CN115109159A - Cd19突变蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种突变的CD19胞外结构域，所述突变的CD19胞外结构域与亲本CD19胞外结构域的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第82位、第83位、第29位、第184位或第234位；所述第82位氨基酸突变为V，所述第83位氨基酸突变为L，所述第29位氨基酸突变为G，所述第184位氨基酸突变为P，所述第234位氨基酸突变为W。

Description

CD19突变蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CD19突变蛋白及其应用。

背景技术

CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。其主要原理是，从癌症病人身上分离T细胞，利用基因工程技术为T细胞引入一个能够识别肿瘤细胞并同时激活T细胞的嵌合抗体，也就是制备CAR-T细胞，再将扩增好的CAR-T细胞回输到病人体内，在病人体内进一步扩增，通过增强病人自身免疫杀灭和清除癌细胞。其中CAR，即嵌合抗原受体，是该治疗的核心要素。CAR的基础设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的ScFv段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。其中，肿瘤相关抗原结合区负责识别肿瘤细胞表面抗原，相当于“GPS导航”作用。CAR-T作为一类新的治疗药物，截至目前，在血液肿瘤，比如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，效果显著。尤其以CD19为靶点的CAR-T在急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤里疗效非常显著。目前，FDA批准上市了两款CAR-T细胞药物，分别是诺华制药(Novartis)的Kymriah，和吉利德公司(Gilead)的Yescarta。两款药物均针对CD19阳性B细胞白血病，采用了相同的抗原结合区，即来源于鼠单克隆抗体FMC63的ScFv(single chain antibody fragment，单链抗体)。

在输入病人体内后，CAR-T细胞数目在多数情况下会迅速增加，这是有治疗效果的必要条件。另一个重要判别指标是：在CAR-T细胞输入病人半年后是否还有残存的CAR-T阳性细胞在病人体内；通常没有残存CAR-T阳性细胞会出现疾病复发。

CAR-T细胞作为一种“活的药物”，其制备流程复杂，质控环节众多。首先，由于病毒感染细胞的效率会随不同的病人或其它因素而改变。因此，适当控制回输到病人体内的有效转染细胞的数量是十分重要的一步。过少的有效细胞治疗无效；而过多的有效细胞会导致诸如细胞因子风暴等严重的副作用(有很高的致死率)。因此，准确检测表达CAR的阳性T细胞是CAR-T药物质量控制的关键步骤，也是临床上对病人治疗剂量控制、过程监控及伴随诊断的重要环节。CAR-T靶点蛋白是CAR-T检测的最理想试剂，但CAR-T靶点蛋白结合其对应抗体亲和力都较低，导致临床样本的检测灵敏度低，不能满足临床需求。以CD19 CAR-T为例，CD19与其抗体与其单链抗体的亲和力很低，无法满足检测的需求，需要大幅提高亲和力。同时CD19的稳定性也较差，现有的生物学特性不能成为一个稳定高效的流式检测试剂。另外，CD19是一种B细胞表面的高度糖基化修饰的糖蛋白，在大肠杆菌及酵母等模式细胞中更难表达，我们将通过本实验室建立的高效CHO细胞进化平台，以CD19为模式蛋白，获得高亲和力、高专一性、高稳定性的突变体，满足为CAR-T的临床检测需求。

CAR-T表达阳性率的检测作为CAR-T疗法质量控制的重要一环，目前尚无标准的检测方案。在临床和科研上都需要采用能够用于评价或监测CAR疗法在受试者中的有效性的方法，该方法在受试者回输前及回输后可以准确地区分阳性CAR-T细胞和阴性CAR-T及阳性细胞的活性水平(即单个细胞上CAR的数目)，并且可以和检测CAR-T细胞其它特征的试剂同时使用，不互相干扰，从而为每一位受试者提供精准、有效地治疗，客观准确地评估或监测CAR疗法对受试者的有效性。

目前为止常用的CAR-T阳性率的检测方法有两种类型：检测CAR基因阳性T细胞和检测CAR蛋白阳性T细胞，即PCR检测CAR的拷贝数及流式细胞仪检测CAR-T细胞。

通过qPCR检测细胞基因组上整合的CAR基因，以及CAR基因的拷贝数，该方法灵敏度高，几乎用于所有受试者的回输前、后检测，且适用于所有的靶点。但该方法不能准确反映表达CAR的阳性T细胞，不能确定阳性细胞和阴性细胞的比例，不能确定CAR的阳性T细胞的类型及比例，不能确定单个CAR阳性细胞上CAR的密度及细胞群体CAR的密度分布。此外，由于CAR-T疗法自身的特殊性以及病人之间的个体化差异，CAR-T细胞的构建过程及回输后的扩增过程都需要对T细胞多种表面标志物(CD3、CD4、CD8等等)同时检测，因此该方法需要与其它流式检测方法相结合，不能使用一种检测和同一个样本获得所有的指标。

对于CAR蛋白阳性T细胞流式检测，现有检测试剂也存在各种各样的缺点，检测效果难以令人满意。其中，抗鼠IgG(Fab')2和Protein L较为常用，但存在特异性较差，背景高，灵敏度低等问题，只能用于回输前CAR阳性率较高时检测。另外，由于无靶点特异性，同时用两个或两个以上靶点进行CAR-T治疗时，无法区分不同的CAR受体。而在临床和科研进展上，针对两个靶点以上的CAR-T治疗取得了明显的进展。例如最新的研究表明，CD19不是CAR-T细胞针对B细胞恶性肿瘤的唯一有效靶标，同时针对CD19及CD22两个抗原进行靶向治疗可以减少肿瘤通过抗原损失逃脱的可能性，从而获得更高的缓解率。

另一种连入标签的靶点蛋白是检测CAR-T阳性细胞最理想的试剂。有文献报道将CD19胞外区连入Fc标签在293T细胞中表达，该融合蛋白经纯化后用于CAR-T细胞阳性率的检测。结果表明CD19-Fc融合蛋白作为检测试剂，在背景上是低于抗鼠IgG(Fab’)2和Protein L等试剂的，基本没有非特异性结合。但是其亲和力低(我们用SPR检测CD19-Fc与对应抗体结合的亲和力，Kd>10^-7M)、灵敏度与抗鼠IgG(Fab’)2抗体和Protein L没有明显差别，甚至略低，不能满足科研及临床检测对高灵敏度的要求。CAR上的ScFv与相应靶分子亲和力低具有一定普遍性。ScFv与相应靶分子亲和力与CAR-T治疗效果没有明确的定量关系，对于一些靶分子其对应ScFv亲和力高治疗效果好，而对于另一些靶分子对应ScFv亲和力高治疗效果差。对于低亲和力ScFv制备的CAR-T细胞(如CD19、CD22)，采用Fc偶联的靶点作为检测试剂灵敏度低，不能满足临床需求。因此，将靶点蛋白与其单链抗体的亲和力提高从而提高检测灵敏度是一种有效地解决方式。

发明内容

CD19是一种辅助受体，可放大B细胞中的信号级联。在B细胞表面，CD19与CD21、CD81和Leu-13结合发挥其功能。CD19的细胞质尾部具有九个保守的酪氨酸残基，通过将信号分子与受体偶联，在CD19介导的功能中发挥关键作用。成熟的人CD19由一个胞外结构域(ECD)和两个Ig样结构域、一个跨膜片段和一个胞质结构域组成。

一方面，本发明提供了一种突变的CD19胞外结构域，所述突变的CD19胞外结构域与亲本CD19胞外结构域的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第82位、第83位、第75位、第29位、第184位、或第234位。

在一个实施方式中，所述突变的CD19胞外结构域在上述第82位氨基酸位点处存在突变；进一步的，在第82位氨基酸突变的基础上，还包括上述第75位和第83位氨基酸位点的突变。

在一个实施方式中，所述突变的CD19胞外结构域在上述第83位氨基酸位点处存在突变；进一步的，在第83位氨基酸突变的基础上，还包括上述第75位氨基酸位点的突变。

在一个实施方式中，所述突变的CD19胞外结构域在上述第29位和第75位氨基酸位点处存在突变。

在一个实施方式中，所述突变的CD19胞外结构域在上述第75位、第151位、第184位和第234位氨基酸位点处存在突变。

在一个实施方式中，第82位氨基酸突变为V，第83位氨基酸突变为L，第75位氨基酸突变为I，第29位氨基酸突变为G，第184位氨基酸突变为P，第234位氨基酸突变为W。

在一个实施方式中，所述亲本CD19胞外结构域为人源的CD19胞外结构域。

在一个实施方式中，所述亲本CD19胞外结构域的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。

本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如，可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。

保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在上述Cas突变蛋白的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。

本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。

术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如E29G表示第29位的E突变为G。多个氨基酸位点同时存在突变时，可以采用M75I+L82V+F83L类似的形式进行表述，例如，M75I+L82V+F83L代表第75位M突变为I同时第82位L突变为V、第83位F突变为L。

另一方面，本发明还提供了编码上述突变的CD19胞外结构域的基因。

另一方面，本发明还提供了包含上述突变的CD19胞外结构域，或上述编码基因的载体或细胞。

另一方面，本发明提供了上述突变的CD19胞外结构域作为抗原，在制备免疫试剂中的应用，例如，抗CD19抗体或CD19特异性免疫细胞。

另一方面，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包括上述突变的CD19胞外结构域以及可检测的标记。在一个实施方式中，该标记可以自身检测，例如放射性同位素标记或荧光标记，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

另一方面，本发明还提供了一种诊断制剂，其包含上述突变的CD19胞外结构域。

另一方面，本发明还提供了上述突变的CD19胞外结构域在检测抗CD19免疫试剂中的应用，或者，在制备用于检测抗CD19免疫试剂的产品中的应用，所述产品可以为诊断制剂、还可以为诊断试剂盒。

上述抗CD19免疫试剂选自抗体，抗体片段，抗体融合构建体，双特异性抗体，三特异性抗体，免疫毒素，嵌合抗原受体(CAR)，人或非人(例如动物或人工)细胞，如T细胞，NK细胞或其它免疫细胞，特别是那些经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞。

在一个实施方式中，所述抗CD19免疫试剂为针对CD19的CAR-T细胞。

在一个实施方式中，所述抗CD19免疫试剂为抗CD19的抗体，例如，FMC63。

另一方面，本发明还提供了一种检测样品中抗CD19免疫试剂的方法，所述方法包括利用上述突变的CD19胞外结构域对样品中抗CD19免疫试剂进行检测的步骤。

所述样品包括但不限于来自患者或非人动物(例如，动物)的样品；例如，组织或体液，特别是血液，血浆，血清，尿液或骨髓活组织检查)和治疗或诊断产品(例如，重组表达的蛋白质，特别是抗体，抗体片段，抗体融合构建体，双特异性抗体，三特异性抗体，免疫毒素，工程化的备选结合物支架，CAR，人或非人(例如动物或人工)细胞，如T细胞，NK细胞或其它免疫细胞，特别是那些经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞。

另一方面，本发明还提供了包含上述突变的CD19胞外结构域的药物制剂，所述药物制剂还包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常包括与本发明提供的抗体或相关组合物或组合物生理相容的任何和所有合适的溶剂，分散介质，包衣，抗菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的其它例子包括无菌水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，聚乙二醇等，以及它们的任意组合。根据一个具体方面，本发明还提供了编码本文所述CD19-ECD的核酸分子。

另一方面，本发明还提供了用于生产上述突变的CD19胞外结构域的方法，所述方法包括对编码上述突变的CD19胞外结构域的基因进行表达的步骤。

附图说明

图1、构建CHO-CD19细胞株；A细胞株构建流程图；B CHO-CD19阳性细胞的分选；C流式细胞仪检测分选的细胞CD19展示率及其与配体antiCD19-ScFv-EGFP蛋白的亲和力。

图2、CD19亲和力优化流程图。

图3、对CD19胞外区亲和力优化的实施过程。

图4、流式细胞仪检测四轮进化后分选出的细胞与单链抗体的结合能力。

图5、流式细胞仪检测CD19突变体与其单链抗体的结合能力。

图6、流式细胞仪检测不同浓度CD19-wt-mFc与CD19-Mut9-mFc结合CAR阳性细胞的能力。A、B分别为不同浓度CD19-wt-mFc、CD19-Mut9-mFc的检测结果。将各融合蛋白(CD19-wt-mFc、CD19-Mut9-mFc)按梯度(0.3、0.1、0.03、0.01、0.0003、0ug/20ul)稀释好，加入5X10⁵CD19CAR-T细胞中，冰上孵育30min，用抗鼠IgG的流式抗体(带APC荧光信号)检测结合强度。

图7、流式细胞仪检测CD19-Mut9对CD19CAR-T(+)细胞的检测灵敏度。将不同量的CD19 CAR+细胞(3x10⁵、3x10⁴、3x10³、3x10²、3x10、0cells)加入对照1x10⁶hPBMC中，作为测试细胞，加入荧光二抗后进行流式实验，在参入率低至万分之三时，Mut9蛋白仍能对阳性细胞进行有效检出，而野生型CD19蛋白无法检测出低浓度的阳性细胞。

图8、不同检测浓度对CD19CAR-T(+)细胞的检测灵敏度。将不同量的CD19 CAR+细胞(3x10⁴、3x10³、3x10²、0cells)加入对照1x10⁶hPBMC中，作为测试细胞，加入荧光二抗后进行流式实验。0.3μg及0.03μg的蛋白量检测CD19CAR-T的阳性率，Mut9蛋白在不同的检测浓度下对不同的阳性率细胞都能够保持较高的灵敏度及较低的检测背景，而CD19-WT蛋白在低浓度下则不能对CD19CAR-T阳性率低的样本进行有效检测。横坐标为检测蛋白与CD19CAR-T细胞的结合强度。

图9、Mut9与CD19-WT蛋白检测信号比较。Mut9蛋白在不同的检测浓度下均有较高的检测信号，浓度越低，与CD19-WT的优势越明显，显然更能满足科研及临床流式检测的需求。横坐标为检测蛋白与CD19CAR-T细胞的结合强度，纵坐标为细胞数。

图10、Mut9与CD19-WT蛋白检测信噪比比较。

Mut9蛋白在不同的检测浓度下均有较高的信噪比，浓度越低，与CD19-WT的优势越明显，显然更能满足科研及临床流式检测的需求。横坐标为检测蛋白与CD19CAR-T细胞的结合强度，纵坐标为细胞数。

图11、不同荧光标记检测信号的比较。Mut9蛋白在不同的荧光素标记下，均可以应用于CD19CAR-T阳性细胞检测。横坐标为检测蛋白与CD19CAR-T细胞的结合强度，纵坐标为细胞数。

图12、简化实验步骤对流式检测结果的影响。横坐标为检测蛋白与CD19CAR-T细胞的结合强度，纵坐标为细胞数。

图13、Mut9与抗Fab抗体进行灵敏度比较。采用0.1μg、0.03μg、0.01μg、0.003μg、0.001μg五个浓度对CD19CAR-T细胞样本进行检测。横坐标为检测蛋白与CD19CAR-T细胞的结合强度，纵坐标为细胞数。

图14、亲和力大小检测。Mut9蛋白的亲和力达到6.6E-09(M)，CD19野生蛋白与单链抗体FMC63的亲和力过低，仪器无法检测。

图15、CD19-wt、抗鼠IgG(Fab’)(Jackson ImmunoResearch)与CD19-Mut9检测同一病人回输前样本的流式检测结果。A、CD19-wt的检测结果；B、Anti-Fab抗体的检测结果；C、CD19-Mut9的检测结果。

实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

本实施方式中，所采用的部分技术可参考申请人在先的专利，CN104531623B，在一个具体的实施方式中，本发明涉及的技术可参考以下方案。

1、替换质粒pFRT-CD19-G4S-HA的构建及扩增：

替换目标细胞株中的PuroR基因，将CD19-G4S-HA稳定展示在细胞表面。

使用PUC57-CD19-G4S-HA(CD19-G4S-HA序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成后连入载体PUC57中)为扩增模板，该模板中含以下碱基序列,该序列经南京金斯瑞公司序列优化后在C端连入G4Slinker及HA Tag。

atgccccctccaaggctgctgttctttctgctgttcctgaccccaatggaggtgcggcca(信号肽)

gaggagccactggtggtgaaggtggaggagggcgacaacgctgtgctgcagtgcctgaagggcacatctgatggccccacccagcagctgacatggtctagagagtcccctctgaagccatttctgaagctgtccctgggactgcctggactgggcatccacatgcgcccactggctatctggctgttcatcttcaacgtgtcccagcagatgggaggcttctacctgtgccagccaggaccacctagcgagaaggcttggcagcctggatggaccgtgaacgtggagggaagcggagagctgtttaggtggaacgtgtccgacctgggaggactgggatgtggcctgaagaaccggtccagcgagggaccctcttccccttccggcaagctgatgagcccaaagctgtacgtgtgggctaaggatagaccagagatctgggagggagagccaccatgcctgcctccacgcgacagcctgaatcagagcctgtctcaggatctgaccatggcccccggctctacactgtggctgtcctgtggagtgccacctgactccgtgagcaggggccctctgtcttggacacacgtgcatccaaagggccccaagagcctgctgtctctggagctgaaggacgataggcctgcccgggacatgtgggtcatggagaccggcctgctgctgccaagagccacagctcaggatgctggcaagtactattgtcaccgcggcaacctgaccatgtccttccatctggagatcacagcccggcctgtg

ggtggtggtggttct(linker)

tatccatatgatgttccagattatgct(HATag)

引物序列如下：

hCD19-SP-EcoRI-F:

atacgcgaattcatgccccctccaaggctgctgttctttctgctgttcctgacccc

hCD19-HA-G4S-XhoI-R:

ctgtcctcgagagcataatctggaacatcatatggataagaaccaccacca cccacaggccgggctgtgatctccagatggaa gg

具体实验步骤如下：

将上述CD19-G4S-HA序列通过如下步骤连入pFRT-SP-HA-TM-Loxp载体中，用于替换细胞CHO/dhFr--PuroR-TK-12中的PuroR基因序列：

(1)PCR扩增：利用Pyrobest高保真扩增酶(Takara)对目的基因(由金斯瑞公司合成)进行PCR扩增出来。(引物为hCD19-SP-EcoRI-F及hCD19-HA-G4S-XhoI-R，模板为PUC57-optiPD1-G4S-HA)，PCR条件为：退火56℃，72℃延伸1min，35个循环。

(2)胶回收PCR产物：上一步已完成的PCR反应物依照DNA凝胶试剂盒(QIAGEN)使用说明进行纯化。

(3)酶切目的基因片段和载体质粒：步骤(2)回收后得到的PCR产物以及载体(pFRT-SP-HA-TM-Loxp，本实验室自行保存)经核酸内切酶(EcoRI,XhoI,NEB)切割后采用DNA凝胶试剂盒(QIAGEN)回收。

(4)回收后的酶切片段以及载体用T4连接酶(NEB)连接，转化并扩增目标质粒：将步骤(3)酶切完成的质粒和PCR产物片段用T4连接酶连接，获得目标质粒pFRT-optiCD19-G4S-HA。将扩增质粒转入TOP10感受态细胞(Transgen Biotech)中进行扩增(转化步骤参照Transgen Biotech CD101产品说明书进行)。

(5)测序鉴定：挑取转化了目标片段的阳性单克隆(随机挑取六个克隆，提取质粒后EcoRI,XhoI进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析有900bp片段的为阳性克隆)，并进行测序(北京睿博兴科生物技术有限公司)。

2、Anti-Human CD19 scFv GFP表达载体的构建：

为提高CD19与其配体anti-hCD19 scFv的亲和力，还需构建能够表达anti-hCD19scFv的质粒，我们将anti-hCD19 scFvC端偶联EGFP绿色荧光蛋白序列，在293-F细胞中表达。

我们在EGFP绿色荧光蛋白C端接入串联的两个His标签，用于后续的蛋白纯化。

使用PUC57-antiCD19-scFv-EGFP(antiCD19-scFv-EGF序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成后连入载体PUC57中)为扩增模板，该模板中含以下碱基序列：

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(anti-hCD19 ScFv)

ggatctggaagttcaggaagcggctcaagtgggtctggaagctca(G4Slinker)

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag(EGFP)

引物序列如下：

Cd19ScFv-SP-HindIII-F:atacgc aagctt gccaccatgctgctgctggtgacctccctgctgctgtgcg

His2-G4S-opti-BH I-R:atacgc ggatcc cta gtgatgatga tgatgatggtgatgatgatg atgatg agaaccacca ccacc cttgtacagc tcgtccattc cc

将上述碱基序列antiCD19-ScFv-EGFP序列通过如下步骤连入pCEP4载体中，用于表达antiCD19-ScFv-EGFP基因序列：

(1)PCR扩增：利用Pyrobest高保真扩增酶(Takara)对目的基因(由金斯瑞公司合成)进行PCR扩增出来。(引物为Cd19ScFv-SP-HindIII-F:及His2-G4S-opti-BH I-R，模板为PUC57-optiPD1-G4S-HA)，PCR条件为：退火56℃，72℃延伸2min，35个循环。

(2)胶回收PCR产物：上一步已完成的PCR反应物依照DNA凝胶试剂盒(QIAGEN)使用说明进行纯化。

(3)酶切目的基因片段和载体质粒：步骤(2)回收后得到的PCR产物以及载体(pCEP4，本实验室自行保存)经核酸内切酶(HindIII,BamHI,NEB)切割后采用DNA凝胶试剂盒(QIAGEN)回收。

(4)回收后的酶切片段以及载体用T4连接酶(NEB)连接，转化并扩增目标质粒：将步骤(3)酶切完成的质粒和PCR产物片段用T4连接酶连接，获得目标质粒pCEP4-antiCD19-ScFv-EGFP。将扩增质粒转入TOP10感受态细胞(Transgen Biotech)中进行扩增(转化步骤参照Transgen Biotech CD101产品说明书进行)。

(5)测序鉴定：挑取转化了目标片段的阳性单克隆(随机挑取六个克隆，提取质粒后EcoRI,XhoI进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析有1600bp片段的为阳性克隆)，并进行测序(北京睿博兴科生物技术有限公司)。

将测序正确的pCEP4-antiCD19-ScFv-EGFP质粒经无内毒素质粒大提试剂盒(Tiangen无内毒素质粒大提试剂盒，具体操作按照说明书进行)进行质粒提取，转染293-F细胞，293-F细胞培养及转染过程参照FreeStyle^TMMAX 293Expression System(ThermoScientific，货号：K900010)。

将上述构建的质粒纯化后转染293-F细胞，antiCD19-ScFv-EGFP-his在293-F中表达后，用镍柱进行纯化，步骤为：

(1)转染后摇床继续培养6天，200g离心3分钟去掉细胞，10000g离心10分钟去掉培养基中的杂质；

(2)用10kd浓缩管在3800rmp条件下，4℃离心浓缩致原体积十分之一左右；

(3)将上清加到填有硫酸镍(NiSO4)的Sepharose High Performance(AmershamBioscience)的层析柱中；

(4)用分别含有30、60、90、120、250mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用超滤管浓缩后即得。

3、表面展示CD19胞外区的细胞(CHO-CD19)的构建：

利用现有的CHO细胞系统(可参见我们的在先专利CN104531623B)构建将CD19胞外区展示在细胞表面的CHO细胞系，我们前期利用重组酶介导的盒式替换技术建立了只含有一个拷贝重组替换位点的细胞株PuroR-14，该细胞株为CN104531623B中构建的PuroR-14细胞株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center，CGMCC)，编号CGMCC No.9717，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。将质粒pCI-Flp-2A-Cre(本实验室构建，含重组酶)与实施例1中构建的质粒pFRT-CD19-G4S-HA共转染到该细胞株，通过重组酶Flp和Cre的作用，将CD19成功展示到细胞表面。将转染后的CHO细胞培养48h，胰酶消化后收集细胞。CD19胞外区被展示在CHO细胞表面后，由于其C端带HA标签，展示效率可用抗HA的流式标签抗体检测。用抗HA标签的抗体(Rabbit Anti-HA tag IgG：

APC兔抗HA抗体(1：100稀释)，Cayman，货号：13406)标记细胞，流式分选展示CD19胞外区的阳性细胞用于CD19胞外区的亲和力进化实验。经流式细胞仪分选出的表面展示了带HA标签的CD19胞外区的细胞命名为CHO-CD19，流式细胞仪检测分选的细胞CD19展示率及其与配体antiCD19-ScFv-EGFP蛋白的亲和力。

4、对CD19胞外区与antiCD19-ScFv-EGFP蛋白的亲和力进行人工进化

体细胞高频突变(SHM，somatic hypermutation)结合胞嘧啶脱氨酶诱导激活(AID，activation-induced cytidine deaminase)技术，能够在细胞增殖过程中，诱导目标蛋白的氨基酸序列变化，从而改善目标蛋白的亲和力、稳定性或专一性等性质(可参见我们的在专利CN104531623B)。通过该技术，对展示在CHO-CD19细胞表面的CD19胞外区与其配体antiCD19-ScFv-EGFP分子的亲和力进行人工进化。向CHO-CD19的细胞中转入AID并进行目标分子的人工进化的方法可参考CN104531623B，具体如下：

将AID转入实施例3制备获得的CHO-CD19细胞株：将约2x10⁵个CHO-CD19细胞转染pCEP4-Ig-Ek-NEO-mAID质粒(本实验室保存)，该质粒为表达AID基因的质粒，带有neo基因，为G418抗性，在培养基中加入G418可以维持AID基因持续表达。

将转入pCEP4-Ig-Ek-NEO-mAID质粒的CHO-CD19细胞置于含有G148抗生素的培养基中培养7天(细胞增殖到约2x10⁸个，随着细胞的增殖，转入的AID随机突变CD19胞外区的基因序列，产生大量的随机突变型的CD19胞外区分子并将其展示在细胞表面)，胰酶消化后收集所有细胞，用抗HA标签的抗体(Rabbit Anti-HA tag IgG:

APC兔抗HA抗体，1：100稀释，Cayman，货号：13406)和antiCD19-ScFv-EGFP融合蛋白在4℃下共同标记细胞。

流式分选出亲和力最高的部分细胞(约占总细胞的0.02～0.05％)，分选后的细胞置于无G418抗生素的培养基中培养3天，细胞扩增到约2x10⁵个以上时，重新转染pCEP4-Ig-Ek-NEO-mAID质粒进行下一轮进化，其余细胞用于验证本轮的进化效果。

5、CD19胞外区突变体的鉴定及CD19-Fc融合蛋白的构建与检测：

提取每轮进化后的S1～S4代的典型细胞的基因组，检测进化后的CD19胞外区突变体的序列结构。每轮进化后分选出的P3区域的细胞，在无G418的培养基中扩增细胞后提取全基因组，基因组提取采用

Genomic DNA Purification Kit提取试剂盒(Promega)提取，具体操作按照说明书进行。以基因组为模板，用引物：

hcd19-sp-nhei-f:atacgcgctagcatgccccctccaaggctgctgttctttctgctgttcctgacccc

hcd19-ha-g4s-xhoi-r:ctgtcctcgagagcataatctggaacatcatatggataagaaccaccacca cc cacaggccgggctgtgatctccagatggaagg

扩增出转入的CD19胞外区序列，经核酸内切酶(NheI，XhoI，NEB)酶切后回收，连接于pCDNA3.1(+)质粒上，随机挑取克隆进行测序，与野生型CD19碱基序列比对检测有无突变发生。

本实施方式中，具体的实施例包括如下：

实施例1、表面展示CD19胞外区的细胞株构建

利用CHO细胞系统(可参见申请人的在先专利CN104531623B)构建将CD19胞外区展示在细胞表面的CHO细胞株(构建流程如图1所示)，野生型CD19胞外区氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

我们前期利用重组酶介导的盒式替换技术建立了只含有一个拷贝重组替换位点的细胞株PuroR-14，该细胞株为CN104531623B中构建的PuroR-14细胞株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter，CGMCC)，编号CGMCC No.9717，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。构建过程如图1A所示，通过重组酶Flp和Cre的作用，将CD19替换掉PuroR基因，从而使细胞表达CD19(图1B所示)。CD19胞外区被展示在CHO细胞表面后，由于其C端带HA标签，展示效率可用抗HA的流式标签抗体检测。用抗HA标签的抗体(Rabbit Anti-HA tag IgG：

APC兔抗HA抗体(1：100稀释)，Cayman，货号：13406)标记细胞，流式分选展示CD19胞外区的阳性细胞用于CD19胞外区的亲和力进化实验。

经流式细胞仪分选出的表面展示了带HA标签的CD19胞外区细胞命名为CHO-CD19，流式细胞仪检测分选的细胞CD19展示率及其与配体antiCD19-ScFv-EGFP蛋白的亲和力。

将2x10⁶个细胞同时用：(1)标记HA标签的抗体进行标记(来源同上)，标记细胞表面展示的CD19展示率；(2)纯化的antiCD19-ScFv-EGFP蛋白在4℃下进行孵育(纯化的antiCD19-ScFv-EGFP蛋白的浓度为0.5mg/ml，每个样本加1ul即0.5ug antiCD19-ScFv-EGFP蛋白)。4℃下孵育30min后用PBS洗去非特异性结合antiCD19-ScFv-EGFP蛋白及荧光抗体。

检测结果如图1C所示：对照细胞为未替换CD19的细胞株(PuroR-14)，横坐标为CD19与antiCD19-ScFv-EGFP的亲和力，纵坐标为CD19的展示效率。

实施例2、对CD19胞外区与其单链抗体的亲和力进行优化

体细胞高频突变(SHM，somatic hypermutation)结合胞嘧啶脱氨酶诱导激活(AID，activation-induced cytidine deaminase)技术，能够在细胞增殖过程中，诱导目标蛋白的氨基酸序列变化，从而改善目标蛋白的亲和力、稳定性或专一性等性质(可参见申请人在先专利CN104531623B)。通过该技术，对展示在CHO-CD19细胞表面的CD19胞外区与其配体antiCD19-ScFv-EGFP分子的亲和力进行人工进化，每轮的步骤及流程如图2所示。

2.1、对CD19胞外区亲和力实施优化

将AID转入上述制备方法获得的CHO-CD19细胞株中：将约2x10⁵个CHO-CD19细胞转染pCEP4-Ig-Ek-NEO-mAID质粒(本实验室保存)，该质粒为表达AID基因的质粒，带有neo基因，为G418抗性，在培养基中加入G418可以维持AID基因持续表达。将转入pCEP4-Ig-Ek-NEO-mAID质粒的CHO-CD19细胞置于含有G148抗生素的培养基中培养7天(细胞增殖到约2x10⁸个，随着细胞的增殖，转入的AID随机突变CD19胞外区的基因序列，产生大量的随机突变型的CD19胞外区分子并将其展示在细胞表面)，胰酶消化后收集所有细胞，用抗HA标签的抗体(Rabbit Anti-HA tag IgG:

APC兔抗HA抗体，1：100稀释，Cayman，货号：13406)和antiCD19-ScFv-EGFP融合蛋白在4℃下共同标记细胞。流式细胞仪分选出亲和力最高的部分细胞(约占总细胞的0.02～0.05％，图3中P3所示部分)，分选后的细胞置于无G418抗生素的培养基中培养3天，细胞扩增到约2x10⁵个以上时，重新转染pCEP4-Ig-Ek-NEO-mAID质粒进行下一轮进化，其余细胞用于验证本轮的进化效果(图3所示)。

2.2、流式细胞仪分选获得高亲和力CD19蛋白的突变细胞群

在第一轮分选到的细胞(S1代细胞)的基础上，按照上述实验流程，再进行三轮进化，共计进化四轮，收集每轮进化的P3区域细胞，分别命名为CHO-CD19 S1～S4，同样方法检测进化后的CD19胞外区与antiCD19-ScFv-EGFP融合蛋白的亲和力，结果见图4，可见，随着进化轮次的提升，进化后的CD19胞外区与antiCD19-ScFv-EGFP融合蛋白的亲和力有大幅提升。

在第一轮分选到的细胞(S1代细胞)的基础上，按照上述实验流程，再进行三轮进化，共计进化四轮，收集每轮进化的P3区域细胞，分别命名为CHO-CD19 S1～S4，同样方法检测进化后的CD19胞外区与antiCD19-ScFv-EGFP融合蛋白的亲和力。

实施例3、CD19胞外区突变体的鉴定

提取每轮进化后的S1～S4代的典型细胞的基因组，检测进化后的CD19胞外区突变体的序列结构。

每轮进化后分选出的P3区域的细胞，在无G418的培养基中扩增细胞后提取全基因组，基因组提取采用

Genomic DNA Purification Kit提取试剂盒(Promega)提取，具体操作按照说明书进行。以基因组为模板，用引物扩增出转入的CD19胞外区序列，经核酸内切酶(NheI，XhoI，NEB)酶切后回收，连接于pCDNA3.1(+)质粒上，随机挑取50个克隆进行测序，与野生型CD19碱基序列比对检测有无突变发生。测序及比对结果显示：经过4轮的进化和分选，共获得30余个含有不同氨基酸突变或者氨基酸突变组合的突变体。挑选其中10个突变体连入pCDNA3.1(+)质粒(该质粒含有突变的hCD19序列及G4S-HA序列，可以瞬时表达在细胞表面，用于检测突变体的亲和力)后瞬时转染CHO/dhFr-细胞，48小时后收集细胞，经标记后流式检测不同hCD19胞外区突变体对其单链抗体的结合能力(具体检测方法与上述所述方法一致)。结果如图5所示：Mut9及Mut10亲和力提高的最为明显，Mut9用于CD19CAR-T的相关检测试验。挑选其中10个突变体连入pCDNA3.1(+)质粒(该质粒含有突变的hCD19序列及G4S-HA序列，可以瞬时表达在细胞表面，用于检测突变体的亲和力)后瞬时转染CHO/dhFr-细胞，48小时后收集细胞，经标记后流式检测不同hCD19胞外区突变体对其单链抗体的结合能力。

经过四轮的流式细胞仪分选，经测序获得了一系列与检测探针(antiCD19-ScFv-EGFP)亲和力提高的突变体。其中，Mut9及Mut10亲和力提高的最为明显，Mut9用于CD19CAR-T的相关检测试验。

经鉴定上述不同突变体(Mut1-Mut10)的突变类型如下表所示：

实施例4、对CD19突变体检测灵敏度的鉴定

我们对CD19突变体连上鼠源Fc标签进行了亲和力检测，其与单链抗体的亲和力(Kd值)最高达到了6.6E-09(M)(CD19-Mut9-mFc)。CD19-Mut9-mFc与CD19-WT-mFc同时对CD19-CAR阳性细胞进行流式细胞仪检测，发现Mut9(图6B所示)的检测灵敏度较野生型(图6A所示)提高了近两个数量级。Mut9蛋白在低至0.003μg仍能对阳性细胞进行有效检出。同时，我们通过向阴性细胞中参入不同比例的阳性细胞检测突变体的灵敏度，发现在参入率低至万分之三时，Mut9蛋白仍能对阳性细胞进行有效检出，而野生型CD19蛋白无法检测出低浓度的阳性细胞(图7所示)。

为了进一步的验证Mut9蛋白相对于CD19-WT有更高的灵敏度及更低的检测背景。我们分别用0.3μg及0.03μg的蛋白量检测CD19CAR-T的阳性率(图8所示)，结果表明Mut9蛋白在不同的检测浓度下对不同的阳性率细胞都能够保持较高的灵敏度及较低的检测背景，而CD19-WT蛋白在低浓度下则不能对CD19CAR-T阳性率低的样本进行有效检测。

实施例5、对CD19突变体流式检测信噪比的鉴定

信噪比，英文名称叫做SNR或S/N(SIGNAL-NOISE RATIO)，又称为讯噪比。是指一个电子设备或者电子系统中信号与噪声的比例。对于流式检测来说，信噪比越高，则说明检测时间灵敏度高，背景低，结果更准确。

我们将不同检测浓度的Mut9蛋白及CD19-WT蛋白对CD19CAR-T阳性细胞的检测信号放在同一个流式图中(图9所示),Mut9蛋白在不同检测浓度的情况下，流式检测信号均高于CD19-WT蛋白。且浓度越低优势更为明显，显然Mut9的特点更能满足科研及临床流式检测的需求。图9A为阴性对照细胞，图9B为CD19CAR-T阳性细胞。同样的，将不同检测浓度的Mut9蛋白及CD19-WT蛋白对CD19CAR-T阳性细胞及阴性对照细胞的检测信号放在同一个流式图中(图10所示),Mut9蛋白在不同检测浓度的情况下，流式检测信噪比均高于CD19-WT蛋白。图10A为CD19-WT蛋白，图10B为Mut9蛋白。

流式细胞术(flow cytometry)是一种高速测定单个细胞光信号(主要是各色荧光信号)的技术，也是当今细胞术领域中一种主要的技术。流式细胞仪(flow cytometer)是实施这种细胞测量技术的仪器，Alice L.Givan给出一个描述性定义为：流式细胞仪是一种当细胞(或其他粒子)以单个方式依次流动经过光源前方时，细胞被探测光束照亮，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并关联各个信号进行分析的仪器。

流式细胞术集中了在单细胞水平高通量、多参数、高精确度和高灵敏度分析功能和高速细胞分选能力，被认为是目前可获得的最佳测量多参数信息的工具。基于以上特点，流式细胞仪在用于CAR-T细胞检测时，有着其它检测手段不可替代的优势。在CAR T制造的前期阶段，流式细胞术可用于分析单采血液分离产品的成分，并确定与预后更好或更差相关的供体T细胞的特定群体。流式细胞术还可用于评估输注之前CAR T细胞的表型和功能。输注后，流式细胞术成为监测CAR-T细胞扩增和持久性、评估治疗反应的必要工具。例如，在抗CD19 CAR T细胞用于治疗儿童和成人复发性和难治性B-ALL的临床试验中，流式细胞仪用于量化CAR T细胞扩增的程度，并检测是否存在对治疗有反应的患者的骨髓和脑脊液中的CAR T细胞。治疗后，需用流式细胞术对这些患者进行了纵向随访，明确获得持续缓解的患者中MRD阴性，并及时发现复发的患者。在复发的情况下，流式细胞术还有助于确定白血病细胞的数量和表型，例如在一名儿童B-ALL复发的情况下，流式可发现患儿的原始细胞出现CD19抗原的丢失。

在输注之前和之后，对CAR产品进行评估时，需要考虑的一个重要因素是要确保方案能够鉴定出CAR阳性的白血病细胞。尽管非常罕见，但有报道称在CAR T细胞生产过程中CAR也能转染到白血病细胞上，从而与治疗性CAR T细胞混在一起，最终导致复发。这种耐药机制是在接受抗CD19 CAR T细胞后复发的B-ALL患者中发现的。这凸显了需要使用流式细胞术而不是仅仅依靠qPCR监测CAR T扩增的重要性，因为流式能够使我们确定正在扩增的CAR阳性细胞是否存在非T细胞群体(白血病细胞)。我们分别用PE(藻红蛋白)及FITC(异硫氰酸荧光素)两种荧光染料对Mut9蛋白进行荧光标记，从而说明Mut9可以适应不同的荧光染料标记，从而更好的满足科研及临床上多参数检测的需求。

由图11可以看出，Mut9蛋白经PE(藻红蛋白)及FITC(异硫氰酸荧光素)两种荧光染料标记后，均可以高效的检测CD19CAR-T阳性细胞。其中，PE标记的区分度会略好于FITC荧光素标记。

在临床样本的实际操作中，简便、高效的实验步骤非常重要，可以大大提高检测效率。同时，简化实验步骤也对检测试剂自身的性质提出了更高的要求。通常在科研实验中，实验细胞样本与检测试剂进行孵育后需要缓冲液清洗两至三次从而可以在一定程度上减低非特性结合信号的影响。如果这一步骤可以省略，可以在临床操作中减免一定的时间的工作量，使得检测试剂更具实际操作性。

我们正常的实验步骤是CD19CAR-T阳性细胞样本与检测试剂进行孵育30分钟后用缓冲液清洗三次。在本实验中，以正常步骤样本为阳性对照，CD19CAR-T阴性细胞为阴性对照，验证CD19CAR-T阳性细胞样本与检测试剂进行孵育15分钟、30分钟后直接用流式细胞仪检测的实验结果。由图12可以看出Mut9蛋白与CD19CAR-T阳性及阴性细胞样本的非特异性结合极低，赋予后不清晰基本不影响实验结果。进一步说明Mut9蛋白能够满足临床检测的需求。

实施例6、Mut9蛋白与现有检测产品灵敏度的比较

对于CAR-T细胞来说，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是CAR阳性的T细胞，CAR-T细胞产品的包装规格及临床使用剂量是以CAR-T阳性细胞数表示的，因此，CAR转染阳性率是CAR-T细胞产品质量控制的必检项，监管部门建议应采用流式细胞法(FACS)检测CAR转染阳性率。目前，针对CAR不同结构区域的检测方法，包括针对CAR抗原结合位点的，比如CD19抗原和抗独特型抗体，或针对轻链或铰链区的抗Fab抗体、Protein L蛋白。

抗Fab抗体可识别抗体Fab段，可与含有Fab段可变区的scFv结合而达到检测CAR表达的目的，具有一定的通用性，可检测不同靶点的CAR。商品化的抗Fab抗体产品质量参差不齐且多数为多抗，批间一致性较差。来自Jackson ImmunoResearch Laboratories的多克隆山羊抗小鼠F(ab)2抗体是目前使用最广泛的抗Fab抗体，广泛用于上市药物Yescarta的抗CD19 CAR表达检测。我们将Mut9蛋白与商品化的抗Fab抗体(Jackson ImmunoResearch)分别用FITC进行标记，采用0.1μg、0.03μg、0.01μg、0.003μg、0.001μg五个浓度对CD19CAR-T细胞样本进行检测。图13的结果表明我们的Mut9蛋白检测灵敏度要远远高于商品化的抗Fab抗体。

实施例7、CD19突变体的亲和力检测

表面等离子体共振(SPR)亲和力测定是一种基于光学的无标记检测技术，用于实时检测两个或多个分子之间的分子互作。SPR亲和力测定具有高通量、高灵活性、高灵敏度的特点，可以用于早期的药物研发以及临床前药物筛选。比如：筛选小分子药物或多肽(酶或抗体等)具有强大的优势能够快速、精准地筛选出候选药物分子为后续研究节省成本。

SPR亲和力检测是一种通过传感器芯片跟踪信号变化来检测分子相互作用的方法。SPR信号通过折射率变化呈现，它指的是响应单位(RU)大约相当于1pg/mm2的蛋白质表面浓度。在两个分子之间的相互作用过程中，随时间绘制SPR信号会产生传感图，该图可以实时可视。一般结合反应包括三个阶段：结合、平衡和解离；将这些传感图数据与数学模型拟合，科学家们可以计算关联(Ka)和解离(Kd)速率常数，并最终确定结合亲和力(KD)。与基于平衡点测量抗体结合亲和力的等温量热法(ITC)不同，SPR可以获得完整的动力学参数来评估结合和解离的所有影响以及抗体亲和力。我们检测了一系列CD19突变体蛋白与其单链抗体FMC63的亲和力，其中Mut9蛋白与FMC63的亲和力达到了6.6E-09(M)。而CD19野生型蛋白与其单链抗体FMC63的亲和力很低(Kd>10^-7M)，仪器无法检测出结果(图14所示)。

实施例8、CD19突变体对临床样本的检测

在CAR-T治疗中，回输CAR-T细胞的数量需要精准控制的，太多了不行，太少了也不行，我们期待发生的是CAR-T回输后会出现一个体内扩增的过程，说明它成功的识别了靶细胞并且充分的被激活了。流式细胞仪在临床上检测CAR-T细胞阳性率具有不可替代的价值，首先，可以将其用于输注前的筛选，以定义表达CAR靶抗原的异常细胞的比例和在表面表达的分子数量。该信息可能很有价值，因为很难知道什么抗原密度阈值足以触发通过CAR激活T细胞。其次，患者输注CAR-T后，以定量的方式跟踪靶抗原的表达水平可能有助于理解耐药性。我们所获得的CD19-Mut9灵敏度远高于目前现有的各类检测试剂。数据表明，我们优化的CD19-Mut9与野生型CD19及其它流式检测试剂相比，在对回输前的样本检测上有更为准确的检测结果对于阳性CAR-T细胞和阴性CAR-T细胞的区分度非常高，检测结果更为准确。由图15可以看出，CD19-Mut9在流式检测上(图15C所示)对于区分CAR-T阳性细胞和阴性细胞的界限更为清晰，能够更准确地判定CAT-T细胞阳性率；在输入体内后能在最早时间CAR-T细胞是否进入快速增殖期，也更易确定在治疗半年以上病人体内是否还残存少量的CAR-T阳性细胞。

CD19CAR-T是针对B细胞靶点CD19的嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigenreceptor T cells)。CD19CAR-T在美国和欧洲已获批治疗白血病，最近也在中国获批临床治疗。其原理是，获取病人T细胞，装载抗CD19抗体及融合蛋白基因，回输给病人，在病人体内大量扩增，靶向并杀死CD19+的白血病B细胞。在构建CAR-T细胞和CAR-T在体内扩增过程中均需要检测监控抗CD19在CAR-T细胞上的表达水平和CAR-T细胞数量。回输后CAR-T细胞迅速增殖是有效清除癌细胞的重要保证；长期在体内保持低水平的CAR-T细胞是不复发的重要指标之一。过去采用的检测试剂不能区分低水平CAR-T细胞和阴性对照，也不能有效区分高水平和低水平抗CD19单链抗体在CAR-T细胞上的表达。我们采用我们开发的CHO细胞人工进化平台，针对抗CD19抗体优化CD19*-Fc(Mut9)亲和力，获得目前国际上最高检测灵敏度的试剂CD19*-Fc,CD19*-Fc针对抗CD19的亲和力达到6.6X 10^-9。

FITC-conjugated anti-IgG Fc F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch)抗体是目前临床上使用的CD19CAR-T诊断抗体，这株抗体显示很高的背景噪音信号(2.44％)，检测CAR-T的阳性信号值不高(4.45％)，不到阴性对照的两倍。用我们的mCD19*(CD19-Mut9)检测同样的细胞样本时，背景显著低于FITC-conjugated anti-IgG Fc F(ab’)2(JacksonImmunoResearch)抗体，阳性信号是该抗体的三倍以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 海珂分子(北京)科技有限责任公司

<120> CD19突变蛋白及其应用

<130> 11

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CD19

<400> 1

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val

275

Claims (10)

1.一种突变的CD19胞外结构域，所述突变的CD19胞外结构域与亲本CD19胞外结构域的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第82位、第83位、第29位、第184位或第234位；所述第82位氨基酸突变为V，所述第83位氨基酸突变为L，所述第29位氨基酸突变为G，所述第184位氨基酸突变为P，所述第234位氨基酸突变为W。

2.根据权利要求1所述的突变的CD19胞外结构域，其特征在于，所述突变的CD19胞外结构域在第82位氨基酸位点处存在突变。

3.根据权利要求1所述的突变的CD19胞外结构域，其特征在于，所述突变的CD19胞外结构域在第82位和第83位氨基酸位点处存在突变；进一步的，还包括对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第75位氨基酸位点的突变，所述第75位氨基酸突变为I。

4.一种诊断试剂，所述诊断试剂包括权利要求1-3任一所述的突变的CD19胞外结构域，任选的，所述诊断试剂还包括可检测的标记。

5.权利要求1-3任一所述的突变的CD19胞外结构域在制备免疫试剂中的应用。

6.权利要求1-3任一所述的突变的CD19胞外结构域在检测抗CD19免疫试剂中的应用，或者，在制备用于检测抗CD19免疫试剂的产品中的应用。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗CD19免疫试剂选自抗体，抗体片段，嵌合抗原受体(CAR)，包含嵌合抗原受体的免疫细胞，或针对CD19的CAR-T细胞。

8.一种检测样品中抗CD19免疫试剂的方法，所述方法包括利用权利要求1-3任一所述的突变的CD19胞外结构域对样品中抗CD19免疫试剂进行检测的步骤。

9.一种药物制剂，所述药物制剂包括权利要求1-3任一所述的突变的CD19胞外结构域以及药学上可接受的载体。

10.一种生产权利要求1-3任一所述的突变的CD19胞外结构域的方法，所述方法包括对编码所述的突变的CD19胞外结构域的基因进行表达的步骤。

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