CN116286659A - 多聚体在car表达细胞检测和细胞制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多聚体在CAR表达细胞检测和细胞制备中的应用。抗原多聚体能够实现高度特异、灵敏和精确的CAR检测，可通过磁性富集用于敏感检测罕有的CAR‑T细胞，还可以利用温度控制和特异的CAR‑T细胞刺激用于激活表型和特异扩增，以及通过单细胞多组学分析实现多维CAR‑T细胞分析。此外，利用抗原多聚体来特异性生产CAR‑T细胞的方法，不同于目前的用非特异性的抗CD28/CD3磁珠来非特异激活扩增T细胞的方法，由于抗原‑多聚体只特异性地激活扩增相应的CAR‑T细胞，不会激活其他T细胞，也不需要担心磁珠潜在的毒性，是一种更优的CAR‑T细胞制备方法。此外，本发明还用寡核苷酸标记了抗原多聚体，实现了通过单细胞测序进行CAR表达检测。

Description

多聚体在CAR表达细胞检测和细胞制备中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体指一种多聚体在CAR表达细胞检测和细胞制备中的应用。
背景技术
CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。这是一种治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的非常具有前景的肿瘤免疫治疗方法。
T细胞也叫T淋巴细胞，技术人员通过基因工程技术，将T细胞激活，将CAR(肿瘤嵌合抗原受体)转导入T淋巴细胞，获得CAR-T细胞，它利用其CAR的特性，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，它们能高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。
随着CAR-T疗法的发展，需要特异性高、敏感性好、精确度佳和多功能的CAR染色试剂来进行生化分析、进行临床前研究、分析患者生物样本以及开发新的CAR。然而，现有的CAR染色试剂均存在局限性。结合CAR单链抗体的通用CAR染色试剂(多克隆抗IgG抗体和蛋白L)受到非特异性结合、与其他抗体不相容的限制，以及对多步骤染色程序的要求。虽然某些特定的CAR染色试剂(目标抗原和抗独特型抗体)可以在市场上买到，但通常受到蛋白质稳定性和高开发成本的限制。此外，所有现有的CAR染色试剂因结合价≤2而应用受限。因此开发具有更高亲和力的，更优检测性能的CAR染色试剂，具有重要的应用前景。
现有中国专利公开了“一种多聚体结合试剂”(公开号CN107847544A)，有望解决上述问题，填补这一领域的应用空缺。
此外，现有技术路线在制备CAR-T细胞时，常采用抗CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激从病人外周血提取的T细胞后，加入慢病毒对T细胞转染以表达抗CD19的CAR，再继续利用抗CD3/CD28抗体偶联磁珠来刺激扩增生产CAR-T细胞。除了磁珠毒性的问题，该方法存还在非特异性细胞增殖的缺陷。这是由于CAR-T细胞慢病毒转染效率较低，仅有部分T细胞在转染后表达CAR分子，而抗CD3/CD28抗体偶联磁珠会刺激所有T细胞，无差别地扩增表达和不表达CAR的细胞群体，导致目前生产的CAR-T细胞产品纯度比较低。现有正常情况下，仅有少部份(～30％)获得的细胞是CAR-T细胞，而大部分细胞(～70％)是非CAR-T细胞，如图11B所示。此技术缺点极大地影响和限制了CAR-T细胞的临床治疗效果，是目前CAR-T细胞生产的一大主要亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服上述CAR-T应用技术中存在的问题，提供一种多聚体在CAR表达细胞制备和检测中的应用。这里CAR表达细胞可以是CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR巨噬细胞或其他CAR转导细胞。
本发明首先提供了一种CAR染色试剂，它包含多聚体-抗原分子的结合物，所述抗原分子是生物素标记的对待检测的CAR具有特异性结合力的抗原分子；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ IDNO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，所述链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原分子；所述链霉亲和素上有可检测的标记物。
需要说明的是，上述CAR染色试剂中所述多聚体及其蛋白亚基的序列中的SEQ IDNO:1与中国专利“一种多聚体结合试剂”(公开号CN107847544A)中公开的一致。即本申请揭示了其可以作为CAR染色试剂的用途。
优选地，所述待检测的CAR具有低亲和力特性。
优选地，所述待检测的CAR的KD值≥0.1nM。
可选地，所述待检测的CAR为CD19的CAR。
可选地，所述待检测的CAR由针对同一种抗原分子的多种CAR的混合组成。
优选地，所述CAR染色试剂的工作温度为0～25℃，更有选为4℃。
其次，本发明提供了一种CAR表达细胞特异扩增生产试剂，包含抗原与多聚体的结合物；
所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO:1；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:2；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，所述链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
需要说明的是，上述多聚体应理解为包含五聚体、八聚体、十二聚体、甚至二十聚体等多个由数量不等的支架蛋白和链霉亲和素的结合物，一个支架蛋白可以结合不同数量的链霉亲和素，而四个链霉亲和素又可以结合1个以上的支架蛋白，由此排列组合可以得到不同形式的多聚体。本申请不仅公开了十二聚体可以作为生产试剂进行CAR表达细胞特异性扩增的用途，还揭示了其他多聚体同样能有此用途，仅存在效果优劣的差异。
优选地，所述试剂的使用温度为30～40℃，优选37℃。
可选地，所述多聚体为十二聚体。
另一种本发明提供的CAR表达细胞特异扩增生产试剂，包括一个链霉亲和素，所述链霉亲和素通过生物素结合2～4个抗原，所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子，将该CAR表达细胞特异扩增生产试剂命名为抗原链霉四聚体。其使用温度同样为30～40℃，优选37℃。
本发明还提供了上述CAR表达细胞特异扩增生产试剂在CAR-T细胞制备过程中的应用。
具体还提供了一种CAR-T细胞特异扩增培养方法，包括如下步骤：将前述的CAR表达细胞特异扩增生产试剂加入到在培养的CAR-T细胞群体中，使培养所生产的CAR-T细胞达到预设的治疗标准。一般来说，上述试剂应该伴随CAR-T细胞的生长过程，以持续刺激特定CAR-T细胞增殖。
再次，本发明提供了一种CAR表达检测试剂，包含用寡核苷酸标记的抗原多聚体，所述抗原多聚体为抗原与多聚体的结合物；
所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ IDNO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
优选地，所述多聚体为十二聚体。
另一种本发明提供的CAR表达检测试剂，包含未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素通过生物素结合2～4个抗原，所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子，将该CAR表达检测试剂命名为抗原链霉四聚体。
本发明还提供了一种CAR表达检测方法，包括步骤：利用上述CAR表达检测试剂染色CAR，再通过单细胞测序进行CAR表达检测。
此外，本发明还提供了一种定点生物素标记分子，是位于抗原蛋白的序列中，使所述抗原蛋白可被生物素化的标记分子，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
一种CD19的CAR抗原多聚体，为抗原-多聚体的结合物，所述抗原为具有可生物素化的位点的CD19抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述CD19抗原蛋白通过生物素与四聚体或多聚体结合；所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ IDNO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
一种HER2的CAR抗原多聚体，为抗原-多聚体的结合物，所述抗原为具有可生物素化的位点的HER2抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述HER2抗原蛋白通过生物素与四聚体或多聚体结合；所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ IDNO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
一种Tn糖苷的CAR抗原多聚体，为抗原-多聚体的结合物，所述抗原为具有可生物素化的位点的Tn糖苷抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述Tn糖苷抗原蛋白通过生物素与四聚体或多聚体结合；所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ IDNO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
最后，本发明还揭示了上述CD19的CAR抗原多聚体、HER2的CAR抗原多聚体及Tn糖苷的CAR抗原多聚体试剂在CAR染色、CAR表达细胞特异扩增生产，CAR表达检测中的应用。
以及本发明还揭示了多聚体和四聚体在制备CAR染色试剂、CAR表达细胞特异扩增生产试剂、CAR表达检测试剂中的应用，其中多聚体和四聚体上的链霉亲和素用于结合已生物素标记的对目标CAR具有特异性结合力的抗原。
为了产生用于CAR-T细胞检测的高亲和力CAR染色试剂，我们设计、构建并验证了两种形式的抗原多聚体：抗原链霉四聚体和抗原十二聚体。抗原多聚体由在链霉亲和素支架上多聚的CAR抗原组成(图1A)。
在所有实验中，抗原分子都是位置特异性生物素化而不是随机生物素化，以减少CAR结合位点的高阶齐聚和空间位阻。我们在三种不同的第二代CAR上验证了抗原多聚体的有效性：抗CD19 CAR(克隆FMC63，“Construction and Pre-clinical Evaluation of anAnti-CD19 Chimeric Antigen Receptor”,J Immunother.2009September；32(7):689–702.doi:10.1097/CJI.0b013e3181ac6138.)、抗HER2 CAR(克隆C6ML3-9,“T CellActivation by Antibody-Like Immunoreceptors:Increase in Affinity of theSingle-Chain Fragment Domain above Threshold Does Not Increase T CellActivation against Antigen-Positive Target Cells but Decreases Selectivity”,JImmunol 2004；173:7647-7653.doi:10.4049/jimmunol.173.12.7647)和抗Tn CAR(克隆237,“Multiple cancer-specific antigens are targeted by a chimeric antigenreceptor on a single cancer cell”,JCI Insight.2019；4(21):e130416.https://doi.org/10.1172/jci.insight.130416.)(图1B)。
每个用于验证的CAR，从N端到C端由细胞外单链抗体、CD8α铰链和跨膜区、4-1BB和CD3δ细胞内结构域以及单体增强型绿色荧光蛋白(meGFP)组成。C端的meGFP用来示踪CAR转导效率和表达。铰链、跨膜区和细胞内区域的设计与Tisagenlecleucel中使用的临床CAR结构相同。其中抗CD19和抗HER2 CAR采用的是人源结构域，而抗Tn CAR采用的是小鼠结构域。三个用来验证的CAR可以有效测试抗原多聚体的效用：(1)抗CD19 CAR使用的是与临床CD19CAR-T疗法相同的基于FMC63的单链抗体片段；(2)CAR结合亲和力KD值范围从0.3nM到140nM，代表不同亲和力的CAR；(3)抗原分子大小在2.6kDa到73kDa之间。
本发明的有益效果：
根据细胞系和患者生物样本的测试结果，抗原多聚体能够实现高度特异、灵敏和精确的CAR检测，可通过磁性富集用于敏感检测罕有的CAR-T细胞，还可以利用温度控制和特异的CAR-T细胞刺激用于激活表型和特异扩增，以及通过单细胞多组学分析实现多维CAR-T细胞分析。通过切换不同的抗原，抗原多聚体可以很容易地扩展应用到现有的和新发现的CAR。我们在三个独立的CAR(抗CD19、抗HER2和抗Tn)上展示了这种扩展性。虽然我们在目前的研究中只测试了抗原链霉四聚体和抗原十二聚体，但抗原多聚体也可以扩展到其他价态，如二聚体、五聚体、八聚体和右旋体。由于其多功能和可扩展性，抗原多聚体是一类新的抗原CAR染色试剂，适用于CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR巨噬细胞或其他CAR转导细胞，具有广泛的CAR表达细胞研究和临床应用前景。此外，利用抗原多聚体来特异性生产CAR-T细胞的方法，不同于目前的用非特异性的抗CD28/CD3磁珠来非特异激活扩增T细胞的方法，由于抗原-多聚体只特异性地激活扩增相应的CAR-T细胞，不会激活其他T细胞，也不需要担心磁珠潜在的毒性，是一种更优的CAR-T细胞制备方法。此外，本发明还用寡核苷酸标记了抗原多聚体，实现以单细胞测序进行CAR表达检测。
附图说明
图1为针对CD19、HER2和Tn糖苷的CAR抗原多聚体设计和验证。图中，(A)为抗原链霉四聚体和抗原十二聚体及其各主要分子成分的示意图。(B)用于验证抗原多聚体的CD19-、HER2-和Tn-导向CAR结构图。每个CAR包含一个C端meGFP，用于示踪CAR表达。CAR转录由脾脏焦点形成病毒(SFFV)或小鼠胚胎干细胞病毒(MSCV)启动子引导。(C，F，I)在匹配的CAR转导细胞系上对三种类型的抗原链霉四聚体和抗原十二聚体进行染色滴定。未转导细胞系的染色显示为深灰色，用于流式设门。图为来自三次独立实验的代表性直方图。(D，G，J)抗原链霉四聚体、抗原十二聚体和抗原单体对照的三次染色滴定结果与剂量-反应曲线拟合，描述了每种浓度的平均值±标准误差。(E，H，K)代表性滴定实验的曲线图(拟合到剂量-反应曲线)，显示几何平均荧光强度与CAR转导(T)和未转导细胞系(U)上染色剂浓度之间的关系。
图2为CAR转导、靶抗原单体对照和BSA-多聚体阴性对照的实验结果图。图中，(A-C)直方图显示针对CD19、HER2和Tn糖苷的meGFP标记CAR转导到人Jurkat细胞(抗CD19和抗HER2 CAR)或小鼠58-/-杂交瘤细胞(抗Tn-CAR)。未转导的细胞作为阴性对照。(D-E)直方图显示Alexa 647标记的牛血清白蛋白多聚体(BSA-多聚体)在未转导和αCD19 CAR转导的Jurkat细胞上的滴定(从0.1到10nM)。基于没有被BSA-多聚体(0nM)染色的细胞，流式设门用于定量同型对照非特异性染色的细胞的比例。(F)在相应的CAR转导细胞系上对单体CD19、HER2或Tn PDPN进行染色滴定。未转导细胞系的染色显示为深灰色，用于流式设门。(G)Tn-PDPN单体在1000倍更高浓度下的染色滴定。
图3为抗原多聚体具有高度特异性的验证图。(A-B)抗原链霉四聚体(A)和抗原十二聚体(B)通过对用CD19-、HER2-和Tn-导向CARs转导的细胞系进行染色来评估特异性。未转导细胞系的染色显示为深灰色，用于流式设门。(C)使用现有的CAR染色试剂进行类似的染色分析，包括多克隆抗IgG抗体和蛋白L。未转导细胞系的染色显示为深灰色，用于流式设门。代表性直方图来自三个独立的染色实验。
图4为利用抗FMC63抗体对抗CD19 CAR-T细胞的滴定检测。图中，(A)显示针对抗CD19 CAR转导Jurkat细胞的抗独特型抗体(抗FMC63)滴定的直方图。该图采用未转导的Jurkat细胞进行流式设门。代表性直方图来自三次独立的染色滴定实验。(B)三次染色滴定结果被用于拟合剂量反应曲线。每个浓度均标示为平均值±标准误差。(C)代表性滴定图(与剂量-反应曲线拟合)，显示CAR转导和未转导细胞系的几何平均荧光强度和染色试剂浓度之间的关系。(D-E)比较抗FMC63抗体、CD19链霉四聚体和CD19十二聚体的染色滴定结果。染色EC50值根据剂量反应曲线拟合推断得知(左)。对于每种染色试剂，1/EC50绘制在条形图上(右)。拟合所得EC50值与平方和F检验进行比较，其中****表示p<0.0001。
图5为抗原多聚体具有高度的敏感性和精确性的验证图。图中，(A)为测定CAR染色试剂灵敏度和精密度的细胞混入检测实验的流程图。由表达CAR-meGFP的细胞和表达mCherry荧光蛋白的非CAR细胞构建的细胞混合物用CAR染色试剂染色。流式细胞术分析后，将细胞分为四类：真阳性(TP)、真阴性(TN)、假阳性(FP)和假阴性(FN)，并描述了计算细胞混合比例、敏感性和精确度的公式。(B)将两个具有低CAR表达的抗CD19 CAR-meGFP转导克隆(“上排的低克隆”和下排的“中克隆”)加入到表达mCherry荧光蛋白的非CAR细胞中。通过流式细胞仪测定meGFP+细胞的百分比来测量CAR细胞的混合比例。随后，应用CD19链霉四聚体(左)或CD19十二聚体(右)进行染色。(C-D)在低克隆(C)和中克隆(D)的分析中，根据CAR染色试剂染色的细胞百分比(左)、检测灵敏度(中)和检测精度(右)绘制细胞混合物中meGFP+CAR细胞的所占比例。对于染色百分比图，如果一个点位于单位虚线上，则染色试剂可准确捕获CAR细胞。对于灵敏度和精密度图，如果一个点位于虚线上(100％)，则染色试剂在区分CAR细胞和非CAR细胞时完全准确。
图6为CAR染色试剂的灵敏度和精密度检测图。图中，(A)柱状图显示两个抗CD19CAR转导单克隆细胞克隆细胞系(命名为“低克隆”和“中克隆”)中的CAR表达(通过meGFP荧光表征)，这两个克隆被流式分选以取得稳定的低CAR表达。图中显示了这两个克隆与未转导细胞和未分选的细胞meGFP荧光值的比较。CAR表达通过单因素方差分析和事后t检验(Sidak多重比较校正)进行比较，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，***表示p<0.0001。(B)直方图显示CAR细胞克隆和非CAR细胞克隆上meGFP标记的CARs(顶部)和mCherry(底部)的表达。这三个克隆用于定量细胞混合物的灵敏度和精密度。(C)条形图显示未转导、低克隆和中克隆细胞上AF647标记抗原多聚体染色(3nM)的几何平均荧光强度。(D)meGFP荧光定量图显示三种标准(黑点)的线形图，用于将meGFP荧光与等效数量的meGFP分子关联。这些点用于构建标准曲线，以测量低克隆、中克隆和原始未分类多克隆CAR转染群体的平均CAR表达，如条形图所示。(E-G)将meGFP+抗CD19 CAR细胞(“低克隆”在顶行，而“中克隆”在底行)以不同比例加入mCherry+非CAR细胞，随后应用CD19分子单体(E)、多克隆抗IgG(F)或蛋白L(G)通过流式细胞术检测CAR细胞。。
图7为抗原多聚体磁性富集CAR-T细胞。(A)为磁浓缩过程的示意图。meGFP+CAR细胞和mCherry+非CAR细胞的混合物用APC标记的抗原链霉四聚体或抗原十二聚体染色，然后用抗APC磁性微球染色。将染色细胞混合物(左)施加到磁性柱上，以进行阴性(中)和阳性(右)选择。(B-D)流式细胞分析图显示在抗原链霉四聚体或抗原十二聚体磁富集下，meGFP+CAR细胞和mCherry+非CAR细胞的比例(“低克隆”位于顶行，“中克隆”位于底行)。初始染色细胞混合物、柱清洗细胞和柱洗脱细胞分别显示在B、C和D中。
图8为磁富集CAR-T细胞的APC标记CD19多聚体染色的效果图。图中，(A-B)直方图显示在用抗原链霉四聚体或抗原十二聚体磁富集之前(A)和之后(B)，细胞混合物的APC多聚体染色(第一行为“低克隆”，第二行为“中克隆”)。流式设门基于荧光扣除对照。
图9为抗原多聚体以温度控制的方式特异性刺激CAR-T细胞的效果图。(A-B)代表性流式图显示在37℃(顶行)和4℃(底行)条件下与不同浓度的抗FMC63抗体、CD19链霉四聚体或CD19十二聚体孵育后，抗CD19 CAR转染细胞上CD69(左)和CD25(右)的表达。(C-D)条形图显示了37℃(C)或4℃(D)下抗CD19转导染细胞染色的流式四分图的CD69表达(左)、CD25表达(中)和IL-2分泌(右)。通过双向方差分析和事后t检验比较CAR染色试剂的效果，其中ns表示不显著，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，***表示p<0.0001。
图10为抗原多聚体刺激第一代CAR-T细胞的效果图。图中，(A-B)代表性流式图显示在37℃下不同浓度的CD19链霉四聚体或CD19十二聚体刺激下，第一代抗CD19 CAR细胞上CD69(A)和CD25(B)的表达。(C)显示CD69表达(左)、CD25表达(中)和IL-2分泌的条形图(右)来自刺激抗CD19 CAR细胞的三次数据。对于所有条形图，通过双向方差分析和事后t检验比较CAR细胞的刺激，其中ns表示不显著，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，***表示p<0.0001。(D)条形图显示抗原多聚体刺激/染色对CAR转染的Jurkat细胞或原代患者CAR-T细胞中细胞活力影响。
图11为抗原多聚体检测患者细胞治疗产品、外周血、肿瘤活检组织中的CAR-T细胞。(A)显示在CAR-T细胞的整个体外和体内存活周期中，可能含有CAR-T细胞的癌症患者的三种生物样本。CAR-T细胞来至细胞治疗产品，通过外周血循环，并进入肿瘤。(B)代表性的流式细胞图显示CD19-链霉四聚体(5nM，顶行)和CD19-十二聚体(5nM，底行)可以检测到来自axicabtagene ciloleucel(axi-cel)和tisagenlecleucel(tisacel)CAR-T细胞治疗产品中的CD4+CAR-T细胞和CD8+CAR-T细胞。流式细胞图显示六个独立的细胞治疗产品(3个axi-cel产品和3个tisa-cel产品)。在此CD19-多聚体荧光扣除对照用于流式设门。(C)CAR-T细胞治疗产品最大染色的相对百分比滴定拟和剂量反应曲线。由于每个细胞治疗产品都含有不同比率的CAR-T细胞，为进行标准化比较，每个细胞治疗产品的染色百分比是通过与该细胞治疗产品在某特定多聚体浓度的染色值与最大染色值比较计算得到。对于每个浓度，点显示平均值±平均值的标准误差。曲线拟合所得的链霉四聚体和十二聚体染色的两个EC50值通过F检验进行比较。(D-E)在病人体内输入axi-cel CAR-T细胞治疗产品后，流式细胞图显示CD19-链霉四聚体所染色的来自弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的外周血样本中所含的CAR-T细胞比例。然后进一步分析了其中CAR-T细胞的CD4和CD8α表达。CAR-T细胞的增加和减少总结在(E)图中。(F)对接受axicel CAR-T细胞输液产品治疗的患者的淋巴瘤肿瘤活检样本，先进行单细胞分离后，再进行抗原多聚体染色，然后进一步分析CD3+CAR+细胞的CD4和CD8α表达。
图12为抗原多聚体从患者生物样本中分离出CAR-T细胞用于单细胞组学分析。(A)流式细胞图展示了使用CD19-链霉四聚体(3nM)对CAR-T细胞分选和单细胞组学分析。对CD3+T细胞流式设门后，来自健康供体(生物对照)的外周血单个核细胞(PBMCs)用于对CAR-和CAR+流式设门。流式设门用于从患者生物样本中分选内源性CAR-阴性T细胞(Endo-T)和治疗性CAR+阳性T细胞(CAR-T)。分选后的Endo-T和CAR-T细胞被用于单细胞组学(RNA-seq和TCR-seq)分析。(B)小提琴图显示了Endo-T和CAR-T样品中标准化后的CAR转基因mRNA表达。(C)饼图描绘了Endo-T和CAR-T细胞之间TCR克隆型的分布。(D)来自Endo-T和CAR-T的单细胞数据通过UMAP和无监督的Louvain聚类进行组合和可视化，然后基于已知生物标记物对十二个T细胞簇进行了注释。(E)堆叠条形图展示了每个T细胞簇中代表的Endo-T和CAR-T细胞的比例。(F)火山图描绘了Endo-T和CAR-T细胞之间差异表达的基因(DEG)，截止值基于log2倍数变化。对感兴趣的DEG进行标记。缩写注释：cyto，细胞毒性；CM，中央记忆型T细胞(Central Memory T cell)；EM，效应记忆T细胞(effector memory)；TE，终端效应T细胞(terminal effector T cells)。
图13为单细胞组学数据的CAR转基因分布、细胞簇注释和TCR克隆大小分布。(A)UMAP描述单细胞数据集中每个细胞的样本来源。(B)UMAP描绘了每个细胞中CAR转基因的标准化表达。(C)描述所有16个T细胞和非T细胞簇的UMAP。(D)描述用于注释T细胞和非T细胞簇的关键基因表达的点图。(E)描述用于注释T细胞亚群的关键基因表达的点图。(F)描述细胞计算细胞周期分析的UMAP。(G)堆叠条形图，描绘了Endo-T和CAR-T样本中CD4+和CD8+T细胞的分布。(H)显示Endo-T和CAR-T样本中TCR克隆大小分布的热图。大多数TCR克隆特定于CAR-T(顶行)或Endo-T(左列)样本。在两个样本中都发现了剩余的TCR克隆，并根据它们在CAR-T和Endo-T样本中的克隆大小绘制了图。
图14为抗原多聚体特异性检测CAR转导的NK-92细胞。NK-92细胞用meGFP标记的基于4-1BB的第二代CAR(～2％转导效率)转导，随后用CD19多聚体染色。流式图显示无多聚体对照(左)、链霉四聚体染色(中间，5nM)和十二聚体染色(右，5nM)CAR-NK-92细胞。
图15为患者CAR T细胞的寡核苷酸标记抗原多聚体检测。直方图显示了两名正在接受治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者(P049和P052)的单采血液产物(CAR转导前，Aphe)和输注产物(CAR转导后，IP)CAR分子在单细胞表面的表达。患者样本用寡核苷酸标记的CD19多聚体(5nM)染色，用于通过单细胞测序进行CAR表达检测。
图16CAR-T细胞扩增。(A)条形图显示CAR转染T细胞在无多聚体或有5nM多聚体(四聚体或十二聚体)处理条件下，白介素-2孵育6天后扩增倍数。***表示p<0.001,****表示p<0.0001,ns表示无显著差异。(B)流式图显示转染带有meGFP标记CAR的人原代T细胞群体的meGFP荧光(x轴)和侧散射光(y轴)。对CAR+T细胞设门基于未转染的对照细胞。
图17活化标志物表达(CD69/CD25)。流式图显示转染带有meGFP标记CAR的人原代T细胞群体在各处理条件下CD69(x轴)和CD25(y轴)表达。设门基于荧光减一对照。
图18PD-1表达。流式图显示转染带有meGFP标记CAR的人原代T细胞群体在各处理条件下PD-1表达。设门基于荧光减一对照。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中采用的多聚体分为十二聚体和链霉四聚体，其具体结构及特性均公开于中国专利申请“一种多聚体结合试剂”(公开号CN107847544A)。十二聚体或链霉四聚体与相应抗原结合后称为抗原十二聚体和抗原链霉四聚体(原则上都属于抗原多聚体)。其他实施例中所用的材料可通过市售渠道获得。
实施例1：抗原多聚体的产生
抗原多聚体的抗原部分是生物素标记的人源CD19蛋白分子片段(SEQ ID No.4)、生物素标记的人源HER2蛋白分子分段(SEQ ID No.5)、生物素标记的Tn-糖基化podplaninG(T*)KPPLEE肽(SEQ ID No.6,其中*为糖基化标记)，或生物素标记的牛血清白蛋白(BioVision，7097-5)。前述人源CD19蛋白分子片段和人源HER2蛋白分子分段之所以可以被生物素标记是在其氨基酸序列中包含了(SEQ ID No.7：GLNDIFEAQKIEWHEKLGLEVLFQGPELEHHHHHHHHHH*)
Alexa Fluor 647标记的链霉亲和素(BioLegend，405237)或别藻蓝蛋白标记的链霉亲和素(BioLegend，405207)用于构建多聚体支架。
为了产生抗原链霉四聚体，将生物素化抗原分子以4:1摩尔比添加到荧光标记的四聚体链霉亲和素中，避光4℃下孵育30分钟。产物用PBS稀释至用于染色的浓度。
为了产生抗原十二聚体，将生物素化的支架蛋白与荧光标记的四聚体链霉亲和素中以1:4摩尔比避光在4℃下孵育30分钟，然后避光在4℃下以12:1摩尔比添加生物素化抗原配体再孵育30分钟。产物用PBS稀释至用于染色的浓度。
实施例2：针对CD19、HER2和Tn糖苷CAR的抗原多聚体试剂染色
首先在CAR转导的细胞系上检测抗原多聚体的染色效用，包括人源Jurkat细胞和小鼠58-/-杂交瘤细胞。CAR上的meGFP荧光标签可作为CAR转染和表达的标记(图2A-C)。对CD19抗原多聚体、HER2抗原多聚体和Tn-PDPN肽多聚体进行滴定染色检测。单体抗原配体作为实验对照。流式细胞术同时测定抗原多聚体染色试剂染色效果和细胞表达的meGFP荧光强度。
染色滴定检测显示CD19抗原多聚体、HER2抗原多聚体和Tn-PDPN肽多聚体对其相应的CAR表达细胞系的染色结果(图1C、1F、1I)。未表达CAR的细胞不染色，阴性对照(牛血清白蛋白多聚体)只有可忽略不计的非特异性染色荧光(图2D-E)。使用的抗原多聚体浓度越高，被染色检测到的细胞比例越高(图1D、1G、1J)。在最高浓度下，抗原链霉四聚体和抗原十二聚体都能检测到超过92％的靶细胞。使用的抗原多聚体浓度越高，染色的平均荧光强度也越高(图1E、1H、1K)。这些发现表明，我们发明的高亲和力抗原多聚体染色试剂是以剂量依赖性的方式与相应的CAR结合，而背景的非特异性染色荧光低到可忽略不计(牛血清白蛋白多聚体对照)。
相对于抗原单体，两种抗原多聚体均增强了荧光信号。在同等摩尔浓度下，相比于抗原链霉四聚体，抗原十二聚体的荧光信号更强。增强的幅度与其抗原的CAR解离常数呈现出相关性。
当染色抗CD19 CAR(KD＝0.3nM)时，高亲和力CAR的荧光增强是较小的；
当染色抗HER2 CAR(KD＝1nM)时，中亲和力CAR的荧光增强是中等的；
当染色抗Tn CAR(KD＝140nM)时，低亲和力CAR的荧光增强是较大的。
特别对于Tn-PDPN肽配体，Tn-PDPN肽十二聚体比Tn-PDPN肽链霉四聚体产生高达4倍的荧光，而单体Tn-PDPN在该浓度范围完全无法染色(图1K)。单体Tn-PDPN肽需要提高1000倍浓度才能检测到对抗Tn CAR的染色(图2G)。
上述实验结果表明，对于较低亲和力的CAR(KD大于10nM)，必须使用抗原多聚体试剂才能有效检测到。一个具体的示例就是Tn CAR(KD＝140nM)，正常浓度下单体完全检测不到，必须使用多聚体才能检测到。对于较高亲和力的CAR，例如CD19 CAR(0.3nM)，多聚体的检测效率依然比单体要高出大约25％(图1D)，高出的这部分细胞主要是细胞群体中低表达CAR的CAR-T细胞。总之，抗原多聚体的高结合亲和力有效增强了其染色能力，对于低亲和力的CAR效果尤为显著。实际的临床细胞治疗中，当CAR-T细胞输入人体，在开始识别杀伤肿瘤细胞后，CAR的表达会很快下调，所以有效检测到这些低表达的CAR-T细胞具有非常重要的临床诊断意义。同时，最新的研究发现，低亲和力的CAR对肿瘤细胞的杀伤效果远好于高亲和力的CAR，而目前只有抗原多聚体试剂能够有效检测到低亲和力CAR。总之，无论高亲和力或低亲和力的CAR，本发明的抗原多聚体试剂都是一种新颖、独特、有效、和必须的CAR检测试剂。
实施例3：抗原多聚体具有高度特异性
针对三种不同CAR的抗原链霉四聚体和抗原十二聚体染色表达相应CAR的细胞后，进一步测定了抗原多聚体的染色特异性。其中一个非特异性对照是不表达CAR的细胞，其它的非特异性对照是表达非配对CAR的细胞，例如CD19抗原多聚体不应染色表达抗HER2或抗Tn CAR的细胞。染色结果显示，抗原链霉四聚体(图3A)和抗原十二聚体(图3B)可以染色检测出≥90％的表达相应CAR的细胞，而对不表达CAR的细胞或表达非配对CAR的细胞染色可忽略不计(≤1％).因此，抗原多聚体具有高度的CAR特异性。
同时评估了目前常用的两种CAR染色试剂的染色特异性：多克隆抗IgG抗体(Fisher Scientific，A21237)和蛋白L(Thermo Fisher Scientific，29997)。由于这两种CAR染色试剂的原理都是通过与细胞表面的Fab样分子结合，因此不能区分不同的CAR。相对于抗原多聚体，多克隆抗IgG抗体(图3C，顶部)同样可以染色抗HER2 CAR和Tn CAR。然而，由于未转导细胞的大量非特异性染色，抗IgG抗体在染色抗CD19 CAR方面的效率明显低于CD19抗原多聚体。通过结合免疫球蛋白κ轻链的蛋白L(图3C，底部)，可以染色抗CD19 CAR，但几乎不能染色抗HER2 CAR，完全不染色Tn CAR，不同CAR之间观察到的这种不一致性可能是由于蛋白L对替代κ轻链的亲和力不同。这些观察结果支持了抗原多聚体比现有的常用CAR染色试剂更具特异性的结论。
最后，评估了目前唯一商用的抗FMC63抗独特型抗体的染色特异性，该抗体专门设计用于检测基于FMC63的抗CD19 CAR。然而在研究中发现，该抗体并不能染色所有的抗CD19CAR。在最高浓度下，抗FMC63抗体可以染色检测到83％的抗CD19 CAR细胞(图4A-B)，低于饱和浓度下的CD19抗原链霉四聚体(93％)和CD19抗原十二聚体(90％)。未转导不表达CAR的细胞的非特异性染色可以忽略不计(图4C)。CD19抗原链霉四聚体和CD19抗原十二聚体的染色体效率分别是是抗FMC63抗体的～8倍和～40倍(图4E)。基于这些发现，尽管抗FMC63抗体与CD19抗原多聚体具有相同的针对CD19 CAR的特异性，但FMC63抗体在饱和浓度时产生荧光的效率较低(图4D-E)，效率的降低可以解释为抗CD19受体结合亲和力的较低。
实施例4：抗原多聚体具有高度的敏感性和精确性
在检测特异性后，评估了抗原多聚体的检测灵敏度和精确度。这些指标通过应用CD19抗原多聚体检测混入了mCherry荧光标记的非CAR细胞和meGFP标记的抗CD19 CAR细胞进行测量，通过流式细胞术进行分析(图5A)。通过监测假阴性来测量灵敏度，通过监测假阳性来测量精确度。当CAR细胞稀少且CAR表达低时，灵敏度和精确度最为关键，这在生物学上是有实际意义的，因为CAR-T细胞在抗原结合后会下调CAR表达。为了模拟这种状况，在两个具有稳定低CAR表达的单克隆细胞系“低克隆”和“中克隆”中混入非CAR细胞进行实验(图6A-D)。低克隆细胞系(每个细胞表达约150000个CAR分子)表达的CAR分子少于中克隆细胞系(每个细胞表达约250000个CAR分子)。这两个克隆表达的CAR均少于先前用于染色分析的未分选的多克隆CAR细胞(平均每个细胞约330000个CAR分子)。非CAR细胞用mCherry转染来进行荧光标记。
在细胞混入检测实验中(将少量CAR细胞混入大量非CAR细胞)，CAR细胞混入比例从10％到0.01％，细胞混合群体中真正的CAR细胞检出率是通过GFP阳性细胞的百分比来衡量。CD19抗原链霉四聚体和CD19抗原十二聚体均可特异性染色CAR细胞(图5B)。正如所料，中克隆比低克隆染色更多(图6C)。对于这两个克隆，CD19抗原多聚体准确检测出低至0.1％的CAR细胞，且敏感性≥90％(图5C-D)。对于较低混入比例的CAR细胞，CD19抗原链霉四聚体和CD19抗原十二聚体的精确度有所不同。对于中克隆，对于低于1％混入比例的CAR细胞，CD19抗原十二聚体检测到的细胞群体比CD19抗原链霉四聚体检测到的更纯。对于低克隆，对于低于10％混入比例的CAR细胞，CD19抗原十二聚体检测到的细胞群体比CD19链霉四聚体检测到的更纯。以上结果表明，CD19抗原多聚体染色具有较高的灵敏度和精确度。重要的是，即使CAR-T细胞CAR分子表达低且细胞数目比例很少(≤1％)，CD19抗原多聚体仍然可以灵敏地从细胞混合群体中检测和分离出高纯度的CAR细胞(≥90％)。
同时使用现有的CAR染色试剂包括单体CD19、多克隆抗IgG抗体和蛋白L(图6D-F)进行细胞混入检测实验。对于中克隆，单体CD19染色效果与CD19抗原多聚体染色具有可比性。然而，单体CD19对低克隆的检测灵敏度降低，这表明CD19抗原多聚体更高的结合亲和力提高了对低CAR表达的细胞的检测灵敏度。抗IgG抗体未能检测到CAR低表达的克隆。对于不同混入比例的CAR细胞，其检测灵敏度和精密度均≤10％。蛋白L检测到一些中克隆细胞，但未能检测到低克隆细胞。对于中克隆的检测，当CAR细胞混入比例为10％，其检测精确度≥90％，但在对低检出率的CAR细胞检测时迅速下降，灵敏度从未超过10％。这些结果表明，当CAR-T细胞在单个细胞中表达较少的CAR分子时，无论是多克隆抗IgG抗体还是蛋白L都不能从混合细胞群体中有效检测出CAR-T细胞。
实施例5：抗原多聚体磁性富集CAR-T细胞
我们预测抗原多聚体可以从细胞混合物中富集稀少的CAR-T细胞。为了验证该预测，用抗原多聚体和磁性粒子标记的抗体对CAR细胞进行磁性选择(图7A)。首先用别藻蓝蛋白(APC)标记的CD19抗原链霉四聚体或十二聚体对CAR-T细胞进行染色，然后再与修饰有磁性粒子的抗APC抗体孵育，染色后的细胞过磁柱。非CAR细胞不能结合磁柱而被移除(阴性选择)，移除磁铁后，洗脱收集CAR细胞(阳性选择)。
采用这种磁选择策略从表达mCherry的非CAR细胞和表达meGFP的CAR细胞的混合群体中富集CAR细胞。为了模拟比较困难的富集环境，采用的是具有稳定低CAR表达的CAR细胞(低克隆和中克隆，如图6A-C所述)。初始未富集染色群体中的CAR细胞非常罕见(约0.2％，图7B)。根据流式细胞仪的CAR细胞检出情况，磁柱上分别保留了约35％和约55％的低克隆和中克隆CAR细胞(图7C)。阴性选择后，洗脱细胞显示出高于100倍的CAR细胞检出率(图7D)。
此外，洗脱细胞中的APC荧光显著高于初始染色群体(图8)。与链霉四聚体相比，十二聚体富集效率更高。这一观察和预期相符，因为十二聚体染色比链霉四聚体染色可产生更高强度的荧光。这些结果表明，抗原多聚体可以磁性富集具有低CAR表达的稀少CAR-T细胞。抗原多聚体磁性富集后CAR-T细胞的数目比例比富集前增加>100倍(图8B)。
实施例6：抗原多聚体以温度控制的方式特异性刺激CAR-T细胞
通过实验确定抗原多聚体结合细胞表面CAR受体后是否可以激活CAR-T细胞。CAR特异性刺激可以用来表征CAR-T细胞的活化表型，这可以与体内CAR-T细胞的功效联系起来。传统上，T细胞的活化表型可以通过T细胞促细胞分裂剂来刺激产生，如抗CD3/CD28抗体、佛波醇12肉豆蔻酸13醋酸盐(PMA)/离子霉素处理、或植物血凝素(PHA)处理。然而，这些促细胞分裂剂既不是CAR特异性的，也不是免疫相关的CAR刺激。基于抗原多聚体可以高亲和力特异性结合CAR，预测抗原多聚体可以作为可溶性试剂直接激活CAR-T细胞。
在37℃下，将第二代抗CD19 CAR细胞与CD19抗原链霉四聚体或CD19抗原十二聚体孵育，发现CD69(早期激活标记，图9A)和CD25(后期激活标记，图9B)表达上调。多聚体浓度越高，CD69和CD25阳性细胞的百分比越高(图9C)。另一方面，尽管抗FMC63抗体可以染色CAR，但它在任何浓度下都不会以可溶性的形式激活CAR-T细胞。多聚体激活的CAR细胞也分泌与CD69和CD25上调相关的IL-2细胞因子。在0.3nM浓度下，十二聚体比链霉四聚体刺激更多的IL-2分泌。在3nM浓度下，两种多聚体的激活效果相同。第1代抗CD19 CAR细胞也获得了类似的实验结果(图10A-C)。链霉四聚体或十二聚体刺激均不影响细胞活性(图10D)。这些结果表明，抗原多聚体可在37℃下作为高亲和力可溶性染色试剂激活CAR-T细胞，而抗FMC63抗体可能是由于较低的结合亲和力，对CAR-T细胞没有激活作用。
同样在4℃条件下用CD19抗原多聚体孵育CAR细胞(图9D)。我们预测较低的温度会减缓代谢，减低CAR激活信号。正如所预测的，在4℃下，任何浓度下的两种多聚体处理均未观察到CD69或CD25表达上调，也没检测到IL-2的分泌，细胞活性未受影响(图10D)。因此，在较低温度下，抗原多聚体不能激活CAR细胞。这些结果表明，当抗原多聚体用于CAR检测时，染色孵育可以在4℃下进行，以避免不必要的刺激。
实施例7：抗原多聚体检测患者输液产品、外周血和肿瘤活检中的CAR-T细胞
在证明抗原多聚体在CAR转导细胞系上的应用后，进一步将CD19多聚体应用于临床生物样本，这些样本来自于接受抗CD19 CAR-T细胞治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤或B细胞急性淋巴细胞白血病患者。在整个治疗过程中，CAR-T细胞来源于细胞输注治疗产品，通过外周血循环，到达肿瘤所在地(图11A)。因此，在细胞输注治疗产品、外周血和肿瘤活检中应用CD19多聚体检测。
在axicabtagene ciloleucel和tisagenelecluel细胞输注治疗产品上滴定CD19多聚体。对于来自任一细胞治疗产品配方的CD4+和CD8+T细胞，较高的CD19多聚体浓度可使更多细胞染色。在染色饱和时，CD19链霉四聚体和CD19十二聚体在六名患者中检测到相同百分比的CAR+细胞(图11B)。将患者细胞的相对染色百分比拟合到剂量-反应曲线，以量化染色EC50值。CD19链霉四聚体的染色EC50值始终大于CD19十二聚体的染色EC50值(图11C)，这与先前在细胞系上的发现一致(图1D)。此外，两种细胞输注治疗产品的染色EC50值相当。最后，CD8+CAR-T细胞的染色EC50值始终大于CD4+CAR-T细胞的染色EC50值。CD8+CAR-T细胞可能在每个细胞中表达较少的CAR分子，使这些细胞在中等CD19多聚体浓度下更难被捕获。
将CD19链霉四聚体应用于检测一组在CAR-T细胞输注后一系列后续时间点采集的的外周血单核细胞，这些细胞来自一名接受了阿昔卡宾酯(axicabtagene ciloleucel)CAR-T细胞输注产品治疗的患者(图11D)。数据显示，CAR-T细胞百分比上升，并在输注后8天内达到峰值。随后，CAR-T细胞百分比下降，在输注后60天几乎无法检测到(图11D-E)。大多数输注后的CAR-T细胞表达CD8。这些观察结果符合CAR-T细胞扩张和收缩的预期模式。这些发现表明CD19链霉四聚体能够准确地检测到患者生物样本中的CAR-T细胞。最后，将CD19十二聚体应用于检测14天前接受了阿昔卡宾酯(axicabtagene ciloleucel)CAR-T细胞输注产品治疗的淋巴瘤患者的肿瘤细胞悬浮液(图11F)。CAR-T细胞占白细胞的22％，其中CD8+T细胞占88％，CD4+T细胞占7％。还观察到少量(2％)明显的双阳性CD4+CD8+CAR-T细胞。结果表明，CD19多聚体能够准确捕获细胞输注治疗产品、输注后患者血液和肿瘤活检中的CD4+和CD8+CAR-T细胞。
实施例8：抗原多聚体从患者生物样本中分离CAR-T细胞，用于单细胞组学分析
在确定了CD19多聚体能够用于从患者生物样本中识别CAR-T细胞的效用后，随后应用CD19链霉四聚体从患者输注后外周血生物样本中分离抗CD19 CAR-T细胞，用于单细胞组学分析。所选样本来源于一例弥漫性大B细胞淋巴瘤患者，该患者接受了阿昔卡宾酯(axicabtagene ciloleucel)CAR-T细胞输注产品治疗。患者在第30天达到完全缓解的临床标准。在注射后21天采集血样。
在第21天，CD19链霉四聚体染色显示10.7％的CD3+T细胞(CAR+细胞)(图12A)。使用CD19链霉四聚体，通过流式细胞仪分选CAR+阳性T细胞(“CAR-T”)和内源性CAR-阴性T细胞(“Endo-T”)，通过配对单细胞RNA和TCR测序进行分析。单细胞RNA测序表明，axicabtagene-ciloleucel CAR转基因的表达对CAR-T细胞具有高度特异性(图12B和图13A-B)。这一观察结果与CD19链霉四聚体的高特异性、敏感性和精确性一致，并表明抗原多聚体可以从患者生物样本中筛选出高纯度和真实的CAR-T细胞群。此外，尽管在CAR-T和Endo-T细胞中都发现了多种多样的T细胞受体(TCR)克隆型，但TCR克隆型重叠很少人群之间的差异≤1％(图12C和图13H)。结果表明CD19链霉四聚体从患者生物样本中捕获了克隆不同的表达CAR转基因的T细胞群。
通过统一流形逼近和投影(UMAP)和无监督Louvain聚类，过滤了3个非T细胞簇之后，基于已知标记物(包括FOXP3、CCR7、TCF7、GZMB、KLRB1和TRDC)鉴定了12个T细胞簇，包括增殖、效应CD8+、细胞毒性CD4+、中枢记忆、效应记忆、γδ、调节性T细胞(图12D和图13C-F)。相对于内源性Endo-T细胞，CAR-T细胞富含CD8+T细胞(图13G)。此外，CAR-T细胞在增殖和效应T细胞簇中富集，而内源性Endo-T细胞在记忆和调节T细胞簇中富集(图12E)。值得注意的是，在γδ和调节性T细胞簇中都发现了CAR-T细胞。差异基因分析显示，CAR-T细胞具有较高表达的激活基因(CXCR3、LAG3、HAVCR2)、细胞毒性相关基因(GNLY、KLRD1、GZMB、PRF1、GZMA)和T细胞衰老相关基因(KLRG1)(图12F)。这些特征与CAR特异性T细胞活化、细胞毒性和分化一致。总之，这些观察结果与CD19链霉四聚体从患者生物样本中捕获一个独特的临床活性T细胞群是一致的。这些实验表明，抗原多聚体可以可靠地用于CAR-T细胞的分离和分析。
实施例9：抗原多聚体检测CAR-NK细胞
NK-92细胞在加入了100单位/mL的人源IL-2的NK-92细胞培养基(Alpha MEM、12.5％ FBS、12.5％马血清、0.2mM i-肌醇、20μM叶酸、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇)中培养。在转导过程中，在12孔板中加入100000个NK-92细胞，该孔中含有1mL加入了10μg/mL硫酸鱼精蛋白的NK-92细胞培养基。以20的感染倍数加入CAR-慢病毒进行转导。将细胞孵育3天之后，通过流式细胞术分析CAR转导效率。
抗原多聚体用于染色检测CAR-NK细胞(图14)。50000个转导了CAR的NK-92细胞在FACS缓冲液(PBS、2％ FBS、0.05％叠氮化钠)中用5nM CD19-链霉四聚体或5nM CD19-十二聚体染色30分钟。随后，将细胞与近红外可固定活/死活力染料(Near-IR Fixable Live/Dead Viability dye)在PBS中以1:1000稀释度在4度孵育5分钟。最后，将细胞洗涤3次并通过流式细胞术分析多聚体染色。
实施例10：通过单细胞测序Total-seq进行CAR检测
弥漫性大B细胞淋巴瘤患者049(完全反应者)和052(无反应者)接受axicabtageneciloleucel抗CD19CAR-T细胞疗法治疗。用寡核苷酸条形码PE-链霉亲和素(Total-seq C,BioLegend,405269)制备的3nM CD19-链霉四聚体染色CAR-T细胞输注产品。随后，将细胞与近红外可固定活/死活力染料(Near-IR Fixable Live/Dead Viability dye)在PBS中以1:1000稀释度在4度孵育5分钟。最后，将细胞洗涤3次并重悬于RPMI+10％FBS中。单细胞测序由10x Genomics 5'试剂盒进行，数据由CellRanger分析。这些实验表明(图15)，抗原多聚体可以可靠地通过单细胞测序Total-seq进行CAR检测。
实施例11：分析抗原多聚体如何促进CAR-T细胞增殖和活化
实验方法：从健康供体获得的T细胞转染(感染复数5)第二代抗CD19 CAR(克隆FMC63)。CAR转染的细胞在T细胞培养基(RPMI培养基，10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺，50uM2-巯基乙醇)和50单位/mL白介素-2中培养12天。CAR转染效率约为50％。2x 104CAR+T细胞分别孵育在3种条件下：1)无多聚体；2)5nM CD19四聚体；3)5nM CD19十二聚体。50单位/mL白介素-2培养6天后，流式细胞术分析以下标志物和荧光：CAR(meGFP),CD3(BV421),CD4(BV510),CD8α(PCP/Cy5.5),CD69(PE),CD25(AF647),PD-1(BV711),和近红外死/活细胞染色。
实验结果：从扩增效果来说，四聚体和十二聚体处理可以扩增CAR-T细胞数量约15-20倍，无多聚体处理下CAR-T细胞数量只扩增了约5倍，并且差异显著(p<0.001)(图16A)。四聚体和十二聚体组间无显著差异。此外，多聚体处理可以富集CAR-T细胞。无多聚体处理下CAR-T细胞占细胞总数49％,四聚体处理下CAR-T细胞占细胞总数上升到61％,十二聚体处理下CAR-T细胞占细胞总数上升到70％(图16B)。
从活化效果来说，四聚体和十二聚体上调CD69(早期激活标志)和CD25(晚期激活标志)表达(图17)。在CD4阳性CAR-T细胞中，CD69+CD25+CAR-T在无多聚体处理下占17％，在四聚体处理下上升到26％，在十二聚体处理下上升到28％。在CD8阳性CAR-T细胞中，CD69+CD25+CAR-T在无多聚体处理下占5％，在四聚体处理下上升到28％，在十二聚体处理下上升到38％。此外，多聚体处理上调PD-1表达(图18)。在CD4阳性CAR-T细胞中，PD-1+CAR-T细胞在无多聚体处理下占19％，在四聚体处理下上升到25％，在十二聚体处理下上升到25％。在CD8阳性CAR-T细胞中，PD-1+CAR-T细胞在无多聚体处理下占2％，在四聚体处理下上升到6％，在十二聚体处理下上升到6％。
结论：
四聚体或十二聚体处理都可以选择性地扩增CAR-T细胞。6天培养处理后CAR-T细胞数量和百分比都有显著增加。四聚体或十二聚体处理上调激活标志(CD69,CD25,PD-1)。其中CD8阳性群体比CD4阳性群体激活效果更显著。对于CD69和CD25标志，十二聚体比四聚体效果更显著。
这些结果说明多聚体可以扩增和激活CAR-T细胞。这一特性在CAR-T细胞制备中非常有用。十二聚体比四聚体能更好地激活CD8阳性CAR-T细胞，可能与其结合效价更高有关。

Claims (23)

1.一种CAR染色试剂，其特征在于：它包含多聚体-抗原分子的结合物，
所述抗原分子是生物素标记的对待检测的CAR具有特异性结合力的抗原分子；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，所述链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原分子；所述链霉亲和素上有可检测的标记物。
2.根据权利要求1所述的CAR染色试剂，其特征在于：所述待检测的CAR具有低亲和力特性。
3.根据权利要求2所述的CAR染色试剂，其特征在于：所述待检测的CAR的KD值≥0.1nM。
4.根据权利要求1所述的CAR染色试剂，其特征在于：所述待检测的CAR为抗CD19的CAR，抗HER2的CAR或抗糖苷的CAR。
5.根据权利要求1所述的CAR染色试剂，其特征在于：所述待检测的CAR由针对同一种抗原分子的多种CAR的混合组成。
6.一种CAR表达细胞特异扩增生产试剂，其特征在于：所述试剂包含抗原与多聚体的结合物；
所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
7.根据权利要求6所述的CAR表达细胞特异扩增生产试剂，其特征在于：所述多聚体为十二聚体。
8.根据权利要求6所述的CAR表达细胞特异扩增生产试剂，其特征在于：所述试剂的使用温度为30～40℃。
9.一种CAR表达细胞特异扩增生产试剂，其特征在于：所述试剂包括一个链霉亲和素，所述链霉亲和素通过生物素结合2～4个抗原，所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子。
10.一种CAR-T细胞特异扩增培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求6～9任一项所述的CAR表达细胞特异扩增生产试剂加入到在培养的CAR-T细胞群体中，使培养所生产的CAR-T细胞达到预设的治疗标准。
11.一种CAR表达检测试剂，其特征在于：包含用寡核苷酸标记的抗原多聚体，所述抗原多聚体为抗原与多聚体的结合物；
所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
12.根据权利要求11所述的CAR表达检测试剂，其特征在于：所述多聚体为十二聚体。
13.一种CAR表达检测试剂，其特征在于：包含未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素通过生物素结合2～4个抗原，所述抗原为表达在靶细胞上的被CAR分子特异性识别的抗原分子。
14.一种CAR表达检测方法，其特征在于，包括步骤：利用权利要求11～13任一项所述CAR表达检测试剂染色CAR，再通过单细胞测序进行CAR表达检测。
15.一种定点生物素标记分子，是位于抗原蛋白的序列中，使所述抗原蛋白可被生物素化的标记分子，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
16.一种CD19的CAR抗原多聚体，为抗原-多聚体的结合物，其特征在于：所述抗原为具有可生物素化的位点的CD19抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述CD19抗原蛋白通过生物素与四聚体或多聚体结合；
所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
17.一种HER2的CAR抗原多聚体，为抗原-多聚体的结合物，其特征在于：所述抗原为具有可生物素化的位点的HER2抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；所述HER2抗原蛋白通过生物素与四聚体或多聚体结合；
所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
18.一种Tn糖苷的CAR抗原多聚体，为抗原-多聚体的结合物，其特征在于：所述抗原为具有可生物素化的位点的Tn糖苷抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；所述Tn糖苷抗原蛋白通过生物素与四聚体或多聚体结合；
所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素；
所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的1～3个所述抗原。
19.权利要求16所述CD19的CAR抗原多聚体作为试剂在CAR染色、CAR表达细胞特异扩增生产，CAR表达检测中的应用。
20.权利要求17所述HER2的CAR抗原多聚体作为试剂在CAR染色、CAR表达细胞特异扩增生产，CAR表达检测中的应用。
21.权利要求18所述Tn糖苷的CAR抗原多聚体作为试剂在CAR染色、CAR表达细胞特异扩增生产，CAR表达检测中的应用。
22.多聚体在制备CAR染色试剂、CAR表达细胞特异扩增生产试剂、CAR表达检测试剂中的应用，其特征在于：所述多聚体包含：
1)支架蛋白，它由四个蛋白亚基组成；所述蛋白亚基包含功能型亚基，或还包含非功能型亚基；所述功能型亚基由链霉亲和素衍生得到，无生物素结合活性，且至少有一个功能型亚基的C端顺序连接一个半胱氨酸及一个生物素标记，所述功能型亚基的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2；所述非功能型亚基的数量≤2，其的氨基酸序列如SEQ ID NO:3；
2)与支架蛋白中生物素标记结合的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的对目标CAR具有特异性结合力的1～3个抗原。
23.四聚体在制备CAR染色试剂、CAR表达细胞特异扩增生产试剂、CAR表达检测试剂中的应用，其特征在于：所述四聚体为未标记、用荧光标记或用寡核苷酸标记的链霉亲和素，链霉亲和素用于结合已生物素标记的对目标CAR具有特异性结合力的1～3个抗原。
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