각각 완충용액에 dNTPs는 0.2 mM, MgCl2의 농도는 4 mM, betaine 0.2 M을 사용하였고 HelixAmpTM Taq DNA polymerase(Nanohelix, 한국)를 5 units를 사용, 혈액은 EDTA가 처리된 혈액을 각각 1, 3, 5 ul 첨가하여 PCR을 진행하였다.
그 결과 도 2에서 확인할 수 있듯이, Tris-반응 완충용액을 사용했을 때는 혈액 1 ul를 사용했을 경우에만 약하게 타겟 핵산이 증폭되었지만 반면, Tricine-반응 완충용액을 사용했을 때는 혈액 양을 약 5 ul까지 사용하여도 PCR이 진행되어 타겟 핵산이 증폭되는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과는 Tricine-반응 완충용액이 Tris-반응 완충용액 보다 PCR 반응의 억제요인(inibitor)을 제어하여 PCR 반응이 효율적으로 이루어질 수 있도록 하는 것을 확인한 결과이다.
[ 실시예 2] 지시약( dye )을 적용한 직접 핵산의 증폭 효율 증대 효과
(1) 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)에 의한 효과
일반적으로 PCR 반응 시 브로모페놀 블루(bromophenol blue)가 혈액을 직접적으로 사용하는 직접 핵산의 증폭에서 어떤 효과를 주는지 확인하기 위해서, 적절한 양의 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가하여 PCR을 진행하였다.
PCR의 최종 부피는 50 ul로 Tricine-반응 완충용액과 함께 0.2 mM dNTPs, 4 mM MgCl2, 0.2 M betaine을 사용하였고, HelixAmpTM Taq DNA polymerase (Nanohelix, 한국)를 5 units를 사용하였으며, 혈액은 EDTA가 처리된 혈액을 3 ul 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과 도 3에서 확인할 수 있듯이, 브로모페놀 블루(Bromophenol blue)를 0.005%(w/v)(레인 4,5), 0.01%(w/v)(레인 6,7) 첨가한 경우, 첨가하지 않았을 때 보다(레인 2,3) 타겟 핵산의 증폭량이 더 많아지는 것을 확인할 수 있었다.
반면에 고 농도의 0.05%(w/v)(레인 10, 11)와 0.1%(w/v)(레인 12, 13)의 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가한 경우 오히려 PCR 반응 효율이 저하되거나 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라 혈액의 양에 따라 테스트한 도 4에서도 확인할 수 있듯이, 브로모페놀 블루를 첨가하였을 경우가 브로모페놀 블루를 첨가하지 않았을 경우 보다 핵산의 증폭량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한 DNA 중합효소의 unit 수에 따른 브로모페놀 블루(bromophenol blue)의 핵산증폭 효율을 조사한 결과, 도 5에서도 확인할 수 있듯이 DNA 중합효소를 1.25 units 또는 2.5 units를 사용했을 경우보다 5 units를 사용했을 경우에 브로모페놀 블루(bromophenol blue)에 의한 핵산증폭 효율이 확실히 증대되는 것으로 확인되었다.
상기의 결과는 브로모페놀 블루(bromophenol blue)가 PCR 억제요인(inibitor)에 기인한 PCR 반응 억제 현상을 감소시켜 직접 핵산의 증폭 효율을 증가시킨다는 것을 확인한 결과이다.
(2) 다른 지시약들에 의한 직접 핵산의 증폭 효율
상기 (1)에서 브로모페놀 블루(bromophenol blue)에 의한 향상된 직접 핵산의 증폭 효율결과를 확인하였다.
상기 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 이외에 비슷한 용도로 사용되는 다른 지시약들이 직접 핵산 증폭에 어떤 효과를 나타내는지 알아보기 위해 적절한 양의 크레졸 레드(cresol red), 페놀 레드(phenol red), 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie vrilliant blue R-250), 레마졸 브릴리안트 블루(Remazol Brilliant Blue R), 레마졸 브릴리안트 바이올렛(Remazol Brilliant Violet 5R)을 각각 첨가하여 테스트를 진행하였다.
PCR의 최종 부피는 50 ul로 Tricine-반응 완충용액을 사용하였고, EDTA가 처리된 혈액 3 ul를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과 도 6에서도 확인할 수 있듯이, 지시약을 첨가하지 않았을 때 보다(레인 2) 각각의 지시약을 0.005 내지 0.05%(w/v)의 농도로 첨가한 조건에서 타겟 핵산의 증폭효율이 모두 증가된 것을 확인할 수 있었다.
또한 혈액의 양에 따라 타겟 핵산의 증폭효율을 확인한 결과 도 7에서 확인할 수 있듯이, 전체적으로 타겟 핵산의 증폭량이 지시약을 첨가하지 않았을 때 보다 모두 다 증가한 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과는 지시약으로 사용되는 크레졸 레드(cresol red), 페놀 레드(phenol red), 쿠마시 브릴리안트 블루(coomassie vrilliant blue R-250), 레마졸 브릴리안트 블루(Remazol Brilliant Blue R), 및 레마졸 브릴리안트 바이올렛(Remazol Brilliant Violet 5R)들 역시도 브로모페놀 블루(bromophenol blue)와 마찬가지로 혈액을 직접 사용한 PCR 반응에서 혈액 내에 존재하는 많은 PCR 반응의 억제요인(inibitor)을 감소시켜, 혈액 내 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요 없는 직접 핵산의 증폭 효율을 증가시킨다는 것을 확인한 결과이다.
한편 혈액을 직접 사용해서 PCR을 수행할 경우, 지시약을 첨가물질로 사용했을 때 Tricine-반응 완충용액과 betaine의 첨가에 따른 타켓 핵산 증폭효과를 확인하였다.
PCR 반응 최종 부피는 50 ul로 각각 Tris-반응 완충용액과 Tricine-반응 완충용액을 사용하였고 EDTA 처리된 혈액을 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과 도 8에서도 확인할 수 있듯이, Tris-반응 완충용액을 사용했을 때는 betaine 첨가 유무에 상관없이 브로모페놀 블루(bromophenol blue)와 페놀 레드(phenol red)에 의한 직접 핵산의 증폭 증대효과는 나타나지 않았고, bataine을 첨가하지 않고 브로모페놀 블루(bromophenol blue)를 첨가했을 때는(레인 3,4,5) 첨가하지 않았을 때보다 오히려 PCR 억제현상이 나타나는 것이 확인되었다.
또한, Tricine-반응 완충용액을 사용하고 betaine을 첨가한 조건에서는 브로모페놀 블루(bromophenol blue)와 페놀 레드(phenol red)를 첨가했을 때 모두 직접 핵산의 증폭 증대효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과는 Tricine-반응 완충용액, betaine, 그리고 지시약 모두의 상호작용에 의해 우수한 직접 핵산의 증폭 증대효과가 나타나는 것을 확인한 것이다.
또한, 상기의 결과들은 Tricine-반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하는 본 발명의 조성물이 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 혈액의 핵산 증폭 반응에 있어, 장비와 특정한 시약 없이도 효율적이고 간편하게 분자 진단에 이용할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.

Claims (10)

  1. 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 핵산 증폭용 조성물에 있어서,
    상기 조성물은 트리신(tricine) 반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하고, 상기 지시약은 0.001 내지 0.02%(w/v) 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 0.005 내지 0.05%(w/v) 페놀 레드(phenol red), 0.005 내지 0.05%(w/v) 쿠마시 블루(coomassie blue), 0.005 내지 0.05%(w/v) 레마졸 블루(remazol blue), 및 0.005 내지 0.05%(w/v) 레마졸 바이올렛(Remazol violet)으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 직접 핵산 증폭용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. (a) 트리신(tricine) 반응 완충용액, 베타인(betaine), dNTPs, DNA 중합효소, 및 지시약을 포함하는 직접 핵산 증폭용 조성물을 생물학적 시료에 혼합하여 반응 혼합물을 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 반응 혼합물을 이용하여 생물학적 시료로부터 타겟 핵산을 증폭하는 단계를 포함하고,
    상기 지시약은 0.001 내지 0.02%(w/v) 브로모페놀 블루(bromophenol blue), 0.005 내지 0.05%(w/v) 페놀 레드(phenol red), 0.005 내지 0.05%(w/v) 쿠마시 블루(coomassie blue), 0.005 내지 0.05%(w/v) 레마졸 블루(remazol blue), 및 0.005 내지 0.05%(w/v) 레마졸 바이올렛(Remazol violet)으로부터 선택되는 1종 이상인 직접 핵산을 증폭하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 (a) 단계의 반응 혼합물을 제조하기 전, 생물학적 시료 내에 존재하는 핵산에 대한 정제가 필요하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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