FI104391B - Määritysmenetelmiä, joissa käytetään havaittavien signaalien herkistimien aiheuttamaa tuotantoa, määritykseen tarkoitettu pakkaus sekä herkistinkonjugaatti - Google Patents

Määritysmenetelmiä, joissa käytetään havaittavien signaalien herkistimien aiheuttamaa tuotantoa, määritykseen tarkoitettu pakkaus sekä herkistinkonjugaatti Download PDF

Info

Publication number
FI104391B
FI104391B FI906043A FI906043A FI104391B FI 104391 B FI104391 B FI 104391B FI 906043 A FI906043 A FI 906043A FI 906043 A FI906043 A FI 906043A FI 104391 B FI104391 B FI 104391B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
sensitizer
specific binding
conjugate
analyte
binding assay
Prior art date
Application number
FI906043A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI906043A0 (fi
Inventor
Frank Mccapra
Original Assignee
London Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26899134&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI104391(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by London Diagnostics Inc filed Critical London Diagnostics Inc
Publication of FI906043A0 publication Critical patent/FI906043A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104391B publication Critical patent/FI104391B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/583—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with non-fluorescent dye label
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/905—Photochemical activation of reactions
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Train Traffic Observation, Control, And Security (AREA)
  • Burglar Alarm Systems (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Measuring Fluid Pressure (AREA)

Description

, 104391 Määritysmenetelmiä, joissa käytetään havaittavien signaalien herkistimien aiheuttamaa tuotantoa, määritykseen - tarkoitettu pakkaus sekä herkistinkonjugaatti 5 Keksinnön alue Tämä keksintö koskee spesifiseen sitoutumiseen perustuvia määrityksiä, joissa käytetään leimausaineena her-kistintä. Keksintö koskee lisäksi määritykseen tarkoitettua pakkausta sekä herkistinkonjugaattia.
10 Keksinnön tausta
Eräät yhdisteet omaksuvat virittyneen triplettiti-lan "eksitoitaessa" ne säteilytyksen, elektroninsiirron, elektrolyysin (so. elektroluminesenssin) tai energiansiirron avulla. Nämä yhdisteet tai "herkistimet" voivat olla 15 vuorovaikutuksessa monenlaisten muiden yhdisteiden kanssa ja siirtää energiaa tai elektroneja näihin muihin yhdisteisiin herkistimien palatessa silloin virittymättömään eli perustilaansa. Virittyneen herkistimen ja näiden muiden yhdisteiden välinen vuorovaikutus voi tietyissä olo-20 suhteissa johtaa sellaisen havaittavissa (detektoitavissa) olevan "signaalin" syntymiseen, jota voidaan tarkkailla ja/tai jonka suuruus voidaan määrittää.
Olisi sen vuoksi toivottavaa käyttää herkistimiä leimausaineina diagnostisissa määrityksissä.
·; 25 Yhteenveto keksinnöstä
Keksintö koskee spesifiseen sitoutumiseen perustuvia määrityksiä, joissa käytetään leimausaineena herkis-tintä. Jos herkistin liitetään spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, jota käytetään spesifisessä sitoutumisreaktios-30 sa määritettäessä jonkin analysoitavan aineen esiintymistä -· näytteessä, herkistimen ja toisen yhdisteen välisen vuoro- vaikutuksen seurauksena syntyvä signaali voidaan saada . korreloimaan analysoitavan aineen esiintymisen tai määrän kanssa näytteessä.
35 Koska herkistin voidaan palauttaa alkuperäiseen tilaansa ja tehdä siten uudessa eksitoinnissa käyttökel- » «
» «I
2 104391 poiseksi, herkistimen käyttö leimausaineena tarjoaa lisäetuna myös herkistimen antaman signaalin vahvistumisen.
Tämän keksinnön kuvauksessa "herkistin" tarkoittaa mitä tahansa osaa, joka yhtä tai useampaa aallonpituutta 5 olevan säteilyn tai muun kemiallisen tai fysikaalisen ärsykkeen (esim. elektroninsiirron, elektrolyysin, elektro-luminesenssin tai energiansiirron) avulla eksitoitaessa saavuttaa virittyneen tilan ja joka (a) sen jälkeen mole-kulaarisen hapen kanssa reagoidessaan tuottaa singlettiti-10 lassa olevaa molekulaarista happea tai joka (b) sen jälkeen leukovärin kanssa reagoidessaan omaksuu pelkistyneen muodon, joka voidaan sitten palauttaa alkuperäiseen tilaansa reaktiolla molekulaarisen hapen kanssa, jonka seurauksena syntyy vetyperoksidia.
15 Jompikumpi virittyneen herkistimen reaktioista syn nyttää muita reagensseja lisättäessä joissakin mutta ei kaikissa tapauksissa havaittavissa olevan signaalin. Sing-lettitilassa oleva molekulaarinen happi voi ensinnäkin reagoida olefiinin kanssa (a) muodostaen dioksetaania, 20 joka hajoaa kuumennettaessa, jolloin emittoituu havaittavissa oleva fotoni, tai (b) muodostaen peroksidia, joka voi joko (i) hajota kuumennettaessa, jolloin emittoituu havaittavissa oleva fotoni, tai (ii) hapettaa kromogeenin, jolloin syntyy havaittavissa oleva värinmuutos tai fluori 25 resenssi. Hapettunut leukoväri toisaalta saa aikaan havaittavissa olevan värinmuutoksen tai fluoresenssin. Pelkistynyt herkistin molekulaarisen hapen avulla alkuperäiseen tilaansa palauttamalla tuotettu vetyperoksidi voidaan havaita kromogeenin hapettumisen seurauksena, joka aiheut-30 taa havaittavissa olevan värinmuutoksen tai fluoresenssin tai kemiluminesoivan osan hapettumisen, joka synnyttää • · havaittavissa olevan fotonin.
Tämä keksintö koskee myös määrityspakkauksia, jotka sisältävät herkistinkonjugaatteja, olefiineja sekä leuko-35 värejä.
Keksinnön kohteena on spesifiseen sitoutumiseen pe-·.: rustuva määritys analysoitavan aineen esiintymisen selvit- 3 104391 tämiseksi näytteestä. Menetelmälle on tunnusomaista, että määrityksessä (i) käytetään hyväksi herkistinkonjugaattia, ' joka sisältää herkistintä liittyneenä spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, ja (ii) analysoitavan aineen esiin-5 tyminen näytteessä on verrannollinen yhden tai useamman spesifisen sitoutumisreaktion herkistinkonjugaattia sisältävän tuotteen muodostumiseen ja määrityksessä annetaan sopivissa olosuhteissa muodostua olennaisessa määrin yhtä tai useampaa spesifisen sitoutumisreaktion tuotetta, joka 10 sisältää herkistinkonjugaattia; (A) annetaan (i) herkis-timen, joka sisältyy yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion herkistinkonjugaattia sisältävään tuotteeseen, tai (ii) herkistimen, joka sisältyy siihen herkistinkonjugaattiin, joka ei sisälly yhteen tai useam-15 paan spesifisen sitoutumisreaktion tuotteeseen, vi- rittyä sopivissa olosuhteissa ja (B) annetaan (i) virittyneen herkistimen, joka sisältyy yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion herkistinkonjugaattia sisältävään tuotteeseen, tai (ii) virittyneen herkistimen, joka sisältyy 20 siihen herkistinkonjugaattiin, joka ei sisälly yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion tuotteeseen, reagoida sopivissa olosuhteissa molekulaarisen hapen kanssa, jolloin syntyy singlettitilassa olevaa molekulaarista happea, joka soveltuu reaktioon, jonka on tarkoitus aiheuttaa ·: 25 havaittavissa (detektoitavissa) oleva signaali; ja mita taan havaittavissa oleva signaali.
Keksinnön kohteena on myös spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys analysoitavan aineen esiintymisen selvittämiseksi näytteestä, jolle määritykselle on 30 tunnusomaista, että määrityksessä (i) käytetään hyväksi • herkistinkonjugaattia, joka sisältää herkistintä liit- * · tyneenä spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, ja (ii) analysoitavan aineen esiintyminen näytteessä on verrannollinen yhden tai useamman spesifisen sitoutumisreaktion 35 herkistinkonjugaattia sisältävän tuotteen muodostumiseen, ja määrityksessä annetaan sopivissa olosuhteissa muodostua · < 4 104391 olennaisessa määrin yhtä tai useampaa spesifisen sitou-tumisreaktion tuotetta, joka sisältää herkistinkonjugaat-tia; (A) annetaan (i) herkistimen, joka sisältyy yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion herkistinkon-5 jugaattia sisältävään tuotteeseen, tai (ii) herkistimen, joka sisältyy siihen herkistinkonjugaattiin, joka ei sisälly yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion tuotteeseen, virittyä sopivissa olosuhteissa ja (B) annetaan (i) virittyneen herkistimen, joka sisältyy yhteen 10 tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion herkistinkon-jugaattia sisältävään tuotteeseen, tai (ii) virittyneen herkistimen, joka sisältyy siihen herkistinkonjugaattiin, joka ei sisälly yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion tuotteeseen, reagoida sopivissa olosuhteissa 15 leukovärin kanssa havaittavissa olevan signaalin aikaansaamiseksi; ja mitataan havaittavissa oleva signaali.
Keksintö koskee lisäksi spesifiseen sitoutumiseen perustuvaan määritykseen tarkoitettua pakkausta, joka soveltuu käytettäväksi keksinnön mukaisessa spesifiseen si-20 toutumiseen perustuvassa määrityksessä. Pakkaukselle on tunnusomaista, että se sisältää ensimmäisen pienen pullon, joka sisältää herkistinkonjugaattia, jossa herkistin on liittyneenä spesifisesti sitoutuvaan aineeseen; ja toisen pienen pullon, joka sisältää olefiinia tai leukoväriä.
·: 25 Keksintö koskee lisäksi herkistinkonjugaattia, joka· sisältää herkistintä liittyneenä spesifiseen sitoutuvaan aineeseen, joka herkistin on viritetty säteilyn tai muun kemiallisen tai fysikaalisen ärsykkeen avulla virittyneeseen tripletti-tilaan ja joka (a) sen jälkeen 30 saatetaan reagoimaan molekylaarisen hapen kanssa tuottamaan singlet-tilassa olevaa molekulaarista happea, tai joka (b) sen jälkeen saatetaan reagoimaan leukovärin kanssa aiheuttamaan värinmuutoksen tai (c) sen jälkeen saatetaan reagoimaan leukovärin kanssa, jolloin herkistin, 35 omaksuu pelkistyneen muodon, josta se palautetaan alkuperäiseen tilaansa reaktiolla singlet-hapen kanssa, jonka • · 5 104391 seurauksena syntyy vetyperoksidia, ja vetyperoksidia voidaan joko käyttää signaalina analysoitavan aineen ' määrän määrittämiseksi tai käyttää muissa kemiallisissa reaktioissa, jotka osoittavat analysoitavan aineen määrän. 5 Kuvioiden selitys
Kuvio 1 esittää herkistimen käyttöä olefiinin kanssa dioksetaanin tuottamiseen, joka dioksetaani emittoi kuumennettaessa valoa.
Kuvio 2 esittää tuloksia, jotka saatiin määritettä-10 essä koettimen avulla erilaisia kohde-DNA-määriä. Edullisen toteutusmuodon kuvaus
Sovellettaessa tätä keksintöä käytännössä spesifisesti sitoutuvat aineet leimataan herkistimellä. Sellaisia herkistimiä ovat, ilman rajoitustarkoitusta, useimmat vä-15 rit, kuten esimerkiksi metyleenisininen, rodamiini, pery-leeni, aromaattiset hiilivedyt (esim. pyreeni), heterosyk-liset yhdisteet, eosiini, vapaat porfyriinit, metallopor-fyriinit, tetrafenyyliporfiini, ftalosyaniini ja erilaiset flaviinijohdannaiset. Esimerkkejä yksityisistä herkisti-20 mistä on esitetty teoksessa The Chemistry of Synthetic Dyes, osat I - IX, jonka on toimittanut K. Venkataraman (Academic Press, New York, 1978), ja teoksessa Singlet Molecular Oxygen, jonka on toimittanut A. Paul Schaap (Bowden, Hutchinson and Ross, 1976), jotka teokset maini-25 taan tässä kokonaisuudessaan lähdeviitteinä.
Erityisen käyttökelpoisia herkistimiä ovat:
Herkistin Singlettihappiteho
Protoporfyriinin dimetyyliesteri 177,67 30 Tetrafenyyliporfiini 40,33
Metyylipyrroporfiini 38,38 • ·
Metyylipyrroporfiinin etyyliesteri 53,13
Protoporfyriinin dinatriumsuola 72,81
Co-porfyriini 40,19 35 Hematoporfyriini 6,72
Ftalosyaniini 10,53 4 · • · 6 104391
Herkistimet voidaan liittää spesifisesti sitoutuvaan aineeseen menetelmin, jotka ovat tällä alalla tunnettuja ja joihin kuuluvat, ilman rajoitustarkoitusta, N-hyd-roksisukkiini-imidyyliesterikytkijän käyttö, diamiinikyt-5 kijän käyttö ja herkistimen yhdistäminen spesifisesti sitoutuvan aineen rakenneosaan (esim. nukleotidiin tai aminohappoon) . Menetelmä, jolla herkistin liitetään spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, vaihtelee käytettävän spesifisesti sitoutuvan aineen tyypin ja käytettävän herkisti-10 men tyypin mukaan.
Spesifisesti sitoutuva aine, johon on liitetty herkistin (ja jota kutsutaan tästä eteenpäin "herkistinkonju-gaatiksi"), on käyttökelpoinen monissa spesifiseen sitoutumiseen perustuvissa määrityksissä, joilla tutkitaan jon-15 kin analysoitavan aineen esiintymistä näytteessä. "Esiin tyminen" tarkoittaa tässä analysoitavan aineen kvalitatiivista ja/tai kvantitatiivista detektiota. Sellaisten määritysten kohteena voi olla mikä tahansa analysoitava aine, joka voidaan havaita käyttämällä herkistinkonjugaattia 20 spesifisiin sitoutumisreaktioihin yhdistettynä. Tällaisia määrityksiä ovat, ilman rajoitustarkoitusta, immunologiset määritykset, proteiinisitoutumismääritykset ja nukleiini-happohybridisaatdmääritykset.
Eräässä tyypillisessä immunologisessa määrityksessä 25 analysoitava aine on immuunireaktiivinen ja sen esiintyminen näytteessä voidaan määrittää sen ja määritysreagenssin välisen immunologisen reaktion perusteella. Eräässä tyypillisessä proteiinisitoutumismäärityksessä analysoitavan aineen esiintyminen näytteessä määritetään käyttäen hyväk-30 si analysoitavan aineen spesifistä sitoutumisreaktiivi- suutta määritysreagenssin suhteen, jossa tapauksessa reak- • < tiivisuus ei ole immuunireaktiivisuutta. Esimerkkejä tästä ovat entsyymi-substraattitunnistus ja avidiinin sitoutu-misaffiniteetti biotiinin suhteen. Eräässä tyypillisessä 35 nukleiinihappohybridisaatiomäärityksessä analysoitavan aineen esiintyminen näytteessä määritetään analysoitavan · 7 104391 aineen ja määritysreagenssin välisen hybridisaatioreaktion avulla. Analysoitava nukleiinihappo (joka on tavallisesti läsnä kaksisäikeisenä DNA:na tai RNAma) muunnetaan tavallisesti ensin yksisäikeiseen muotoon ja immobilisoidaan 5 kantajalle (esim. nitroselluloosapaperille). Vaihtoehtoisesti analysoitava nukleiinihappo voidaan immobilisoida elektroforeettisesti geelimatriksiin. Immobilisoitu analysoitava aine voidaan sitten hybridisoida (so. sitoa spesifisesti yhteen) komplementaarisen nukleiinihapposekvenssin 10 kanssa.
Edellä esitetyt spesifiseen sitoutumiseen perustuvat määritykset voidaan toteuttaa monilla eri tavoilla. Näissä määritysmenetelmissä käytetään hyväksi herkistin-konjugaattia, joka käsittää herkistimen liitettynä spesi-15 fisesti sitoutuvaan aineeseen. "Spesifisesti sitoutuva aine" tarkoittaa tässä mitä tahansa sellaista ainetta, joka sitoutuu spesifisesti immuunireaktion, proteiinisi-toutumisreaktion, nukleiinihappohybridisaatioreaktion tai jonkin muun sellaisen reaktion kautta, jossa aine reagoi 20 spesifisesti johonkin rajoitettuun ryhmään kuuluvien bio logisten, biokemiallisten tai kemiallisten spesiesten kanssa. Tässä määritysten ryhmässä herkistinkonjugaatti osallistuu spesifiseen sitoutumisreaktioon ja analysoitavan aineen esiintyminen näytteessä on verrannollinen yhden •j 25 tai useamman spesifisen sitoutumisreaktion herkistinkonju-gaattia sisältävän tuotteen muodostumiseen. Määritys toteutetaan antamalla tarvittavien spesifisten sitoutumis-reaktioiden tapahtua sopivissa reaktio-olosuhteissa. Spesifisen sitoutumisreaktion herkistinkonjugaattia sisältä-30 vien tuotteiden muodostuminen määritetään mittaamalla sel- • laisten herkistinkonjugaattia sisältävien tuotteiden vi- «t rittymisen tuloksena syntyvä signaali tai mittaamalla sellaisiin tuotteisiin sisältymättömän, reagoimattoman tai osittain reagoineen herkistinkonjugaatin virittymisen tu-35 loksena syntyvä signaali.
• · 8 104391
Esimerkkejä tyypillisistä määritysmenetelmistä ovat kerrosmääritykset, kompetitiiviset määritykset, pinta-antigeenimääritykset, peräkkäiskyllästysmääritykset, kompetitiiviset korvausmääritykset ja vaimennusmääritykset.
5 Eräässä tyypillisessä kerrosmääritysmenetelmässä spesifisesti sitoutuva aine, johon herkistin liitetään, kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoitavaan aineeseen. Määrityksessä käytetään lisäksi reagoivaa ainetta (reak-tanttia), joka kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoi-10 tavaan aineeseen, jolloin muodostuu kompleksinen reaktan-tin, analysoitavan aineen ja herkistimen konjugaatti. Reaktantti voidaan sitoa kiinteään faasiin, mm. (ilman rajoitustarkoitusta) mittatikkuihin, helmiin, putkiin tai paperi- tai polymeeriarkkeihin. Sellaisissa tapauksissa 15 analysoitavan aineen esiintyminen näytteessä on verrannollinen kiinteään faasiin sitoutuneen herkistimen virittymisen tuloksena, sen jälkeen kun spesifiset sitoutumisreak-tiot ovat menneet loppuun, syntyvään signaaliin. Sellaisia määritysmenetelmiä on käsitelty tarkemmin US-patenttijul-20 kaisuissa 4 652 533, 4 383 031, 4 380 580 ja 4 226 993, jotka mainitaan tässä viitteinä.
Eräässä tyypillisessä kompetitiivisessa menetelmässä määrityksessä käytetään hyväksi reaktanttia, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoitavaan aineeseen muo-25 dostaen analysoitavan aineen ja reaktantin kompleksin sekä spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, johon on liitetty herkistin, jolloin muodostuu herkistinkonjugaatti-reaktantti-kompleksi. Reaktantti voidaan sitoa kiinteään faasiin, tai vaihtoehtoisesti reaktanttia sisältävät reaktiotuotteet 30 voidaan saostaa toista vasta-ainetta käyttäen tai muilla tunnetuilla tavoilla. Tässä kompetitiivisessa menetelmässä »< analysoitavan aineen esiintyminen on "verrannollinen", so. kääntäen verrannollinen, kiinteään faasiin sitoutuneen tai sakan sisältämän herkistimen virittymisen tuloksena synty
• I
9 104391 vään signaaliin. Tätä määritysmenetelmää käsitellään tarkemmin edellä juuri mainituissa US-patenttijulkaisuissa.
Eräässä toisessa määritysmenetelmässä analysointi-kohde voi esiintyä jonkin suuremman biologisen, biokemial-5 lisen tai kemiallisen spesieksen pinnalla tai olla sitoutunut sellaiseen. Esimerkki tämäntyyppisestä määritysmenetelmästä on pinta-antigeenimääritys. Tässä menetelmässä spesifisesti sitoutuva aine kykenee sitoutumaan spesifisesti analysointikohteeseen ja analysointikohteen esiinty-10 minen on verrannollinen reaktiotuotteena muodostuneeseen analysointikohteen ja herkistinkonjugaatin kompleksiin. Kuvaava esimerkki tästä on herkistimen liittäminen vasta-aineeseen, joka on spesifinen solun pinta-antigeenin suhteen. Solun pinta-antigeenin esiintymisen osoittaa signaa-15 li, joka syntyy soluihin sitoutuneen herkistimen virittymisen seurauksena reaktion mentyä loppuun. Itse soluja voidaan käyttää yhdessä suodatussysteemin kanssa solujen pinnalle muodostuneen analysointikohde-herkintinkonjugaat-tikompleksin erottamiseksi reagoimattomasta herkistinkon-20 jugaatista. Tätä käsitellään tarkemmin US-patenttijulkai sussa 4 652 533.
Herkistintä voidaan käyttää alalla tunnetuissa muissakin määritysmenetelmissä, joihin kuuluvat, ilman rajoitustarkoitusta, peräkkäiskyllästysmääritys ja kompe-25 titiivinen korvausmääritys, joissa molemmissa käytetään hyväksi herkistinkonjugaattia, jossa sekä (1) spesifisesti sitoutuva aine, johon on liitetty herkistin, että (2) analysoitava aine sitoutuvat spesifisesti reaktanttiin. Pe-räkkäiskyllästyksen tapauksessa analysoitavan aineen anne-30 taan reagoida reaktantin kanssa ensin, mitä seuraa herkistinkonjugaatin reaktio jäljelle jääneen reagoimattoman • < reaktantin kanssa. Kompetitiivisen korvauksen tapauksessa herkistinkonjugaatti korvaa kompetitiivisesti reaktanttiin jo sitoutuneen analysoitavan aineen.
• I
104391
Tyypillisessä vaimennusmenetelmässä määrityksessä käytetään hyväksi reaktanttia, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoitavaan aineeseen muodostaen analysoitavan aineen ja reaktantin kompleksin sekä spesifisesti 5 sitoutuvaan aineeseen, johon on liitetty herkistin, jolloin muodostuu herkistinkonjugaatti-reaktanttikompleksi. Vaimennusosa liitetään reaktanttiin. Herkistimen välittömään läheisyyteen tuotuna vaimennusosa heikentää tai vaimentaa signaalin, joka syntyy sitoutuneen herkistimen vi-10 rittymisen seurauksena, tai vähentää tai hillitsee elektronien tai energian siirtymistä virittyneestä herkistimes-tä välireagenssiin (so. molekulaariseen happeen tai leuko-väriin). Tässä vaimennusmenetelmässä analysoitavan aineen esiintyminen on verrannollinen hajoavien dioksetaanien 15 luminesenssiin. Tätä menetelmää käsitellään tarkemmin US-patenttijulkaisuissa 4 220 450 ja 4 277 437, jotka mainitaan tässä viitteinä.
Mitä edellä käsiteltyihin määritysmenetelmiin ja jäljempänä käsiteltäviin menetelmiin tulee, määritysrea-20 genssien lisäys- ja reagointijärjestys voi vaihdella suuresti, kuten tällä alalla hyvin tiedetään. Esimerkiksi kerrosmäärityksessä kiinteään faasiin sitoutuneen reaktantin voidaan antaa reagoida näytteen sisältämän analysoitavan aineen kanssa, ja tämän reaktion jälkeen kompleksin 25 muodostaneen analysoitavan aineen sisältävä kiinteä faasi voidaan erottaa loppuosasta näytettä. Tämän erotusvaiheen jälkeen herkistinkonjugaatin voidaan antaa reagoida kiinteään faasiin sidotun kompleksin kanssa. Vaihtoehtoisesti voidaan kiinteä faasi, näyte ja herkistinkonjugaatti lisä-30 tä yhdessä samanaikaisesti ja antaa niiden reagoida ennen erotusta. Vielä yhtenä mutta epäedullisempana vaihtoehtona
• I
näytteen sisältämän analysoitavan aineen ja herkistinkonjugaatin voidaan antaa reagoida keskenään, ennen kuin lisätään kiinteään faasiin sidottu reaktanttti. Samanlaiset 35 sekoitus- ja reaktiovaiheiden vaihtelut ovat mahdollisia • • « 11 104391 myös kompetitiivisten määritysmenetelmien samoin kuin muiden alalla tunnettujen menetelmien tapauksessa. Ilmaisu "annetaan sopivissa olosuhteissa muodostua olennaisessa määrin" spesifisen sitoutumisreaktion tuotteita käsittää 5 tässä monia erilaisia määritysreagenssien lisäys- ja reagointi järjestyksen muunnelmia.
Edellä kuvatut määritykset voivat olla heterogeenisia tai homogeenisia. Heterogeenisissa määrityksissä reaktiotuotteet, joiden muodostuminen on verrannollinen analy-10 soitavan aineen esiintymiseen näytteessä, erotetaan muista reaktiotuotteista. Erotus voidaan tehdä millä tavalla tahansa mukaan luettuina, ilman rajoitustarkoitusta, neste-faasin erotus kiinteästä faasista suodattamalla, mikrosuo-datus, kaksoisvasta-ainesaostus, sentrifugointi, koon mu-15 kaan erotteleva kromatografia, kiinteän faasin (esim. mittatikun) poisto näyteliuoksesta ja elektroforeesi. Esimerkiksi kerrosmäärityksessä reaktantin, analysoitavan aineen ja herkistinkonjugaatin kompleksi erotetaan reagoimattomasta herkistinkonjugaatista. Pinta-antigeenimäärityksessä 20 analysoitavan aineen ja herkistinkonjugaatin kompleksi erotetaan reagoimattomasta herkistinkonjugaatista. Kompe-titiivisessa määrityksessä reaktantti-herkistinkonjugaat-tikompleksi erotetaan reagoimattomasta herkistinkonjugaatista. Peräkkäiskyllästysmäärityksessä ja kompetitiivises-25 sa korvausmäärityksessä reaktantti-herkistinkonjugaatti- kompleksi erotetaan reagoimattomasta herkistinkonjugaatista. Toisaalta homogeenisissä määrityksissä reaktiotuotteita ei eroteta. Sen jälkeen kun määritysreagenssien on annettu reagoida, signaali voidaan mitata koko määritysseok-30 sesta, onpa seos sitten liuoksessa, kiinteän faasin pinnalla tai jakautuneena mittatikun tai muun kiinteän kanta- • < jän erilaisten kalvokerrosten väliin. Vaimennusmääritys on kuvaava esimerkki kompleksisesta homogeenisesta määrityksestä, jossa erottaminen on tarpeetonta. Pidetään mahdol-35 lisena, että mikä määritysmenetelmien ryhmä tahansa saat- • c l2 104391 taa tuottaa joko heterogeenisia tai homogeenisia menetelmiä.
Toinen esimerkki homogeenisesta määrityksestä on esitetty EP-hakemuksessa 823 03699.1, joka on julkaistu 5 16. lokakuuta 1985 (julkaisunumero 070 685) ja joka maini taan tässä viitteenä. Tässä julkaisussa on esitetty homogeeninen hybridisaatiomääritys, jossa käytetään kahta koe-tinta, joista toinen leimataan kemiluminesoivalla ryhmällä ja toinen absorboija-/emittoijaryhmällä. Määritys voidaan 10 tehdä liuoksessa tarvitsematta ryhtyä minkäänlaisiin immo-bilisointitoimenpiteisiin. Tässä keksinnössä valitaan edullisesti kaksi DNA-säiettä, joita luetaan vastakkaisista päistä. Toinen säie leimataan edullisesti kemiluminesoivalla ryhmällä, jonka virittynyt tila saa aikaan suuren 15 fluoresenssikvanttituoton. Toinen säie leimataan edullisesti herkistimellä, joka eksitoidaan toisen leimausaineen avulla. Kemiluminesoiva ryhmä voitaisiin vaihtoehtoisesti korvata raskaan atomin (I tai Br) sisältävällä yhdisteellä, joka muuntaisi toisessa säikeessä olevan leimausher-20 kistimen systeeminsisäisellä vaihdolla heikosta herkisti -mestä voimakkaaksi sellaisen raskaan atomin sisältävän yhdisteen ollessa leimausherkistimen välittömässä läheisyydessä .
Edellä esitetyn lisäksi herkistinleimausaineita . 25 voidaan käyttää DNA:n sekventointiin. Nykyisessä DNA:n sekventoinnissa käytetään neljää eri fluoresenssiväriä, yhtä kunkin emäksistä A, T, C ja G kanssa reagointia varten. Tässä keksinnössä voidaan käyttää neljää herkistintä, joilla kullakin on eri eksitaatioaallonpituus, yhdessä 30 neljän suodattimen kanssa asianomaisten herkistimien eksi-toimiseksi perätysten.
« Määrityksissä, joissa käytetään hyväksi herkistin-konjugaattia, analysoitavan aineen esiintyminen voidaan havaita eksitoimalla herkistin sopivan säteilyn tai muun 35 ärsykkeen (esim. elektroninsiirron, elektrolyysin, elekt- 13 104391 roluminesenssln tai energiansiirron) avulla. Virittynyt herkistin reagoi sitten "välireagenssin" (so. molekulaari-sen hapen tai leukovärin) kanssa. Syntyvät tuotteet ja jatkoreaktiot määräytyvät sen mukaan, mitä välireagenssi-5 lajia käytetään.
Välireagenssin ollessa molekulaarinen happi syntyy singlettitilassa olevaa molekulaarista happea ja herkistin palaa alkuperäiseen virittymättömään tilaansa. Singlettitilassa oleva molekulaarinen happi reagoi sitten olefiinin 10 kanssa, jolloin muodostuu joko dioksetaania tai peroksi-dia. Olefiinille on tunnusomaista seuraava yleiskaava:
Rl-^ ^R3 15 R2^ ^R4 jossa Rl, R2, R3 ja R4 ovat mitä tahansa ryhmiä. Joissakin tapauksissa Rl, R2, R3 ja/tai R4 voivat olla liittyneet 20 toisiinsa muodostaen renkaan tai rengasmaisia rakenteita, joista ovat esimerkkejä seuraavat rakenteet 1 ja 4: 30 ^ CHj (1) (4) 14 104391 j
Missä tahansa määrätyssä olefUnissa kussakin ryhmistä Rl, R2, R3 ja R4 lähinnä kaksoissidosta sijaitsevan hiiliatomin ("viereisen hiiliatomin") luonne määrää sen, muodostuuko olefiinin ja singlettitilassa olevan molekulaarisen 5 hapen välisessä reaktiossa dioksetaania vai peroksidia.
Jos kaikki viereiset hiiliatomit (a) ovat sillanpääasemia tai (b) eivät yksikään sisällä vetyatomeja, muodostuu dioksetaania. Esimerkkinä: 10 herkistin1 herkistin ch5 ch3 (l) (2) 20
Kuumennettaessa dioksetaani hajoaa tuottaen havaittavissa olevan fotonin. Esimerkkinä: 25 ' 17^ fotoni + kuumennus ^
30 kJL.JLJ OOC
CH1 ? (2) (3)
Substituoidut olefiinit, jotka sisältävät substituenttien-35 sa joukossa elektroneja luovuttavia ryhmiä, ovat edullisia 104391 15 tämänä keksinnön soveltamista käytännössä ajatellen, koska ne tuottavat dioksetaaneja, joiden hajotessa kvanttituotto ' on suurempi. Edullisesti Rl, R2, R3 ja/tai R4 ovat liitty neet yhteen muodostaen fluoresoivan rengasmaisen ryhmän.
5 Esimerkiksi edellä esitetyssä rakenteessa 1 Rl ja R2 muodostavat N-metyyliakridaanin. Sisältäessään "toisessa päässä" fluoresoivan ryhmän olefiini johtaa syntyvästä dioksetaanista peräisin olevan kvanttituoton kohoamiseen edelleen.
10 Mikäli yksi tai useampi viereisistä hiiliatomeista (a) ei ole sillanpääasema tai (b) sisältää ainakin yhden vetyatomin, muodostuu peroksidia. Kuumennettaessa diokse-taani hajoaa myös synnyttäen havaittavissa olevan (joskin heikon) fotoniemission. Vaihtoehtoisesti peroksidi voidaan 15 käyttää kromogeenin hapettamiseen, jolloin saadaan aikaan havaittavissa oleva värinmuutos tai fluoresenssi.
Välireagenssin ollessa leukoväri virittynyt herkistin pelkistetään leukovärillä. Hapettunut leukoväri muuttuu näkyväksi ja on havaittavissa seurauksena olevan vä-20 rinmuutoksen tai fluoresenssin perusteella. Pelkistyneen herkistimen voidaan myös antaa reagoida molekulaarisen hapen kanssa vetyperoksidin tuottamiseksi ja herkistimen palauttamiseksi alkuperäiseen virittymättömään tilaansa. Vetyperoksidi voidaan käyttää kromogeenin hapettamiseen ha-25 väittävissä olevan värinmuutoksen tai fluoresenssin ai- · kaansaamiseksi tai kemiluminesoivan ryhmän hapettamiseksi, jolloin syntyy havaittavissa oleva fotoni. Leukovärit ovat värejä (esimerkkeinä hydroksiantrakinonit ja metyleenisi-ninen), jotka ovat pelkistyneessä muodossaan värittömiä ja 30 muuttuvat hapetettaessa värillisiksi. Esimerkkejä leukovä-' .. reistä on esitetty teoksessa The Chemistry of Synthetic
Dyes, osat I - IX, jonka on toimittanut K. Venkataraman (Academic Press, New York, 1978), ja teoksessa Singlet Molecular Oxygen, jonka on toimittanut A. Paul Schaap 1 • · · 16 104391 j (Bowden, Hutchinson and Ross, 1976), jotka teokset mainitaan tässä kokonaisuudessaan lähdeviitteinä.
Koska stimuloituva herkistinmäärä on korreloitavissa analysoitavan aineen esiintymisen kanssa, edellä käsi-5 teltyjen reaktioiden synnyttämä signaali (so. fotoni tai värinmuutos tai fluoresenssi) voidaan myös saada korreloimaan analysoitavan aineen esiintymisen tai määrän kanssa näytteessä.
"Kromogeenit", jotka peroksideilla hapetettaessa 10 aiheuttavat värin muuttumisen tai fluoresenssin, ovat alalla tunnettuja yhdisteitä. Sopivia värinmuutoksen aikaansaavia "kromogeeneja" ovat, ilman rajoitustarkoitusta, bentsidiini ja sen johdannaiset. Sopivia fluoresenssin aikaansaavia "kromogeeneja" ovat, ilman rajoitustarkoitusta, 15 fluoresiini (so. dihydrofluoreseiini) ja sen johdannaiset.
Ilmaisu "antamalla sopivissa olosuhteissa" käsittää, ilman rajoitustarkoitusta ja sen ollessa olennaista, niiden spesifisen sitoutumisreaktion tuotteiden, joiden muodostuminen on verrannollinen analysoitavan aineen 20 esiintymiseen näytteessä, erottamisen muista reaktiotuotteista, minkä tahansa spesifisen’ sitoutumisreaktion tuotteen sisältämän herkistinkonjugaatin eksitoinnin, muiden reagenssien (so. olefiinin, leukovärin, kromogeenin tai kemiluminesoivan osan) lisäyksen ja/tai dioksetaanin tai ;· 25 peroksidin kuumentamisen sen hajoamisen indusoimiseksi, värinmuutoksen tai fluoresenssin mittaamisen millä tavalla tahansa (esim. visuaalisesti tai absorption, heijastusky-vyn tai fluoresenssin avulla).
Esimerkki I
30 Herkistinkonjugaatin muodostamiseksi pyreenivoihap- po liitettiin kinaasilla käsitellyn synteettisen oligonuk-leotidin 5'-terminaaliseen fosfaattiin (20 emästä; sekvenssi: 5'-TTCAATCATGCGAAACGATC-3') heksaanidiamiinikytki-jän kautta, kuten alla on esitetty: 1 35 · ' 17 104391
O
II
oligonukleotldi —5’—O— P—0“ O"
li K> AZOLE CDI
T
o
II
oligonukleotldi —31—-0—P— N-a A- 10 " NH2CCH2)6NH2 f o
II
15 oligonukleotldi — 51— 0-P—NMCH^gNHj o- / 0 P)N-0“C(CH2)3 20 0 O0l T0Q)
V
25 0 0
Il II
oligonukleotldi —3·—0— P—NH(CH2)6NH- C(CH2) 3 οάι 30 Ί0®
Oligonukleotldi syntetisoitiin automaattisella syn-tetisointilaitteella (kaupallisesti saatavissa Applied Biosystemsiltä, Foster City, CA 94404; malli 380B). 2 2 · < 18 104391
Oligonukleotidi (2,5 μg) muunnettiin 5'-fosfori-imidatsolidiksi käsittelemällä sitä 0,1 M 1-metyyli-imi-datsolipuskuriin (pH 7,8) tehdyllä 0,1 M l-etyyli-3,3-di-metyyliaminopropyylikarbodi-imidiliuoksella (CDI) huoneen 5 lämpötilassa 1 tunnin ajan samalla voimakkaasti ravistaen. Tuote muunnettiin 5'-heksaanidiamiiniadditiotuotteeksi käsittelemällä sitä 0,25 M heksaanidiamiinilla (pH 7,8) 50 °C:ssa 1 tunnin ajan.
Pyreenillä (herkistin) leimattu oligonukleotidi 10 muodostettiin antamalla 5 '-heksaanidiamiiniadditiotuotteen reagoida pyreenivoihapon kanssa, joka oli N-hydroksisuk-kiini-imidyyliesterinsä muodossa ja 0,25 M liuoksena l-metyyli-imidatsolipuskurissa (pH 7,8), huoneenlämpötilassa .
15 Olefiini, 9-(adamantylideeni)-N-metyyliakridaani (edellä esitetty rakenne 1), syntetisoitiin seuraavasti: N-metyyliakridaani (15,2 g, 0,074 mol) ja fosforipentasul-fidi (10,3 g, 0,046 mol) sekoitettiin kuivaan pyridiiniin (470 ml), ja seosta refluksoitiin 1 tunti. Liuoksen jääh-20 dytyksen jälkeen punaiset kiteet kerättiin talteen. Kiteytettäessä ne uudelleen ksyleenistä saatiin 12,5 g N-metyy-liakridonitionia.
Kuivaan natriumhydridiin lisättiin adamantanoni-p-tolyylihydratsonia ja trifenyylifosfiinia dimetyyliaseta-·:' 25 midissa (DMA) , ja seosta kuumennettiin 120 °C:ssa 20 mi nuuttia. Reaktioseokseen lisättiin N-metyyliakridonitio-nia, ja uutta seosta refluksoitiin 2 tuntia. Liuos jäähdytettiin, ja kerätty kiinteä aine kiteytettiin uudelleen ksyleenistä. Tulokseksi saatu tuote käsiteltiin kromato-30 grafisesti silikageelillä käyttäen eluenttina tolueenia.
Ensimmäinen jae (Rf = 0,8) otettiin talteen. Tolueeni haihdutettiin ja tulokseksi saatu 9-(adamantylideeni)-N-metyyliakridaani kiteytettiin uudelleen asetonista.
Tehtäessä nukleiinihappohybridisaatiomääritys DNA 35 immobilisoitiin nailonsuodattimille (kaupallisesti saata- • · 19 104391 vissa nimellä Hybond Amershamilta, GB) alalla tunnetuin menetelmin. Tavanomaisessa Southern-täplämenettelyssä, jossa käytettiin koettimena herkistimellä leimattua oligonukleotidia, käytettiin kohteina komplementaarista nukleo-5 tidia ("Sorneo") ja ei-komplementaarista (so. vertailu) oligonukleotidia ("pAT 153"). Kohdeoligonukleotidit määritettiin pitoisuuksilla 0,2 μg, 0,02 μg ja 0,002 μg. Näyte keskitettiin täpläksi, jonka koko oli 2x2 cm. Hybridisaatio toteutettiin 200 μg:lla/ml herkistimellä leimattua 10 oligonukleotidia 37 °C:ssa hybridisaatiopuskurissa (6 x SSC, 0,5 % SDS, 110 x Denhardts) 2 tunnin aikana, ja pesu tehtiin tavanomaisella tavalla.
Hybridisaation jälkeen ja pesun päätyttyä kuhunkin hybridisaatiotäplään lisättiin 50 μΐ 1 x 10'6 M 9-(adaman-15 tylideeni)-N-metyyliakridaanin diklooritolueeniliuosta.
Kutakin täplää säteilytettiin ultraviolettivalonlähteellä (150 W:n ksenonkaarilampulla) 10 minuuttia ympäröivän mo-lekulaarisen hapen ollessa läsnä. Puolet täplistä kuumennettiin myös 100 °C:seen välittömästi säteilytyksen jäl-20 keen säteilytettäessä muodostuneen dioksetaanin hajoamisen indusoimiseksi.
Hajoavien dioksetaanien luminesenssi mitattiin käyttämällä valomonistinputkea (kaupallisesti saatavissa Thorn EMI:Itä; tyyppi 9813 QB) , jota pidettiin 0 °C:ssa ; 25 tavanomaisen termoelektrisesti jäähdytettävän vaipan si sällä. Mitattavat näytteet laitettiin kuumennusalustalla olevan valotiiviin kammion sisään. Kuumennustason sisään asennettu termopari mahdollisti suoraan kuumennustason alle sijoitettujen kuumennuselementtien lämpötilan sääte-30 lyn (±0,1 °C:n tarkkuudella alueella 30 - 300 °C). Näyte-- kenno suljettiin myös hermeettisesti, jotta mittaus voi- tiin tehdä halutussa atmosfäärissä.
. Yhteenveto luminesenssimittauksista on esitetty taulukoissa 1 ja 2.
t • · < 35 20 104391
Taulukko 1
Luminesenssi huoneen lämpötilassa
Luminesens s i* 5 Pitoisuus1* Sorneo pAt 153 0,2 pg 9,6845 5,7100 0,02 μg 8,8377 8,5845 0,002 μg 16,450 17,151 aSykäykset 102; tausta (sama menettely käyttämättä koe-10 tinta) 5,6092 · 102 b Kohdenukleotidin pit.
Taulukko 2
Luminesenssi 100 °C:ssa 15
Luminesenssi* Väkevyys1* Sorneo pAt 153 0,2 μg 6253,5 498,57 0,02 μg 23,905 17,023 20 0,002 μg 658,14 136,08 aSykäykset · 102; tausta (sama menettely käyttämättä koe-tinta) 14,933 102 b Kohdenukleotidin pit.
·: 25 Vaikka tulokset saatiin karkealla ja kehittymättö mällä määritysohjelmalla, kuumennus synnytti kussakin tapauksessa voimakkaamman signaalin ja komplementaarinen kohde tuotti enemmän sykäyksiä kuin vertailukohde. Tavat tämän määritysmenettelyn parantamiseksi (esim. kunkin rea-30 genssityypin parempi poispesu, inhibiittoreiden lisäys olefiinin autoksidaation vähentämiseksi, tehokkaampien a herkistimien käyttö, herkistimen absorboima primaarinen aallonpituus huomioon ottaen tarkoituksenmukaisten suodattimien käyttö, täplän jäähdytys sitä säteilytettäessä, 35 kuumennusnopeuden säätely ja/tai optimointi, reaktiivisten • a 21 104391 olefUnien käyttö, enemmän valoa tuottavia dioksetaaneja muodostavien olefiinien käyttö sekä liuottimien käyttö singlettihapen migraation edistämiseksi) ovat alan ammattilaisille ilman muuta tuttuja.
5 Esimerkki II
Edellisen esimerkin mukaista koetinmääritystä voidaan käyttää porfyriinilla leimattujen oligonukleotidien yhteydessä. Porfyyrlinilla (herkistin) leimattu oligonuk-leotidi voidaan muodostaa käyttämällä alla esitettyä N6-10 (6-aminoheksyyli)-dATP;tä (tästä eteenpäin "AHdATP"): NH(CH2)6NH2 °"
Q
20 H0 DNA:lie tehdään "nick"-translaatio tunnetuin tavoin AHdATP:n läsnä ollessa sellaisten DNA-säikeiden muodostamiseksi, jotka sisältävät esillä olevia funktionaalisia NH2-ryhmiä. Tämän tuotteen annetaan reagoida NHS-esteri- • · 25 porfyriinikonjugaatin kanssa DMF/H20:n läsnä ollessa tunnetuin tavoin, jolloin muodostuu DNA-säikeitä, joihin on liittynyt ryhmiä: 0
II
-NHC-porfyriinileima 30
,·: Esimerkki III
Edellisten esimerkkien mukainen koetinmääritys toistettiin käyttäen leimausaineena protoporfyriinin di-natriumsuolaa. 5 μΐ dCTP:tä, dGTP:tä ja dTTP:tä (20 μΜ) 35 lisättiin seokseen, joka sisälsi 1 μΐ testi-DNA:ta (pUG), • « 22 104391 f 3 μΐ 0,4 mM AHdATP:tä ja 10 μΐ vettä. Lyhyen sekoituksen jälkeen lisättiin 5 μΐ DNA-polymeraasi I:tä. Seosta inku-boitiin sitten 15 °C:ssa 60 minuuttia. Liittymistä seurattiin tunnetuin tavoin. Aminoheksaaliryhmällä leimattu DNA 5 erotettiin sitten liittymättömistä nukleotideista ekskluu-siokromatografiän avulla Sephadex G-50 -pylväässä käyttäen eluenttina 1 x 5SC-liuosta, joka sisälsi 0,1 % SDS:ää. Jakeet kerättiin, ja sen jälkeen tehtiin saostus EtOH:lla. Sen jälkeen kun leimatun DNA:n oli annettu reagoida esi-10 merkin II mukaisesti NHS-esteri-protoporfyriinikonjugaatin kanssa, tehtiin koetinmääritys esimerkin I mukaisesti. DNA immobilisoitiin nailonsuodattimille. Tavanomaisessa Southern-täplämenettelyssä, jossa käytettiin koettimena herkistimellä leimattua oligonukleotidia esimerkin I mu-15 kaisesti, käytettiin kohteena komplementaarista oligonuk leotidia. Syntyneet täplät kuumennettiin 100 °C:seen välittömästi säteilytyksen jälkeen säteilytettäessä muodostuneen dioksetaanin hajoamisen indusoimiseksi.
20 Taulukko 3
Luminesenssi 100 °C:ssa 1 minuutin aikana
Sykäykset 1. Sykäykset 2.
määrityksessä määrityksessä
Kohteen pitoisuus (piikin korkeus) (piikin korkeus) ·; 25 100 μg 1,58 2,67
> · I
10 μg 1,02 1,65 1 μg 0,69 1,03 0,1 μg 0,49 0,88 0,01 μg 0,37 0,74 30 nollakoe 0,16 0,059 • (
Esimerkki IV
Esimerkki III toistettiin käyttäen leimausaineina samanaikaisesti protoporfyriinin dinatriumsuolaa ja 32P:ta 35 määrityksen herkkyyden vertaamiseksi näitä kahta leimaus- * • i 23 104391 ainetta käytettäessä. Esimerkin III mukaiseen seokseen lisättiin 1 μΐ 32P-dCTP:tä, ennen kuin lisättiin 5 μΐ DNA-’ polymeraasi I:tä. Määritys tehtiin käyttämällä seuraavia kohde-DNA:n pitoisuuksia: 100 μg, 10 μ%, 1 μgl 0,1 μg, 5 0,01 μg, 0,005 μg, nollakoe. Kuviossa 2 esitetyt tulokset, jotka saatiin kuumennettaessa täpliä 100 °C:ssa 1 minuutin ajan, osoittavat detektiorajaksi edellä esitetyssä määrityksessä 0 , 005 μ9 kohde-DNA:ta. Toisaalta 32P-leimausaineen tapauksessa 24 tunnin säteilytysajalla tavanomaisessa kallo vodetektiosysteemissä detektioraja oli vastaava.
Tässä esimerkissä IV ei yritetty alentaa taustaa herkistinleimausaineen tapauksessa. Herkistimet voidaan valita tiettyihin aallonpituuksiin kohdistuvan herkkyyden perusteella, jotka aallonpituudet poikkeavat taustamateri-15 aalien eksitaation (yleisesti tunnettujen peroksidien muodostuminen mukaan luettuna) aallonpituudesta. Esimerkiksi herkistimenä voidaan käyttää metyleenisinistä tai pyreeniä ja mukaan voidaan liittää eksitaatiosuodatin, niin että ainoastaan ne aallonpituudet, jotka eksitoivat nämä her-20 kistimet, johtavat singlettihapen muodostumiseen. Kalvon kuumennus voi synnyttää yleisten peroksidien kuumenemisesta aiheutuvaa taustavaloa. Dioksetaanien hajoamisen käynnistäminen alemmilla lämpötiloilla auttaa alempien tausta-lukemien saavuttamista, erityisesti kyseisten lämpötilojen ·: 25 ollessa paljon alempia kuin taustavaloa synnyttävä lämpö- • · ' tila. Lopuksi olefiini pitäisi valita niin, että syntyy dioksetaania, joka emittoi eri aallonpituudella kuin tausta. Silloin voidaan valita taustaa alentava emissiosuoda-tin. Näiden ja muiden parannusten odotetaan lisäävän mer-30 kittävästi herkistinleimausta hyväksi käyttävien määritys-- # ten herkkyyttä.
» I
Edellä esitetyn perusteella on alan tämän alan ammattilaisille selvää, että edellä kuvattuihin menetelmiin, koostumuksiin ja valmistettuihin tuotteisiin voidaan tehdä 35 monenlaisia muutoksia poikkeamatta keksinnön hengestä ja • • 24 104391 piiristä. Keksintöä voidaan siis ilmentää muillakin erikoismuodoilla poikkeamatta sen hengestä tai olennaisista ominaispiirteistä. Tässä esitettyjä toteutusmuotoja ja esimerkkejä tulee sen vuoksi pitää kaikissa suhteissa il-5 lustratiivisina eikä rajoittavina oheisten patenttivaatimusten mieluummin kuin edellä esitetyn osoittaessa keksinnön piiriin, ja niiden on tarkoitus kattaa kaikki sellaiset muutokset, jotka kuuluvat patenttivaatimusten tarkoituksen ja vastaavuusalueen piiriin.
• · ' • · • « v • ·

Claims (45)

1. Spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys analysoitavan aineen esiintymisen selvittämiseksi näyt-5 teestä, tunnettu siitä, että määrityksessä (i) käytetään hyväksi herkistinkonjugaattia, joka sisältää herkistintä liittyneenä spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, ja (ii) analysoitavan aineen esiintyminen näytteessä on verrannollinen yhden tai useamman spesifisen sitoutu-10 misreaktion herkistinkonjugaattia sisältävän tuotteen muodostumiseen ja määrityksessä annetaan sopivissa olosuhteissa muodostua olennaisessa määrin yhtä tai useampaa spesifisen sitoutumisreaktion tuotetta, joka sisältää herkistinkonjugaattia; (A) annetaan (i) herkistimen, joka 15 sisältyy yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion herkistinkonjugaattia sisältävään tuotteeseen, tai (ii) herkistimen, joka sisältyy siihen herkistinkonjugaat-tiin, joka ei sisälly yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion tuotteeseen, virittyä sopivissa olosuh-20 teissä ja (B) annetaan (i) virittyneen herkistimen, joka sisältyy yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion herkistinkonjugaattia sisältävään tuotteeseen, tai (ii) virittyneen herkistimen, joka sisältyy siihen herkis-tinkonjugaattiin, joka ei sisälly yhteen tai useampaan 25 spesifisen sitoutumisreaktion tuotteeseen, reagoida sopi vissa olosuhteissa molekulaarisen hapen kanssa, jolloin syntyy singlettitilassa olevaa molekulaarista happea, joka soveltuu reaktioon, jonka on tarkoitus aiheuttaa havaittavissa (detektoitavissa) oleva signaali; ja mitataan ha-30 väittävissä oleva signaali.
*’· 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen spesifiseen si toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että spesifisesti'sitoutuva aine kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoitavaan aineeseen ja yksi tai useampi 35 spesifisen sitoutumisreaktion tuote on analysoitavan ai- , neen ja herkistinkonjugaatin kompleksi. • · 26 104391
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että käytetään lisäksi reagoivaa ainetta (reaktanttia), joka kykenee sitoutumaan spesifisesti (i) analysoitavaan 5 aineeseen muodostaen analysoitavan aineen ja reaktantin kompleksin sekä (ii) spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, jolloin muodostuu herkistinkonjugaatti-reaktanttikomplek-si, ja että yksi tai useampi spesifisen sitoutumisreaktion tuote on herkistinkonjugaatti-reaktanttikompleksi.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen spesifiseen si toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että spesifisesti sitoutuva aine kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoitavaan aineeseen ja että lisäksi käytetään reaktanttia, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti 15 analysoitavaan aineeseen, jolloin muodostuu reaktantin, analysoitavan aineen ja herkistinkonjugaatin kompleksi, ja että yksi tai useampi spesifisen sitoutumisreaktion tuote on reaktantin, analysoitavan aineen ja herkistinkonjugaa-tin kompleksi.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että herkistin on jokin väri, porfyriini, metalloporfyrii-ni, aromaattinen hiilivety, heterosyklinen yhdiste tai flaviinijohdannainen. "25
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että herkistin on pyreeni tai metyleenisininen.
7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, 30 että porfyriini on protoporfyriinin dimetyyliesteri, pro-toporfyriinin dinatriumsuola, metyylipyrroporfiinin etyy-liesteri, metyylipyrroporfiini, tetrafenyyliporfiini, ko-porfyriini tai hematoporfyriini.
8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen spesifiseen si- 35 toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, , että herkistin on ftalosyaniini, hemiini tai rodamiini. « 27 104391
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että singlettitilassa oleva molekulaarinen happi reagoi olefiinin kanssa muodostaen dioksetaani- tai peroksidiryh- 5 män.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että ryhmä hajoaa kuumennettaessa aiheuttaen havaittavissa olevan signaalin fotonin muodossa.
11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen spesifiseen si toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että peroksidi hapettaa kromogeenin aiheuttaen havaittavissa olevan signaalin kromogeenin värinmuutoksen tai fluoresenssin muodossa.
12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen spesifiseen si toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että olefiini on substituoitu olefiini.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, 20 että substituoitu olefiini sisältää ainakin yhden substi- tuentin, joka on elektroneja luovuttava ryhmä.
14. Patenttivaatimuksen 12 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että vähintään kaksi substituoidun olefiinin substituen- 25 teista on liittynyt yhteen muodostaen rengasmaisen fluoresoivan ryhmän.
15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että substituoidulla olefiinilla on kaava 28 104391 ίΓΊ 10 * CHj
16. Spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys analysoitavan aineen esiintymisen selvittämiseksi näytteestä, tunnettu siitä, että määrityksessä (i) 15 käytetään hyväksi herkistinkonjugaattia, joka sisältää herkistintä liittyneenä spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, ja (ii) analysoitavan aineen esiintyminen näytteessä on verrannollinen yhden tai useamman spesifisen sitoutu-misreaktion herkistinkonjugaattia sisältävän tuotteen muo-20 dostumiseen, ja määrityksessä annetaan sopivissa olosuhteissa muodostua olennaisessa määrin yhtä tai useampaa spesifisen sitoutumisreaktion tuotetta, joka sisältää herkistinkonjugaattia; (A) annetaan (i) herkistimen, joka sisältyy yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreak- • t 25 tion herkistinkonjugaattia sisältävään tuotteeseen, tai (ii) herkistimen, joka sisältyy siihen herkistinkonjugaat-tiin, joka ei sisälly yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion tuotteeseen, virittyä sopivissa olosuhteissa ja (B) annetaan (i) virittyneen herkistimen, joka 30 sisältyy yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreak-· tion herkistinkonjugaattia sisältävään tuotteeseen, tai (ii) virittyneen herkistimen, joka sisältyy siihen herkis-tinkonjugaattiin, joka ei sisälly yhteen tai useampaan spesifisen sitoutumisreaktion tuotteeseen, reagoida sopi-35 vissa olosuhteissa leukovärin kanssa havaittavissa olevan • •1 29 104391 signaalin aikaansaamiseksi; ja mitataan havaittavissa oleva signaali.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, 5 että spesifisesti sitoutuva aine kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoitavaan aineeseen ja yksi tai useampi spesifisen sitoutumisreaktion tuote on analysoitavan aineen ja herkistinkonjugaatin kompleksi.
18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen spesifiseen si- 10 toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että käytetään lisäksi reaktanttia, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti (i) analysoitavaan aineeseen muodostaen analysoitavan aineen ja reaktantin kompleksin sekä (ii) spesifisesti sitoutuvaan aineeseen, jolloin muodostuu her- 15 kistinkonjugaatti-reaktanttikompleksi, ja että yksi tai useampi spesifisen sitoutumisreaktion tuote on herkistin-konjugaatti-reaktanttikompleksi.
19. Patenttivaatimuksen 16 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, 20 että spesifisesti sitoutuva aine kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoitavaan aineeseen ja että lisäksi käytetään reaktanttia, joka kykenee sitoutumaan spesifisesti analysoitavaan aineeseen, jolloin muodostuu reaktantin, analysoitavan aineen ja herkistinkonjugaatin kompleksi, ja • · ' 25 että yksi tai useampi spesifisen sitoutumisreaktion tuote on reaktantin, analysoitavan aineen ja herkistinkonjugaatin kompleksi.
20. Patenttivaatimuksen 16 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, 30 että herkistin on jokin väri, porfyriini, metalloporfyrii- · ni, aromaattinen hiilivety, heterosyklinen yhdiste tai flaviinijohdannainen.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, 35 että herkistin on pyreeni tai metyleenisininen. I I 30 104391
22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että porfyriini on protoporfyriinin dimetyyliesteri, pro-toporfyriinin dinatriumsuola, metyylipyrroporfiinin etyy- 5 liesteri, metyylipyrroporfiini, tetrafenyyliporfiini, ko-porfyriini tai hematoporfyriini.
23. Patenttivaatimuksen 20 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että herkistin on ftalosyaniini, hemiini tai rodamiini.
24. Patenttivaatimuksen 16 mukainen spesifiseen si toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että leukoväri hapetetaan havaittavissa olevan signaalin aikaansaamiseksi leukovärin värinmuutoksen tai fluoresenssin muodossa.
25 I
25. Patenttivaatimuksen 16 mukainen spesifiseen si toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että virittynyt herkistin pelkistetään leukovärillä ja hapetetaan sen jälkeen reaktiolla molekulaarisen hapen kanssa, jolloin syntyy vetyperoksidia.
25 1 0 4 3 91
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen spesifiseen si toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että vetyperoksidi hapettaa kromogeenin aiheuttaen havaittavissa olevan signaalin kromogeenin värinmuutoksen ta: fluoresenssin muodossa. • ·
27. Patenttivaatimuksen 25 mukainen spesifiseen si toutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että vetyperoksidi hapettaa kemiluminesoivan ryhmän aiheuttaen havaittavissa olevan signaalin fotonin muodossa.
28. Spesifiseen sitoutumiseen perustuvaan määrityk- 30 seen tarkoitettu pakkaus, joka soveltuu käytettäväksi pa-·· tenttivaatimuksen 1 mukaisessa spesifiseen sitoutumiseen perustuvassa määrityksessä, tunnettu siitä, että se sisältää ensimmäisen pienen pullon, joka sisältää her-kistinkonjugaattia, jossa herkistin on liittyneenä spesi- 35 fisesti sitoutuvaan aineeseen; ja toisen pienen pullon, joka sisältää olefiinia tai leukoväriä. ^ « 31 104391
29. Patenttivaatimuksen 28 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että herkistin on jokin väri, por-fyriini, metalloporfyriini, aromaattinen hiilivety tai f1aviinijohdannainen.
30 CH, «« *
30. Patenttivaatimuksen 28 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että toinen pullo sisältää olefii-nia.
31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että olefiini on substituoitu ole- 10 fiini.
32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että substituoitu olefiini sisältää ainakin yhden substituentin, joka on elektroneja luovuttava ryhmä.
33. Patenttivaatimuksen 31 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että vähintään kaksi substituoidun olefiinin substituenteista on liittynyt yhteen muodostaen rengasmaisen fluoresoivan ryhmän.
34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen pakkaus, 20 tunnettu siitä, että substituoidulla olefiinilla on kaava
35. Patenttivaatimuksen 28 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että toinen pullo sisältää leuko-väriä. $ 0 - 32 104391
36. Herkistinkonjugaatti, tunnettu siitä, että se sisältää herkistintä liittyneenä spesifiseen sitoutuvaan aineeseen, joka herkistin on viritetty säteilyn tai muun kemiallisen tai fysikaalisen ärsykkeen avulla 5 virittyneeseen tripletti-tilaan ja joka (a) sen jälkeen saatetaan reagoimaan molekylaarisen hapen kanssa tuottamaan singlet-tilassa olevaa molekulaarista happea, tai joka (b) sen jälkeen saatetaan reagoimaan leukovärin kanssa aiheuttamaan värinmuutoksen tai (c) sen jälkeen saate-10 taan reagoimaan leukovärin kanssa, jolloin herkistin, omaksuu pelkistyneen muodon, josta se palautetaan alkuperäiseen tilaansa reaktiolla singlet-hapen kanssa, jonka seurauksena syntyy vetyperoksidia, ja vetyperoksidia voidaan joko käyttää signaalina analysoitavan aineen määrän 15 määrittämiseksi tai käyttää muissa kemiallisissa reaktioissa, jotka osoittavat analysoitavan aineen määrän.
37. Patenttivaatimuksen 36 mukainen herkistinkonjugaatti, tunnettu siitä, että herkistin on jokin väri, porfyriini, metalloporfyriini, aromaattinen hiilive- 20 ty, heterosyklinen yhdiste tai flaviinijohdannainen.
38. Patenttivaatimuksen 37 mukainen herkistinkonjugaatti, tunnettu siitä, että herkistin on pyreeni tai metyleenisininen.
39. Patenttivaatimuksen 37 mukainen herkistinkonju-, > · < 25 gaatti, tunnettu siitä, että herkistin on proto-porfyriinin dimetyyliesteri, protoporfyriinin dinatrium-suola, metyylipyrroporfiinin etyyliesteri, metyylipyrro-porfiini, tetrafenyyliporfiini, koporfyriini tai hemato-porfyriini.
40. Patenttivaatimuksen 37 mukainen herkistinkonju gaatti, tunnettu siitä, että herkistin on ftalo-syaniini, hemiini tai rodamiini.
41. Patenttivaatimuksen 36 mukainen herkistinkonjugaatti, tunnettu siitä, että spesifisesti sitou-35 tuva aine sitoutuu spesifisesti joko A-, T-, C- tai G-emäkseen. « 33 1 0 4 3 91
42. Patenttivaatimuksen 36 mukainen herkistinkonju- . gaatti, tunnettu siitä, että spesifisesti sitou tuva aine sitoutuu spesifisesti polynukleotidijaksoon.
43. Patenttivaatimuksen 36 mukainen herkistinkonju- 5 gaatti, tunnettu siitä, että spesifisesti sitou tuva aine sitoutuu spesifisesti proteiiniin tai proteiini -konjugaattiin.
44. Patenttivaatimuksen 36 mukainen herkistinkonju-gaatti, tunnettu siitä, että spesifinen aine on 10 vasta-aine tai sisältää vasta-ainefragmentin.
45. Patenttivaatimuksen 1 tai 16 mukainen spesifiseen sitoutumiseen perustuva määritys, tunnettu siitä, että herkistinkonjugaatti sisältää herkistintä liittyneenä ensimmäiseen yksisäikeiseen polynukleotidijak- 15 soon ja että lisäksi käytetään kemiluminesoivan ryhmän konjugaattia, joka sisältää kemiluminesoivan ryhmän liittyneenä toiseen yksisäikeiseen polynukleotidijaksoon, jotka ensimmäinen ja toinen polynukleotidijakso ovat komplementaarisia yksisäikeisen kohdepolynukleotidin vastavuo- 20 roisesti yksinomaisten osien suhteen, niin että yksisäikeisen kohdenukleotidin kanssa hybridisoitumisen jälkeen kerniluminesoiva ryhmä ja herkistin ovat riittävän lähellä toisiaan, jotta energian siirtyminen kemiluminesoivasta ryhmästä virittämään herkistintä on mahdollista. ♦ · • . t 34 104391
FI906043A 1988-06-08 1990-12-07 Määritysmenetelmiä, joissa käytetään havaittavien signaalien herkistimien aiheuttamaa tuotantoa, määritykseen tarkoitettu pakkaus sekä herkistinkonjugaatti FI104391B (fi)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20405588A 1988-06-08 1988-06-08
US20405588 1988-06-08
US36018889A 1989-06-01 1989-06-01
US36018889 1989-06-01
PCT/US1989/002479 WO1989012232A1 (en) 1988-06-08 1989-06-05 Assays utilizing sensitizer-induced production of detectable signals
US8902479 1989-06-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI906043A0 FI906043A0 (fi) 1990-12-07
FI104391B true FI104391B (fi) 2000-01-14

Family

ID=26899134

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI906043A FI104391B (fi) 1988-06-08 1990-12-07 Määritysmenetelmiä, joissa käytetään havaittavien signaalien herkistimien aiheuttamaa tuotantoa, määritykseen tarkoitettu pakkaus sekä herkistinkonjugaatti

Country Status (15)

Country Link
US (2) US5516636A (fi)
EP (1) EP0345776B1 (fi)
JP (1) JP2681061B2 (fi)
AT (1) ATE114373T1 (fi)
AU (1) AU636110B2 (fi)
CA (1) CA1338927C (fi)
DE (1) DE68919440T2 (fi)
DK (1) DK174773B1 (fi)
ES (1) ES2064380T3 (fi)
FI (1) FI104391B (fi)
GR (1) GR3014969T3 (fi)
IE (1) IE66734B1 (fi)
IL (1) IL90542A (fi)
NZ (1) NZ229465A (fi)
WO (1) WO1989012232A1 (fi)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2681061B2 (ja) * 1988-06-08 1997-11-19 ロンドン・ダイアグノスティック・インコーポレーテッド 検出可能なシグナルのセンシタイザー誘導発生を利用したアッセイ
US5094958A (en) * 1990-08-30 1992-03-10 Fiberchem Inc. Method of self-compensating a fiber optic chemical sensor
EP0476556A3 (en) * 1990-09-18 1992-11-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for determination of a light sensitive substance
DK0507904T3 (da) * 1990-10-26 1999-09-13 Sangtec Medical Ab Fremgangsmåde til vurdering af tilstrækkeligheden af kliniske prøver til hybridiseringsassays og kit til udførelse af vurde
US6251581B1 (en) 1991-05-22 2001-06-26 Dade Behring Marburg Gmbh Assay method utilizing induced luminescence
EP0515194B1 (en) * 1991-05-22 2001-10-31 Dade Behring Marburg GmbH Assay methods utilizing induced luminescence
US5340716A (en) * 1991-06-20 1994-08-23 Snytex (U.S.A.) Inc. Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label
US5578498A (en) * 1991-05-22 1996-11-26 Behringwerke Ag Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays
WO1994002486A1 (en) * 1992-07-20 1994-02-03 Syntex (U.S.A.) Inc. Novel chemiluminescent compounds and methods of use
US6002000A (en) * 1992-07-20 1999-12-14 Dade Behring Marburg Gmbh Chemiluminescent compounds and methods of use
EP0653066B1 (en) * 1992-07-31 1998-01-28 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Photoactivatable chemiluminescent matrices
ATE177842T1 (de) * 1993-09-03 1999-04-15 Behringwerke Ag Fluoreszenz-sauerstoffkanalisation-immunteste
DE4403780A1 (de) * 1994-02-03 1995-08-10 Frank Dr Schubert Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen
ATE195266T1 (de) 1994-06-16 2000-08-15 Dade Behring Marburg Gmbh Verfahren und vorrichtung zum mischen von flüssigkeiten
US5891736A (en) * 1996-06-21 1999-04-06 Bayer Corporation Reagents and methods for releasing and measuring lead ions from biological matrices
US5800999A (en) 1996-12-16 1998-09-01 Tropix, Inc. Dioxetane-precursor-labeled probes and detection assays employing the same
US6365346B1 (en) * 1998-02-18 2002-04-02 Dade Behring Inc. Quantitative determination of nucleic acid amplification products
JP2002504689A (ja) 1998-02-18 2002-02-12 デイド・ベーリング・インコーポレイテッド 複数の検体の検出において使用するための化学ルミネセンス組成物
GB9811483D0 (en) * 1998-05-29 1998-07-29 Photonic Research Systems Limi Luminescence assay using cyclical excitation wavelength sequence
WO2000049406A1 (en) * 1999-02-16 2000-08-24 Princeton Separations Activating film for chemiluminescent assays and methods for use
DE19912380B4 (de) * 1999-03-19 2005-02-03 Dräger Safety AG & Co. KGaA Biomimetisches Reagenzsystem und seine Verwendung
US6627400B1 (en) 1999-04-30 2003-09-30 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed measurement of membrane protein populations
US6322980B1 (en) 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US6764817B1 (en) * 1999-04-20 2004-07-20 Target Discovery, Inc. Methods for conducting metabolic analyses
US20030119069A1 (en) * 1999-04-20 2003-06-26 Target Discovery, Inc. Labeling of protein samples
US6649351B2 (en) 1999-04-30 2003-11-18 Aclara Biosciences, Inc. Methods for detecting a plurality of analytes by mass spectrometry
US6673550B2 (en) 1999-04-30 2004-01-06 Aclara Biosciences, Inc. Electrophoretic tag reagents comprising fluorescent compounds
US7001725B2 (en) 1999-04-30 2006-02-21 Aclara Biosciences, Inc. Kits employing generalized target-binding e-tag probes
US20030235832A1 (en) * 2000-06-21 2003-12-25 Ahmed Chenna Multiplexed analysis by chromatographic separation of molecular tags
US6331530B1 (en) * 1999-07-13 2001-12-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Hydrophilic carrier for photosensitizers that cleaves when they catalyze the formation of singlet oxygen
EP1227844A2 (en) * 1999-10-29 2002-08-07 Pharmacyclics, Inc. Compositions for treating atheroma and neoplastic tissue
US7078486B2 (en) * 1999-12-10 2006-07-18 Spectral Diagnostics, Inc. Single-chain polypeptides comprising troponin I and troponin C
US6703248B1 (en) 1999-12-15 2004-03-09 Dade Behring Marburg Gmbh Particles for diagnostic and therapeutic use
US7537938B2 (en) * 2000-04-28 2009-05-26 Monogram Biosciences, Inc. Biomarker detection in circulating cells
US20030207300A1 (en) * 2000-04-28 2003-11-06 Matray Tracy J. Multiplex analytical platform using molecular tags
US7160735B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Monogram Biosciences, Inc. Tagged microparticle compositions and methods
US7771929B2 (en) * 2000-04-28 2010-08-10 Monogram Biosciences, Inc. Tag library compounds, compositions, kits and methods of use
JP4796259B2 (ja) 2000-05-04 2011-10-19 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・プロダクツ・ゲーエムベーハー 複数のアナライトの検出において使用するための組成物
US6797481B1 (en) * 2000-10-17 2004-09-28 Dade Behring Marburg Gmbh Simultaneous screening of multiple analytes
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
US7087395B1 (en) 2001-01-16 2006-08-08 Quest Diagnostics Investments Incorporated Vitamin D assay
WO2002078906A2 (en) * 2001-03-29 2002-10-10 Cellect Technologies Corp. Methods devices and systems for sorting and separating particles
CZ20033143A3 (en) * 2001-05-21 2004-04-14 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
HUP0501021A3 (en) 2001-05-21 2006-06-28 Aclara Biosciences Inc Mountai Methods and compositions for analyzing proteins
AU2002344221A1 (en) * 2001-05-26 2002-12-09 Aclara Biosciences, Inc. Catalytic amplification of multiplexed assay signals
US6906050B2 (en) * 2001-05-31 2005-06-14 Miravant Pharmaceuticals, Inc. Substituted porphyrin and azaporphyrin derivatives and their use in photodynamic therapy, radioimaging and MRI diagnosis
US7291477B2 (en) * 2001-07-03 2007-11-06 Xenotope Diagnostics, Inc. Method and device for trichomonas detection
US20050032060A1 (en) * 2001-08-31 2005-02-10 Shishir Shah Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays
US7045311B2 (en) * 2001-10-25 2006-05-16 Monogram Biosciences, Inc. Whole cell assay systems for cell surface proteases
KR20040108655A (ko) * 2002-03-05 2004-12-24 아클라라 바이오사이언시스 인코퍼레이티드 막-결합된 민감제를 사용하는 복합 분석법
US20040229294A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
US20040229299A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Badal M. Youssouf Intracellular complexes as biomarkers
US20040229293A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui Surface receptor complexes as biomarkers
US7105308B2 (en) 2002-07-25 2006-09-12 Monogram Biosciences, Inc. Detecting receptor oligomerization
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US7402397B2 (en) * 2002-05-21 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
US6897036B2 (en) * 2002-06-06 2005-05-24 Lumigen, Inc. Fluorescent detection of peroxidase enzymes
US20040175765A1 (en) * 2002-07-05 2004-09-09 Sharat Singh Cell-screening assay and composition
US20040014043A1 (en) * 2002-07-16 2004-01-22 Emp Biotech Gmbh Sensitizer-labeled analyte detection
US6764819B2 (en) * 2002-07-16 2004-07-20 Emp Biotech Gmbh Method for chemiluminescent detection
WO2004010842A2 (en) * 2002-07-26 2004-02-05 Aclara Biosciences, Inc. Lipophilic electrophoretic probes
US6674781B1 (en) * 2002-08-19 2004-01-06 The Boeing Company Method and system for fueling a closed cycle chemical oxygen iodine laser
US20040091850A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Travis Boone Single cell analysis of membrane molecules
WO2004063200A1 (en) 2003-01-16 2004-07-29 Techno Mart Co., Ltd Porphyrin derivatives
US7402398B2 (en) * 2003-07-17 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Measuring receptor homodimerization
CA2535510C (en) * 2003-08-11 2013-10-15 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
US7259122B1 (en) * 2004-08-30 2007-08-21 John Lombardi Chemically-resistant shelter coating
US7915197B2 (en) * 2003-08-29 2011-03-29 Lombardi John L Pathogen-resistant coatings
US20050130246A1 (en) * 2003-10-27 2005-06-16 Hossein Salimi-Moosavi Detecting human anti-therapeutic antibodies
GB0329220D0 (en) * 2003-12-17 2004-01-21 Inverness Medical Switzerland System
US7939267B2 (en) * 2004-11-04 2011-05-10 Laboratory Corporation Of America Holdings Detection of activation of endothelial cells as surrogate marker for angiogenesis
US20060204999A1 (en) * 2005-03-14 2006-09-14 Stephen Macevicz Detecting molecular complexes
PT1877415E (pt) * 2005-05-02 2010-12-09 Baseclick Gmbh Novas estratégias de marcação para a detecção sensível de analitos
KR101335218B1 (ko) 2005-05-02 2013-12-12 바스프 에스이 분석물의 감응성 검출을 위한 신규한 표지화 전략
US20060281104A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-14 Macevicz Stephen C Leuco dye particles and uses thereof
WO2007120192A2 (en) * 2005-10-27 2007-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for labeling nucleic acids
US7799534B2 (en) * 2006-05-09 2010-09-21 Beckman Coulter, Inc. Nonseparation assay methods
BRPI0711388B1 (pt) * 2006-05-09 2021-02-23 Beckman Coulter, Inc método para detectar um analito em uma amostra em um procedimento de ensaio
US7732153B2 (en) * 2006-05-09 2010-06-08 Beckman Coulter, Inc. Nonseparation assay methods
US20070299046A1 (en) * 2006-06-26 2007-12-27 Mai Nguyen Brooks Orally available light-independent antineoplastic compounds
AU2007315190B2 (en) * 2006-10-31 2012-05-31 Baseclick Gmbh Click chemistry for the production of reporter molecules
US9146233B2 (en) 2006-11-13 2015-09-29 Perkinelmer Health Sciences, Inc. Detecting molecular interactions by fluorescence resonance energy transfer on a solid-phase support
EP2109689A4 (en) * 2007-02-07 2010-02-10 Perscitus Biosciences Llc DETECTION OF THE PROXIMITY OF A MOLECULE
US20100240070A1 (en) * 2007-11-07 2010-09-23 Beckman Coulter, Inc. Nonseparation Assay Methods Using Peroxide Generating Enzymes
CA2711843C (en) * 2007-12-20 2018-11-13 Laboratory Corporation Of America Holdings Her-2 diagnostic methods
CN104263816B (zh) 2008-05-16 2018-10-19 生命技术公司 用于测量细胞增殖的双标记法
SG177252A1 (en) 2008-12-01 2012-03-29 Lab Corp America Holdings METHODS AND ASSAYS FOR MEASURING p95 AND/OR p95 IN A SAMPLE AND ANTIBODIES SPECIFIC FOR p95
CA2749846C (en) 2009-01-15 2018-08-07 Laboratory Corporation Of America Holdings Methods of determining patient response by measurement of her-3
WO2010095033A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Perkinelmer Biosignal, Inc. Multiplex assay methods and compositions
US9347947B2 (en) 2009-03-12 2016-05-24 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Immunoassays employing non-particulate chemiluminescent reagent
JP6468838B2 (ja) 2011-05-19 2019-02-13 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス 癌患者の生存可能性を決定するためおよび癌患者における転移可能性を予測するための方法
JP6402173B2 (ja) 2013-04-05 2018-10-10 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス Ｈｅｒ３の検出に基づく癌の診断、予後予測、および処置を容易にするためのシステムおよび方法
JP2019515252A (ja) 2016-03-15 2019-06-06 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス 細胞間のタンパク質相互作用を評価する方法
DK3482210T3 (da) 2016-07-06 2021-07-12 Prothena Biosciences Ltd Assay til detektering af totalt og s129-phosphoryleret alpha-synuklein
EP4252629A3 (en) 2016-12-07 2023-12-27 Biora Therapeutics, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
AU2017378398B2 (en) 2016-12-14 2023-02-02 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a JAK inhibitor and devices
BR112019011689A2 (pt) 2016-12-14 2019-10-22 Progenity Inc tratamento de uma doença do trato gastrointestinal com um inibidor de tnf
US11426566B2 (en) 2016-12-14 2022-08-30 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a TLR modulator
WO2018112237A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-6r inhibitor
CN116712540A (zh) 2016-12-14 2023-09-08 比奥拉治疗股份有限公司 使用整联蛋白抑制剂治疗胃肠道疾病
CA3045310A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
CA3045475A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-12/il-23 inhibitor released using an ingestible device
CA3045472A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a smad7 inhibitor
EP3554346B1 (en) 2016-12-14 2024-01-31 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunosuppressant
US20200315540A1 (en) 2016-12-14 2020-10-08 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an il-1 inhibitor
EP3601531B1 (en) 2017-03-30 2023-06-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with live biotherapeutics
EP4108183A1 (en) 2017-03-30 2022-12-28 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
US11596670B2 (en) 2017-03-30 2023-03-07 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with IL-10 or an IL-10 agonist
CA3054159A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chst15 inhibitor
WO2018183932A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a il-13 inhibitor
WO2019036363A1 (en) 2017-08-14 2019-02-21 Progenity Inc. TREATMENT OF GASTROINTESTINAL TRACT DISEASE WITH GLATIRAMER OR A PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALT THEREOF
CN112400024B (zh) 2018-06-01 2024-04-09 比奥拉治疗股份有限公司 用于胃肠道微生物组检测和处理的装置和系统
CN111693500B (zh) * 2020-06-19 2022-11-25 哈尔滨工业大学 一种基于时间分辨光谱测量实现单态氧量子产率监测的方法

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4383031A (en) * 1975-04-28 1983-05-10 Miles Laboratories, Inc. Homogeneous chemiluminescent specific binding assay
US4277437A (en) * 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4220450A (en) * 1978-04-05 1980-09-02 Syva Company Chemically induced fluorescence immunoassay
US4668619A (en) * 1980-10-30 1987-05-26 Miles Laboratories, Inc. Multilayer homogeneous specific binding assay device
CA1190838A (en) * 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
US4743561A (en) * 1985-03-05 1988-05-10 Abbott Laboratories Luminescent assay with a reagent to alter transmitive properties of assay solution
US4792521A (en) * 1985-08-15 1988-12-20 Immunomedics, Inc. Non-enzymatic immunohistochemical staining system and reagents
US4868103A (en) * 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
US4777128A (en) * 1986-05-27 1988-10-11 Ethigen Corporation Fluorescence immunoassay involving energy transfer between two fluorophores
US4822746A (en) * 1986-06-25 1989-04-18 Trustees Of Tufts College Radiative and non-radiative energy transfer and absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
US5254477A (en) * 1986-06-25 1993-10-19 Trustees Of Tufts College Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods
US4956477A (en) * 1987-12-31 1990-09-11 Tropix, Inc. Synthesis of 1,2-dioxetanes
US4775745A (en) * 1986-12-08 1988-10-04 National Distillers And Chemical Corporation Diazonium compounds useful as components for nucleic acid probes
US4900686A (en) * 1987-04-02 1990-02-13 Polaroid Corporation Fluorescent conjugates and biological diagnostic assay
US4894348A (en) * 1987-07-01 1990-01-16 Ronald Robert C Fluorescein-conjugated proteins with enhanced fluorescence
US5037615A (en) * 1987-10-30 1991-08-06 Cordis Corporation Tethered pair fluorescence energy transfer indicators, chemical sensors, and method of making such sensors
NZ227506A (en) * 1987-12-31 1992-06-25 London Diagnostics Inc Specific binding assays using chemiluminescent compounds
WO1989006650A1 (en) * 1987-12-31 1989-07-27 Quest Systems, Inc. Dioxetanes for use in assays
JP2681061B2 (ja) * 1988-06-08 1997-11-19 ロンドン・ダイアグノスティック・インコーポレーテッド 検出可能なシグナルのセンシタイザー誘導発生を利用したアッセイ
US4935498A (en) * 1989-03-06 1990-06-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Expanded porphyrins: large porphyrin-like tripyrroledimethine-derived macrocycles
US5340716A (en) * 1991-06-20 1994-08-23 Snytex (U.S.A.) Inc. Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label

Also Published As

Publication number Publication date
DE68919440D1 (de) 1995-01-05
US5705622A (en) 1998-01-06
IE66734B1 (en) 1996-01-24
NZ229465A (en) 1992-05-26
AU636110B2 (en) 1993-04-22
DE68919440T2 (de) 1995-06-08
IL90542A (en) 1994-11-11
JPH03505373A (ja) 1991-11-21
DK291690A (da) 1991-01-25
EP0345776B1 (en) 1994-11-23
ATE114373T1 (de) 1994-12-15
WO1989012232A1 (en) 1989-12-14
IE891831L (en) 1989-12-08
US5516636A (en) 1996-05-14
DK174773B1 (da) 2003-10-27
AU3771889A (en) 1990-01-05
EP0345776A3 (en) 1991-04-03
IL90542A0 (en) 1990-01-18
DK291690D0 (da) 1990-12-07
FI906043A0 (fi) 1990-12-07
EP0345776A2 (en) 1989-12-13
JP2681061B2 (ja) 1997-11-19
GR3014969T3 (en) 1995-05-31
CA1338927C (en) 1997-02-25
ES2064380T3 (es) 1995-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI104391B (fi) Määritysmenetelmiä, joissa käytetään havaittavien signaalien herkistimien aiheuttamaa tuotantoa, määritykseen tarkoitettu pakkaus sekä herkistinkonjugaatti
US5332659A (en) Light emission-or absorbance-based binding assays for polynucleic acids
CA2305415C (en) Extended dynamic range assays
US20130084652A1 (en) Homogeneous Chemiluminescence Assay Methods with Increased Sensitivity
CN108391432B (zh) 杂环化合物的生物偶联分子
DE3688766T2 (de) Verlängerte Chemolumineszenz.
Morrison Detection of Energy Transfer 13 and Fluorescence Quenching
CN1198816A (zh) 聚氧烃基相关产物和荧光测定方法
US5679516A (en) Process for detecting nucleic acid by capillary electrophoresis
US5232830A (en) Intrinsic fluorescent quenching methods
US3891669A (en) Thiol-group detecting fluorescence reagents
JPH02502122A (ja) 液体中のリガンドを検出及び定量する方法
NO310258B1 (no) Spesifikk bindingsbestemmelse, analysepakke og sensibilisatorkonjugat
JP2002176999A (ja) 核酸の検出方法
Liu et al. Nanosecond Time-Resolved Fluorescence Assays
WO2003002975A2 (en) Biophotonic sensors and methods of use thereof
JPH0643159A (ja) 固定化ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法
JPH05123196A (ja) 固定化相補ｄｎａまたはｒｎａを用いるｄｎａまたはｒｎａ断片の測定方法
Cross The development of luminescent lanthanide chelates for cellular based assays
Kim Kinetic mechanism of nucleotide binding to Escherichia coli transcription termination factor Rho: Stopped-flow kinetic studies using ATP and fluorescent ATP analogues

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: LONDON DIAGNOSTICS, INC.

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: NICHOLS INSTITUTE DIAGNOSTICS