CN117233380A - 用于检测细胞表面部分的表达或聚集的方法 - Google Patents
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Abstract
用于检测细胞表面部分的表达或聚集的方法。本公开涉及一种用于检测和/或量化患者样品中至少第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达的方法，以及一种用于检测和/或量化样品中至少第一细胞表面部分与第二细胞表面部分的聚集的方法，其中使所述样品暴露于对至少所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的分子。本公开进一步涉及一种用于预测受试者对此类结合分子的反应性的方法，一种用于确定此类结合分子的有效性的方法，一种用于确认此类结合分子的作用模式的方法，一种用于治疗受试者的方法，以及一种用于针对诱导第一细胞表面部分与第二细胞表面部分的聚集的能力来筛选一种或多种测试剂的方法。
Description
本申请是申请号为202180066203.9、发明名称为“用于检测细胞表面部分的表达或聚集的方法”的中国专利申请的分案申请，该母案申请是2021年09月28日提交的PCT国际专利申请PCT/EP2021/076688进入中国国家阶段的申请。
技术领域
本公开涉及一种用于检测和/或量化优选地在患者肿瘤样品中至少第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达或聚集的方法。在某些实施方案中，本公开的所述方法可用于预测患者是否可能受益于使用结合两种细胞表面部分的结合剂的疗法，或用于确认此类结合剂的作用模式。
背景技术
在过去几年中，用于治疗癌症的治疗性抗体的开发已迅速增加。对于多种癌症类型，正在使用诊断测定来评定某个患者是否将受益于使用特定药物的疗法，以便可以预测所述疗法可能是安全和/或有效的。已与生物制剂或大分子疗法一起使用的一类诊断测定涉及测试患者的组织样品中所述生物制剂所靶向的抗原的表达水平。例如，可以从患者的肿瘤中取出组织活检物并进行量化测定。此类量化测定的示例包括免疫组织化学(IHC)、双重原位杂交测定、显色原位杂交(CISH)测定和荧光原位杂交(FISH)测定。
IHC已成为用于评估例如乳腺癌中的例如HER2表达的标准测试方法。IHC测试利用与细胞表面上的HER2蛋白结合的特异性单克隆或多克隆抗体。添加具有报告分子功能的经标记二抗，之后进行酶促反应，产生了与所存在的HER2蛋白的量成比例的信号。然而，尽管存在有关于IHC表达水平的分级和评分的指南，但是无法完全避免实验室间变化性。
FISH、CISH和银增强的原位杂交测定使用单探针或双探针技术量化每细胞的基因拷贝数。FISH已成为在例如HER2测试方面的广泛认可的平台。然而，FISH测试是昂贵的、劳动密集的，并且需要荧光显微术和高级培训。明场原位杂交测定(诸如CISH和银增强原位杂交)不需要荧光显微术并且成本较低。
另一项开发是一种已被验证为一种测量例如乳腺癌中总HER2、HER2同源二聚体或p95HER2表达的方法的测定，所述测定是一种基于邻近度的测定，被设计为量化蛋白质表达、二聚化和蛋白质-蛋白质相互作用(在Diagn Mol Pathol2009；18:11-21；Shi等人中详细描述)。
迄今为止，本领域尚缺乏证明两种或更多种抗原在多特异性试剂存在下聚集的能力的稳健方法，其中此类抗原通常在躯体条件下不缔合。在此，本发明人展示了这种测定及其用途的示例性应用。
发明内容
本发明人已开发了一种用于检测和量化CD137(一种在T细胞上表达的细胞表面部分(cell surface moiety))和PD-L1(一种在肿瘤细胞上表达的细胞表面部分)的表达水平的测定。这允许预测特定患者是否可能对结合这两种细胞表面部分的治疗产生反应并从所述治疗受益。在某些实施方案中，可以使用其他适用的方法，所述方法与本文所用的测定一样，是基于测量当所述两种细胞表面部分存在于同一样品中时产生的信号。在此上下文中，信号可以是信号的存在或不存在。在某些实施方案中，这两种读出都提供关于细胞表面部分的表达水平的信息。此外，所述方法可用于检测和/或量化可被特定药物(诸如例如多特异性试剂，如双特异性或三特异性抗体)结合的任何两种或更多种细胞表面部分的表达水平。
本发明人已经进一步开发了一种用于检测和量化CD137的聚集以及CD137与PD-L1的聚集的测定。CD137和PD-L1不形成同源受体-配体对，它们不会自然聚集或形成直接的蛋白质-蛋白质相互作用。然而，当被同时结合两种细胞表面部分的药物(诸如例如多特异性试剂，如双特异性或三特异性抗体)靶向时，这两种细胞表面部分变得彼此靠近，从而产生可检测的信号。类似地，当被结合相同细胞表面部分中的至少两种细胞表面部分的多价药物(诸如例如单特异性的二价试剂，如单特异性抗体，或多特异性试剂，如双特异性或三特异性抗体)靶向时，所述至少两种细胞表面部分变得彼此靠近，从而产生可检测的信号。
在某些实施方案中，本公开基于同时结合肿瘤细胞和/或来自免疫系统的细胞的细胞表面上的两种或更多种靶抗原的多特异性试剂(诸如双特异性或三特异性抗体)的治疗用途。多特异性试剂由此诱导两种或更多种靶抗原的聚集。因此，两种或更多种抗原的聚集仅在多特异性试剂存在下发生，或者与不存在多特异性试剂时相比以增大的水平发生。
在某些实施方案中，这允许评定患者正在治疗所用的药物是否确实同时结合两种细胞表面部分并表现出其预期的作用模式。在某些实施方案中，可以使用其他适用的方法，所述其他适用的方法如本文所用的测定一样，是基于测量当两种细胞表面部分非常接近时产生的信号。在这种情况下，信号可以是测定的报告分子或特征的存在或不存在。在某些实施方案中，这两种读出(报告分子的存在或缺失)都提供了关于细胞表面部分的接近度的信息。此外，所述方法可用于检测和/或量化可同时被特定药物(诸如例如多特异性试剂，如双特异性或三特异性抗体)结合的任何两种或更多种细胞表面部分的聚集。
在某些实施方案中，本公开涉及一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的聚集的存在的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子及特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子接触，其中所述第一结合分子和所述第二结合分子中的至少一者包含分子标签，除非所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分彼此接近，否则所述分子标签不被检测到；以及
检测所述分子标签的存在或不存在以检测所述样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的聚集的存在。
本公开还涉及用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
使来自患有癌症的受试者的肿瘤活检样品与检测所述第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测所述第二细胞表面部分的至少一种结合分子接触，
其中检测所述第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测所述第二细胞表面部分的至少一种结合分子包含分子标签；以及
检测和/或量化所述分子标签的存在或不存在以检测所述样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的表达。
本公开进一步涉及一种用于预测受试者、特别是癌症患者对结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，特别是在免疫效应细胞上表达的部分和在肿瘤细胞上表达的部分的一种或多种试剂的反应性的方法，所述方法包括：
-检测和/或量化来自所述受试者的生物样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的表达水平；
-确定所述受试者的样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的所述表达水平是高于还是低于阈值水平；以及
-如果所述受试者的样品中所述第一细胞表面部分和所述第二种细胞表面部分的所述表达水平等于或高于所述阈值水平，则预测所述受试者可能对结合所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的一种或多种试剂有反应。
本公开进一步涉及一种用于治疗患有癌症的有需要的受试者的方法，所述方法包括：
-预测受试者、特别是患有癌症的受试者对结合如本文所述的第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的一种或多种试剂的反应性；以及
-将结合所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的一种或多种试剂施用于可能有反应的受试者。
本公开进一步涉及一种用于确定试剂的有效性的方法，所述试剂包含结合分子，所述结合分子至少包含特异性结合第一细胞表面部分的结合结构域和特异性结合第二细胞表面的结合结构域，所述方法包括检测和/或量化处于使用所述试剂治疗下的受试者的生物样品中第一细胞表面部分与第二细胞表面部分的聚集，如本文所述。
本公开进一步涉及一种用于确认试剂的作用模式的方法，所述试剂包含结合分子，所述结合分子至少包含特异性结合第一细胞表面部分的结合结构域和特异性结合第二细胞表面的结合结构域，所述方法包括检测和/或量化处于使用所述试剂治疗下的受试者的生物样品中第一细胞表面部分与第二细胞表面部分的聚集，如本文所述。
本公开进一步涉及一种用于治疗有需要的受试者、特别是患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
-用结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的试剂治疗有需要的受试者；
-分析所述试剂的有效性或所述试剂的作用模式，如本文所述。
本公开进一步涉及一种用于针对诱导第一细胞表面部分与第二细胞表面部分聚集的能力来筛选一种或多种测试剂的方法，所述方法包括：
-使一种或多种测试细胞培养物与测试剂接触，
其中所述测试细胞培养物包含表达第一细胞表面部分的细胞和表达第二细胞表面部分的细胞；
-检测第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的聚集水平，如本文所述；以及
将所述聚集水平与针对未与所述测试剂接触或与参考剂接触的对照细胞培养物中的聚集检测到的聚集水平进行比较，
其中所述对照细胞培养物包含所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分。
附图说明
图1.根据本公开的某些实施方案使用的测定的概念的示意图。这个图示中的/>测定形式使用两种结合一种或两种特定抗原的一抗，所述一抗中的一种一抗包含标签，并且另一种包含切割诱导部分(剪刀符号)。光活化从所述抗体中的一种抗体释放切割诱导部分，接着切割诱导部分诱导从另一种抗体上切割标签。随后通过毛细管电泳(CE)测量由标签产生的信号。
然而，本文所叙述的公开内容不限于这个图中所呈现的测定形式。
图2.使用一抗的测定形式的示例的示意图。在这个图示中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分是不同的细胞表面部分。然而，本公开还包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分相同的实施方案。
A)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子以及特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签并且所述第二结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且其中所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签并且所述第四结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)；
B)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子以及特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签并且所述第一结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且其中所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签并且所述第三结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)；
C)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子以及特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签并且所述第二结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且其中所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签并且所述第三结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)；
D)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子以及特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签并且所述第一结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且其中所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签并且所述第四结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)。
图3.使用针对各个靶标的两种一抗和一种二抗的测定形式的示例的示意图。在这个图示中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分是不同的细胞表面部分。然而，本公开还包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分相同的实施方案。
A)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第一结合分子和所述第三结合分子分别包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子和所述第三结合分子的第一分子标签和第二分子标签，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
B)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第二结合分子和所述第四结合分子分别包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子和所述第四结合分子的第一分子标签和第二分子标签，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
C)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第一结合分子和所述第三结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；
D)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第二结合分子和所述第四结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；
E)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签，所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
F)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签，所述第三结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并且包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；
G)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签，所述第四结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并且包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；
H)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签，所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
I)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签，所述第三结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并且包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；
J)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签，所述第四结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并且包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；
K)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第一结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至所述第四结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
L)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第一结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至所述第三结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
M)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第一结合分子和所述第四结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；
N)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第二结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至所述第四结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
O)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第二结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至所述第三结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
P)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子以及第六结合分子，
其中所述第二结合分子和所述第三结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；
图4.针对每个靶标使用两种一抗和两种二抗的测定形式的示例的示意图。在这个图示中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分是不同的细胞表面部分。然而，本公开还包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分相同的实施方案。
A)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子，第六结合分子，第七结合分子以及第八结合分子，
其中所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，所述第七结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签，并且所述第八结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
B)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子，第六结合分子，第七结合分子以及第八结合分子，
其中所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第七结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第七结合分子的第一分子标签，所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第八结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第八结合分子的第二分子标签；
C)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子，第六结合分子，第七结合分子以及第八结合分子，
其中所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，所述第七结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第八结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第八结合分子的第二分子标签；
D)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子，特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子，第五结合分子，第六结合分子，第七结合分子以及第八结合分子，
其中所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)，所述第七结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第七结合分子的第一分子标签，所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签，并且所述第八结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)。
图5.针对各个靶标使用一种一抗和针对所述一抗中的一种一抗使用一种二抗的测定形式的示例的示意图。这种形式使用DTT介导的分子标签释放。在这个图示中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分是不同的细胞表面部分。然而，本公开还包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分相同的实施方案。
A)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第二结合分子和结合至第一结合分子的第三结合分子，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签；并且其中所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签；
B)特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第二结合分子和结合至第二结合分子的第三结合分子，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签；并且其中所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签。
图6.针对各个靶标使用一种一抗来检测和/或量化靶标的聚集的测定形式的示例的示意图。在这个图示中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分是在不同细胞上表达的不同细胞表面部分。然而，本公开还包括其中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分存在于同一细胞上的实施方案。此外，在这个图示中，对第一细胞表面部分和第二细胞表面部分具有结合特异性的分子是二价双特异性抗体。然而，本公开还涵盖这样的情况，其中对细胞表面部分具有结合特异性的分子是多价双特异性抗体或多特异性抗体，诸如三特异性或四特异性抗体。
A)双特异性抗体(100)，所述双特异性抗体结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，从而使第一细胞表面部分和第二细胞表面部分彼此接近；特异性结合第一细胞表面部分的第一结合分子和特异性结合第二细胞表面部分的第二结合分子，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的分子标签并且所述第二结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)；
B)双特异性抗体(100)，所述双特异性抗体结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，从而使第一细胞表面部分和第二细胞表面部分彼此接近；特异性结合第一细胞表面部分的第一结合分子和特异性结合第二细胞表面部分的第二结合分子，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的分子标签，并且所述第一结合分子包含切割诱导部分。
图7.针对各个靶标使用一种一抗和针对所述一抗中的一种一抗使用二抗来检测和/或量化靶标的聚集的测定形式的示例的示意图。在这个图示中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分是在不同细胞上表达的不同细胞表面部分。然而，本公开还包括其中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分存在于同一细胞上的实施方案。此外，在这个图示中，对第一细胞表面部分和第二细胞表面部分具有结合特异性的分子是二价双特异性抗体。然而，本公开还涵盖这样的情况，其中对细胞表面部分具有结合特异性的分子是多价双特异性抗体或多特异性抗体，诸如三特异性或四特异性抗体。
A)双特异性抗体(100)，所述双特异性抗体结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，从而使第一细胞表面部分和第二细胞表面部分彼此接近；特异性结合第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子，其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的分子标签，并且所述第三结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
B)双特异性抗体(100)，所述双特异性抗体结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，从而使第一细胞表面部分和第二细胞表面部分彼此接近；特异性结合第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子，其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的分子标签，并且所述第三结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
C)双特异性抗体(100)，所述双特异性抗体结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，从而使第一细胞表面部分和第二细胞表面部分彼此接近；特异性结合第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子，其中所述第一结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第三结合分子结合至所述第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的分子标签；
D)双特异性抗体(100)，所述双特异性抗体结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，从而使第一细胞表面部分和第二细胞表面部分彼此接近；特异性结合第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子，其中所述第二结合分子包含切割诱导部分(剪刀符号)，并且所述第三结合分子结合至所述第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的分子标签；
图8.针对各个靶标使用一种一抗和针对所述一抗使用两种二抗来检测和/或量化靶标的聚集的测定形式的示意图。在这个图示中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分是在不同细胞上表达的不同细胞表面部分。然而，本公开还扩展至第一细胞表面部分和第二细胞表面部分存在于同一细胞上的情况。此外，在这个图示中，对第一细胞表面部分和第二细胞表面部分具有结合特异性的分子是二价双特异性抗体。然而，本公开还涵盖这样的情况，其中对细胞表面部分具有结合特异性的分子是多价双特异性抗体或多特异性抗体，诸如三特异性或四特异性抗体。
A)双特异性抗体(100)，所述双特异性抗体结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，从而使第一细胞表面部分和第二细胞表面部分彼此接近；特异性结合第一细胞表面部分的第一结合分子，特异性结合第二细胞表面部分的第二结合分子，第三结合分子和第四结合分子，其中所述第三结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的分子标签，并且所述第四结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；
B)双特异性抗体(100)，所述双特异性抗体结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，从而使第一细胞表面部分和第二细胞表面部分彼此接近；特异性结合第一细胞表面部分的第一结合分子，特异性结合第二细胞表面部分的第二结合分子，第三结合分子和第四结合分子，其中所述第三结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分(剪刀符号)；并且所述第四结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的分子标签。
图9.示出以使用测定测量的以相对峰面积(RPA)表示的PD-L1表达水平的图表。样品A：通过与抗CD137阳性对照抗体一起孵育制备的细胞沉淀；样品B：通过与结合CD137和PD-L1的双特异性抗体一起孵育制备的细胞沉淀；样品C：通过与结合RSV的阴性对照抗体一起孵育制备的细胞沉淀。
图10.示出以使用测定测量的以相对峰面积(RPA)表示的CD137表达水平的图表。左：与抗CD137检测抗体BBK2一起孵育；右：与抗CD137检测抗体M127一起孵育。样品A：通过与抗CD137阳性对照抗体一起孵育制备的细胞沉淀；样品B：通过与结合CD137和PD-L1的双特异性抗体一起孵育制备的细胞沉淀；样品C：通过与结合RSV的阴性对照抗体一起孵育制备的细胞沉淀。
图11.示出以使用测定测量的以相对峰面积(RPA)表示的CD137聚集的曲线图。左：与抗CD137检测抗体BBK2一起孵育；右：与抗CD137检测抗体M127一起孵育。样品A：通过与结合RSV的阴性对照抗体一起孵育制备的细胞沉淀；样品B：通过与结合CD137和PD-L1的双特异性抗体一起孵育制备的细胞沉淀；样品C：通过与抗CD137阳性对照抗体一起孵育制备的细胞沉淀。
图12.示出以使用测定测量的以相对峰面积(RPA)表示的PD-L1-CD137聚集的图表。左：与抗CD137检测抗体BBK2一起孵育；右：与抗CD137检测抗体M127一起孵育。样品A：通过与结合RSV的阴性对照抗体一起孵育制备的细胞沉淀；样品B：通过与结合CD137和PD-L1的双特异性抗体一起孵育制备的细胞沉淀；样品C：通过与抗CD137阳性对照抗体一起孵育制备的细胞沉淀。将这个测定中的聚集水平与在同种型对照实验(ITC)中测量的聚集水平进行比较。
图13.以下的示意图：A--如本文所述的用于检测细胞膜上存在的受体(抗原1)的表达的测定；B-如本文所述的用于检测同一细胞上的受体(抗原1)的聚集的邻近度测定；和C-如本文所述用于检测一个细胞上的受体(抗原1)与另一个细胞上的受体(抗原2)聚集从而形成免疫突触的邻近度测定。
具体实施方式
在一个方面中，本公开提供了一种用于检测和/或量化样品中至少第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达的方法，所述方法包括检测当第一细胞表面部分和第二细胞表面部分在同一样品中表达时产生的信号。在某些实施方案中，优选地产生两种不同的信号以便可以量化每种细胞表面部分的表达。或者，在某些实施方案中，产生信号的部分经选择为使得组合信号提供关于每种细胞表面部分的表达水平的信息。
可以多种方式产生信号，所述方式包括但不限于为第一细胞表面部分和第二细胞表面部分提供优选不同的荧光分子标签，为第一细胞表面部分和第二细胞表面部分提供优选不同的显色分子标签，为第一细胞表面部分和第二细胞表面部分提供优选不同的放射性分子标签；以及为第一细胞表面部分和第二细胞表面部分提供优选不同的同位素纯金属螯合剂分子标签。猝灭是另一种可以使用的方法。在某些实施方案中，将优选不同的荧光团用于每种细胞表面部分以允许测量一种荧光团的荧光强度的降低或与第二猝灭剂的相互作用引起的来自信号发射剂的信号。
可以以不同的形式执行根据本公开的方法。在一种形式中，本公开提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
a)使样品与检测第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测第二细胞表面部分的至少一种结合分子接触，
其中检测第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测第二细胞表面部分的至少一种结合分子包含分子标签，任选地其中附接至检测第一细胞表面部分的结合分子的分子标签不同于附接至检测第二细胞表面部分的结合分子的分子标签；以及
b)检测所述分子标签的存在或不存在，或测量所述分子标签的量，以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。
在另一种形式中，本公开提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
a)使样品与检测第一细胞表面部分的至少两种结合分子和检测第二细胞表面部分的至少两种结合分子接触，
其中检测第一细胞表面部分的结合分子中的一种结合分子和所述检测第二细胞表面部分的结合分子中的一种结合分子包含分子标签，所述分子标签优选地经由可切割接头附接至所述结合分子，并且任选地其中检测第一细胞表面部分的结合分子中的另一种结合分子和所述检测第二细胞表面部分的结合分子中的另一种结合分子包含切割诱导部分；
b)任选地诱导分子标签的切割；以及
c)检测所述分子标签的存在或不存在，或测量所述分子标签的量，以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。
在某些实施方案中，根据本公开的方法可用于测量单个样品、优选地患者样品中至少两种不同细胞表面部分的共表达。因此，所述方法尤其可用于预测患者、优选地癌症患者对用结合至少两种不同细胞表面部分的一种或多种试剂进行治疗的反应。此类试剂的示例是例如多特异性抗体。
在某些实施方案中，本公开中所用的方法包括测定。/>测定在本领域中是众所周知的并且在例如WO 2017/161030和其中所引用的参考文献(以其全文并入本文中)中描述。
测定可以以不同的形式执行。一种形式是针对各个靶标部分使用两种一次结合分子(primary binding molecule)的邻近度测定，其中所述针对各个靶标部分使用的一次结合分子中的一种一次结合分子包含分子标签，并且另一种一次结合分子包含切割诱导部分。
在一个实施方案中，本公开因此提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
a1)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子以及特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签，并且所述第二结合分子包含切割诱导部分，并且其中所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签，并且所述第四结合分子包含切割诱导部分；或者
a2)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子以及特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签，并且所述第一结合分子包含切割诱导部分，并且其中所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签，并且所述第三结合分子包含切割诱导部分；或者
a3)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子以及特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签，并且所述第二结合分子包含切割诱导部分，并且其中所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签，并且所述第三结合分子包含切割诱导部分；或者
a4)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子以及特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签，并且所述第一结合分子包含切割诱导部分，并且其中所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签，并且所述第四结合分子包含切割诱导部分；或者
其中附接至检测第一细胞表面部分的结合分子的分子标签不同于附接至检测第二细胞表面部分的结合分子的分子标签；
b)诱导第一分子标签和第二分子标签的切割；以及
c)检测所释放的第一分子标签和第二分子标签的存在或不存在以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。
另一种形式是邻近度测定，其中对各个靶标部分使用两种一次结合分子并且针对所述一次结合分子中的一种一次结合分子使用二次结合分子。
在一个实施方案中，本公开因此提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
a1)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第一结合分子和所述第三结合分子分别包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子和所述第三结合分子的第一分子标签和第二分子标签，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分；或者
a2)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第二结合分子和所述第四结合分子分别包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子和所述第四结合分子的第一分子标签和第二分子标签，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分；或者
a3)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第一结合分子和所述第三结合分子包含切割诱导部分，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；或者
a4)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第二结合分子和所述第四结合分子包含切割诱导部分，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；或者
a5)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签，所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分；或者
a6)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签，所述第三结合分子包含切割诱导部分，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；或者
a7)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签，所述第四结合分子包含切割诱导部分，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；或者
a8)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签，所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分；或者
a9)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签，所述第三结合分子包含切割诱导部分，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；或者
a10)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签，所述第四结合分子包含切割诱导部分，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；或者
a11)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含切割诱导部分，所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分；或者
a12)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含切割诱导部分，所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分；或者
a13)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第一结合分子和所述第四结合分子包含切割诱导部分，所述第五结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；或者
a14)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含切割诱导部分，所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分；或者
a15)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含切割诱导部分，所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分；或者
a16)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、以及第六结合分子接触，
其中所述第二结合分子和所述第三结合分子包含切割诱导部分，所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，并且所述第六结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签；
其中附接至检测第一细胞表面部分的结合分子的分子标签不同于附接至检测第二细胞表面部分的结合分子的分子标签；
b)诱导第一分子标签和第二分子标签的切割；以及
c)检测所释放的第一分子标签和第二分子标签的存在或不存在以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。
另一种形式是对各个靶标部分使用两种一次结合分子并且针对所述一次结合分子中的每种一次结合分子使用二次结合分子的邻近度测定，其中对各个靶标部分使用的二次结合分子中的一种二次结合分子包含分子标签，并且另一种二次结合分子包含切割诱导部分。
在一个实施方案中，本公开因此提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
a1)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、第六结合分子、第七结合分子和第八结合分子接触，
其中所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，所述第七结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分，所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签，并且所述第八结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分；或者
a2)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、第六结合分子、第七结合分子和第八结合分子接触，
其中所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分，所述第七结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第七结合分子的第一分子标签，所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第八结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第八结合分子的第二分子标签；或者
a3)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、第六结合分子、第七结合分子和第八结合分子接触，
其中所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第五结合分子的第一分子标签，所述第七结合分子结合至第二结合分子并包含切割诱导部分，所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含切割诱导部分，并且所述第八结合分子结合至第四结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第八结合分子的第二分子标签；或者
a4)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子和第二结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第三结合分子和第四结合分子、第五结合分子、第六结合分子、第七结合分子和第八结合分子接触，
其中所述第五结合分子结合至第一结合分子并包含切割诱导部分，所述第七结合分子结合至第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第七结合分子的第一分子标签，所述第六结合分子结合至第三结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第六结合分子的第二分子标签，并且所述第八结合分子结合至第四结合分子并包含切割诱导部分；
其中附接至检测第一细胞表面部分的结合分子的分子标签不同于附接至检测第二细胞表面部分的结合分子的分子标签；
b)诱导第一分子标签和第二分子标签的切割；以及
c)检测所释放的第一分子标签和第二分子标签的存在或不存在以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。
另一种形式是DTT介导的释放，其中所述用于检测和/或量化样品中至少第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达的方法包括：
a)使样品与检测第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测第二细胞表面部分的至少一种结合分子接触，
其中检测第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测第二细胞表面部分的至少一种结合分子包含经由可切割接头附接至所述结合分子的分子标签，并且
其中附接至检测第一细胞表面部分的结合分子的分子标签不同于附接至检测第二细胞表面部分的结合分子的分子标签；
b)诱导分子标签的切割；以及
c)检测所释放的分子标签的存在或不存在以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。
在一种形式中，所述DTT介导的释放测定对包含分子标签的各个靶标部分使用一次结合分子。
在一个实施方案中，本公开因此提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
a)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子及特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第二结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签；并且
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第二分子标签；
其中附接至检测第一细胞表面部分的结合分子的分子标签不同于附接至检测第二细胞表面部分的结合分子的分子标签；
b)诱导第一分子标签和第二分子标签的切割；以及
c)检测所释放的分子标签的存在或不存在以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。
另一种形式是使用针对各个靶标部分的一次结合分子和二次结合分子的DTT介导的释放测定，其中所述二次结合分子包含分子标签。
在一个实施方案中，本公开因此提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
a)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第二结合分子、特异性结合第一结合分子的第三结合分子、以及特异性结合第二结合分子的第四结合分子接触，
其中所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第一分子标签；并且
其中所述第四结合分子包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的第二分子标签；
其中附接至检测第一细胞表面部分的结合分子的分子标签不同于附接至检测第二细胞表面部分的结合分子的分子标签；
b)诱导第一分子标签和第二分子标签的切割；以及
c)检测所释放的分子标签的存在或不存在以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。
另一种形式是使用针对各个靶标部分的一次结合分子以及结合至所述一次结合分子中的一种一次结合分子并包含分子标签的二次结合分子的DTT介导的释放测定。
在一个实施方案中，本公开因此提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
a1)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第二结合分子、以及特异性结合第一结合分子的第三结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的第一分子标签；并且
其中所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签；或者
a2)使样品与特异性结合在细胞表面上表达的第一部分的第一结合分子、特异性结合在细胞表面上表达的第二部分的第二结合分子、以及特异性结合第二结合分子的第三结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的第一分子标签；并且
其中所述第三结合分子包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的第二分子标签；
其中附接至检测第一细胞表面部分的结合分子的分子标签不同于附接至检测第二细胞表面部分的结合分子的分子标签；
b)诱导第一分子标签和第二分子标签的切割；以及
c)检测所释放的分子标签的存在或不存在以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。
在上面使用一次结合分子和二次结合分子的例示性形式中的每个例示性形式中，在一次结合分子与二次结合分子之间可以存在一种或多种结合分子。
根据本公开的方法可包括邻近度测定和DTT介导的释放测定的组合，其中使用邻近度测定来检测第一细胞表面部分并且使用DTT介导的释放测定来检测第二细胞表面部分。
根据本公开的方法可用于测量单个样品中至少两种不同细胞表面部分的共表达。从中获得的知识可用于预测患者、特别是癌症患者对结合所述两种不同细胞表面部分的一种或多种试剂的反应性。
因此，本公开提供了一种用于预测患者、特别是癌症患者对结合至少第一细胞表面部分和第二细胞表面部分、特别是在免疫效应细胞上表达的部分和在肿瘤细胞上表达的部分的一种或多种试剂的反应性的方法，所述方法包括：
a)使用根据本公开的方法检测来自受试者、特别是来自受试者的肿瘤的生物样品中第一细胞表面部分和第二细胞表面构件的表达水平；
b)确定所述受试者的样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的所述表达水平是高于还是低于阈值水平；以及
c)如果所述受试者的样品中所述第一细胞表面部分和所述第二种细胞表面部分的所述表达水平等于或高于所述阈值水平，则预测所述受试者可能对结合所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的一种或多种试剂有反应。所述一种或多种试剂包括如本文进一步定义的试剂。这种方法在本文中也称为“预测方法”。
本公开还提供了一种用于治疗有需要的受试者、特别是患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
a)使用如上所述的预测方法预测受试者对结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的一种或多种试剂的反应性；以及
b)将结合第一细胞表面部分和第二细胞表面的一种或多种试剂施用于根据预测可能有反应的受试者。所述一种或多种试剂包括如本文进一步定义的试剂。
本公开进一步提供了结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的一种或多种试剂，以用于治疗受试者，特别是患有癌症的受试者，其中所述治疗包括：
a)使用如上所述的预测方法预测受试者对结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的一种或多种试剂的反应性；以及
b)将结合第一细胞表面部分和第二细胞表面的一种或多种试剂施用于根据预测可能有反应的受试者。所述一种或多种试剂包括如本文进一步定义的试剂。
本公开进一步提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的聚集的存在的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括检测在第一细胞表面部分和第二细胞表面部分已暴露于对至少第一细胞表面部分和第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品中信号的存在或不存在，除非所述第一细胞表面部分和第二细胞表面部分彼此接近，否则检测不到所述信号。这种方法可用于显示两种或更多种细胞表面部分是否彼此接近。当两种或更多种细胞表面部分彼此接近时，如果产生如本文所述的信号，则它们被认为聚集。至少两种细胞表面部分的接近是由对至少两种细胞表面部分具有结合特异性的试剂(诸如例如多特异性抗体)引起或诱导的。在某些实施方案中，所述方法因此也可以被定义为包括检测当第一细胞表面部分和第二细胞表面部分同时被对所述至少两种细胞表面部分具有结合特异性的试剂结合时产生的信号。
根据本公开的方法可以以不同的方式执行，所述方式包括不同形式的邻近度测定。一种执行所述方法的方式涉及猝灭来自附接至检测所述细胞表面部分中的一种细胞表面部分的结合分子的荧光团的信号，其中所述猝灭是由附接至检测所述细胞表面部分中的另一种细胞表面部分的结合分子的猝灭剂引起的。另一种执行所述方法的方式涉及由附接至检测所述细胞表面部分中的一种细胞表面部分的结合分子的荧光团与附接至检测所述细胞表面部分中的另一种细胞表面部分的结合分子的另一不同荧光团的干扰产生的信号。
在邻近度测定的一种形式的中，使用两种一次结合分子，一种一次结合分子针对各个靶标部分，其中所述一次结合分子中的一种一次结合分子包含分子标签，并且另一种一次结合分子包含切割诱导部分。
在一个实施方案中，本公开因此提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的聚集的存在的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，其中所述方法包括：
a1)使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子及特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的分子标签，并且所述第二结合分子包含切割诱导部分；或者
a2)使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子及特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的分子标签，并且所述第一结合分子包含切割诱导部分；以及
b)诱导分子标签的切割；以及
c)检测所释放的分子标签的存在或不存在以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分与第二细胞表面部分的聚集。
在另一种形式中，使用针对各个靶标部分的一次结合分子和针对一次结合分子中的一种一次结合分子的二次结合分子，其中未被所述二次结合分子结合的一次结合分子包含分子标签并且所述二次结合分子包含切割诱导部分，或者未被所述二次结合分子结合的一次结合分子包含切割诱导部分并且所述二次结合分子包含分子标签。
在一个实施方案中，本公开因此提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的聚集的存在的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，其中所述方法包括：
a1)使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的分子标签，并且所述第三结合分子结合至所述第二结合分子并包含切割诱导部分；或者
a2)使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的分子标签，并且所述第三结合分子结合至所述第一结合分子并包含切割诱导部分；或者
a3)使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含切割诱导部分，并且所述第三结合分子结合至所述第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的分子标签；或者
a4)使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含切割诱导部分，并且所述第三结合分子结合至所述第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的分子标签；
b)诱导分子标签的切割；以及
c)检测所释放的分子标签的存在或不存在以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分与第二细胞表面部分的聚集。
在另一种形式中，使用针对各个靶标部分的一次结合分子和针对所述两种一次结合分子的二次结合分子，其中所述二次结合分子中的一种二次结合分子包含分子标签，并且另一种二次结合分子包含切割诱导部分。
在一个实施方案中，本公开因此提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的聚集的存在的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，其中所述方法包括：
a1)使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、第三结合分子和第四结合分子接触，
其中所述第三结合分子结合至所述第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的分子标签，并且所述第四结合分子结合至所述第二结合分子并包含切割诱导部分；或者
a2)使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、第三结合分子和第四结合分子接触，
其中所述第三结合分子结合至所述第一结合分子并包含切割诱导部分；并且所述第四结合分子结合至所述第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的分子标签，
b)诱导分子标签的切割；以及
c)检测所释放的分子标签以检测和/或量化样品中第一细胞表面部分与第二细胞表面部分的聚集。
在使用一次结合分子和二次结合分子的上述例示性形式中的每个例示性形式中，在一次结合分子与二次结合分子之间可以存在一种或多种结合分子。
本公开进一步提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的聚集的存在的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
使其中所述第一细胞表面部分和所述第三细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第三细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子接触，其中所述第一结合分子和所述第二结合分子中的至少一者包含分子标签，除非所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分彼此接近，否则所述分子标签不被检测到；以及
检测所述分子标签的存在或不存在以检测所述样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的聚集的存在。
在本文中，至少第一细胞表面部分和第三细胞表面部分优选是不同的细胞表面部分。在某些实施方案中，所述第一细胞表面部分是CD137或另一种共刺激分子，并且所述第三细胞表面部分是另一细胞上的部分，例如肿瘤相关部分或免疫检查点部分，优选地PD-L1。第一细胞表面部分和第二细胞表面部分优选是相同的细胞表面部分。在某些实施方案中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分是CD137。
根据本公开的方法可用于测量单个样品中两种或更多种不同细胞表面部分的聚集，并且根据本公开，特别是在聚集由对所述两种或更多种不同细胞表面部分具有结合特异性的试剂诱导的情况下。在某些实施方案中，从中获得的知识可用于确定用对两种或更多种不同细胞表面部分具有结合特异性的试剂的治疗是否有效，所述确定基于确认对所述两种不同细胞表面部分具有结合特异性的试剂与这些部分的同时结合。
所述试剂可以是能够同时结合至少两种细胞表面部分的任何单一部分。在某些实施方案中，所述试剂至少包含特异性结合第一细胞表面部分的结合结构域和特异性结合第二细胞表面部分的结合结构域。合适的试剂例如包括结合分子，诸如抗体，包括多特异性抗体(诸如例如双特异性和三特异性抗体)、抗体片段、包含抗体衍生的结构域的分子、和融合蛋白。所述试剂也可称为药物。
因此，本公开提供了一种用于确定试剂的有效性的方法，所述试剂至少包含特异性结合第一细胞表面部分的结合结构域和特异性结合第二细胞表面部分的结合结构域，所述方法包括通过使用根据本公开的方法，检测和/或量化处于使用所述试剂治疗下的受试者的生物样品中所述第一细胞表面部分与所述第二细胞表面部分的聚集。所述试剂是如本文进一步定义的试剂。所述方法在本文中也称为“监测方法”。
本公开还提供了一种用于确认试剂的作用模式的方法，所述试剂至少包含特异性结合至少第一细胞表面部分的结合结构域和特异性结合第二细胞表面部分的结合结构域，所述方法包括通过使用根据本公开的方法，检测和/或量化处于使用所述试剂治疗下的受试者的生物样品中所述第一细胞表面部分与所述第二细胞表面部分的聚集。所述试剂是如本文进一步定义的试剂。所述作用模式例如是试剂与第一细胞表面部分和第二细胞表面部分同时结合。在此上下文中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分优选是不同的细胞表面部分，并且所述试剂是多特异性抗体。另一种作用模式是例如两种或更多种细胞表面部分的聚集。在此上下文中，在一个实施方案中，至少第一细胞表面和第二细胞表面部分是相同的，并且所述试剂是单特异性抗体；并且在另一个实施方案中，至少第一细胞表面部分和第二细胞表面部分是不同的细胞表面部分，并且所述试剂是多特异性抗体。所述方法在本文中也称为“确认方法”。例如，可以确定对在免疫效应细胞上表达的细胞表面部分、优选地CD137或任何其他免疫效应细胞共刺激部分，以及在肿瘤细胞上表达的细胞表面部分、优选地PD-L1或任何其他肿瘤相关部分或免疫检查点具有特异性的试剂、优选地多特异性抗体，是否诱导在免疫效应细胞上表达的细胞表面部分中的两种或更多种细胞表面部分、优选地一种或多种CD137，或任何其他免疫效应细胞共刺激蛋白的聚集。
本公开进一步提供了一种用于治疗有需要的受试者、特别是患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
a)用结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的试剂治疗受试者；
b)使用如本文所述的监测方法分析试剂的有效性，或使用如本文所述的确认方法确认试剂的作用模式。所述试剂是如本文进一步定义的试剂。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括基于所述分析或确认的结局继续或调整治疗，其中调整包括但不限于增加或降低剂量和/或增加或降低试剂的施用频率，或结束治疗。
本公开进一步提供一种结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的试剂，以用于治疗受试者、特别是患有癌症的受试者，其中所述治疗包括：
a)用结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的试剂治疗受试者；
b)使用如本文所述的监测方法分析试剂的有效性，或使用如本文所述的确认方法确认试剂的作用模式。所述试剂是如本文进一步定义的试剂。在某些实施方案中，所述治疗可进一步包括基于所述分析或确认的结局继续或调整治疗，其中调整包括但不限于增加或降低剂量和/或增加或降低试剂的施用频率，或结束治疗。
根据本公开的方法可进一步用于针对诱导至少第一细胞表面部分与第二细胞表面部分聚集的能力来筛选一种或多种测试剂。
因此，本公开进一步提供了一种针对诱导至少第一细胞表面部分与第二细胞表面部分的聚集的能力来筛选一种或多种测试剂的方法，所述方法包括：
a)使一种或多种测试细胞培养物与测试剂接触，
其中所述测试细胞培养物包含表达至少第一细胞表面部分的细胞和表达第二细胞表面部分的第二细胞；
b)使用根据本公开的方法检测第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的聚集水平；以及
c)将步骤b)中检测到的聚集水平与针对未与测试剂接触或与参考剂接触的对照细胞培养物中的聚集检测到的聚集水平进行比较，
其中所述对照细胞培养物包含所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分。在某些实施方案中，所述方法可进一步包括选择诱导与对照细胞培养物中的聚集水平相比相等或更高的聚集水平的测试剂。
除了那些已知的结合分子之外，这种方法还可用于鉴定对两种或更多种不同的细胞表面部分具有结合特异性的新的另外或替代的结合分子。例如，这种方法可用于鉴定对CD137或任何其他免疫效应细胞共刺激部分以及PD-L1或任何其他肿瘤相关部分或免疫检查点部分具有结合特异性的另外或替代的结合分子。
本公开还提供了一种套装药盒。在某些实施方案中，所述药盒包含根据如本文所述方法特异性结合至少第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的结合分子。在一个实施方案中，所述套装药盒包含特异性结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的至少两种结合分子，任选地其中所述结合分子中的一种结合分子包含经由可切割接头附接至所述结合分子的分子标签，并且另一种结合分子包含切割诱导部分；以及说明书，所述说明书关于使患者样品与所述至少两种结合分子接触，任选地以诱导所述分子标签的切割；以及以测量通过使所述患者样品与所述至少两种结合分子接触而诱导的信号。
以下是对如本文所述的方法的特征的进一步描述。出于清楚和简明的描述的目的，本文将特征描述为相同或单独实施方案的一部分，然而，应当理解的是本公开的范围可以包括具有所描述的特征中的全部或一些特征的组合的实施方案。
根据本公开的方法可用于检测第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的表达。本公开进一步提供了一种可用于显示两种细胞表面部分是否彼此接近的方法。所使用的检测方法，标签从结合到细胞表面部分(中的一种细胞表面部分)的结合分子释放，还允许量化第一细胞表面部分和第二细胞表面部分(的复合物)的表达。
在某些实施方案中，根据本公开的方法允许检测和/或量化单个样品中的第一细胞表面部分和第二细胞表面部分。为此，附接至结合第一细胞表面部分的抗体的分子标签不同于附接至结合第二细胞表面部分的抗体的分子标签。在某些实施方案中，所述方法可用于确定第一细胞部分和第二细胞部分是否在特定样品中共表达。
根据本公开的某些实施方案的方法中的样品可以是但不限于组织样品、血液样品或培养的细胞。优选地，所述样品是来自受试者或患者的组织样品、血液样品或培养的细胞。来自受试者或患者的组织样品可以是新鲜样品或经福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)的或以其他方式固定的样品。所述方法尤其可用于检测和/或量化来自患有癌症的受试者的肿瘤活检样品中的第一细胞表面部分和第二细胞表面部分(的聚集)。
在某些实施方案中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分优选是不同的部分并且可以在相同细胞类型(诸如例如肿瘤细胞或免疫细胞)上、在相同细胞或不同细胞上表达。在某些实施方案中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分优选在不同细胞类型上表达。
在某些实施方案中，本公开的方法可用于其中感兴趣的是测量两种或更多种细胞表面部分的共表达，和/或其中感兴趣的是确定在相同或分开的细胞上的两种或更多种细胞表面部分的聚集的任何应用中。
在某些实施方案中，所述至少两种细胞表面部分中的一种细胞表面部分优选在免疫效应细胞，特别是NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞，优选地T细胞上表达。
在某些实施方案中，所述至少两种细胞表面部分中的一种细胞表面部分在可以来自肿瘤或来自免疫细胞来源的细胞，诸如例如但不限于肿瘤细胞、B细胞、骨髓细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞上表达。
在某些实施方案中，所述至少两种细胞表面部分中的一种细胞表面部分在免疫效应细胞，特别是NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞，优选地T细胞上表达，并且所述至少两种细胞表面部分中的另一种细胞表面部分在可以来自肿瘤或来自免疫细胞来源的细胞，诸如例如但不限于肿瘤细胞、B细胞、骨髓细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞上表达。
在某些实施方案中，所述免疫效应细胞可以是NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞，优选地T细胞。
在某些实施方案中，免疫效应细胞共刺激部分可以是CD137、OX40、GITR、CD27、CD28、ICOS、CD40L或LIGHT，优选地CD137。
在某些实施方案中，免疫检查点部分或肿瘤相关部分可以选自但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、TIM3、CD47或CD70，优选地PD-L1。
第一细胞表面部分和第二细胞表面部分可以是响应于使两种细胞表面部分彼此靠近的试剂而聚集的任何细胞表面部分。在某些实施方案中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分可以相同，并且所述方法用于检测和/或量化这些细胞表面部分响应于试剂的聚集，例如二聚化或三聚化。这在本文中是例如针对至少两种CD137分子的聚集所例示的。
在某些实施方案中，第一细胞表面部分是CD137并且第二细胞表面部分是PD-L1。
用于测量HER2同二聚体以及HER1/HER2异二聚体、HER2/HER3异二聚体、HGF-c-Met复合物、HER3-PI3K复合物、PD-1-PD-L1复合物的方法不是本公开的一部分。
因此，本公开提供了一种用于检测和/或量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，如本文所述，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分不是HER2；HER1和HER2；HER2和HER3；HGF和c-Met；HER3和PI3K；或PD-1和PD-L1。
本公开还提供了一种用于检测和/或量化检测样品中至少两种细胞表面部分的聚集的存在的方法，如本文所述，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分不是HER2；HER1和HER2；HER2和HER3；HGF和c-Met；HER3和PI3K；或PD-1和PD-L1，。
在本公开的方法的某些实施方案中，使样品与结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的结合分子接触。这些结合分子也称为测定结合分子。
在根据本公开的方法的某些形式中，针对每个部分使用两种结合分子。本公开将结合第一细胞表面部分的两种结合分子称为第一结合分子和第二结合分子。结合第二细胞表面部分的两种结合分子在本文中称为第三结合分子和第四结合分子。在提及这些结合分子时使用的数字表示结合分子在结合特异性和/或为了更容易地可视化有用的测定形式的示例方面是彼此不同的。这些数字不指代任何特定的次序或结合分子中的一种或多种必需存在。此外，在使用一次结合分子和一种或多种二次结合分子的形式中，在一次结合分子(即直接结合所述细胞表面部分的结合分子)与二次结合分子(即包含分子标签或切割诱导部分的结合分子)之间可以存在其他结合分子。
在根据本公开的方法的某些形式中，结合第一细胞表面部分的两种结合分子是结合不同表位的结合分子，并且经选择为使得它们不干扰彼此与第一细胞表面部分的结合。类似地，结合第二细胞表面部分的两种结合分子是结合不同表位的结合分子，并且经选择为使得它们不干扰彼此与第二细胞表面部分的结合。第一结合分子、第二结合分子、第三结合分子和/或第四结合分子可以结合细胞表面部分的细胞外结构域；但是它们也可能结合细胞表面部分的细胞内结构域。它们的组合也是可能的。例如，结合第一细胞表面部分的两种结合分子可以针对所述第一细胞表面部分的细胞外结构域，而结合第二细胞表面部分的两种结合分子可以结合所述第二细胞表面部分的细胞内结构域；或者，结合第一细胞表面部分的结合分子中的一种结合分子可以结合所述第一细胞表面部分的细胞外结构域并且另一种结合分子可以结合所述第一细胞表面部分的细胞内结构域，并且对于第二细胞表面部分也是如此；或者结合第一细胞表面部分的结合分子中的一种结合分子可以结合所述第一细胞表面部分的细胞外结构域并且另一种结合分子可以结合所述第一细胞表面部分的细胞内结构域，而结合第二细胞表面部分的两种结合分子可以结合所述第二细胞表面部分的细胞外或细胞内结构域，或反之亦然。
在某些实施方案中，针对各个部分使用一种一次结合分子。本公开将结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的两种一次结合分子称为第一结合分子和第二结合分子。在提及这些结合分子时使用的数字表示结合分子在结合特异性和/或为了更容易地可视化有用的测定形式的示例方面是彼此不同的。这些数字不指代任何特定的次序或结合分子中的一种或多种必需存在。它们也不表示它们将与关于本公开的其他实施方案所提及的第一结合分子和第二结合分子相同。此外，在使用一次结合分子和一种或多种二次结合分子的形式中，在一次结合分子(即直接结合所述细胞表面部分的结合分子)与二次结合分子(即包含分子标签或切割诱导部分的结合分子)之间可以存在其他结合分子。
在某些实施方案中，结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的两种结合分子是结合不同细胞表面部分的结合分子。第一结合分子和第二结合分子可以结合细胞表面部分的细胞外结构域；但是它们也可能结合细胞表面部分的细胞内结构域。它们的组合也是可能的。例如，结合第一细胞表面部分的结合分子可以结合所述第一细胞表面部分的细胞外结构域，而结合第二细胞表面部分的结合分子可以结合所述第二细胞表面部分的细胞内结构域，或反之亦然。
根据本公开的方法的某些实施方案中使用的结合分子优选是抗体或其抗原结合片段。在这种上下文中，第一细胞表面部分和第二细胞表面部分可以被认为是抗原。特异性结合抗原的抗体或其抗原结合片段是本领域已知的并且可用于大量不同的抗原。它们是可商购获得的或可以容易地生产。此类抗体或其抗原结合片段通常与抗原结合，但不在其他方面表现出生物学功能，诸如例如阻断抗原与其配体之间的相互作用，或诱导细胞杀伤活性。
在根据本公开的方法的某些形式中，针对各种细胞表面部分的一次结合分子中的一种一次结合分子包含分子标签或切割诱导部分。在本公开的方法的某些形式中，所述一次结合分子中的一种一次结合分子包含分子标签并且另一种一次结合分子包含切割诱导部分。使用本领域中的标准技术，可以将此类分子标签或切割诱导部分附接至一次结合分子，特别是抗体。在一些情况下，可能难以将分子标签或切割诱导部分附接至特定结合分子。在那种情况下，可以使用附接有分子标签或切割诱导部分的二次结合分子，通常是抗体。此类包含分子标签或切割诱导部分的二次结合分子通常针对一次结合分子的Fc区，并且通常可商购获得。
分子标签可以是可检测的任何分子部分，诸如分子。在某些情况下，分子部分在释放时会提供可测量的信号。分子标签可以基于其区别于其他部分的性质中的一种或多种性质来选择，所述性质包括但不限于电泳迁移率、分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、电荷/质量比和极性。这些性质中至少一种性质的差异允许在单个样品中测量多种细胞表面部分的测定中分离分子标签。在某些实施方案中，所述分子标签包括检测部分，诸如例如但不限于荧光标记、显色标记、放射性标记或电化学标记。示例性荧光染料包括水溶性罗丹明染料、荧光素、4,7-二氯荧光素、苯并呫吨染料和能量转移染料，如以下参考文献中所公开：Handbook of Molecular Probes and Research Reagents,第8版(2002),MolecularProbes,Eugene,Oreg.；WO 2001/32783；美国专利公布号US 2002-0081616、US2002-0086985；和Lee等人,1997,Nucleic Acids Research25:2816-282。合适的分子标签的示例包括但不限于报告分子。/>报告分子在本领域中是众所周知的。优选的分子标签是例如/>报告分子Pro11和Pro125。Pro11是光可释放的标签的示例，其中Pro125是DTT可释放标签的示例。其他/>分子例如描述于美国专利公布号US2004-0166529；US2004-0126818；US2003-0013126；US2005-0079565；和US2011-0180408中，所述美国专利公布中的每一者和其中引用的参考文献均全文并入本文。
切割诱导部分可以是任何能够直接或间接诱导分子标签从经由可切割接头附接有所述分子标签的结合分子切割的部分。在某些实施方案中，切割诱导部分是例如产生能够切割可切割接头的活性物质的部分。示例性活性物质包括单线态氧、过氧化氢、NADH和羟基自由基、苯氧基自由基、超氧化物等。用于引起氧化的活性物质的说明性猝灭剂包括多烯，类胡萝卜素，维生素E，维生素C，酪氨酸、组氨酸和谷胱甘肽的氨基酸吡咯N-缀合物。参见例如Beutner等人,2000,Meth.Enzymol.319:226-241。一个示例是其中使缀合至结合分子的生物素与链霉亲和素缀合的亚甲蓝接触并暴露于光，从而导致释放能够切割可切割接头的单线态氧。
在某些测定形式中，分子标签经由可切割接头附接至结合分子上。可切割接头可以是任何可切割接头，包括但不限于可被单线态氧或过氧化氢或被DTT切割的接头。可被DTT切割的接头是SS接头。可切割键还可包括对在整个反应混合物中起作用的试剂不稳定的键，诸如碱不稳定键、可光切割的键、可通过还原切割的键、通过氧化切割的键、酸不稳定键和可被特定蛋白酶切割的肽键。描述许多此类键的参考文献包括Greene和Wuts,1991,Protective Groups in Organic Synthesis,第二版,John Wiley&Sons,New York；Hennanson,1996,Bioconjugate Techniques,Academic Press,New York；和美国专利公布号US 2003-0119059。
可以通过本领域中已知的方法诱导分子标签从结合分子上的切割，所述方法包括但不限于使用光诱导和DTT介导的释放。光诱导诱导光吸收分子的活化，当被光活化时，所述光吸收分子将分子氧转化成单线态氧。通过使用DTT诱导切割涉及DTT诱导的二硫化物接头切割，所述二硫化物接头可通过还原切割并将分子标签连接至结合分子。
在某些实施方案中，在本公开的方法中测量的信号是所释放的分子标签的量。在本公开的方法的某些形式中，使用至少两种不同的分子标签。在某些实施方案中，这些分子标签可以在检测之前通过本领域已知的方法分离，所述方法包括但不限于电泳或基于分子量、形状、溶解度、pKa、疏水性、电荷、电荷/质量比和极性的差异的方法。检测方法取决于分子标签。
在本公开的上下文中，“邻近度”是指包含所附接的分子标签的结合分子和包含切割诱导部分的结合分子处于允许由切割诱导部分诱导的分子标签切割的距离内。在测定中，这是约1000nm，优选地彼此之间在约20-200nm或30-100nm内。邻近度适用的其他范围取决于所用分子标签的性质，并且可由本领域技术人员容易地确定，并且是由市售标签、猝灭剂和报告分子的供应商提供的信息。本领域技术人员应用本公开中的特定邻近度测定所需的信息在本领域中是可获得的。例如Nathan P.2020,Assay GuidanceManual,Compound-Mediated Assay Interferences in Homogenous Proximity Assays(全文以引用方式并入本文)提供了关于尤其可用于FRET测定的供体和受体荧光团的信息，包括对供体与受体荧光团之间最佳距离的描述(例如，参见表2和表3)。
根据本公开的方法可用于测量单个样品中两种不同细胞表面部分的共表达。从中获得的知识可用于确定患者的治疗计划。例如，如果两种细胞表面部分在患者的组织或血液样品中共表达，则可以确定用靶向这两种细胞表面部分的一种或多种试剂来治疗患者。这种情况的一个示例是其中癌症患者的肿瘤活检样品显示出两种肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上的共表达。然后可以用结合这些肿瘤相关抗原并干扰肿瘤相关抗原的信号传导通路和/或诱导T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的一种或多种试剂成功地治疗患者。如果患者的肿瘤样品未显示出此类肿瘤相关抗原的共表达，则治疗医师可确定患者不太可能从此类治疗中受益。另一种情况是例如其中肿瘤活检显示肿瘤细胞上的肿瘤相关抗原和在免疫效应细胞上表达的抗原的共表达。这表明肿瘤微环境中存在免疫效应细胞，诸如例如T细胞和/或NK细胞。此类患者可受益于用使免疫细胞靠近肿瘤细胞和/或活化免疫效应细胞使得肿瘤细胞将被选择性杀伤的试剂进行的治疗。在某些实施方案中，本公开的方法因此可用于预测患者、优选地癌症患者对用结合两种不同细胞表面部分的一种或多种试剂进行治疗的反应。
结合两种不同细胞表面部分的试剂的示例是例如多特异性抗体。这种多特异性抗体可以是同时结合两种细胞表面部分的双特异性或三特异性抗体或其抗原结合片段。此类多特异性抗体可以表现出对两种细胞表面部分的单价结合，使得所述多特异性抗体包含针对每种细胞表面部分的单个抗原结合片段。所述细胞表面部分可以是本文所公开的第一细胞表面部分和第二细胞表面部分中的任一者。
结合两种不同细胞表面部分并且与可使用本公开的方法相关的多特异性抗体的一个具体示例是结合肿瘤细胞上的PD-L1和T细胞上的CD137的多特异性抗体。此类多特异性抗体可包含CD137结合结构域，所述CD137结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48、或SEQ ID NO:52中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述CD137结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48、或SEQ ID NO:52中任一者所示。所述CD137结合结构域可进一步包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、或SEQ ID NO:50中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:47、或SEQ ID NO:51中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述CD137结合结构域可包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、或SEQID NO:50中任一者所示；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、或SEQ ID NO:51中任一者所示。HCDR1、HCDR2和HCDR3的任何组合都是可能的。优选的CD137结合结构域包含具有以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3的组合：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6、SEQID NO:7和SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:14、SEQID NO:15和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34；SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42；SEQID NO:44、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；或SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:52。此类多特异性抗体的CD137结合结构域可包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、或SEQ ID NO:49中的任一者，或与其构架区具有至少80％、85％、90％、95％、或99％，优选95％序列同一性。在某些实施方案中，此类多特异性抗体的CD137结合结构域还包含CH1结构域。可以使用任何CH1结构域。合适的CH1结构域的示例由被提供为SEQ ID NO:116的氨基酸序列提供。
多特异性抗体可进一步包含PD-L1结合结构域，所述PD-L1结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQID NO:72、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:91、SEQID NO:95、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:102、或SEQ ID NO:106中的任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，PD-L1结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQID NO:72、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:91、SEQID NO:95、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:102、或SEQ ID NO:106中的任一者所示。所述PD-L1结合结构域可进一步包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:54、SEQID NO:60、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQID NO:82、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、或SEQ ID NO:93中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:105、或SEQ ID NO:108中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述PD-L1结合结构域可包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、或SEQID NO:93中任一者所示；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:105、或SEQ ID NO:108中任一者所示。HCDR1、HCDR2和HCDR3的任何组合都是可能的。优选的PD-L1结合结构域包含具有以下的HCDR1、HCDR2、和HCDR3的组合：SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、和SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、和SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、和SEQ ID NO:56；SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、和SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:55、和SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、和SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、和SEQ IDNO:76；SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、和SEQ ID NO:80；SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、和SEQ ID NO:84；SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、和SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:79、和SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、和SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:68、SEQID NO:55、和SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:98、和SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:101、和SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:105、和SEQ ID NO:106；或者SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:108、和SEQ ID NO:88。此类多特异性抗体的PD-L1结合结构域可包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:97、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、或SEQ ID NO:107中的任一者，或与其构架区具有至少80％、85％、90％、95％、99％，优选95％序列同一性。在某些实施方案中，此类多特异性抗体的PD-L1结合结构域还包含CH1结构域。可以使用任何CH1结构域。合适的CH1结构域的示例由被提供为SEQ ID NO:116的氨基酸序列提供。
在某些实施方案中，多特异性抗体可包含如本文所公开的CD137结合结构域和PD-L1结合结构域的任何组合，参见例如表1。一种此类多特异性抗体是MCLA-145。
在某些实施方案中，多特异性抗体可进一步包含任何轻链。合适的轻链的一个示例包含轻链可变区，所述轻链可变区包含轻链CDR3(LCDR3)，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQID NO:113所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含具有如SEQ ID NO:113所示的氨基酸序列的轻链CDR3(LCDR3)。所述轻链可变区可进一步包含轻链CDR1(LCDR1)，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:111所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代；和/或轻链CDR2(LCDR2)，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:112所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含轻链CDR1(LCDR1)，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:111所示；和/或轻链CDR2(LCDR2)，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:112所示。所述多特异性抗体的轻链可变区可包含具有SEQ ID NO:110或与其框架区具有至少80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，此类多特异性抗体的轻链还包含CL结构域。可以使用任何CL结构域。合适的CL结构域的示例由被提供为SEQ IDNO:115的氨基酸序列提供。
在某些实施方案中，多特异性抗体可进一步包含Fc区或其部分。此类Fc区可包含本领域已知的任何修饰，诸如例如但不限于消除或降低Fc效应子功能的修饰，和/或促进不同CH3结构域的异二聚化的修饰。可以使用任何Fc区。合适的Fc区的一个示例由被提供为SEQ ID NO:116至SEQ ID NO:120的氨基酸序列提供。
根据本公开的方法可用于检测单个样品中至少两种不同细胞表面部分的聚集，并且根据本公开，特别是在聚集由对所述至少两种不同细胞表面部分具有结合特异性的试剂诱导的情况下。从中获得的知识可用于确定患者是否受益于用对所述两种不同细胞表面部分具有结合特异性的试剂进行的治疗，并且因此确定继续、调整还是终止治疗。例如，如果施用治疗剂但未观察到聚集或聚集低于某个阈值水平，则可以确定结束治疗。或者，如果观察到一些聚集但未达到所需水平，则可以确定增加治疗剂量和/或治疗间隔。在某些实施方案中，因此根据本公开的方法可以被认为是监测患者对特定治疗的反应的方法。
对两种不同的细胞表面部分具有结合特异性的试剂的示例是例如多特异性抗体。这种多特异性抗体可以是同时结合两种细胞表面部分的双特异性或三特异性抗体或其抗原结合片段。此类多特异性抗体可以表现出对两种细胞表面部分的单价结合，使得所述多特异性抗体包含针对每种细胞表面部分的单个抗原结合片段。本公开的方法可用于其中两种或更多种细胞表面部分被对这两种或更多种细胞表面部分具有结合特异性的试剂聚集的任何情况中。因此，对两种不同细胞表面部分具有结合特异性的试剂可以结合任何细胞表面部分，诸如本文所公开的那些，但不限于此。
结合两种不同细胞表面部分并且与可使用本公开的方法相关的多特异性抗体的一个具体示例是结合肿瘤细胞上的PD-L1和T细胞上的CD137的多特异性抗体。此类多特异性抗体可包含CD137结合结构域，所述CD137结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48、或SEQ ID NO:52中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述CD137结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48、或SEQ ID NO:52中任一者所示。所述CD137结合结构域可进一步包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、或SEQ ID NO:50中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:47、或SEQ ID NO:51中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述CD137结合结构域包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、或SEQID NO:50中任一者所示；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、或SEQ ID NO:51中任一者所示。HCDR1、HCDR2和HCDR3的任何组合都是可能的。优选的CD137结合结构域包含具有以下的HCDR1、HCDR2和HCDR3的组合：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:6、SEQID NO:7和SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；SEQ ID NO:14、SEQID NO:15和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23；SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34；SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38；SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42；SEQID NO:44、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:45；SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48；或SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:52。此类多特异性抗体的CD137结合结构域可包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、或SEQ ID NO:49中的任一者，或与其构架区具有至少80％、85％、90％、95％、或99％，优选95％序列同一性。在某些实施方案中，此类多特异性抗体的CD137结合结构域还包含CH1结构域。可以使用任何CH1结构域。合适的CH1结构域的示例由被提供为SEQ ID NO:116的氨基酸序列提供。
多特异性抗体可进一步包含PD-L1结合结构域，所述PD-L1结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQID NO:72、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:91、SEQID NO:95、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:102、或SEQ ID NO:106中的任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，PD-L1结合结构域包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQID NO:72、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:91、SEQID NO:95、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:102、或SEQ ID NO:106中的任一者所示。所述PD-L1结合结构域可进一步包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:54、SEQID NO:60、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQID NO:82、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、或SEQ ID NO:93中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:105、或SEQ ID NO:108中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述PD-L1结合结构域可包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、或SEQID NO:93中任一者所示；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ IDNO:105、或SEQ ID NO:108中任一者所示。HCDR1、HCDR2和HCDR3的任何组合都是可能的。优选的PD-L1结合结构域包含具有以下的HCDR1、HCDR2、和HCDR3的组合：SEQ ID NO:54、SEQID NO:55、和SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、和SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:63、和SEQ ID NO:56；SEQ IDNO:65、SEQ ID NO:66、和SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:55、和SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、和SEQ ID NO:72；SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、和SEQ IDNO:76；SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、和SEQ ID NO:80；SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、和SEQ ID NO:84；SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、和SEQ ID NO:88；SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:79、和SEQ ID NO:91；SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、和SEQ ID NO:95；SEQ ID NO:68、SEQID NO:55、和SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:98、和SEQ ID NO:99；SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:101、和SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:105、和SEQ ID NO:106；或者SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:108、和SEQ ID NO:88。此类多特异性抗体的PD-L1结合结构域可包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:97、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、或SEQ ID NO:107中的任一者，或与其构架区具有至少80％、85％、90％、95％、99％，优选95％序列同一性。在某些实施方案中，此类多特异性抗体的PD-L1结合结构域还包含CH1结构域。可以使用任何CH1结构域。合适的CH1结构域的示例由被提供为SEQ ID NO:116的氨基酸序列提供。
在某些实施方案中，多特异性抗体可包含如本文所公开的CD137结合结构域和PD-L1结合结构域的任何组合，参见例如表1。一种此类多特异性抗体是MCLA-145。
在某些实施方案中，多特异性抗体可进一步包含任何轻链。合适的轻链的一个示例包含轻链可变区，所述轻链可变区包含轻链CDR3(LCDR3)，所述LCDR3的氨基酸序列如SEQID NO:113所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含具有如SEQ ID NO:113所示的氨基酸序列的轻链CDR3(LCDR3)。所述轻链可变区可进一步包含轻链CDR1(LCDR1)，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:111所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代；和/或轻链CDR2(LCDR2)，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:112所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代。在某些实施方案中，所述轻链可变区包含轻链CDR1(LCDR1)，所述LCDR1的氨基酸序列如SEQID NO:111所示；和/或轻链CDR2(LCDR2)，所述LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:112所示。所述多特异性抗体的轻链可变区可包含具有SEQ ID NO:110或与其框架区具有至少80％、85％、90％、95％、99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，此类多特异性抗体的轻链还包含CL结构域。可以使用任何CL结构域。合适的CL结构域的示例由被提供为SEQ IDNO:115的氨基酸序列提供。
在某些实施方案中，多特异性抗体可进一步包含Fc区或其部分。此类Fc区可包含本领域已知的任何修饰，诸如例如但不限于消除或降低Fc效应子功能的修饰，和/或促进不同CH3结构域的异二聚化的修饰。可以使用任何Fc区。合适的Fc区的一个示例由被提供为SEQ ID NO:116至SEQ ID NO:120的氨基酸序列提供。
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如本文所用，“包括”及其变形以其非限制性的意义使用，意指包括所述词后面的项目，但不排除没有具体提到的项目。
如本文所用的冠词“一个/种”是指一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)所述冠词的语法宾语。举例来说，“一种要素”意指一种要素或多于一种要素。
本文中提及的专利文献或其他事项不应被视为承认该文献或事项是已知的，或者该文献或事项所包含的信息是在任何请求项的优先权日期时的公知常识的一部分。
在本申请中引用的全部专利和文献参考文件通过引用以其全部内容特此并入。
本公开以以下实施例例示。这些实施例不限制本公开的范围。
实施例
实施例1-用于测定的细胞沉淀的制备
将T75烧瓶用2μg/mL抗CD3(克隆OKT3，eBioscience，目录号16-0037-85)的PBS溶液包被过夜。接着，将表达CD137的Jurkat T细胞(Jurkat_CD137K)以1.8×106个细胞/mL的浓度添加到50mL培养基(9％ FBS-HI RPMI 1640，2mM L-谷氨酰胺)中并于37℃孵育4小时。然后将所述Jurkat细胞与50mL培养基中浓度为0.45×106个细胞/mL的表达PD-L1的CHO-K1细胞(CHO-PD-L1)共培养(Jurkat至CHO)。使细胞相互作用4小时，然后添加结合CD137和PD-L1的双特异性抗体、抗CD137阳性对照抗体或结合RSV的阴性对照抗体(10μg/mL)达另外2小时。然后通过重悬和刮擦从烧瓶中收集细胞，并如下固定：于4℃以1,200rpm(125x g)离心10min后，倒出培养基并使细胞沉淀松散并重悬于冰冷的PBS中。重复离心两次，从而倒掉PBS并通过涡旋使细胞沉淀松散。在第二次洗涤后，将沉淀重悬于30mL的10％中性缓冲福尔马林(10％ NBF，目录号5701，Thermo Fisher Scientific)中，并于4℃轻轻旋转过夜。在于4℃以1,500rpm离心10min后，去除福尔马林并将细胞沉淀以25×106个细胞/mL重悬于80％乙醇中，并于4℃储存，然后如先前所述进行处理(Shi等人,2009)。
结合CD137和PD-L1的合适双特异性抗体是例如本文具体公开的那些。
实施例2-PD-L1表达测定
将实施例1中制备的细胞沉淀用于该测定。将4.5×105个细胞置于带正电的载玻片(FisherScientific)上，并使用技术进行分析，如下文简要描述。
使用加压蒸煮器(Biocare Medical)经由加热执行抗原修复。在抗原修复后，添加抗体对，并通过毛细管电泳检测DTT介导释放的荧光VeraTag。将释放的VeraTag归一化为样品缓冲液体积，以给出每4.5×105个细胞的相对荧光单位。
所使用的抗体是经由二硫键用荧光报告分子标记的抗PD-L1兔单克隆抗体E1L3N(Cell Signaling Technology目录号13684)和山羊抗兔IgG(H+L)的胃蛋白酶消化物(Southern Biotech目录号4052-01)。在同种型对照实验中，PD-L1抗体被兔IgG(CellSignaling Technology目录号3900)代替。
结果如图9所示。测定似乎是用于检测PD-L1的表达水平的合适方法。在所有三个样品中测量到相似量的PD-L1。
实施例3-CD137表达测定
将实施例1中制备的细胞沉淀用于该测定。将4.5×105个细胞置于带正电的载玻片(FisherScientific)上，并使用技术进行分析，如下文简要描述。
使用加压蒸煮器(Biocare Medical)经由加热执行抗原修复。在抗原修复后，添加抗体对，并通过毛细管电泳检测DTT介导释放的荧光VeraTag。将释放的VeraTag归一化为样品缓冲液体积，以给出每4.5×105个细胞的相对荧光单位。
评估以下两种不同的一抗：抗CD137小鼠单克隆抗体M127(BD Pharmingen目录号552532)和抗CD137小鼠单克隆抗体BBK2(ThermoFisher目录号MS-621)。缀合至VeraTag的山羊抗小鼠IgG二抗(Jackson ImmunoResearch目录号115-005-146)与一抗配对。在同种型对照实验中，CD137抗体被小鼠IgG(BD Pharmingen目录号554121)代替。
结果如图10所示。测定似乎是检测CD137的表达水平的合适方法。对于两种测定一抗，在所有三个样品中都测量到了相似量的CD137。
实施例4-CD137聚集测定
将实施例1中制备的细胞沉淀用于该测定。将4.5×105个细胞置于带正电的载玻片(FisherScientific)上，并使用技术进行分析，如下文简要描述。
使用加压蒸煮器(Biocare Medical)经由加热执行抗原修复。在抗原修复后，添加抗体对，并通过毛细管电泳检测释放的荧光VeraTag。将释放的VeraTag归一化为样品缓冲液体积，以给出每4.5×105个细胞的相对荧光单位。
评估以下两种不同的一抗：抗CD137小鼠单克隆抗体M127(BD Pharmingen目录号552532)和抗CD137小鼠单克隆抗体BBK2(ThermoFisher目录号MS-621)。将等浓度的抗CD137抗体用荧光VeraTag报告分子或生物素标记。
结果如图11所示。测定似乎是检测CD137聚集的合适方法。与M127抗体相比，当BBK抗体被用作测定一抗时，/>信号显得更强。
实施例5-CD137-PD-L1邻近度测定
将实施例1中制备的细胞沉淀用于该测定。将4.5×105个细胞置于带正电的载玻片(FisherScientific)上，并使用技术进行分析，如下文简要描述。
使用加压蒸煮器(Biocare Medical)经由加热执行抗原修复。在抗原修复后，添加抗体对，并通过毛细管电泳检测释放的荧光VeraTag。将释放的VeraTag归一化为样品缓冲液体积，以给出每4.5×105个细胞的相对荧光单位。
CD137-PD-L1邻近度通过VeraTag报告分子从与抗PD-L1兔单克隆抗体E1L3N(CellSignaling Technology目录号13684，c末端)和生物素化山羊抗兔IgG二抗(RocklandImmunochemicals目录号611-101-122)配对的抗CD137小鼠单克隆抗体M127(BDPharmingen目录号552532，细胞外结构域)或小鼠单克隆抗体BBK2(ThermoFisher目录号MS-621，细胞外结构域)的邻近度依赖性释放测量。在同种型对照实验中，PD-L1抗体被兔IgG(Cell Signaling Technology目录号3900)代替。结果如图12所示。测定似乎是用于检测CD137-PD-L1复合物的合适方法。样品B显示出针对两种测定一抗的最强VeraTag信号。这表明CD137xPD-L1双特异性抗体同时结合CD137和PD-L1并聚集这些抗原，以及由此聚集表达这些抗原的细胞。
序列
SEQ ID NO:1：重链可变区
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SEQ ID NO:2：根据KABAT的来自SEQ ID NO:1的HCDR1
NFAMN
SEQ ID NO:3：根据KABAT的来自SEQ ID NO:1的HCDR2
WINTNTGNPTYAQGFTG
SEQ ID NO:4：根据KABAT的来自SEQ ID NO:1的HCDR3
DWGVIGGHYMDV
SEQ ID NO:5：重链可变区
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SEQ ID NO:6：根据KABAT的来自SEQ ID NO:5的HCDR1
SYGIS
SEQ ID NO:7：根据KABAT的来自SEQ ID NO:5的HCDR2
WISAYNGNTNYAQKLQG
SEQ ID NO:8：根据KABAT的来自SEQ ID NO:5的HCDR3
DSDGYGPKAFDY
SEQ ID NO:9：重链可变区
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SEQ ID NO:10：根据KABAT的来自SEQ ID NO:9的HCDR1
SYWIG
SEQ ID NO:11：根据KABAT的来自SEQ ID NO:9的HCDR2
IIYPDDSDTRYSPSFQG
SEQ ID NO:12：根据KABAT的来自SEQ ID NO:9的HCDR3
FYTGIVGATGAFDV
SEQ ID NO:13：重链可变区
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SEQ ID NO:14：根据KABAT的来自SEQ ID NO:13的HCDR1
SDAIS
SEQ ID NO:15：根据KABAT的来自SEQ ID NO:13的HCDR2
GMIPILGTANYAQKFQG
SEQ ID NO:16：根据KABAT的来自SEQ ID NO:13的HCDR3
GATYYYGSGTYYSINWFDP
SEQ ID NO:17：重链可变区
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SEQ ID NO:18：根据KABAT的来自SEQ ID NO:17的HCDR1
NFAMT
SEQ ID NO:19：根据KABAT的来自SEQ ID NO:17的HCDR3
DWASVMVRGDLDY
SEQ ID NO:20：重链可变区
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SEQ ID NO:21：根据KABAT的来自SEQ ID NO:20的HCDR1
ELSIH
SEQ ID NO:22：根据KABAT的来自SEQ ID NO:20的HCDR2
GFYPEDVEPIYARKFQG
SEQ ID NO:23：根据KABAT的来自SEQ ID NO:20的HCDR3
EGFDNYGSGIRGNWFDP
SEQ ID NO:24：重链可变区
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SEQ ID NO:25：根据KABAT的来自SEQ ID NO:24的HCDR1
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SEQ ID NO:27：根据KABAT的来自SEQ ID NO:24的HCDR3
EGVGVIRGNWFDP
SEQ ID NO:28：重链可变区
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SEQ ID NO:29：根据KABAT的来自SEQ ID NO:28的HCDR2
IIFPDDSDTRYSPSFQG
SEQ ID NO:30：根据KABAT的来自SEQ ID NO:28的HCDR3
LGGYSGYAEDFVDF
SEQ ID NO:31：重链可变区
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SEQ ID NO:32：根据KABAT的来自SEQ ID NO:31的HCDR1
KLSMH
SEQ ID NO:33：根据KABAT的来自SEQ ID NO:31的HCDR2
GFEPEDGETINAQKFQG
SEQ ID NO:34：根据KABAT的来自SEQ ID NO:31的HCDR3
DLRLGASYYYSYMDV
SEQ ID NO:35：重链可变区
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TSGMSVG
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LIYWNDDKYFSPSLKS
SEQ ID NO:38：根据KABAT的来自SEQ ID NO:35的HCDR3
TLWGSDDVFDV
SEQ ID NO:39：重链可变区
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SEQ ID NO:40：根据KABAT的来自SEQ ID NO:39的HCDR1
NYWIG
SEQ ID NO:41：根据KABAT的来自SEQ ID NO:39的HCDR2
IIYPGDSDTRYSPSFQG
SEQ ID NO:42：根据KABAT的来自SEQ ID NO:39的HCDR3
HQGYSFSGSHIDDY
SEQ ID NO:43：重链可变区
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SEQ ID NO:44：根据KABAT的来自SEQ ID NO:43的HCDR1
TYWIG
SEQ ID NO:45：根据KABAT的来自SEQ ID NO:43的HCDR3
HAGFIITSQNIDDY
SEQ ID NO:46：重链可变区
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SEQ ID NO:47：根据KABAT的来自SEQ ID NO:46的HCDR2
WINTNTGNPTYAQDFTG
SEQ ID NO:48：根据KABAT的来自SEQ ID NO:46的HCDR3
DWGLVAIGYFDY
SEQ ID NO:49：重链可变区
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTTGVGVNWIRQPPGEALEWLALIYWNDDTYYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHEGIIGFLGGNWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:50：根据KABAT的来自SEQ ID NO:49的HCDR1
TTGVGVN
SEQ ID NO:51：根据KABAT的来自SEQ ID NO:49的HCDR2
LIYWNDDTYYSPSLKS
SEQ ID NO:52：根据KABAT的来自SEQ ID NO:49的HCDR3
EGIIGFLGGNWFDP
SEQ ID NO:53：重链可变区
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSHAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:54：根据KABAT的来自SEQ ID NO:53的HCDR1
SHAMN
SEQ ID NO:55：根据KABAT的来自SEQ ID NO:53的HCDR2
WINPNTGNPTYAQGFTG
SEQ ID NO:56：根据KABAT的来自SEQ ID NO:53的HCDR3
DRKYVTNWVFAEDFQH
SEQ ID NO:57：重链可变区
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSHAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAIDRGYMSNWVFAEYFPHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:58：根据KABAT的来自SEQ ID NO:57的HCDR3
DRGYMSNWVFAEYFPH
SEQ ID NO:59：重链可变区
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCATDRGYISSWVFAEDFQHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:60：根据KABAT的来自SEQ ID NO:59的HCDR1
SYAMN
SEQ ID NO:61：根据KABAT的来自SEQ ID NO:59的HCDR3
DRGYISSWVFAEDFQH
SEQ ID NO:62：重链可变区
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCTASGYTFTSYAMNWVRQAPGQRLEWMACVNPNTGSPTYAQGSTGRFVVSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGHGTLVTVSS
SEQ ID NO:63：根据KABAT的来自SEQ ID NO:62的HCDR2
CVNPNTGSPTYAQGSTG
SEQ ID NO:64：重链可变区
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAPGQGLEWMGWMNPNTGNPTYAQGSTGRFVVSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO:65：根据KABAT的来自SEQ ID NO:64的HCDR1
NYAMN
SEQ ID NO:66：根据KABAT的来自SEQ ID NO:64的HCDR2
WMNPNTGNPTYAQGSTG
SEQ ID NO:67：重链可变区
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAINWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGRGTLVTVSS
SEQ ID NO:68：根据KABAT的来自SEQ ID NO:67的HCDR1
NYAIN
SEQ ID NO:69：重链可变区
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFNTYSITWVRQAPGQGLEWMGSIVPIFGTINNAQKFQGRVTITADKSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDNTMVRGVDYYYMDVWGKGTMVTVSS
SEQ ID NO:70：根据KABAT的来自SEQ ID NO:69的HCDR1
TYSIT
SEQ ID NO:71：根据KABAT的来自SEQ ID NO:69的HCDR2
SIVPIFGTINNAQKFQG
SEQ ID NO:72：根据KABAT的来自SEQ ID NO:69的HCDR3
DNTMVRGVDYYYMDV
SEQ ID NO:73：重链可变区
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGIFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTPNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMDLSSLRSEDTAVYYCAKNVRGYSAYDLDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:74：根据KABAT的来自SEQ ID NO:73的HCDR1
TYAIS
SEQ ID NO:75：根据KABAT的来自SEQ ID NO:73的HCDR2
GIIPIFDTPNYAQKFQG
SEQ ID NO:76：根据KABAT的来自SEQ ID NO:73的HCDR3
NVRGYSAYDLDY
SEQ ID NO:77：重链可变区
EVQLVQSGAEVKNPGSSVKVSCKATGGTFNTYGTNWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTTTAYMEVSSLRSEDTAVYYCARGGADMGTLDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:78：根据KABAT的来自SEQ ID NO:77的HCDR1
TYGTN
SEQ ID NO:79：根据KABAT的来自SEQ ID NO:77的HCDR2
GIIPIFGTANYAQKFQG
SEQ ID NO:80：根据KABAT的来自SEQ ID NO:77的HCDR3
GGADMGTLDY
SEQ ID NO:81：重链可变区
EVQLVQSGAEVMRPGSSVKVSCKASGGIFNTYTIIWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTPNFAQKFQGRLTITADKSTNTAYMELTSLRSEDTAVYYCAREGCNHGVCYPYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:82：根据KABAT的来自SEQ ID NO:81的HCDR1
TYTII
SEQ ID NO:83：根据KABAT的来自SEQ ID NO:81的HCDR2
GIIPIFDTPNFAQKFQG
SEQ ID NO:84：根据KABAT的来自SEQ ID NO:81的HCDR3
EGCNHGVCYPY
SEQ ID NO:85：重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFRSYGITWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQKFQGRVTITADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRRGYSNPHWLDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:86：根据KABAT的来自SEQ ID NO:85的HCDR1
SYGIT
SEQ ID NO:87：根据KABAT的来自SEQ ID NO:85的HCDR2
GIIPIFGTTNYAQKFQG
SEQ ID NO:88：根据KABAT的来自SEQ ID NO:85的HCDR3
RRGYSNPHWLDP
SEQ ID NO:89：重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGILWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADISTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGNYYEFVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:90：根据KABAT的来自SEQ ID NO:89的HCDR1
TYGIL
SEQ ID NO:91：根据KABAT的来自SEQ ID NO:89的HCDR3
GGGNYYEFVY
SEQ ID NO:92：重链可变区
EVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFNTYAINWVRQAPGQGLEWVGRIIPIFDTANYAQKFQGRVTISADKSTTTAYMELSSLRSEDTAVFYCAKDETGYSSSNFQHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:93：根据KABAT的来自SEQ ID NO:92的HCDR1
TYAIN
SEQ ID NO:94：根据KABAT的来自SEQ ID NO:92的HCDR2
RIIPIFDTANYAQKFQG
SEQ ID NO:95：根据KABAT的来自SEQ ID NO:92的HCDR3
DETGYSSSNFQH
SEQ ID NO:96：重链可变区
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAINWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:97：重链可变区
QVQLVQSGAEVKRPGSSVKVSCKASGGTFNTYSITWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTSKYAQKFQDRVTITADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPSFSSSSGWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:98：根据KABAT的来自SEQ ID NO:97的HCDR2
GIIPVFGTSKYAQKFQD
SEQ ID NO:99：根据KABAT的来自SEQ ID NO:97的HCDR3
DPSFSSSSGWFDP
SEQ ID NO:100：重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNTYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQRFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAKDQTGYSSTLFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:101：根据KABAT的来自SEQ ID NO:100的HCDR2
GIIPIFDTANYAQRFQG
SEQ ID NO:102：根据KABAT的来自SEQ ID NO:100的HCDR3
DQTGYSSTLFDY
SEQ ID NO:103：重链可变区
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSHAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAIDRGYMSNWVFAEYFPHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:104：重链可变区
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGWIIPIFDTGNYAQKIQGRVTITADKSTSTAYMELTSLRSEDTAVYYCARHDYTNTVDAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO:105：根据KABAT的来自SEQ ID NO:104的HCDR2
WIIPIFDTGNYAQKIQG
SEQ ID NO:106：根据KABAT的来自SEQ ID NO:104的HCDR3
HDYTNTVDAFDI
SEQ ID NO:107：重链可变区
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFRSYGITWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTTNYAQKFQGRVTITADKSTSTVFMELNSLRSEDTAVYYCARRRGYSNPHWLDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:108：根据KABAT的来自SEQ ID NO:107的HCDR2
GIIPVFGTTNYAQKFQG
SEQ ID NO:109：人类共同轻链IGKV1-39/jk1的氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:110：共同轻链可变结构域的氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:111：根据KABAT的来自SEQ ID NO:110的LCDR1
RASQSISSYLN
SEQ ID NO:112：根据KABAT的来自SEQ ID NO:110的LCDR2
AASSLQS
SEQ ID NO:113：根据KABAT的来自SEQ ID NO:110的LCDR3
QQSYSTPPT
SEQ ID NO:114：共同轻链恒定结构域的氨基酸序列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:115：轻链恒定结构域的氨基酸序列
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:116：CH1的氨基酸序列
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
SEQ ID NO:117：铰链的氨基酸序列
EPKSCDKTHTCPPCP
SEQ ID NO:118：CH2的氨基酸序列
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
SEQ ID NO:119：具有KK突变的CH3的氨基酸序列
GQPREPQVYTKPPSREEMTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:120：具有DE突变的CH3的氨基酸序列
GQPREPQVYTDPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
Claims (47)
1.一种用于检测样品中至少两种细胞表面部分的聚集的存在的方法，所述两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子及特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子接触，其中所述第一结合分子和所述第二结合分子中的至少一者包含分子标签，除非所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分彼此接近，否则所述分子标签不被检测到；以及
检测所述分子标签的存在或不存在以检测所述样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的聚集的存在。
2.一种用于量化样品中至少两种细胞表面部分的聚集的存在的方法，所述两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
使其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分已暴露于至少对所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分具有结合特异性的试剂的样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子及特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子接触，其中所述第一结合分子和所述第二结合分子中的至少一者包含分子标签，除非所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分彼此接近，否则所述分子标签不被检测到；以及
测量所述分子标签的量以量化所述样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的聚集的存在。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括：
-a)使所述样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子及特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的分子标签，并且所述第二结合分子包含切割诱导部分；或者
b)使所述样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子及特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的分子标签，并且所述第一结合分子包含切割诱导部分；
-诱导所述分子标签的切割；以及
-检测所释放的分子标签的存在或不存在，或测量所释放的分子标签的量，从而检测或量化所述样品中所述第一细胞表面部分与所述第二细胞表面部分的聚集。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括：
-a)使所述样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含经由可切割接头附接至所述第一结合分子的分子标签，并且所述第三结合分子结合至所述第二结合分子并包含切割诱导部分；或者
b)使所述样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含经由可切割接头附接至所述第二结合分子的分子标签，并且所述第三结合分子结合至所述第一结合分子并包含切割诱导部分；或者
c)使所述样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子接触，
其中所述第一结合分子包含切割诱导部分，并且所述第三结合分子结合至所述第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的分子标签；或者
d)使所述样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、以及第三结合分子接触，
其中所述第二结合分子包含切割诱导部分，并且所述第三结合分子结合至所述第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的分子标签；
-诱导所述分子标签的切割；以及
-检测所释放的分子标签的存在或不存在，或测量所释放的分子标签的量，从而检测或量化所述样品中所述第一细胞表面部分与所述第二细胞表面部分的聚集。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括：
-a)使所述样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、第三结合分子和第四结合分子接触，
其中所述第三结合分子结合至所述第一结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第三结合分子的分子标签，并且所述第四结合分子结合至所述第二结合分子并包含切割诱导部分；或者
b)使所述样品与特异性结合所述第一细胞表面部分的第一结合分子、特异性结合所述第二细胞表面部分的第二结合分子、第三结合分子和第四结合分子接触，
其中所述第三结合分子结合至所述第一结合分子并包含切割诱导部分；并且所述第四结合分子结合至所述第二结合分子并包含经由可切割接头附接至所述第四结合分子的分子标签，
-诱导所述分子标签的切割；以及
-检测所释放的分子标签的存在或不存在，或测量所释放的分子标签的量，从而检测或量化所述样品中所述第一细胞表面部分与所述第二细胞表面部分的聚集。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述样品是组织样品、血液样品或培养细胞，优选地来自受试者或患者。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述样品是新鲜样品或经固定的样品。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述样品是来自患有癌症的受试者的肿瘤活检样品。
9.一种用于检测样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
使来自患有癌症的受试者的肿瘤活检样品与检测第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测第二细胞表面部分的至少一种结合分子接触，
其中检测所述第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测所述第二细胞表面部分的至少一种结合分子包含分子标签；以及
检测所述分子标签的存在或不存在以检测所述样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的表达。
10.一种用于量化样品中至少两种细胞表面部分的表达的方法，所述至少两种细胞表面部分包括第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，所述方法包括：
使来自患有癌症的受试者的肿瘤活检样品与检测第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测第二细胞表面部分的至少一种结合分子接触，
其中检测所述第一细胞表面部分的至少一种结合分子和检测所述第二细胞表面部分的至少一种结合分子包含分子标签；以及
测量所述分子标签的量以量化所述样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的表达。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分由相同的细胞或相同类型的细胞表达。
12.根据权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分由不同的细胞或不同类型的细胞表达。
13.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一细胞表面部分由免疫效应细胞，特别是NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞表达，并且所述第二细胞表面部分由肿瘤细胞或免疫细胞表达。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中至少一种细胞表面部分是CD137或另一种免疫效应细胞共刺激部分。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中至少一种细胞表面部分是PD-L1或另一种肿瘤相关部分或免疫检查点部分。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中至少一种细胞表面部分是CD137或另一种免疫效应细胞共刺激部分，并且至少一种细胞表面部分是PD-L1或另一种肿瘤相关部分或免疫检查点部分。
17.根据权利要求1-8和11-16中任一项所述的方法，其中对所述细胞表面部分具有结合特异性的所述试剂是多特异性抗体，诸如双特异性或三特异性抗体。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体，所述双特异性抗体结合CD137或另一种免疫效应细胞共刺激分子和PD-L1或另一种肿瘤相关部分或免疫检查点部分。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述双特异性抗体的结合CD137的结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区具有重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:48、或SEQ ID NO:52中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代，优选1个氨基酸取代。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述双特异性抗体的结合CD137的结合结构域包含：重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、或SEQ ID NO:50中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代，优选1个氨基酸取代；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、或SEQ ID NO:51中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代，优选1个氨基酸取代。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体的结合CD137的结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:46、或SEQ ID NO:49中的任一者，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％序列同一性，特别是与其构架区具有至少80％、85％、90％、95％、99％序列同一性。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体的结合PD-L1的结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区具有重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:102、或SEQ ID NO:106中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代，优选1个氨基酸取代。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体的结合PD-L1的结合结构域包含：重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、或SEQ ID NO:93中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代，优选1个氨基酸取代；和/或重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:105、或SEQ ID NO:108中任一者所示，允许所述氨基酸序列中有1个、2个或3个氨基酸取代，优选1个氨基酸取代。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体的结合PD-L1的结合结构域包含重链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:59、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:81、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:97、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、或SEQ ID NO:107中的任一者，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、99％序列同一性，特别是与其构架区具有至少80％、85％、90％、95％、99％序列同一性。
25.一种用于预测受试者、特别是癌症患者对结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分、特别是在免疫效应细胞上表达的部分和在肿瘤细胞或免疫细胞上表达的部分的一种或多种试剂的反应性的方法，所述方法包括：
-检测来自所述受试者的生物样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面构件的表达水平；
-确定所述受试者的样品中所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的所述表达水平是高于还是低于阈值水平；以及
-如果所述受试者的样品中所述第一细胞表面部分和所述第二种细胞表面部分的所述表达水平等于或高于所述阈值水平，则预测所述受试者可能对结合所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的一种或多种试剂有反应。
26.根据权利要求25所述的方法，其中使用根据权利要求9-16中任一项所述的方法测量所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面构件的所述表达水平。
27.一种用于治疗有需要的受试者、特别是患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
-使用根据权利要求25或26所述的方法预测所述受试者对结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的一种或多种试剂的反应性；以及
-将结合所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面的一种或多种试剂施用于可能有反应的受试者。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中至少一种细胞表面部分是CD137或另一种免疫效应细胞共刺激部分。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中至少一种细胞表面部分是PD-L1或另一种肿瘤相关部分或免疫检查点部分。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法，其中至少一种细胞表面部分是CD137并且至少一种细胞表面部分是PD-L1。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中结合所述细胞表面部分的所述试剂是多特异性抗体，诸如双特异性抗体或三特异性抗体，特别是双特异性抗体，所述双特异性抗体特异性结合CD137或另一种免疫效应细胞共刺激部分和PD-L1或另一种肿瘤相关部分或免疫检查点部分，如在权利要求17-24中任一项中所定义。
32.一种用于确定试剂的有效性的方法，所述试剂至少包含特异性结合第一细胞表面部分的结合结构域和特异性结合第二细胞表面部分的结合结构域，所述方法包括通过使用根据权利要求1-24中任一项所述的方法，检测处于使用所述试剂治疗下的受试者的生物样品中所述第一细胞表面部分与所述第二细胞表面部分的聚集。
33.一种用于确定试剂的有效性的方法，所述试剂至少包含特异性结合第一细胞表面部分的结合结构域和特异性结合第二细胞表面部分的结合结构域，所述方法包括通过使用根据权利要求1-24中任一项所述的方法，量化处于使用所述试剂治疗下的受试者的生物样品中所述第一细胞表面部分与所述第二细胞表面部分的聚集。
34.一种用于确认试剂的作用模式的方法，所述试剂至少包含特异性结合第一细胞表面部分的结合结构域和特异性结合第二细胞表面部分的结合结构域，所述方法包括通过使用根据权利要求1-24中任一项所述的方法，检测处于使用所述试剂治疗下的受试者的生物样品中所述第一细胞表面部分与所述第二细胞表面部分的聚集。
35.一种用于确认试剂的作用模式的方法，所述试剂至少包含特异性结合第一细胞表面部分的结合结构域和特异性结合第二细胞表面部分的结合结构域，所述方法包括通过使用根据权利要求1-24中任一项所述的方法，量化处于使用所述试剂治疗下的受试者的生物样品中所述第一细胞表面部分与所述第二细胞表面部分的聚集。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述作用模式是所述试剂同时结合所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分。
37.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述作用模式是两种或更多种细胞表面部分的聚集。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述聚集是在免疫效应细胞上表达的两种或更多种细胞表面部分的聚集，特别是两种或更多种CD137蛋白的聚集。
39.一种用于治疗有需要的受试者、特别是患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
-用结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分的试剂治疗受试者；
-使用根据权利要求32-38中任一项所述的方法分析所述试剂的有效性或所述试剂的作用模式。
40.根据权利要求39所述的方法，所述方法进一步包括基于所述分析或确认的结局继续或调整所述治疗。
41.一种针对诱导至少第一细胞表面部分与第二细胞表面部分的聚集的能力来筛选一种或多种测试剂的方法，所述方法包括：
-使一种或多种测试细胞培养物与测试剂接触，
其中所述测试细胞培养物包含表达第一细胞表面部分的细胞和表达第二细胞表面部分的细胞；
-使用根据权利要求1-24中任一项所述的方法检测或量化所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分的聚集水平；以及
-将所述聚集水平与针对未与所述测试剂接触或与参考剂接触的对照细胞培养物中的聚集检测到的聚集水平进行比较，
其中所述对照细胞培养物包含所述第一细胞表面部分和所述第二细胞表面部分。
42.根据权利要求41所述的方法，所述方法进一步包括选择测试剂，所述测试剂诱导与所述对照细胞培养物中的所述聚集水平相比相等或更高的聚集水平。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中至少一种细胞表面部分是CD137或另一种免疫效应物共刺激部分。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中至少一种细胞表面部分是PD-L1或另一种肿瘤相关部分或免疫检查点分子。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中至少一种细胞表面部分是CD137并且至少一种细胞表面部分是PD-L1。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其中所述参考剂是多特异性抗体，所述多特异性抗体特异性结合CD137或另一种免疫效应物共刺激部分和PD-L1或另一种肿瘤相关部分或免疫检查点部分，如权利要求17-24中任一项中所定义。
47.一种套装药盒，所述套装药盒包含：至少两种结合分子，所述结合分子特异性结合第一细胞表面部分和第二细胞表面部分，任选地其中所述结合分子中的一种结合分子包含经由可切割接头附接至所述结合分子的分子标签，并且另一种结合分子包含切割诱导部分；以及说明书，所述说明书关于使患者样品与所述至少两种结合分子接触，任选地以诱导所述分子标签的切割；并且以检测通过使所述患者样品与所述至少两种结合分子接触而诱导的信号的存在或不存在。
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