KR20230075467A - 세포 표면 모이어티의 발현 또는 군집화를 검출하기 위한 방법 - Google Patents

세포 표면 모이어티의 발현 또는 군집화를 검출하기 위한 방법 Download PDF

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KR20230075467A
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세실리아 안나 윌헬미나 게위젠
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메뤼스 엔.페.
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Abstract

본 개시내용은 환자 샘플에서 적어도 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법, 및 샘플에서 적어도 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와의 군집화를 검출 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것이고, 상기 샘플은 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 분자에 노출된다. 본 개시내용은 추가로 이러한 결합 분자에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 방법, 이러한 결합 분자의 유효성을 결정하는 방법, 이러한 결합 분자의 작용 방식을 확인하는 방법, 대상체를 치료하는 방법, 및 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와의 군집화를 유도하는 능력에 대한 하나 이상의 시험 제제를 선별하는 방법에 관한 것이다.

Description

세포 표면 모이어티의 발현 또는 군집화를 검출하기 위한 방법
본 개시내용은 바람직하게는 환자 종양 샘플에서 적어도 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현 또는 군집화를 검출 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 환자가 두 세포 표면 모이어티에 결합하는 결합제를 사용한 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 있는지를 예측하거나 이러한 결합제의 작용 방식을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
암 치료를 위한 치료용 항체의 개발은 지난 몇 년 동안 급속히 증가했다. 다양한 암 유형의 경우, 특정 환자가 특정 약물을 사용한 치료로부터 이익을 얻을 수 있는지를 평가하기 위해 진단 분석이 사용되고 있으며, 이는 그것이 안전하고/효과적일 가능성이 높다고 예측할 수 있다. 생물학적 제제 또는 대형 분자 치료제와 함께 사용되어 온 진단 분석의 한 범주는 환자의 조직 샘플에서 생물학적 제제가 표적으로 하는 항원의 발현 수준을 시험하는 것과 관련된다. 예를 들어, 환자의 종양에서 조직 생검을 하여 정량 분석할 수 있다. 이러한 정량적 검정의 예는 면역조직화학 (IHC), 이중 제자리 혼성화 검정, 발색성 제자리 혼성화 (CISH) 검정, 및 형광 제자리 혼성화 (FISH) 검정을 포함한다.
IHC는 예를 들어 유방암에서 예를 들어 HER2 발현을 평가하기 위한 표준 시험 방법이었다. IHC 시험은 세포 표면의 HER2 단백질에 결합하는 특정 단클론 또는 다클론 항체를 사용한다. 리포터 기능이 있는 2차 태그 항체를 추가한 후 효소 반응을 수행하면 존재하는 HER2 단백질의 양에 비례하는 신호가 생성된다. 그러나 IHC 발현 수준의 등급 및 채점에 대한 지침에도 불구하고 실험실 간 변동성을 완전히 방지할 수는 없다.
FISH, CISH, 및 은-강화 제자리 혼성화 검정으로 단일 또는 이중 프로브 기술을 사용하여 세포당 유전자 카피 수를 정량화한다. FISH는 예를 들어 HER2 시험에서 널리 사용되는 플랫폼이 되었다. 그러나 FISH 분석은 비용이 많이 들고 노동 집약적이며 형광 현미경 검사와 고급 훈련이 필요하다. CISH 및 은-강화 제자리 혼성화와 같은 명시야 제자리 혼성화 분석은 형광 현미경이 필요하지 않으며 비용도 저렴하다.
또 다른 개발은 예를 들어 유방암에서 총 HER2, HER2 동형이량체 또는 p95HER2 발현을 측정하는 방법으로 검증된 분석법으로, 단백질 발현, 이량체화 및 단백질-단백질 상호 작용을 정량화하도록 설계된 근접 기반 분석법이다 (Diagn Mol Pathol 2009;18:11-21; Shi et al.에 자세히 설명되어 있음).
지금까지, 다중특이적 제제의 존재하에 2개 이상의 항원이 군집화하는 능력을 입증하는 강건한 방법이 결여되어 있는데, 그러한 항원은 일반적으로 신체 조건하에서 회합하지 않는다. 여기에서, 본 발명자들은 그러한 검정 및 그 용도의 예시적인 응용을 입증한다.
본 발명자들은 T 세포에서 발현되는 세포 표면 모이어티인 CD137 및 종양 세포에서 발현되는 세포 표면 모이어티인 PD-L1의 발현 수준을 검출하고 정량화하기 위한 분석법을 개발하였다. 이를 통해 특정 환자가 이 두 세포 표면 모이어티를 결합하는 치료에 반응하고 혜택을 받을 수 있는지를 예측할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 사용된 검정과 같이, 2개의 세포 표면 모이어티가 동일한 샘플에 존재할 때 생성되는 신호 측정을 기반으로 하는 다른 적용 가능한 방법이 사용될 수 있다. 이 맥락에서 신호는 신호의 존재 또는 부재일 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 판독 모두는 세포 표면 모이어티의 발현 수준에 대한 정보를 제공한다. 또한, 방법은 예를 들어 이중특이적 또는 삼중특이적 항체와 같은 다중특이적 제제와 같은 특정 약물에 의해 결합될 수 있는 임의의 2개 이상의 세포 표면 모이어티의 발현 수준을 검출 및/또는 정량화하는 데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 CD137, 및 PD-L1과 CD137의 군집화를 검출하고 정량화하기 위해 사용되는 분석법을 추가로 개발하였다. CD137 및 PD-L1은 동족 수용체-리간드 쌍을 형성하지 않으며, 자연적으로 군집화되거나 직접적인 단백질-단백질 상호 작용을 형성하지 않는다. 그러나 예를 들어 이중특이적 또는 삼중특이적 항체와 같은 다중특이적 제제와 같이 두 세포 표면 모이어티에 동시에 결합하는 약물에 의해 표적화될 때, 이들 두 세포 표면 모이어티는 서로 근접하게 되어 검출될 수 있는 신호를 생성한다. 유사하게, 예를 들어 단일특이적 항체와 같은 단일특이적 2가 제제, 또는 이중특이적 또는 삼중특이적 항체와 같은 다중특이적 제제와 같은 적어도 2개의 동일한 세포 표면 모이어티에 결합하는 다가 약물에 의해 표적화될 때, 적어도 2개의 세포 표면 모이어티는 서로 근접하여 검출될 수 있는 신호를 생성한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 종양 세포 및/또는 면역계 세포로부터의 세포 표면상의 2개 이상의 표적 항원에 동시에 결합하는 이중 또는 삼중특이적 항체와 같은 다중특이적 작용제의 치료적 용도를 기반으로 한다. 이와 함께 다중특이적 제제는 2개 이상의 표적 항원의 군집화를 유도한다. 따라서 2개 이상의 항원의 군집화는 다중특이적 제제의 존재하에서만 발생하거나, 다중특이적 제제가 존재하지 않을 때와 비교하여 증가된 수준으로 발생한다.
특정 구현예에서, 이것은 환자가 치료받는 약물이 실제로 2개의 세포 표면 모이어티에 동시에 결합하고 예상되는 작용 방식을 나타내는지의 평가를 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 여기에서 사용된 검정과 같이, 2개의 세포 표면 모이어티가 근접해 있을 때 생성되는 신호를 측정하는 것을 기반으로 하는 다른 적용 가능한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 맥락에서 신호는 검정의 리포터 또는 기능의 존재 또는 부재일 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 판독 (리포터의 존재 또는 손실) 둘 모두는 세포 표면 모이어티의 근접성에 대한 정보를 제공한다. 또한, 방법은 예를 들어 이중특이적 또는 삼중특이적 항체와 같은 다중특이적 제제와 같은 특정 약물에 의해 동시에 결합될 수 있는 임의의 2개 이상의 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출 및/또는 정량화하는 데 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자와 접촉시키는 단계, 여기서 제1 결합 분자 및 제2 결합 분자 중 적어도 하나는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 서로 근접하지 않는 한 검출되지 않는 분자 태그를 포함하고; 그리고
분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하여 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출하는 단계.
본 개시내용은 또한 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는, 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 다음을 포함한다:
암을 앓는 대상체로부터의 종양 생검 샘플을 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자는 분자 태그를 포함하고;
그리고
분자 태그의 존재 또는 부재를 검출 및/또는 정량화하여 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출하는 단계.
본 개시내용은 추가로 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티, 특히 면역 효과기 세포상에서 발현되는 모이어티 및 종양 세포상에서 발현되는 모이어티에 결합하는 작용제 또는 작용제들에 대한 대상체, 특히 암 환자의 반응성을 예측하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기를 포함한다:
-대상체로부터의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현 수준을 검출 및/또는 정량화하는 단계;
-대상체의 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현 수준이 임계값 수준 초과인지 미만인지를 결정하는 단계; 및
-대상체의 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현 수준이 동일하거나 같으면 대상체가 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 결합하는 작용제 또는 작용제들에 반응할 가능성이 임계값 수준 이상인지 예측하는 단계.
본 개시내용은 추가로 암을 앓는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 다음을 포함한다:
-본원에 기재된 바와 같은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 결합시키는 작용제 또는 작용제들에 대한 대상체, 특히 암을 갖는 대상체의 반응성을 예측하는 단계; 및
-제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티를 결합시키는 작용제 또는 작용제들을 반응할 가능성이 있는 대상체에게 투여하는 단계.
본 개시내용은 추가로 작용제의 유효성을 결정하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 작용제는 적어도 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 결합 분자를 포함하고, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 작용제로 치료 중인 대상체의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출 및/또는 정량화하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 추가로 작용제의 작용 방식을 확인하기 위한 방법에 관한 것이며, 상기 작용제는 적어도 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 결합 분자를 포함하고, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 작용제로 치료 중인 대상체의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출 및/또는 정량화하는 것을 포함한다.
본 개시내용은 추가로 치료를 필요로 하는 대상체, 특히 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
-제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티를 결합하는 작용제로 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 단계;
-본원에 기재된 바와 같이 작용제의 효과 또는 작용 방식을 분석하는 단계.
본 개시내용은 추가로 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 유도하는 능력에 대해 하나 이상의 시험 제제를 선별하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
-하나 이상의 시험 세포 배양물을 시험 제제와 접촉시키는 단계,
상기 시험 세포 배양물은 제1 세포 표면 모이어티를 발현하는 세포 및 제2 세포 표면 모이어티를 발현하는 세포를 포함하고;
-본원에 기술된 바와 같이, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티의 군집화 수준을 검출하는 단계; 및
군집화 수준을 시험 제제와 접촉하지 않거나 참조 제제와 접촉한 대조군 세포 배양물에서 군집화에 대해 검출된 군집화 수준과 비교하는 단계,
여기서 대조군 세포 배양물은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함한다.
도 1. 본 개시내용의 특정 구현예에 따라 사용되는 VeraTag® 분석의 개념의 도식적 표현. 이 도면에서 VeraTag® 분석 형식은 하나 또는 두 개의 특정 항원에 결합하는 두 개의 1차 항체를 사용하고, 1차 항체 중 하나는 태그를 포함하고 다른 하나는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함한다. 광활성화는 항체 중 하나로부터 절단-유도 모이어티를 방출하고, 여기서 절단-유도 모이어티는 다른 항체로부터 태그의 절단을 유도한다. 태그에 의해 생성된 신호는 이후 모세관 전기영동 (CE)으로 측정된다.
그러나 본원에 제시된 개시내용은 이 도면에 제시된 분석 형식으로 제한되지 않는다.
도 2. 1차 항체를 사용하는 VeraTag® 분석 형식의 예에 대한 도식적 표현. 이 도면에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 상이한 세포 표면 모이어티다. 그러나 본 개시내용은 또한 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 동일한 구현예를 포함한다.
A) 세포 표면상에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자 및 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커 (가위 기호)를 포함하고, 여기서 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고 제4 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
B) 세포 표면상에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자 및 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 여기서 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
C) 세포 표면상에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자 및 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커 (가위 기호)를 포함하고, 여기서 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
D) 세포 표면상에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자 및 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 여기서 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고 제4 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함한다.
도 3. 각 표적에 대해 2개의 1차 항체와 2차 항체를 사용하는 VeraTag® 분석 형식의 예에 대한 도식적 표현. 이 도면에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 상이한 세포 표면 모이어티다. 그러나 본 개시내용은 또한 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 동일한 구현예를 포함한다.
A) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제1 및 제3 결합 분자는 각각 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 및 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
B) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제2 및 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 각각 부착된 제1 및 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
C) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제1 및 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
D) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제2 및 제4 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
E) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
F) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
G) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제4 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
H) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
I) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
J) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제4 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
K) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
L) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
M) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제1 결합 분자 및 제4 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
N) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
O) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
P) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자,
여기서 제2 및 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함한다.
도 4. 각 표적에 대해 2개의 1차 항체와 2개의 2차 항체를 사용하는 VeraTag® 분석 형식의 예에 대한 도식적 표현. 이 표현에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 상이한 세포 표면 모이어티다. 그러나 본 개시내용은 또한 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 동일한 구현예를 포함한다.
A) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현되는 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제 5 결합 분자, 제6 결합 분자, 제7 결합 분자 및 제8 결합 분자,
여기서 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제7 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제8 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
B) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현되는 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제 5 결합 분자, 제6 결합 분자, 제7 결합 분자 및 제8 결합 분자,
여기서 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제7 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제8 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
C) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현되는 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제 5 결합 분자, 제6 결합 분자, 제7 결합 분자 및 제8 결합 분자,
여기서 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제7 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제8 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
D) 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현되는 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제 5 결합 분자, 제6 결합 분자, 제7 결합 분자 및 제8 결합 분자,
여기서 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하며 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고, 제7 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제8 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함한다.
도 5. 각 표적에 대한 하나의 1차 항체와 1차 항체 중 하나에 대한 하나의 2차 항체를 사용하는 VeraTag® 분석 형식의 예에 대한 도식적 표현. 이 형식은 분자 태그의 DTT 매개 방출을 사용한다. 이 도면에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 상이한 세포 표면 모이어티다. 그러나 본 개시내용은 또한 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 동일한 구현예를 포함한다.
A) 세포 표면에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 세포 표면에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제1 결합 분자에 결합하는 제3 결합 분자,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고; 여기서 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
B) 세포 표면에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 세포 표면에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제2 결합 분자에 결합하는 제3 결합 분자,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고; 여기서 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함한다.
도 6. 표적의 군집화를 검출 및/또는 정량화하기 위해 각 표적에 대해 하나의 1차 항체를 사용하는 VeraTag® 분석 형식의 예에 대한 도식적 표현. 이 도면에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 상이한 세포에서 발현되는 상이한 세포 표면 모이어티다. 그러나 본 발명은 또한 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 동일한 세포 상에 존재하는 구현예를 포함한다. 또한, 이 표현에서 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 분자는 2가 이중특이적 항체이다. 그러나 본 개시내용은 또한, 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 분자가 다가 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 또는 사중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체인 상황을 포함한다.
A) 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합함으로써 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 서로 근접하게 하는 이중특이적 항체 (100); 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 분자 태그를 포함하고 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커 (가위 기호)를 포함하고;
B) 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합함으로써 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 서로 근접하게 하는 이중특이적 항체 (100); 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함한다.
도 7. 표적의 군집화를 검출 및/또는 정량화하기 위해 각 표적에 대한 하나의 1차 항체 및 1차 항체 중 하나에 대한 2차 항체를 사용하는 VeraTag® 분석 형식의 예에 대한 도식적 표현. 이 도면에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 상이한 세포에서 발현되는 상이한 세포 표면 모이어티다. 그러나 본 발명은 또한 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 동일한 세포 상에 존재하는 구현예를 포함한다. 또한, 이 표현에서 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 분자는 2가 이중특이적 항체이다. 그러나 본 개시내용은 또한 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 분자가 다가 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 또는 사중특이적 항체 와 같은 다중특이적 항체인 상황을 포함한다.
A) 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합함으로써 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 서로 근접하게 하는 이중특이적 항체 (100); 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자, 여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
B) 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합함으로써 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 서로 근접하게 하는 이중특이적 항체 (100); 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자, 여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
C) 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합함으로써 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 서로 근접하게 하는 이중특이적 항체 (100); 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자, 여기서 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고 제3 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 거기에 부착된 분자 태그를 포함하고;
D) 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합함으로써 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 서로 근접하게 하는 이중특이적 항체 (100); 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자, 여기서 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함한다.
도 8. 표적의 군집화를 검출 및/또는 정량화하기 위해 각 표적에 대한 1차 항체 및 1차 항체에 대한 2개의 2차 항체를 사용하는 VeraTag® 분석 형식의 예에 대한 도식적 표현. 이 도면에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 상이한 세포에서 발현되는 상이한 세포 표면 모이어티다. 그러나 본 개시내용은 또한 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 동일한 세포 상에 존재하는 경우까지 확장된다. 또한, 이 표현에서 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 분자는 2가 이중특이적 항체이다. 그러나 본 개시내용은 또한 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 분자가 다가 이중특이적 항체 또는 삼중특이적 또는 사중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체인 상황을 포함한다.
A) 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합함으로써 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 서로 근접하게 하는 이중특이적 항체 (100); 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 제3 결합 분자, 및 제4 결합 분자, 여기서 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고, 제4 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고;
B) 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합함으로써 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 서로 근접하게 하는 이중특이적 항체 (100); 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 제3 결합 분자, 및 제4 결합 분자, 여기서 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티 (가위 기호)를 포함하고; 제4 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함한다.
도 9. VeraTag® 분석을 사용하여 측정한, 상대 피크 면적 (RPA)에서 PD-L1 발현 수준을 보여주는 다이어그램. 샘플 A: 항-CD137 양성 대조군 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛; 샘플 B: CD137 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛; 샘플 C: RSV에 결합하는 음성 대조군 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛.
도 10. VeraTag® 분석을 사용하여 측정한, 상대 피크 면적 (RPA)에서 CD137 발현 수준을 보여주는 다이어그램. 왼쪽: 항-CD137 검정 항체 BBK2와의 배양; 오른쪽: 항-CD137 검정 항체 M127과의 배양. 샘플 A: 항-CD137 양성 대조군 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛; 샘플 B: CD137 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛; 샘플 C: RSV에 결합하는 음성 대조군 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛.
도 11. VeraTag® 분석을 사용하여 측정한, 상대 피크 면적 (RPA)에서 CD137 군집화를 보여주는 그래프. 왼쪽: 항-CD137 검정 항체 BBK2와의 배양; 오른쪽: 항-CD137 검정 항체 M127과의 배양. 샘플 A: RSV에 결합하는 음성 대조군 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛; 샘플 B: CD137 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛; 샘플 C: 항-CD137 양성 대조군 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛.
도 12. VeraTag® 분석을 사용하여 측정한, 상대 피크 면적 (RPA)에서 PD-L1-CD137 군집화를 보여주는 다이어그램. 왼쪽: 항-CD137 검정 항체 BBK2와의 배양; 오른쪽: 항-CD137 검정 항체 M127과의 배양. 샘플 A: RSV에 결합하는 음성 대조군 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛; 샘플 B: CD137 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛; 샘플 C: 항-CD137 양성 대조군 항체와 함께 배양하여 제조된 세포 펠렛. 이 분석에서 군집화 수준은 이소형 대조군 실험 (ITC)에서 측정된 것과 비교된다.
도 13. 다음의 개략도: A - 세포막에 존재하는 수용체 (항원 1)의 발현을 검출하기 위한 본원에 기술된 검정; B - 동일한 세포에서 수용체 (항원 1) 군집화를 검출하기 위한 본원에 기술된 근접 검정; 및 C - 하나의 세포에 있는 수용체 (항원 1)와 다른 세포에 있는 수용체 (항원 2)의 군집화를 감지하여 면역학적 시냅스를 형성하기 위한 본원에 설명된 근접 검정.
한 양태에서, 본 개시내용은 샘플에서 적어도 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 이 방법은 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 동일한 샘플에서 발현될 때 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 바람직하게는 2개의 상이한 신호가 생성되어 각 세포 표면 모이어티의 발현을 정량화할 수 있다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 조합된 신호가 각 세포 표면 모이어티의 발현 수준에 대한 정보를 제공하도록 신호 생성 모이어티가 선택된다.
신호는, 바람직하게는 상이한 형광 분자 태그를 갖는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 제공하는 단계, 바람직하게는 상이한 발색성 분자 태그를 갖는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 제공하는 단계, 바람직하게는 상이한 방사성 분자 태그를 갖는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 제공하는 단계; 및 바람직하게는 상이한 동위원소적으로 순수한 금속 킬레이터 분자 태그를 갖는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티를 제공하는 단계를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다양한 방식으로 생성될 수 있다. 소광은 사용할 수 있는 또 다른 방법이다. 특정 구현예에서, 바람직하게는 상이한 형광단이 각각의 세포 표면 모이어티에 사용되어 하나의 형광단의 형광 강도 감소 또는 제2 소광제와의 상호작용에 의해 유발된 신호 방출제로부터의 신호를 측정할 수 있게 한다.
본 개시내용에 따른 방법은 상이한 형식으로 수행될 수 있다. 한 형식에서, 본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자는 분자 태그를 포함하고, 선택적으로 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그는 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그와 상이하고; 그리고
b) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하기 위해 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하거나 양을 측정하는 단계.
또 다른 형식에서, 본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 2개의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 2개의 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자 중 하나 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자 중 하나는 분자 태그를 포함하고, 바람직하게는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착되고, 임의로 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 또 다른 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 또 다른 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고;
b) 임의로 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하기 위해 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하거나 양을 측정하는 단계.
특정 구현예에서, 본 개시내용에 따른 방법은 단일 샘플, 바람직하게는 환자 샘플에서 적어도 2개의 상이한 세포 표면 모이어티의 공동-발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같이, 적어도 2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 결합하는 작용제 또는 작용제들을 사용한 치료에 대한 환자, 바람직하게는 암 환자의 반응을 예측하는 데 특히 유용하다. 그러한 작용제의 예는 예를 들어 다중특이적 항체이다.
특정 구현예에서, 본 개시내용에 사용된 방법은 VeraTag® 검정을 포함한다. VeraTag® 검정은 당 업계에 잘 알려졌고 예를 들어 WO 2017/161030 및 본원에 인용된 참고문헌에 기술되어 있으며, 이들은 그 전체가 본원에 포함된다.
VeraTag® 검정은 다양한 형식으로 수행할 수 있다. 하나의 형식은 각각의 표적 부분에 대한 2개의 1차 결합 분자를 사용하는 근접 검정인데, 여기서 각각의 표적 모이어티에 대한 1차 결합 분자 중 하나는 분자 태그를 포함하고 다른 하나는 절단 유도 모이어티를 포함한다.
따라서 한 구현예에서, 본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a1) 샘플을 세포 표면상에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자 및 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 여기서 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고 제4 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a2) 샘플을 세포 표면상에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자 및 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 여기서 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a3) 샘플을 세포 표면상에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자 및 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 여기서 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a4) 샘플을 세포 표면상에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자 및 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 여기서 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고;
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그는 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그와 상이하고;
b) 제1 및 제2 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 제1 및 제2 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
또 다른 형식은 각 표적 모이어티에 대한 두 개의 1차 결합 분자와 1차 결합 분자 중 하나에 대한 2차 결합 분자를 사용하는 근접 검정이다.
따라서 한 구현예에서, 본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a1) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 및 제3 결합 분자는 각각 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 및 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a2) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 및 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 각각 부착된 제1 및 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a3) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 및 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a4) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 및 제4 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제5 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 제1 결합 분자 및 이에 부착된 제1 분자 태그에 결합하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a5) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a6) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a7) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a8) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a9) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a10) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a11) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a12) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a13) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자 및 제4 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제5 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a14) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a15) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a16) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 및 제6 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 및 제3 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그는 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그와 상이하고;
b) 제1 및 제2 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 제1 및 제2 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
또 다른 형식은 각각의 표적 모이어티에 대한 2개의 1차 결합 분자 및 각각의 1차 결합 분자에 대한 2차 결합 분자를 사용하는 근접 검정이며, 여기서 각각의 표적 모이어티에 대한 2차 결합 분자 중 하나는 분자 태그를 포함하고 다른 하나는 절단 유도 모이어티를 포함한다.
따라서 한 구현예에서, 본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a1) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현되는 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 제6 결합 분자, 제7 결합 분자 및 제8 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제7 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제8 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a2) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현되는 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 제6 결합 분자, 제7 결합 분자 및 제8 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제7 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제8 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a3) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현되는 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 제6 결합 분자, 제7 결합 분자 및 제8 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제7 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제8 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a4) 샘플을 세포 표면상에 발현되는 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 및 제2 결합 분자, 세포 표면상에 발현되는 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제3 및 제4 결합 분자, 제5 결합 분자, 제6 결합 분자, 제7 결합 분자 및 제8 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제5 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고, 제7 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고, 제6 결합 분자는 제3 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고, 제8 결합 분자는 제4 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고;
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그는 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그와 상이하고;
b) 제1 및 제2 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 제1 및 제2 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
또 다른 형식은 DTT-매개 방출이며, 샘플에서 적어도 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법은 다음을 포함한다:
a) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고, 그리고
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그는 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그와 상이하고;
b) 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
한 형식에서, DTT-매개 방출 검정은 분자 태그를 포함하는 각 표적 모이어티에 대해 1차 결합 분자를 사용한다.
따라서 한 구현예에서, 본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 샘플을 세포 표면에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 세포 표면에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고; 그리고
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그는 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그와 상이하고;
b) 제1 및 제2 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
또 다른 형식은 각각의 표적 모이어티에 대한 1차 결합 분자 및 2차 결합 분자를 사용하는 DTT-매개 방출 검정이며, 여기서 2차 결합 분자는 분자 태그를 포함한다.
따라서 한 구현예에서, 본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 샘플을 세포 표면에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 세포 표면에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 제1 결합 분자와 특이적으로 결합하는 제3 결합 분자, 및 제2 결합 분자와 특이적으로 결합하는 제4 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고; 그리고
여기서 제4 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그는 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그와 상이하고;
b) 제1 및 제2 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
또 다른 형식은 각 표적 모이어티에 대한 1차 결합 분자, 및 1차 결합 분자 중 하나에 결합하고 분자 태그를 포함하는 2차 결합 분자를 사용하는 DTT-매개 방출 검정이다.
따라서 한 구현예에서, 본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a1) 샘플을 세포 표면에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 세포 표면에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제1 결합 분자에 특이적으로 결합하는 제3 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고; 그리고
여기서 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하거나; 또는
a2) 샘플을 세포 표면에 발현된 제1 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 세포 표면에 발현된 제2 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제2 결합 분자에 특이적으로 결합하는 제3 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제1 분자 태그를 포함하고; 그리고
여기서 제3 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 제2 분자 태그를 포함하고;
여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그는 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 결합 분자에 부착된 분자 태그와 상이하고;
b) 제1 및 제2 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
1차 결합 분자 및 2차 결합 분자가 사용되는 상기 예시된 형식 각각에서, 하나 이상의 결합 분자가 1차 결합 분자와 2차 결합 분자 사이에 존재할 수 있다.
본 개시내용에 따른 방법은 근접 검정 및 DTT-매개 방출 검정의 조합을 포함할 수 있고, 여기서 근접 검정은 제1 세포 표면 모이어티를 검출하기 위해 사용되고 DTT-매개 방출 검정은 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는데 사용된다.
본 개시내용에 따른 방법은 단일 샘플에서 적어도 2개의 상이한 세포 표면 모이어티의 공동-발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 그로부터 얻은 지식은 2개의 상이한 세포 표면 모이어티를 결합하는 작용제 또는 작용제들에 대한 환자, 특히 암 환자의 반응성을 예측하는 데 사용될 수 있다.
따라서 본 개시내용은 적어도 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티, 특히 면역 효과기 세포상에서 발현되는 모이어티 및 종양 세포상에서 발현된 모이어티를 결합하는 작용제 또는 작용제들에 대한 환자, 특히 암 환자의 반응성을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 본 개시내용에 따른 방법을 사용하여 대상체, 특히 대상체의 종양으로부터의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 구성원의 발현 수준을 검출하는 단계;
b) 대상체의 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현 수준이 임계값 수준 초과인지 미만인지를 결정하는 단계; 및
c) 대상체의 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현 수준이 임계값 수준 이상이면 대상체가 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 결합하는 작용제 및 작용제들에 반응할 가능성이 있는지 예측하는 단계. 작용제 또는 작용제들은 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 작용제를 포함한다. 이 방법은 본원에서 "예측 방법"이라고도 한다.
따라서 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체, 특히 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 상기 기재된 예측 방법을 사용하여 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 결합하는 작용제 또는 작용제들에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 단계; 및
b) 예측에 따라 반응할 가능성이 있는 대상체에게 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면을 결합시키는 작용제 또는 작용제들을 투여하는 단계. 작용제 또는 작용제들은 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 작용제를 포함한다.
본 개시내용은 대상체, 특히 암을 갖는 대상체의 치료를 위한 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 결합시키는 작용제 또는 작용제들을 추가로 제공하며, 여기서 치료는 다음을 포함한다:
a) 상기 기재된 예측 방법을 사용하여 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 결합하는 작용제 또는 작용제들에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 단계; 및
b) 예측에 따라 반응할 가능성이 있는 대상체에게 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면과 결합하는 작용제 또는 작용제들을 투여하는 단계. 작용제 또는 작용제들은 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 작용제를 포함한다.
본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출 및/또는 정량화하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 서로 근접하지 않으면 검출되지 않는 신호의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 이 방법은 두 개 이상의 세포 표면 모이어티가 서로 근접해 있는지 표시하는 데 사용할 수 있다. 2개 이상의 세포 표면 모이어티가 서로 근접한 경우, 본원에 기술된 바와 같이 신호를 생성하는 경우 이들은 군집화되는 것으로 간주된다. 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 근접성은 적어도 2개의 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제, 예를 들어 다중특이적 항체에 의해 야기되거나 유도된다. 따라서 특정 구현예에서, 방법은 또한, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 2개의 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 의해 동시에 결합될 때 생성된 신호를 검출하는 것을 포함하는 것으로 정의될 수 있다.
본 개시내용에 따른 방법은 근접 검정의 상이한 형식을 포함하는 상이한 방식으로 수행될 수 있다. 상기 방법을 수행하는 한 가지 방법은 세포 표면 모이어티 중 하나를 검출하는 결합 분자에 부착된 형광단으로부터 신호를 소광하는 것을 포함하며, 여기서 소광은 세포 표면 모이어티 중 다른 부분을 검출하는 결합 분자에 부착된 소광제에 의해 야기된다. 이 방법을 수행하는 또 다른 방법은 세포 표면 모이어티 중 하나를 감지하는 결합 분자에 부착된 형광단과 다른 세포 표면 모이어티를 감지하는 결합 분자에 부착된 다른 형광단의 간섭에 의해 생성된 신호를 포함한다.
근접 검정의 한 형식에서, 2개의 1차 결합 분자가 사용되며, 각각의 표적 모이어티에 대해 하나씩, 1차 결합 분자 중 하나는 분자 태그를 포함하고 다른 1차 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함한다.
한 구현예에서, 본 개시내용은 따라서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a1) 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 분자 태그를 포함하고 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a2) 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 분자 태그를 포함하고 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고; 그리고
b) 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
또 다른 형식에서, 1차 결합 분자는 각각의 표적 모이어티 및 1차 결합 분자 중 하나에 대한 2차 결합 분자에 대해 사용되며, 여기서 2차 결합 분자에 의해 결합되지 않은 1차 결합 분자는 분자 태그를 포함하고 2차 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하거나, 또는 2차 결합 분자에 의해 결합되지 않은 1차 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고 2차 결합 분자는 분자 태그를 포함한다.
한 구현예에서, 본 개시내용은 따라서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a1) 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 부착된 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a2) 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a3) 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자에 접촉시키는 단계,
여기서 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고 제3 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하거나; 또는
a4) 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자에 접촉시키는 단계,
여기서 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고;
b) 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하는 단계.
또 다른 형식에서, 1차 결합 분자는 1차 결합 분자 모두에 대한 각각의 표적 모이어티 및 2차 결합 분자에 대해 사용되며, 여기서 2차 결합 분자 중 하나는 분자 태그를 포함하고 다른 하나는 절단 유도 모이어티를 포함한다.
한 구현예에서, 본 개시내용은 따라서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a1) 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 제3 결합 분자, 및 제4 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고, 제4 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하거나; 또는
a2) 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 제3 결합 분자, 및 제4 결합 분자와 접촉시키는 단계,
여기서 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고; 제4 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고,
b) 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
c) 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출 및/또는 정량화하기 위해 방출된 분자 태그를 검출하는 단계.
1차 결합 분자 및 2차 결합 분자가 사용되는 상기 예시된 형식 각각에서, 하나 이상의 결합 분자가 1차 결합 분자와 2차 결합 분자 사이에 존재할 수 있다.
본 개시내용은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출 및/또는 정량화하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
제1 및 제3 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제3 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자에 접촉시키는 단계, 여기서 제1 결합 분자 및 제2 결합 분자 중 적어도 하나는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 서로 근접하지 않는 한 검출되지 않는 분자 태그를 포함하고; 그리고
분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하여 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출하는 단계.
이러한 맥락에서, 적어도 제1 및 제3 세포 표면 모이어티는 바람직하게는 상이한 세포 표면 모이어티다. 특정 구현예에서, 제1 세포 표면 모이어티는 CD137 또는 또 다른 공동자극 분자이고 제3 세포 표면 모이어티는 종양 관련 부분 또는 면역 체크포인트 모이어티, 바람직하게는 PD-L1과 같은 또 다른 세포 상의 모이어티다. 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 바람직하게는 동일한 세포 표면 모이어티다. 특정 구현예에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 CD137이다.
본 개시내용에 따른 방법은 단일 샘플에서 2개 이상의 상이한 세포 표면 모이어티의 군집화를 측정하기 위해 사용될 수 있고, 본 개시내용에 따르면, 특히 군집화가 2개 이상의 상이한 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 의해 유도될 때 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 그로부터 얻은 지식은 2개 이상의 상이한 세포 표면 모이어티에 대해 결합 특이성을 갖는 작용제로의 치료가 효과적인지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 결정은 이들 모이어티에 대한 2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제의 동시 결합의 확인에 기초한다.
작용제는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티에 동시에 결합할 수 있는 임의의 단일 모이어티일 수 있다. 특정 구현예에서, 작용제는 적어도 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어 적합한 작용제는 예를 들어 이중특이적 및 삼중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체를 포함하는 항체와 같은 결합 분자, 항체 단편, 항체 유래 도메인을 포함하는 분자, 및 융합 단백질을 포함한다. 작용제는 약물로도 지칭될 수 있다.
따라서 본 개시내용은 적어도 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 작용제의 유효성을 결정하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시내용에 따른 방법을 사용함으로써 작용제로 치료 중인 대상체의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출 및/또는 정량화하는 것을 포함한다. 작용제는 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 작용제이다. 이 방법은 본원에서 "모니터링 방법"이라고도 한다.
또한, 본 개시내용은 적어도 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 작용제의 작용 방식을 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시내용에 따른 방법을 사용함으로써 작용제로 치료 중인 대상체의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출 및/또는 정량화하는 것을 포함한다. 작용제는 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 작용제이다. 작용 방식은 예를 들어 작용제를 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 동시에 결합시키는 것이다. 이와 관련하여, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 바람직하게는 상이한 세포 표면 모이어티고 작용제는 다중특이적 항체이다. 또 다른 작용 방식은 예를 들어 2개 이상의 세포 표면 모이어티의 군집화다. 이와 관련하여, 한 구현예에서, 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 동일하고 제제는 단일특이적 항체이다; 또 다른 구현예에서, 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 상이한 세포 표면 모이어티고 작용제는 다중특이적 항체이다. 이 방법은 본원에서 "확인 방법"이라고도 한다. 예를 들어, 작용제, 바람직하게는 면역 효과기 세포 상에 발현된 세포 표면 모이어티, 바람직하게는 CD137 또는 임의의 다른 면역 효과기 세포 동시자극 모이어티, 및 종양 세포 상에 발현된 세포 표면 모이어티, 바람직하게는 PD-L1 또는 임의의 다른 종양 관련 모이어티 또는 면역 체크포인트가 면역 효과기 세포에서 발현되는 2개 이상의 세포 표면 모이어티, 바람직하게는 하나 이상의 CD137, 또는 임의의 다른 면역 효과기 세포 동시자극, 단백질의 군집화를 유도하는지 결정할 수 있다.
본 개시내용은 추가로 치료를 필요로 하는 대상체, 특히 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음을 포함한다:
a) 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 작용제로 대상체를 치료하는 단계;
b) 본원에 기술된 모니터링 방법을 사용하여 작용제의 효과를 분석하거나, 본원에 기술된 확인 방법을 사용하여 작용제의 작용 방식을 확인하는 단계. 작용제는 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 작용제이다. 특정 구현예에서, 이 방법은 분석 또는 확인의 결과에 기초하여 치료를 계속하거나 조정하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 조정은 투여량을 증가시키거나 감소시키는 것 및/또는 작용제의 투여 빈도를 증가시키거나 감소시키는 것, 또는 치료 종료를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용은 대상체, 특히 암을 갖는 대상체의 치료에 사용하기 위한 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티와 결합하는 작용제를 추가로 제공하며, 여기서 치료는 하기를 포함한다:
a) 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와 결합하는 작용제로 대상체를 치료하는 단계;
b) 본원에 기술된 모니터링 방법을 사용하여 작용제의 효과를 분석하거나, 본원에 기술된 확인 방법을 사용하여 작용제의 작용 방식을 확인하는 단계. 작용제는 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 작용제이다. 특정 구현예에서, 이 방법은 분석 또는 확인의 결과에 기초하여 치료를 계속하거나 조정하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 조정은 투여량을 증가시키거나 감소시키는 것 및/또는 작용제의 투여 빈도를 증가시키거나 감소시키는 것, 또는 치료 종료를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 개시내용에 따른 방법은 적어도 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 유도하는 능력에 대해 하나 이상의 시험 제제를 선별하는데 추가로 사용될 수 있다.
따라서 본 개시내용은 적어도 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 유도하는 능력에 대해 하나 이상의 시험 제제를 선별하는 방법을 추가로 제공하며, 이 방법은 하기를 포함한다:
a) 하나 이상의 시험 세포 배양물을 시험 제제와 접촉시키는 단계,
여기서 시험 세포 배양물은 적어도 제1 세포 표면 모이어티를 발현하는 세포 및 제2 세포 표면 모이어티를 발현하는 제2 세포를 포함하고;
b) 본 개시내용에 따른 방법을 사용하여 제1 및 제2 세포 표면 모이어티의 군집화 수준을 검출하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 검출된 군집화 수준을 시험 제제와 접촉하지 않거나 참조 제제와 접촉한 대조군 세포 배양물에서 군집화에 대해 검출된 군집화 수준을 비교하는 단계,
여기서 대조군 세포 배양물은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 이 방법은 대조군 세포 배양물에서의 군집화 수준과 동일하거나 더 높은 수준의 군집화를 유도하는 시험 제제를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
이 방법은 이미 알려진 것 외에 두 개 이상의 다른 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 가진 새로운, 추가 또는 대체 결합 분자를 식별하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 CD137, 또는 임의의 다른 면역 효과기 세포 공동 자극 모이어티, 및 PD-L1, 또는 임의의 다른 종양 관련 모이어티 또는 면역 체크포인트 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 추가 또는 대체 결합 분자를 식별하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 추가로 부품 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 방법에 따라 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 부품 키트는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 결합 분자, 임의로 여기서 결합 분자 중 하나는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고 다른 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고, 그리고 선택적으로 분자 태그의 절단을 유도하기 위해 적어도 2개의 결합 분자와 환자 샘플을 접촉시키기 위한 지침; 및 적어도 2개의 결합 분자와 환자 샘플을 접촉시킴으로써 유도된 신호를 측정하는 것을 포함한다.
다음은 본원에 기술된 방법의 특징에 대한 추가 설명이다. 명료하고 간결한 설명을 위해, 특징은 동일하거나 별도의 구현예의 일부로서 본원에서 설명되지만, 본 발명의 범위는 설명된 특징의 전부 또는 일부의 조합을 갖는 구현예를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 개시내용에 따른 방법은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 본 개시내용은 2개의 세포 표면 모이어티가 서로 근접해 있는지를 보여주기 위해 사용될 수 있는 방법을 추가로 제공한다. 사용된 검출 방법, 세포 표면 모이어티(중 하나)에 결합된 결합 분자로부터의 분자 태그의 방출은 또한 제1 및 제2 세포 표면 모이어티(의 복합체)의 발현의 정량화를 가능하게 한다.
특정 구현예에서, 본 개시내용에 따른 방법은 단일 샘플에서 제1 및 제2 세포 표면 모이어티의 검출 및/또는 정량화를 가능하게 한다. 이를 위해, 제1 세포 표면 모이어티를 결합하는 항체에 부착된 분자 태그는 제2 세포 표면 모이어티를 결합하는 항체에 부착된 분자 태그와 상이하다. 특정 구현예에서, 방법은 제1 및 제2 세포 모이어티가 특정 샘플에서 공동-발현되는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용의 특정 구현예에 따른 방법에서의 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, 또는 배양 세포일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 샘플은 대상체 또는 환자로부터의 조직 샘플, 혈액 샘플 또는 배양 세포이다. 대상체 또는 환자로부터의 조직 샘플은 신선한 샘플 또는 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE), 또는 달리 고정된 샘플일 수 있다. 상기 방법은 암을 앓는 대상체로부터의 종양 생검 샘플에서 제1 및 제2 세포 표면 모이어티 (클러스터)의 검출 및/또는 정량화에 특히 유용하다.
특정 구현예에서, 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티는 바람직하게는 상이한 모이어티이고 동일한 세포 유형, 예를 들어 종양 세포 또는 면역 세포, 동일한 세포 또는 상이한 세포상에서 발현될 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티는 바람직하게는 상이한 세포 유형에서 발현된다.
특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 2개 이상의 세포 표면 모이어티의 공동-발현을 측정하는 것이 관심있는, 및/또는 동일한 또는 별도의 세포에서 2개 이상의 세포 표면 모이어티의 군집화의 결정이 관심있는 임의의 적용에서 유용하다.
특정 구현예에서, 적어도 2개의 세포 표면 모이어티 중 하나는 바람직하게는 면역 효과기 세포, 특히 NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 호중구 과립구, 바람직하게는 T 세포상에서 발현된다.
특정 구현예에서, 적어도 2개의 세포 표면 모이어티 중 하나는 종양 또는 면역 세포 기원, 예를 들어 비제한적으로 종양 세포, B 세포, 골수 세포, 수지상 세포, 또는 호중구로부터 유래될 수 있는 세포상에서 발현된다.
특정 구현예에서, 적어도 2개의 세포 표면 모이어티 중 하나는 면역 효과기 세포, 특히 NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 호중구 과립구, 바람직하게는 T 세포상에서 발현되고, 적어도 2개의 세포 표면 모이어티 중 다른 하나는 종양 또는 면역 세포 기원, 예를 들어 비제한적으로 종양 세포, B 세포, 골수 세포, 수지상 세포, 또는 호중구로부터 유래될 수 있는 세포상에서 발현된다.
특정 구현예에서 면역 효과기 세포는 NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 호중구 과립구, 바람직하게는 T 세포일 수 있다.
특정 구현예에서, 면역 효과기 세포 공동자극 모이어티는 CD137, OX40, GITR, CD27, CD28, ICOS, CD40L 또는 LIGHT, 바람직하게는 CD137일 수 있다.
특정 구현예에서, 면역 체크포인트 모이어티 또는 종양 관련 모이어티는 PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, TIM3, CD47 또는 CD70, 바람직하게는 PD-L1로부터 선택될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 두 세포 표면 모이어티를 서로 근접하게 만드는 작용제에 반응하여 군집화되는 임의의 세포 표면 모이어티일 수 있다. 특정 구현예에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 동일할 수 있고 상기 방법은 작용제에 반응하여 이들 세포 표면 모이어티의 군집화, 예를 들어 이량체화 또는 삼량체화를 검출 및/또는 정량화하는 데 사용된다. 이것은 예를 들어 적어도 2개의 CD137 분자의 군집화에 대해 본 명세서에서 예시된다.
특정 구현예에서, 제1 세포 표면 모이어티는 CD137이고 제2 세포 표면 모이어티는 PD-L1이다.
HER2 동종이량체, 뿐만 아니라 HER1/HER2 이종이량체, HER2/HER3 이종이량체, HGF-c-Met 복합체, HER3-PI3K 복합체, PD-1-PD-L1 복합체를 측정하는 방법은 본 발명의 일부가 아니다.
본 개시내용은 따라서 본원에 기재된 바와 같은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플에서의 발현을 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하여, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 HER2; HER1 및 HER2; HER2 및 HER3; HGF 및 c-Met; HER3 및 PI3K; 또는 PD-1 및 PD-L1이 아니다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출 및/또는 정량화하는 방법을 제공하여, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 HER2; HER1 및 HER2; HER2 및 HER3; HGF 및 c-Met; HER3 및 PI3K; 또는 PD-1 및 PD-L1이 아니다.
본 개시내용의 방법의 특정 구현예에서, 샘플은 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 결합 분자와 접촉된다. 이들은 분석 결합 분자라고도 한다.
본 개시내용에 따른 방법의 특정 형식에서, 2개의 결합 분자가 각 모이어티에 대해 사용된다. 본 개시내용은 제1 결합 분자 및 제2 결합 분자로서 제1 세포 표면 모이어티에 결합하는 2개의 결합 분자를 지칭한다. 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 2개의 결합 분자는 본원에서 제3 결합 분자 및 제4 결합 분자로 지칭된다. 이들 결합 분자를 언급하는데 사용된 숫자는 결합 분자가 결합 특이성 및/또는 유용한 분석 형식의 예를 더욱 쉽게 시각화하기 위해 서로 다르다는 것을 나타낸다. 숫자는 특정 순서 또는 하나 이상의 결합 분자의 필수 존재를 나타내지 않는다. 또한, 1차 결합 분자 및 하나 이상의 2차 결합 분자를 사용하는 형식에서, 다른 결합 분자는 1차 결합 분자, 즉 세포 표면 모이어티에 직접 결합하는 결합 분자와 2차 결합 분자, 즉 분자 태그 또는 절단 유도 모이어티를 포함하는 결합 분자 사이에 존재할 수 있다.
본 개시내용에 따른 방법의 특정 형식에서, 제1 세포 표면 모이어티에 결합하는 2개의 결합 분자는 상이한 에피토프에 결합하는 결합 분자이고, 제1 세포 표면 모이어티에 대한 서로의 결합을 방해하지 않도록 선택된다. 유사하게, 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 2개의 결합 분자는 상이한 에피토프에 결합하는 결합 분자이고, 이들이 제2 세포 표면 모이어티에 대한 서로의 결합을 방해하지 않도록 선택된다. 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 결합 분자는 세포 표면 모이어티의 세포외 도메인에 결합할 수 있고; 그러나 그들이 세포 표면 모이어티의 세포 내 도메인에 결합하는 것도 가능하다. 이들의 조합도 가능하다. 예를 들어, 제1 세포 표면 모이어티에 결합하는 2개의 결합 분자는 그의 세포외 도메인으로 향할 수 있는 반면, 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 2개의 결합 분자는 그의 세포 내 도메인에 결합할 수 있거나; 또는 제1 세포 표면 모이어티에 결합하는 결합 분자 중 하나는 세포외 도메인에 결합할 수 있고 다른 하나는 그의 세포 내 도메인에 결합할 수 있고, 제2 세포 표면 모이어티에 대해서도 동일하거나; 또는 제1 세포 표면 모이어티에 결합하는 결합 분자 중 하나는 세포외 도메인에 결합할 수 있고 다른 하나는 그의 세포 내 도메인에 결합할 수 있는 반면, 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 결합 분자 둘 모두는 세포외 또는 세포내 도메인에 결합할 수 있거나 그 반대일 수 있다.
특정 구현예에서, 하나의 1차 결합 분자가 각 모이어티에 사용된다. 본 개시내용은 제1 결합 분자 및 제2 결합 분자로서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 2개의 1차 결합 분자를 지칭한다. 이들 결합 분자를 언급하는데 사용된 숫자는 결합 분자가 결합 특이성 및/또는 유용한 분석 형식의 예를 더욱 쉽게 시각화하기 위해 서로 다르다는 것을 나타낸다. 숫자는 특정 순서 또는 하나 이상의 결합 분자의 필수 존재를 나타내지 않는다. 그들은 또한 본 개시내용의 다른 구현 예와 관련하여 언급된 제1 및 제2 결합 분자와 동일할 것임을 나타내지 않는다. 또한, 1차 결합 분자 및 하나 이상의 2차 결합 분자를 사용하는 형식에서, 다른 결합 분자는 1차 결합 분자, 즉 세포 표면 모이어티에 직접 결합하는 결합 분자와 2차 결합 분자, 즉 분자 태그 또는 절단 유도 모이어티를 포함하는 결합 분자 사이에 존재할 수 있다.
특정 구현예에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 2개의 결합 분자는 상이한 세포 표면 모이어티에 결합하는 결합 분자이다. 제1 및 제2 결합 분자는 세포 표면 모이어티의 세포외 도메인에 결합할 수 있으며; 그러나 그들이 세포 표면 모이어티의 세포 내 도메인에 결합하는 것도 가능하다. 이들의 조합도 가능하다. 예를 들어, 제1 세포 표면 모이어티에 결합하는 결합 분자는 그의 세포외 도메인에 결합할 수 있는 반면, 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 결합 분자는 그의 세포내 도메인에 결합할 수 있거나 그 반대일 수 있다.
본 개시내용에 따른 방법의 특정 구현예에서 사용되는 결합 분자는 바람직하게는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 이러한 맥락에서, 제1 및 제2 세포 표면 모이어티는 항원으로 간주할 수 있다. 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 당업계에 공지되어 있고 다수의 상이한 항원에 대해 이용 가능하다. 상업적으로 이용 가능하거나 쉽게 생산할 수 있다. 이러한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 일반적으로 항원에 결합하지만 예를 들어 항원과 이의 리간드 사이의 상호작용을 차단하거나 세포 사멸 활성을 유도하는 것과 같은 생물학적 기능을 나타내지 않는다.
본 개시내용에 따른 방법의 특정 형식에서, 각각의 세포 표면 모이어티에 대한 1차 결합 분자 중 하나는 분자 태그 또는 절단 유도 모이어티를 포함한다. 본 개시내용의 방법의 특정 형식에서, 1차 결합 분자 중 하나는 분자 태그를 포함하고 다른 하나는 절단 유도 모이어티를 포함한다. 이러한 분자 태그 또는 절단 유도 모이어티는 당업계의 표준 기술을 사용하여 1차 결합 분자, 특히 항체에 부착될 수 있다. 일부 경우에 특정 결합 분자에 분자 태그 또는 절단 유도 모이어티를 부착하는 것이 어려울 수 있다. 이 경우, 분자 태그 또는 절단 유도 부분이 부착된 2차 결합 분자, 일반적으로 항체를 사용할 수 있다. 분자 태그 또는 절단 유도 모이어티를 포함하는 이러한 2차 결합 분자는 전형적으로 1차 결합 분자의 Fc 영역으로 향하고 일반적으로 상업적으로 이용 가능하다.
분자 태그는 감지할 수 있는 분자와 같은 모든 분자 모이어티일 수 있다. 특정 경우 방출 시, 분자 모이어티는 측정 가능한 신호를 제공한다. 분자 태그는 전기영동 이동성, 분자량, 모양, 용해도, pKa, 소수성, 전하, 전하/질량비, 및 극성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 부분과 구별되는 특성 중 하나 이상을 기준으로 선택될 수 있다. 이러한 특성 중 적어도 하나의 차이는 다중 세포 표면 모이어티가 단일 샘플에서 측정되는 분석에서 분자 태그의 분리를 허용한다. 특정 구현예에서, 분자 태그는 예를 들어 형광 표지, 발색성 표지, 방사성 표지 또는 전기화학적 표지와 같은 검출 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 형광 염료는 수용성 로다민 염료, 플루오레세인, 4,7-디클로로플루오레세인, 벤족산텐 염료 및 에너지 전달 염료를 포함하며, 이는 다음 참조 문헌에 개시되어 있다: Handbook of Molecular Probes and Research Reagents, 8th ed. (2002), Molecular Probes, Eugene, Oreg.; WO 2001/32783; 미국 특허 공개 번호 US 2002-0081616, US 2002-0086985; 및 Lee et al., 1997, Nucleic Acids Research 25:2816-2822. 적합한 분자 태그의 예는 VeraTag® 리포터 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. VeraTag® 리포터 분자는 당업계에 잘 알려졌다. 바람직한 분자 태그는 예를 들어 VeraTag® 리포터 분자 Pro11 및 Pro125이다. Pro11은 광-방출 가능 태그의 예이며, Pro125는 DTT-방출 가능 태그의 예이다. 다른 VeraTag® 분자는 예를 들어 미국 특허 공개 번호 US 2004-0166529; US 2004-0126818; US 2003-0013126; US 2005-0079565; 및 US 2011-0180408에 기술되어 있고, 이들 각각 및 거기에 인용된 참고문헌은 그 전체가 본원에 포함된다.
절단-유도 모이어티는 분자 태그가 절단 가능한 링커를 통해 부착되는 결합 분자로부터 분자 태그의 절단을 직접적으로 또는 간접적으로 유도할 수 있는 임의의 모이어티일 수 있다. 특정 구현예에서, 절단-유도 모이어티는 예를 들어 절단 가능한 링커를 절단할 수 있는 활성 종을 생성하는 모이어티다. 예시적인 활성 종은 일중항(singlet) 산소, 과산화수소, NADH, 및 히드록실 라디칼, 페녹시 라디칼, 슈퍼옥사이드 등을 포함한다. 산화를 일으키는 활성 종에 대한 예시적인 소광제는 폴리엔, 카로티노이드, 비타민 E, 비타민 C, 티로신, 히스티딘 및 글루타티온의 아미노산 피롤 N-접합체를 포함한다. 예를 들어, Beutner et al., 2000, Meth. Enzymol. 319:226-241 참조. 한 가지 예는 결합 분자에 접합된 비오틴이 스트렙타비딘-접합된 메틸렌 블루와 접촉하고 빛에 노출되어 절단 가능한 링커를 절단할 수 있는 일중항 산소를 방출하는 것이다.
특정 분석 형식에서, 분자 태그는 절단 가능한 링커를 통해 결합 분자에 부착된다. 절단 가능한 링커는 일중항 산소 또는 과산화수소에 의해 또는 DTT에 의해 절단될 수 있는 링커를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 절단 가능한 링커일 수 있다. DTT에 의해 절단될 수 있는 링커는 SS-링커이다. 절단 가능한 결합은 또한 염기-불안정성 결합, 광분해성 결합, 환원에 의해 절단 가능한 결합, 산화에 의해 절단된 결합, 산-불안정성 결합 및 특정 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩티드 결합과 같은 반응 혼합물 전체에 걸쳐 작동하는 제제에 불안정한 결합을 포함할 수 있다. 그러한 많은 연결을 설명하는 참고문헌은 Greene and Wuts, 1991, Protective Groups in Organic Synthesis, Second Edition, John Wiley & Sons, New York; Hennanson, 1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, New York; 및 미국 특허 공개 번호 US 2003-0119059를 포함한다.
결합 분자로부터의 분자 태그의 절단은 광유도 및 DTT-매개 방출의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법에 의해 유도될 수 있다. 광유도는 빛에 의해 활성화될 때 분자 산소를 일중항 산소로 변환하는 광흡수 분자의 활성화를 유도한다. DTT를 사용하여 절단을 유도하는 것은 환원에 의해 절단 가능하고 분자 태그를 결합 분자에 연결하는 디설파이드 링커의 DTT-유도 절단을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 방법에서 측정되는 신호는 방출된 분자 태그의 양이다. 본 개시내용의 방법의 특정 형식에서, 적어도 2개의 상이한 분자 태그가 사용된다. 특정 구현예에서 이들은 전기영동 또는 분자량, 형태, 용해도, pKa, 소수성, 전하, 전하/질량비, 및 극성 차이에 기초한 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 방법에 의해 검출 전에 분리될 수 있다. 검출 방법은 분자 태그에 따라 다르다.
본 개시내용의 맥락에서 "근접성"은 이에 부착된 분자 태그를 포함하는 결합 분자 및 절단-유도 부분을 포함하는 결합 분자가 절단-유도 부분에 의해 유도된 분자 태그의 절단을 허용하는 거리 내에 있음을 의미한다. VeraTag® 검정에서 이것은 약 1000 nm, 바람직하게는 서로 약 20-200 nm 또는 30-100 nm 이내이다. 근접성에 대한 다른 범위는 사용되는 분자 태그의 특성에 따라 적용되며, 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며 상업적으로 이용 가능한 태그, 소광제 및 리포터 모이어티의 공급자가 제공하는 정보이다. 본 개시내용에서 특정 근접 검정을 적용하기 위해 당업자에게 필요한 정보는 당업계에서 이용 가능하다. 예를 들어 Nathan P. 2020, Assay Guidance Manual, Compound-Mediated Assay Interferences in Homogenous Proximity Assays (본원에서 전체 내용이 참조로 포함됨)는 무엇보다도, 공여자와 수용자 형광단 사이의 최적 거리에 대한 설명을 포함하는 FRET 분석에서 사용할 수 있는 공여자 및 수용자 형광단에 대한 정보를 제공한다 (예를 들어 표 2 및 3 참조).
본 개시내용에 따른 방법은 단일 샘플에서 2개의 상이한 세포 표면 모이어티의 공동-발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 그로부터 얻은 지식은 환자의 치료 계획을 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 2개의 세포 표면 모이어티가 환자의 조직 또는 혈액 샘플에서 공동-발현되는 경우, 환자를 이들 2개의 세포 표면 모이어티를 표적으로 하는 작용제 또는 작용제들로 치료하는 것으로 결정할 수 있다. 이러한 상황의 한 가지 예는 암 환자의 종양 생검 샘플이 종양 세포에서 두 개의 종양 관련 항원의 동시 발현을 나타내는 경우이다. 그런 다음 환자는 이러한 종양 관련 항원에 결합하고 종양 관련 항원의 신호 전달 경로를 방해하고/하거나 T 세포 매개 종양 세포 사멸을 유도하는 하나 이상의 작용제로 성공적으로 치료될 수 있다. 환자의 종양 샘플이 이러한 종양 관련 항원의 동시 발현을 나타내지 않는 경우, 치료 의사는 환자가 이러한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 없다고 판단할 수 있다. 또 다른 상황은 예를 들어 종양 생검이 종양 세포에서 종양 관련 항원과 면역 효과기 세포에서 발현된 항원의 공동 발현을 나타내는 경우이다. 이것은 예를 들어 T 세포 및/또는 NK 세포와 같은 면역 효과기 세포가 종양 미세환경에 존재한다는 것을 나타낸다. 그러한 환자는 종양 세포에 근접하게 면역 세포를 가져오고/거나 종양 세포가 선택적으로 사멸되도록 면역 효과기 세포를 활성화시키는 작용제로 치료함으로써 이익을 얻을 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 따라서 2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 결합하는 작용제 또는 작용제들을 사용한 치료에 대한 환자, 바람직하게는 암 환자의 반응을 예측하는 데 사용될 수 있다.
2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 결합하는 작용제의 예는 예를 들어 다중특이적 항체이다. 이러한 다중특이적 항체는 두 세포 표면 모이어티에 동시에 결합하는 이중특이적 또는 삼중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 이러한 다중특이적 항체는 다중특이적 항체가 각각의 세포 표면 모이어티에 대한 단일 항원-결합 단편을 포함하도록 두 세포 표면 모이어티 모두에 대해 1가 결합을 나타낼 수 있다. 세포 표면 모이어티는 본원에 개시된 바와 같은 제1 및 제2 세포 표면 모이어티 중 임의의 것일 수 있다.
2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 결합하고 본 발명의 방법이 유용한 다중특이적 항체의 특정 예는 종양 세포 상의 PD-L1 및 T 세포 상의 CD137에 결합하는 다중특이적 항체이다. 이러한 다중특이적 항체는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 19, 23, 27, 30, 34, 38, 42, 45, 48, 또는 52 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는 CD137 결합 도메인을 포함할 수 있고, 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용한다. 특정 구현예에서, CD137 결합 도메인은 서열 번호 4, 8, 12, 16, 19, 23, 27, 30, 34, 38, 42, 45, 48, 또는 52 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함한다. CD137 결합 도메인은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 21, 25, 32, 36, 40, 44, 또는 50 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1), 및/또는 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 3, 7, 11, 15, 22, 26, 29, 33, 37, 41, 47, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CD137 결합 도메인은 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 21, 25, 32, 36, 40, 44, 또는 50 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1); 및/또는 서열 번호 3, 7, 11, 15, 22, 26, 29, 33, 37, 41, 47, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)을 포함할 수 있다. HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 모든 조합이 가능하다. 바람직한 CD137 결합 도메인은 서열 번호 2, 서열 번호 3, 및 서열 번호 4; 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8; 서열 번호 10, 서열 번호 11, 및 서열 번호 12; 서열 번호 14, 서열 번호 15, 및 서열 번호 16; 서열 번호 18, 서열 번호 3, 및 서열 번호 19; 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23; 서열 번호 25, 서열 번호 26, 및 서열 번호 27; 서열 번호 10, 서열 번호 29, 및 서열 번호 30; 서열 번호 32, 서열 번호 33, 및 서열 번호 34; 서열 번호 36, 서열 번호 37, 및 서열 번호 38; 서열 번호 40, 서열 번호 41, 및 서열 번호 42; 서열 번호 44, 서열 번호 41, 및 서열 번호 45; 서열 번호 2, 서열 번호 47, 및 서열 번호 48; 또는 서열 번호 50, 서열 번호 52, 및 서열 번호 52의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 조합을 포함한다. 이러한 다중특이적 항체의 CD137 결합 도메인은 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 20, 24, 28, 31, 35, 39, 43, 46, 또는 49 중 어느 하나를 갖는, 또는 그의 프레임워크 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%, 바람직하게는 95%, 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 다중특이적 항체의 CD137 결합 도메인은 또한 CH1 도메인을 포함한다. 임의의 CH1 도메인을 사용할 수 있다 적합한 CH1 도메인의 예는 서열 번호 116으로 제공되는 아미노산 서열에 의해 제공된다.
다중특이적 항체는 서열 번호 56, 58, 61, 72, 76, 80, 84, 88, 91, 95, 99, 102, 또는 106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는 PD-L1 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용한다. 특정 구현예에서, PD-L1 결합 도메인은 서열 번호 56, 58, 61, 72, 76, 80, 84, 88, 91, 95, 99, 102, 또는 106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함한다. PD-L1 결합 도메인은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는 서열 번호 54, 60, 65, 68, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 또는 93 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1), 및/또는 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 55, 3, 63, 66, 71, 75, 79, 83, 87, 94, 98, 101, 105, 또는 108 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, PD-L1 결합 도메인은 서열 번호 54, 60, 65, 68, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 또는 93 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1); 및/또는 서열 번호 55, 3, 63, 66, 71, 75, 79, 83, 87, 94, 98, 101, 105, 또는 108 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함한다. HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 모든 조합이 가능하다. 바람직한 PD-L1 결합 도메인은 서열 번호 54, 서열 번호 55, 및 서열 번호 56; 서열 번호 54, 서열 번호 55, 및 서열 번호 58; 서열 번호 60, 서열 번호 3, 및 서열 번호 61; 서열 번호 60, 서열 번호 63, 및 서열 번호 56; 서열 번호 65, 서열 번호 66, 및 서열 번호 56; 서열 번호 68, 서열 번호 55, 및 서열 번호 56; 서열 번호 70, 서열 번호 71, 및 서열 번호 72; 서열 번호 74, 서열 번호 75, 및 서열 번호 76; 서열 번호 78, 서열 번호 79, 및 서열 번호 80; 서열 번호 82, 서열 번호 83, 및 서열 번호 84; 서열 번호 86, 서열 번호 87, 및 서열 번호 88; 서열 번호 90, 서열 번호 79, 및 서열 번호 91; 서열 번호 93, 서열 번호 94, 및 서열 번호 95; 서열 번호 68, 서열 번호 55, 및 서열 번호 56; 서열 번호 70, 서열 번호 98, 및 서열 번호 99; 서열 번호 93, 서열 번호 101, 및 서열 번호 102; 서열 번호 74, 서열 번호 105, 및 서열 번호 106; or 서열 번호 86, 서열 번호 108, 및 서열 번호 88의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 조합을 포함한다. 이러한 다중특이적 항체의 PD-L1 결합 도메인은 서열 번호 53, 57, 59, 62, 64, 67, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 92, 96, 97, 100, 103, 104, 또는 107 중 어느 하나를 갖는, 또는 그의 프레임워크 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 바람직하게는 95%, 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 다중특이적 항체의 PD-L1 결합 도메인은 또한 CH1 도메인을 포함한다. 임의의 CH1 도메인을 사용할 수 있다. 적합한 CH1 도메인의 예는 서열 번호 116으로 제공되는 아미노산 서열에 의해 제공된다.
특정 구현예에서, 다중특이적 항체는 본원에 개시된 바와 같은 CD137 및 PD-L1 결합 도메인의 임의의 조합을 포함할 수 있다, 예를 들어 표 1 참조. 하나의 이러한 다중특이적 항체는 MCLA-145이다.
특정 구현예에서, 다중특이적 항체는 임의의 경쇄를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 경쇄의 예는 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 111에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1), 및/또는 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 112에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 111에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1); 및/또는 서열 번호 112에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2)를 포함한다. 다중특이적 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 110을 갖는 경쇄 가변 영역, 그의 프레임워크 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 다중특이적 항체의 경쇄는 또한 CL 도메인을 포함한다. 임의의 CL 도메인을 사용할 수 있다. 적합한 CL 도메인의 예는 서열 번호 115로 제공된 아미노산 서열에 의해 제공된다.
특정 구현예에서, 다중특이적 항체는 Fc 영역 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 Fc 영역은 예를 들어, Fc 효과기 기능을 제거하거나 감소시키는 변형, 및/또는 상이한 CH3 도메인의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 변형을 포함할 수 있다. 임의의 Fc 영역이 사용될 수 있다. 적합한 Fc 영역의 예는 서열 번호 116-120으로 제공된 아미노산 서열에 의해 제공된다.
본 개시내용에 따른 방법은 단일 샘플에서 적어도 2개의 상이한 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출하기 위해 사용될 수 있고, 본 개시내용에 따르면, 특히 군집화가 적어도 2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 제제에 의해 유도될 때이다. 그로부터 얻은 지식은 환자가 2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제로의 치료로부터 이익을 얻고 있는지, 따라서 치료가 지속, 조정 또는 종료되는지를 결정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 치료제가 투여되었지만 군집화가 관찰되지 않거나 특정 임계값 수준 미만이면 치료를 종료하는 것으로 결정할 수 있다. 또는 일부 군집화가 관찰되지만 원하는 수준이 아닌 경우 치료 용량 및/또는 치료 간격을 늘리도록 결정할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시내용에 따른 방법은 따라서 특정 치료에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 방법으로 간주될 수 있다.
2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제의 예는 예를 들어 다중특이적 항체이다. 이러한 다중특이적 항체는 두 세포 표면 모이어티에 동시에 결합하는 이중특이적 또는 삼중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 이러한 다중특이적 항체는 다중특이적 항체가 각각의 세포 표면 모이어티에 대한 단일 항원-결합 단편을 포함하도록 두 세포 표면 모이어티 모두에 대해 1가 결합을 나타낼 수 있다. 본 개시내용의 방법은 2개 이상의 세포 표면 모이어티가 이들 2개 이상의 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 의해 군집화되는 임의의 상황에서 사용될 수 있다. 따라서 2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제는 임의의 세포 표면 모이어티, 예를 들어 본원에 개시된 것과 결합할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
2개의 상이한 세포 표면 모이어티에 결합하고 본 발명의 방법이 유용한 다중특이적 항체의 특정 예는 종양 세포 상의 PD-L1 및 T 세포 상의 CD137에 결합하는 다중특이적 항체이다. 이러한 다중특이적 항체는 서열 번호 4, 8, 12, 16, 19, 23, 27, 30, 34, 38, 42, 45, 48, 또는 52 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는 CD137 결합 도메인을 포함할 수 있고, 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용한다. 특정 구현예에서, CD137 결합 도메인은 서열 번호 4, 8, 12, 16, 19, 23, 27, 30, 34, 38, 42, 45, 48, 또는 52 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함한다. CD137 결합 도메인은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 21, 25, 32, 36, 40, 44, 또는 50 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1), 및/또는 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 3, 7, 11, 15, 22, 26, 29, 33, 37, 41, 47, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, CD137 결합 도메인은 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 21, 25, 32, 36, 40, 44, 또는 50 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1); 및/또는 서열 번호 3, 7, 11, 15, 22, 26, 29, 33, 37, 41, 47, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함한다. HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 모든 조합이 가능하다. 바람직한 CD137 결합 도메인은 서열 번호 2, 서열 번호 3, 및 서열 번호 4; 서열 번호 6, 서열 번호 7, 및 서열 번호 8; 서열 번호 10, 서열 번호 11, 및 서열 번호 12; 서열 번호 14, 서열 번호 15, 및 서열 번호 16; 서열 번호 18, 서열 번호 3, 및 서열 번호 19; 서열 번호 21, 서열 번호 22, 및 서열 번호 23; 서열 번호 25, 서열 번호 26, 및 서열 번호 27; 서열 번호 10, 서열 번호 29, 및 서열 번호 30; 서열 번호 32, 서열 번호 33, 및 서열 번호 34; 서열 번호 36, 서열 번호 37, 및 서열 번호 38; 서열 번호 40, 서열 번호 41, 및 서열 번호 42; 서열 번호 44, 서열 번호 41, 및 서열 번호 45; 서열 번호 2, 서열 번호 47, 및 서열 번호 48; 또는 서열 번호 50, 서열 번호 52, 및 서열 번호 52의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 조합을 포함한다. 이러한 다중특이적 항체의 CD137 결합 도메인은 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 20, 24, 28, 31, 35, 39, 43, 46, 또는 49 중 어느 하나를 갖거나, 또는 그의 프레임워크 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 바람직하게는 95%, 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 다중특이적 항체의 CD137 결합 도메인은 또한 CH1 도메인을 포함한다. 임의의 CH1 도메인을 사용할 수 있다. 적합한 CH1 도메인의 예는 서열 번호 116으로 제공되는 아미노산 서열에 의해 제공된다.
다중특이적 항체는 서열 번호 56, 58, 61, 72, 76, 80, 84, 88, 91, 95, 99, 102, 또는 106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는 PD-L1 결합 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용한다. 특정 구현예에서, PD-L1 결합 도메인은 아미노산 서열을 갖는 서열 번호 56, 58, 61, 72, 76, 80, 84, 88, 91, 95, 99, 102, 또는 106 중 어느 하나에 제시된 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함한다. PD-L1 결합 도메인은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 54, 60, 65, 68, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 또는 93 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1), 및/또는 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 55, 3, 63, 66, 71, 75, 79, 83, 87, 94, 98, 101, 105, 또는 108 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, PD-L1 결합 도메인은 서열 번호 54, 60, 65, 68, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 또는 93 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1); 및/또는 서열 번호 55, 3, 63, 66, 71, 75, 79, 83, 87, 94, 98, 101, 105, 또는 108 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함한다. HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 모든 조합이 가능하다. 바람직한 PD-L1 결합 도메인은 서열 번호 54, 서열 번호 55, 및 서열 번호 56; 서열 번호 54, 서열 번호 55, 및 서열 번호 58; 서열 번호 60, 서열 번호 3, 및 서열 번호 61; 서열 번호 60, 서열 번호 63, 및 서열 번호 56; 서열 번호 65, 서열 번호 66, 및 서열 번호 56; 서열 번호 68, 서열 번호 55, 및 서열 번호 56; 서열 번호 70, 서열 번호 71, 및 서열 번호 72; 서열 번호 74, 서열 번호 75, 및 서열 번호 76; 서열 번호 78, 서열 번호 79, 및 서열 번호 80; 서열 번호 82, 서열 번호 83, 및 서열 번호 84; 서열 번호 86, 서열 번호 87, 및 서열 번호 88; 서열 번호 90, 서열 번호 79, 및 서열 번호 91; 서열 번호 93, 서열 번호 94, 및 서열 번호 95; 서열 번호 68, 서열 번호 55, 및 서열 번호 56; 서열 번호 70, 서열 번호 98, 및 서열 번호 99; 서열 번호 93, 서열 번호 101, 및 서열 번호 102; 서열 번호 74, 서열 번호 105, 및 서열 번호 106; 또는 서열 번호 86, 서열 번호 108, 및 서열 번호 88의 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3의 조합을 포함한다. 이러한 다중특이적 항체의 PD-L1 결합 도메인은 서열 번호 53, 57, 59, 62, 64, 67, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 92, 96, 97, 100, 103, 104, 또는 107 중 어느 하나를 갖거나, 또는 그의 프레임워크에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 바람직하게는 95%, 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 다중특이적 항체의 PD-L1 결합 도메인은 또한 CH1 도메인을 포함한다. 임의의 CH1 도메인을 사용할 수 있다. 적합한 CH1 도메인의 예는 서열 번호 116으로 제공되는 아미노산 서열에 의해 제공된다.
특정 구현예에서, 다중특이적 항체는 본원에 개시된 바와 같은 CD137 및 PD-L1 결합 도메인의 임의의 조합을 포함할 수 있다, 예를 들어 표 1 참조. 하나의 이러한 다중특이적 항체는 MCLA-145이다.
특정 구현예에서, 다중특이적 항체는 임의의 경쇄를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 경쇄의 예는 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용한다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 113에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함한다. 경쇄 가변 영역은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 111에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1), 및/또는 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 112에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2)을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 서열 번호 111에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR1 (LCDR1); 및/또는 서열 번호 112에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 CDR2 (LCDR2)를 포함한다. 다중특이적 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 번호 110을 갖거나: 그의 프레임워크 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 다중특이적 항체의 경쇄는 또한 CL 도메인을 포함한다. 임의의 CL 도메인을 사용할 수 있다. 적합한 CL 도메인의 예는 서열 번호 115로 제공된 아미노산 서열에 의해 제공된다.
특정 구현예에서, 다중특이적 항체는 Fc 영역 또는 이의 일부를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 Fc 영역은 당업계에 공지된 임의의 변형, 예를 들어 Fc 효과기 기능을 제거하거나 감소시키는 변형 및/또는 상이한 CH3 도메인의 이종이량체화를 촉진하는 변형을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 임의의 Fc 영역이 사용될 수 있다. 적합한 Fc 영역의 예는 서열 번호 116-120으로 제공된 아미노산 서열에 의해 제공된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
본원에서 사용된 바와 같이, "구성하다" 및 그의 활용형은 비제한적인 의미로 단어 뒤에 오는 항목이 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 항목이 제외되지 않는다는 의미로 사용된다.
관사 "a" 및 "an"은 본원에서 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 둘 이상 (즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로써, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본원에서 특허 문서 또는 기타 문제에 대한 언급은 해당 문서 또는 문제가 알려졌거나 여기에 포함된 정보가 청구 범위의 우선일에 일반적인 일반 지식의 일부였다는 것을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고문헌은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 하기 실시예에서 예시된다. 이들 예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 -VeraTag® 검정을 위한 세포 펠렛의 제조
T75 플라스크를 PBS 중 2 μg/mL 항-CD3 (클론 OKT3, eBioscience, cat no 16-0037-85)로 밤새 코팅하였다. 다음으로, CD137을 발현하는 저캇 T 세포 (저캇_CD137K)를 50 mL 배지 (9% FBS-HI RPMI 1640, 2 mM L-글루타민)에서 1.8Х106 세포/mL의 농도로 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음 저캇 세포를 50 mL 배지 (저캇에서 CHO로)에서 0.45Х106 세포/mL의 농도로 PD-L1을 발현하는 CHO-K1 세포 (CHO-PD-L1)와 공동 배양하였다. 세포를 4시간 동안 상호작용하도록 한 다음, CD137 및 PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체, 항-CD137 양성 대조군 항체 또는 RSV에 결합하는 음성 대조군 항체 (10 μg/mL)를 추가로 2시간 동안 첨가하였다. 그런 다음 재현탁 및 스크래핑에 의해 플라스크로부터 세포를 수집하고 다음과 같이 고정시켰다: 1,200 rpm (125 x g), 4℃에서 10분 동안 원심분리한 후, 배지를 붓고 세포 펠렛을 느슨하게 하고 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁시켰다. 원심분리를 2회 반복하여 PBS를 붓고 세포 펠렛을 볼텍싱하여 느슨하게 했다. 두 번째 세척 후, 펠렛을 30 mL 10% 중성 완충 포르말린 (10% NBF, 카탈로그 번호 5701, Thermo Fisher Scientific)에 재현탁하고 4℃에서 밤새 부드럽게 회전시켰다. 1,500 rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리한 후, 포르말린을 제거하고 세포 펠렛을 80% 에탄올에 25Х106 세포/mL로 재현탁하고 이전에 설명한 대로 처리하기 전에 4℃에서 보관했다 (Shi et al, 2009).
CD137 및 PD-L1에 결합하는 적합한 이중특이적 항체는 예를 들어 본원에 구체적으로 개시된 것들이다.
실시예 2 - PD-L1 발현 VeraTag® 검정
실시예 1에서 제조된 세포 펠렛을 이 검정에 사용하였다. 4.5x105 세포를 양전하를 띤 유리 슬라이드 (FisherScientific)에 놓고 아래에 간략하게 설명된 대로 VeraTag® 기술을 사용하여 분석했다.
항원 회수는 압력솥 (Biocare Medical)을 사용하여 열을 통해 수행되었다. 항원 회수 후, 항체 쌍을 추가하고, DTT-매개 방출 형광 VeraTag를 모세관 전기영동으로 검출했다. 방출된 VeraTag는 4.5x105 세포 당 상대 형광 단위를 제공하기 위해 샘플 완충액 부피로 정규화되었다.
사용된 항체는 항-PD-L1 토끼 mAb E1L3N (Cell Signaling Technology cat#13684) 및 이황화 결합을 통해 형광 VeraTag® 리포터로 표지된 염소 항-토끼 IgG(H+L) (Southern Biotech cat#4052-01)의 펩신 분해물이다. 이소형 대조군 실험에서, PD-L1 항체는 토끼 IgG (Cell Signaling Technology cat#3900)로 대체된다.
결과는 도 9에 나타낸다. VeraTag® 검정은 PD-L1의 발현 수준을 검출하는 데 적합한 수단으로 보인다. 비슷한 양의 PD-L1이 세 샘플 모두에서 측정되었다.
실시예 3 - CD137 발현 VeraTag® 검정
실시예 1에서 제조된 세포 펠렛을 이 검정에 사용하였다. 4.5x105 세포를 양전하를 띤 유리 슬라이드 (FisherScientific)에 놓고 아래에 간략하게 설명된 대로 VeraTag® 기술을 사용하여 분석했다.
항원 회수는 압력솥 (Biocare Medical)을 사용하여 열을 통해 수행되었다. 항원 회수 후, 항체 쌍을 추가하고, DTT-매개 방출 형광 VeraTag를 모세관 전기영동으로 검출했다. 방출된 VeraTag는 4.5x105 세포 당 상대 형광 단위를 제공하기 위해 샘플 완충액 부피로 정규화되었다.
2개의 상이한 1차 항체를 평가하였다: 항-CD137 마우스 mAb M127 (BD Pharmingen cat#552532) 및 항-CD137 마우스 mAb BBK2 (ThermoFisher cat#MS-621). VeraTag에 접합된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch cat#115-005-146)가 1차 항체와 쌍을 이루었다. 이소형 대조군 실험에서, CD137 항체는 마우스 IgG (BD Pharmingen cat#554121)로 대체된다.
결과는 도 10에 나타낸다. VeraTag® 검정은 CD137의 발현 수준을 검출하는 데 적합한 수단으로 보인다. 유사한 양의 CD137이 2개의 1차 검정 항체에 대해 3개의 샘플 모두에서 측정되었다.
실시예 4 - CD137 군집화 VeraTag® 검정
실시예 1에서 제조된 세포 펠렛을 이 검정에 사용하였다. 4.5x105 세포를 양전하를 띤 유리 슬라이드 (FisherScientific)에 놓고 아래에 간략하게 설명된 대로 VeraTag® 기술을 사용하여 분석했다.
항원 회수는 압력솥 (Biocare Medical)을 사용하여 열을 통해 수행되었다. 항원 회수 후, 항체 쌍을 추가하고, DTT-매개 방출 형광 VeraTag를 모세관 전기영동으로 검출했다. 방출된 VeraTag는 4.5x105 세포 당 상대 형광 단위를 제공하기 위해 샘플 완충액 부피로 정규화되었다.
2개의 상이한 1차 항체를 평가하였다: 항-CD137 마우스 mAb M127 (BD Pharmingen cat#552532) 및 항-CD137 마우스 mAb BBK2 (ThermoFisher cat#MS-621). 동일한 농도의 항-CD137 항체를 형광 VeraTag 리포터 또는 비오틴으로 표지했다.
결과는 도 11에 나타낸다. VeraTag® 검정은 CD137의 군집화를 검출하는 데 적합한 수단으로 보인다. VeraTag® 신호는 BBK 항체가 M127 항체에 비해 1차 분석 항체로 사용될 때 더 강하게 나타난다.
실시예 5 - CD137-PD-L1 근접성 VeraTag® 검정
실시예 1에서 제조된 세포 펠렛을 이 검정에 사용하였다. 4.5x105 세포를 양전하를 띤 유리 슬라이드 (FisherScientific)에 놓고 아래에 간략하게 설명된 대로 VeraTag® 기술을 사용하여 분석했다.
항원 회수는 압력솥 (Biocare Medical)을 사용하여 열을 통해 수행되었다. 항원 회수 후, 항체 쌍을 추가하고, DTT-매개 방출 형광 VeraTag를 모세관 전기영동으로 검출했다. 방출된 VeraTag는 4.5x105 세포 당 상대 형광 단위를 제공하기 위해 샘플 완충액 부피로 정규화되었다.
CD137-PD-L1 근접성은 항-CD137 마우스 mAb M127 (BD Pharmingen cat#552532, 엑토도메인) 또는 항-PD-L1 토끼 mAb E1L3N (Cell Signaling Technology cat#13684, c-말단)과 페어링된 마우스 mAb BBK2 (ThermoFisher cat#MS-621, 엑토도메인) 및 비오티닐화된 염소 항-토끼 IgG 2차 항체 (Rockland Immunochemicals cat#611-101-122)로부터 VeraTag 리포터의 근접 의존적 방출에 의해 측정되었다. 이소형 대조군 실험에서, PD-L1 항체는 토끼 IgG (Cell Signaling Technology cat#3900)로 대체된다. 결과는 도 12에 나타낸다. VeraTag® 검정은 CD137-PD-L1 복합체를 검출하는 데 적합한 수단으로 보인다. 샘플 B는 1차 검정 항체 모두에 대해 가장 강한 VeraTag 신호를 나타낸다. 이는 CD137xPD-L1 이중특이적 항체가 CD137 및 PD-L1에 동시에 결합하고 이러한 항원을 군집화하므로, 세포가 이러한 항원을 발현함을 나타낸다.
서열
서열 번호 1: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNFAMNWVRRAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVNTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDWGVIGGHYMDVWGKGTTVTVSS
서열 번호 2: 서열 번호 1의 KABAT에 따른 HCDR1
NFAMN
서열 번호 3: 서열 번호 1의 KABAT에 따른 HCDR2
WINTNTGNPTYAQGFTG
서열 번호 4: 서열 번호 1의 KABAT에 따른 HCDR3
DWGVIGGHYMDV
서열 번호 5: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDSDGYGPKAFDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 6: 서열 번호 5의 KABAT에 따른 HCDR1
SYGIS
서열 번호 7: 서열 번호 5의 KABAT에 따른 HCDR2
WISAYNGNTNYAQKLQG
서열 번호 8: 서열 번호 5의 KABAT에 따른 HCDR3
DSDGYGPKAFDY
서열 번호 9: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPDDSDTRYSPSFQGQVTISADKSSSTAYLQWSSLKASDTAMYYCASFYTGIVGATGAFDVWGQGTTVTVSS
서열 번호 10: 서열 번호 9의 KABAT에 따른 HCDR1
SYWIG
서열 번호 11: 서열 번호 9의 KABAT에 따른 HCDR2
IIYPDDSDTRYSPSFQG
서열 번호 12: 서열 번호 9의 KABAT에 따른 HCDR3
FYTGIVGATGAFDV
서열 번호 13: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSDAISWVRQAPGQGLEWMGGMIPILGTANYAQKFQGRVTITADRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCVRGATYYYGSGTYYSINWFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 14: 서열 번호 13의 KABAT에 따른 HCDR1
SDAIS
서열 번호 15: 서열 번호 13의 KABAT에 따른 HCDR2
GMIPILGTANYAQKFQG
서열 번호 16: 서열 번호 13의 KABAT에 따른 HCDR3
GATYYYGSGTYYSINWFDP
서열 번호 17: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCRASGYTFTNFAMTWVRQAPGQGPEYMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVNTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDWASVMVRGDLDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 18: 서열 번호 17의 KABAT에 따른 HCDR1
NFAMT
서열 번호 19: 서열 번호 17의 KABAT에 따른 HCDR3
DWASVMVRGDLDY
서열 번호 20: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLSELSIHWVRQAPGKGVEWMGGFYPEDVEPIYARKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELNSLRSEDTAVYYCAAEGFDNYGSGIRGNWFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 21: 서열 번호 20의 KABAT에 따른 HCDR1
ELSIH
서열 번호 22: 서열 번호 20의 KABAT에 따른 HCDR2
GFYPEDVEPIYARKFQG
서열 번호 23: 서열 번호 20의 KABAT에 따른 HCDR3
EGFDNYGSGIRGNWFDP
서열 번호 24: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQSPGKGLEWMGSFYPEDGETIYAQKFQGRITMTEDTSADTAYMELSSLRSEDTAVYYCATEGVGVIRGNWFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 25: 서열 번호 24의 KABAT에 따른 HCDR1
ELSMH
서열 번호 26: 서열 번호 24의 KABAT에 따른 HCDR2
SFYPEDGETIYAQKFQG
서열 번호 27: 서열 번호 24의 KABAT에 따른 HCDR3
EGVGVIRGNWFDP
서열 번호 28: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIFPDDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKPSDTAMYYCVRLGGYSGYAEDFVDFWGQGTLVTVSS
서열 번호 29: 서열 번호 28의 KABAT에 따른 HCDR2
IIFPDDSDTRYSPSFQG
서열 번호 30: 서열 번호 28의 KABAT에 따른 HCDR3
LGGYSGYAEDFVDF
서열 번호 31: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTKLSMHWVRQAPGKGLEWMGGFEPEDGETINAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATDLRLGASYYYSYMDVWGRGTMVTVSS
서열 번호 32: 서열 번호 31의 KABAT에 따른 HCDR1
KLSMH
서열 번호 33: 서열 번호 31의 KABAT에 따른 HCDR2
GFEPEDGETINAQKFQG
서열 번호 34: 서열 번호 31의 KABAT에 따른 HCDR3
DLRLGASYYYSYMDV
서열 번호 35: 중쇄 가변 영역
QITLKESGPTLVKPTQTLTLSCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLALIYWNDDKYFSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTLTNMDPVDTATYYCAHTLWGSDDVFDVWGQGTMVTVSS
서열 번호 36: 서열 번호 35의 KABAT에 따른 HCDR1
TSGMSVG
서열 번호 37: 서열 번호 35의 KABAT에 따른 HCDR2
LIYWNDDKYFSPSLKS
서열 번호 38: 서열 번호 35의 KABAT에 따른 HCDR3
TLWGSDDVFDV
서열 번호 39: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKVSGYSFTNYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWHTLKASDTAMYYCARHQGYSFSGSHIDDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 40: 서열 번호 39의 KABAT에 따른 HCDR1
NYWIG
서열 번호 41: 서열 번호 39의 KABAT에 따른 HCDR2
IIYPGDSDTRYSPSFQG
서열 번호 42: 서열 번호 39의 KABAT에 따른 HCDR3
HQGYSFSGSHIDDY
서열 번호 43: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVRKPGESLKISCKGSGYSFTTYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTVYLQWSSLKASDTAMYYCARHAGFIITSQNIDDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 44: 서열 번호 43의 KABAT에 따른 HCDR1
TYWIG
서열 번호 45: 서열 번호 43의 KABAT에 따른 HCDR3
HAGFIITSQNIDDY
서열 번호 46: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNFAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQDFTGRFVFSLDTSGNTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDWGLVAIGYFDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 47: 서열 번호 46의 KABAT에 따른 HCDR2
WINTNTGNPTYAQDFTG
서열 번호 48: 서열 번호 46의 KABAT에 따른 HCDR3
DWGLVAIGYFDY
서열 번호 49: 중쇄 가변 영역
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTTGVGVNWIRQPPGEALEWLALIYWNDDTYYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHEGIIGFLGGNWFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 50: 서열 번호 49의 KABAT에 따른 HCDR1
TTGVGVN
서열 번호 51: 서열 번호 49의 KABAT에 따른 HCDR2
LIYWNDDTYYSPSLKS
서열 번호 52: 서열 번호 49의 KABAT에 따른 HCDR3
EGIIGFLGGNWFDP
서열 번호 53: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSHAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGQGTLVTVSS
서열 번호 54: 서열 번호 53의 KABAT에 따른 HCDR1
SHAMN
서열 번호 55: 서열 번호 53의 KABAT에 따른 HCDR2
WINPNTGNPTYAQGFTG
서열 번호 56: 서열 번호 53의 KABAT에 따른 HCDR3
DRKYVTNWVFAEDFQH
서열 번호 57: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSHAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAIDRGYMSNWVFAEYFPHWGQGTLVTVSS
서열 번호 58: 서열 번호 57의 KABAT에 따른 HCDR3
DRGYMSNWVFAEYFPH
서열 번호 59: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCATDRGYISSWVFAEDFQHWGQGTLVTVSS
서열 번호 60: 서열 번호 59의 KABAT에 따른 HCDR1
SYAMN
서열 번호 61: 서열 번호 59의 KABAT에 따른 HCDR3
DRGYISSWVFAEDFQH
서열 번호 62: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCTASGYTFTSYAMNWVRQAPGQRLEWMACVNPNTGSPTYAQGSTGRFVVSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGHGTLVTVSS
서열 번호 63: 서열 번호 62의 KABAT에 따른 HCDR2
CVNPNTGSPTYAQGSTG
서열 번호 64: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAPGQGLEWMGWMNPNTGNPTYAQGSTGRFVVSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGRGTLVTVSS
서열 번호 65: 서열 번호 64의 KABAT에 따른 HCDR1
NYAMN
서열 번호 66: 서열 번호 64의 KABAT에 따른 HCDR2
WMNPNTGNPTYAQGSTG
서열 번호 67: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAINWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGRGTLVTVSS
서열 번호 68: 서열 번호 67의 KABAT에 따른 HCDR1
NYAIN
서열 번호 69: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFNTYSITWVRQAPGQGLEWMGSIVPIFGTINNAQKFQGRVTITADKSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDNTMVRGVDYYYMDVWGKGTMVTVSS
서열 번호 70: 서열 번호 69의 KABAT에 따른 HCDR1
TYSIT
서열 번호 71: 서열 번호 69의 KABAT에 따른 HCDR2
SIVPIFGTINNAQKFQG
서열 번호 72: 서열 번호 69의 KABAT에 따른 HCDR3
DNTMVRGVDYYYMDV
서열 번호 73: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGIFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTPNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMDLSSLRSEDTAVYYCAKNVRGYSAYDLDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 74: 서열 번호 73의 KABAT에 따른 HCDR1
TYAIS
서열 번호 75: 서열 번호 73의 KABAT에 따른 HCDR2
GIIPIFDTPNYAQKFQG
서열 번호 76: 서열 번호 73의 KABAT에 따른 HCDR3
NVRGYSAYDLDY
서열 번호 77: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKNPGSSVKVSCKATGGTFNTYGTNWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTTTAYMEVSSLRSEDTAVYYCARGGADMGTLDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 78: 서열 번호 77의 KABAT에 따른 HCDR1
TYGTN
서열 번호 79: 서열 번호 77의 KABAT에 따른 HCDR2
GIIPIFGTANYAQKFQG
서열 번호 80: 서열 번호 77의 KABAT에 따른 HCDR3
GGADMGTLDY
서열 번호 81: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVMRPGSSVKVSCKASGGIFNTYTIIWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTPNFAQKFQGRLTITADKSTNTAYMELTSLRSEDTAVYYCAREGCNHGVCYPYWGQGTLVTVSS
서열 번호 82: 서열 번호 81의 KABAT에 따른 HCDR1
TYTII
서열 번호 83: 서열 번호 81의 KABAT에 따른 HCDR2
GIIPIFDTPNFAQKFQG
서열 번호 84: 서열 번호 81의 KABAT에 따른 HCDR3
EGCNHGVCYPY
서열 번호 85: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFRSYGITWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQKFQGRVTITADKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRRGYSNPHWLDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 86: 서열 번호 85의 KABAT에 따른 HCDR1
SYGIT
서열 번호 87: 서열 번호 85의 KABAT에 따른 HCDR2
GIIPIFGTTNYAQKFQG
서열 번호 88: 서열 번호 85의 KABAT에 따른 HCDR3
RRGYSNPHWLDP
서열 번호 89: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGILWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADISTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGNYYEFVYWGQGTLVTVSS
서열 번호 90: 서열 번호 89의 KABAT에 따른 HCDR1
TYGIL
서열 번호 91: 서열 번호 89의 KABAT에 따른 HCDR3
GGGNYYEFVY
서열 번호 92: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFNTYAINWVRQAPGQGLEWVGRIIPIFDTANYAQKFQGRVTISADKSTTTAYMELSSLRSEDTAVFYCAKDETGYSSSNFQHWGQGTLVTVSS
서열 번호 93: 서열 번호 92의 KABAT에 따른 HCDR1
TYAIN
서열 번호 94: 서열 번호 92의 KABAT에 따른 HCDR2
RIIPIFDTANYAQKFQG
서열 번호 95: 서열 번호 92의 KABAT에 따른 HCDR3
DETGYSSSNFQH
서열 번호 96: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAINWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRKYVTNWVFAEDFQHWGQGTLVTVSS
서열 번호 97: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGAEVKRPGSSVKVSCKASGGTFNTYSITWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTSKYAQKFQDRVTITADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPSFSSSSGWFDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 98: 서열 번호 97의 KABAT에 따른 HCDR2
GIIPVFGTSKYAQKFQD
서열 번호 99: 서열 번호 97의 KABAT에 따른 HCDR3
DPSFSSSSGWFDP
서열 번호 100: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNTYAINWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQRFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCAKDQTGYSSTLFDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 101: 서열 번호 100의 KABAT에 따른 HCDR2
GIIPIFDTANYAQRFQG
서열 번호 102: 서열 번호 100의 KABAT에 따른 HCDR3
DQTGYSSTLFDY
서열 번호 103: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTSHAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAIDRGYMSNWVFAEYFPHWGQGTLVTVSS
서열 번호 104: 중쇄 가변 영역
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGWIIPIFDTGNYAQKIQGRVTITADKSTSTAYMELTSLRSEDTAVYYCARHDYTNTVDAFDIWGQGTMVTVSS
서열 번호 105: 서열 번호 104의 KABAT에 따른 HCDR2
WIIPIFDTGNYAQKIQG
서열 번호 106: 서열 번호 104의 KABAT에 따른 HCDR3
HDYTNTVDAFDI
서열 번호 107: 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFRSYGITWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTTNYAQKFQGRVTITADKSTSTVFMELNSLRSEDTAVYYCARRRGYSNPHWLDPWGQGTLVTVSS
서열 번호 108: 서열 번호 107의 KABAT에 따른 HCDR2
GIIPVFGTTNYAQKFQG
서열 번호 109: 인간 공통 경쇄 IGKV1-39/jk1의 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열 번호 110: 공통 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTKVEIK
서열 번호 111: 서열 번호 100의 KABAT에 따른 LCDR1
RASQSISSYLN
서열 번호 112: 서열 번호 100의 KABAT에 따른 LCDR2
AASSLQS
서열 번호 113: 서열 번호 100의 KABAT에 따른 LCDR3
QQSYSTPPT
서열 번호 114: 공통 경쇄 불변 도메인의 아미노산 서열
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열 번호 115: 경쇄 불변 도메인의 아미노산 서열
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
서열 번호 116: CH1의 아미노산 서열
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
서열 번호 117: 힌지의 아미노산 서열
EPKSCDKTHTCPPCP
서열 번호 118: CH2의 아미노산 서열
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
서열 번호 119: KK 돌연변이를 갖는 CH3의 아미노산 서열
GQPREPQVYTKPPSREEMTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 120: DE 돌연변이를 갖는 CH3의 아미노산 서열
GQPREPQVYTDPPSREEMTKNQVSLTCEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQUENCE LISTING <110> Merus N.V. <120> METHOD FOR DETECTING EXPRESSION OR CLUSTERING OF CELL SURFACE MOIETIES <130> P4023PC00 <140> NL 2026558 <141> 2020-09-28 <160> 120 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Trp Gly Val Ile Gly Gly His Tyr Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 1 <400> 2 Asn Phe Ala Met Asn 1 5 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Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Thr Leu Trp Gly Ser Asp Asp Val Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 35 <400> 36 Thr Ser Gly Met Ser Val Gly 1 5 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 35 <400> 37 Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Tyr Phe Ser Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 35 <400> 38 Thr Leu Trp Gly Ser Asp Asp Val Phe Asp Val 1 5 10 <210> 39 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp His Thr Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gln Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Ser His Ile Asp Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 39 <400> 40 Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 39 <400> 41 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 42 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 39 <400> 42 His Gln Gly Tyr Ser Phe Ser Gly Ser His Ile Asp Asp Tyr 1 5 10 <210> 43 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Ala Gly Phe Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Asp Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 43 <400> 44 Thr Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 43 <400> 45 His Ala Gly Phe Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Asp Asp Tyr 1 5 10 <210> 46 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Gly Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Trp Gly Leu Val Ala Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 47 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 46 <400> 47 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Asp Phe Thr 1 5 10 15 Gly <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 46 <400> 48 Asp Trp Gly Leu Val Ala Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 49 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 49 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Thr 20 25 30 Gly Val Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Glu Gly Ile Ile Gly Phe Leu Gly Gly Asn Trp Phe Asp 100 105 110 Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 49 <400> 50 Thr Thr Gly Val Gly Val Asn 1 5 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 49 <400> 51 Leu Ile Tyr 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according to KABAT from SEQ ID NO: 53 <400> 54 Ser His Ala Met Asn 1 5 <210> 55 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 53 <400> 55 Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe Thr 1 5 10 15 Gly <210> 56 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 53 <400> 56 Asp Arg Lys Tyr Val Thr Asn Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe Gln His 1 5 10 15 <210> 57 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 57 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 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Val Ser Ser 115 120 125 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 59 <400> 60 Ser Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 59 <400> 61 Asp Arg Gly Tyr Ile Ser Ser Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe Gln His 1 5 10 15 <210> 62 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Ala Cys Val Asn Pro Asn Thr Gly Ser Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Ser 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Val Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Lys Tyr Val Thr Asn Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe 100 105 110 Gln His Trp Gly His Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 62 <400> 63 Cys Val Asn Pro Asn Thr Gly Ser Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Ser Thr 1 5 10 15 Gly <210> 64 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Ser 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Val Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Lys Tyr Val Thr Asn Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe 100 105 110 Gln His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 65 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 64 <400> 65 Asn Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 66 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 64 <400> 66 Trp Met Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Ser Thr 1 5 10 15 Gly <210> 67 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Lys Tyr Val Thr Asn Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe 100 105 110 Gln His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 67 <400> 68 Asn Tyr Ala Ile Asn 1 5 <210> 69 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ser Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ser Ile Val Pro Ile Phe Gly Thr Ile Asn Asn Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asn Thr Met Val Arg Gly Val Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 69 <400> 70 Thr Tyr Ser Ile Thr 1 5 <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 69 <400> 71 Ser Ile Val Pro Ile Phe Gly Thr Ile Asn Asn Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 69 <400> 72 Asp Asn Thr Met Val Arg Gly Val Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val 1 5 10 15 <210> 73 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ile Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Val Arg Gly Tyr Ser Ala Tyr Asp Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 74 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 73 <400> 74 Thr Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 73 <400> 75 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Pro Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 73 <400> 76 Asn Val Arg Gly Tyr Ser Ala Tyr Asp Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Asn Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gly Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Gly Thr Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 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Asp Thr Pro Asn Phe Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Cys Asn His Gly Val Cys Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 81 <400> 82 Thr Tyr Thr Ile Ile 1 5 <210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 81 <400> 83 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Pro Asn Phe Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 81 <400> 84 Glu Gly Cys Asn His Gly Val Cys Tyr Pro Tyr 1 5 10 <210> 85 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 85 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Gly Tyr Ser Asn Pro His Trp Leu Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 85 <400> 86 Ser Tyr Gly Ile Thr 1 5 <210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 85 <400> 87 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 85 <400> 88 Arg Arg Gly Tyr Ser Asn Pro His Trp Leu Asp Pro 1 5 10 <210> 89 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 89 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Ile Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Gly Asn Tyr Tyr Glu Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 90 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 89 <400> 90 Thr Tyr Gly Ile Leu 1 5 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 89 <400> 91 Gly Gly Gly Asn Tyr Tyr Glu Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 92 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Glu Thr Gly Tyr Ser Ser Ser Asn Phe Gln His Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 92 <400> 93 Thr Tyr Ala Ile Asn 1 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 92 <400> 94 Arg Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 92 <400> 95 Asp Glu Thr Gly Tyr Ser Ser Ser Asn Phe Gln His 1 5 10 <210> 96 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 96 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Lys Tyr Val Thr Asn Trp Val Phe Ala Glu Asp Phe 100 105 110 Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 97 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 97 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ser Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Ser Phe Ser Ser Ser Ser Gly Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 98 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 97 <400> 98 Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Thr Ser Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Asp <210> 99 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 97 <400> 99 Asp Pro Ser Phe Ser Ser Ser Ser Gly Trp Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 100 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HEAVY CHAIN VARIABLE REGION <400> 100 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gln Thr Gly Tyr Ser Ser Thr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 101 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 100 <400> 101 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Arg Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 100 <400> 102 Asp Gln Thr Gly Tyr Ser Ser Thr Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 103 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 103 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser His 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Asp Arg Gly Tyr Met Ser Asn Trp Val Phe Ala Glu Tyr Phe 100 105 110 Pro His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 104 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 104 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Ile 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Asp Tyr Thr Asn Thr Val Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 105 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 104 <400> 105 Trp Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Tyr Ala Gln Lys Ile Gln 1 5 10 15 Gly <210> 106 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 104 <400> 106 His Asp Tyr Thr Asn Thr Val Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 107 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable region <400> 107 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asp Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Phe 65 70 75 80 Met Glu Leu Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Gly Tyr Ser Asn Pro His Trp Leu Asp Pro Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 108 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 107 <400> 108 Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 109 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of human common light chain IGKV1-39/jk1 <400> 109 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 110 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of common light chain variable domain <400> 110 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 111 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 according to KABAT from SEQ ID NO: 110 <400> 111 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 according to KABAT from SEQ ID NO: 110 <400> 112 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 according to KABAT from SEQ ID NO: 110 <400> 113 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 114 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of common light chain constant domain <400> 114 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 115 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain constant domain <400> 115 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 116 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CH1 <400> 116 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 117 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the hinge <400> 117 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 118 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CH2 <400> 118 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 119 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CH3 with KK mutations <400> 119 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lys Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 120 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CH3 with DE mutations <400> 120 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Asp Pro Pro Ser Arg Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Glu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105

Claims (47)

  1. 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 결합 분자 및 제2 결합 분자 중 적어도 하나는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 서로 근접하지 않는 한 검출되지 않는 분자 태그를 포함하는 단계; 및
    분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하여 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 검출하는 단계.
  2. 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 적어도 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제에 노출된 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자와 접촉시키는 단계로서, 여기서 제1 결합 분자 및 제2 결합 분자 중 적어도 하나는 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 서로 근접하지 않는 한 검출되지 않는 분자 태그를 포함하는 단계; 및
    분자 태그의 양을 측정하여 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 군집화의 샘플 내 존재를 정량화하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    - a) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하는 단계; 또는
    b) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하는 단계;
    - 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
    - 방출된 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하거나 그 양을 측정함으로써 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와의 군집화를 검출 또는 정량화하는 단계.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    - a) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제1 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하는 단계; 또는
    b) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제2 결합 분자는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하는 단계; 또는
    c) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제1 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고 제3 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하는 단계; 또는
    d) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 및 제3 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제2 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하고 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하는 단계;
    - 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
    - 방출된 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하거나 그 양을 측정함으로써 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와의 군집화를 검출 또는 정량화하는 단계.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    - a) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 제3 결합 분자, 및 제4 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고, 제4 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하는 단계; 또는
    b) 샘플을 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제1 결합 분자, 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 제2 결합 분자, 제3 결합 분자, 및 제4 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제3 결합 분자는 제1 결합 분자에 결합하고 절단 유도 모이어티를 포함하고; 제4 결합 분자는 제2 결합 분자에 결합하고 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하는 단계,
    - 분자 태그의 절단을 유도하는 단계; 및
    - 방출된 분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하거나 그 양을 측정함으로써 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티의 군집화를 검출 또는 정량화하는 단계.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 바람직하게는 대상체 또는 환자로부터의 조직 샘플, 혈액 샘플, 또는 배양 세포인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 샘플이 신선한 샘플 또는 고정화된 샘플인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 암을 앓는 대상체로부터의 종양 생검 샘플인 방법.
  9. 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는, 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플 내 발현을 검출하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    암을 앓는 대상체로부터의 종양 생검 샘플을 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자는 분자 태그를 포함하는 단계;
    및
    분자 태그의 존재 또는 부재를 검출하여 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는, 적어도 2개의 세포 표면 모이어티의 샘플 내 발현을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은
    암을 앓는 대상체로부터의 종양 생검 샘플을 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 제1 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자 및 제2 세포 표면 모이어티를 검출하는 적어도 하나의 결합 분자는 분자 태그를 포함하는 단계;
    및
    분자 태그의 양을 측정하여 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현을 정량화하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 동일한 세포 또는 동일한 유형의 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 세포 표면 모이어티가 상이한 세포 또는 상이한 유형의 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 세포 표면 모이어티가 면역 효과기 세포, 특히 NK 세포, T 세포, B 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 호중구 과립구에 의해 발현되고, 제2 세포 표면 모이어티가 종양 세포 또는 면역 세포에 의해 발현되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 CD137 또는 또 다른 면역 효과기 세포 공동자극 모이어티인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 PD-L1 또는 또 다른 종양 관련 모이어티 또는 면역 체크포인트 모이어티인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 CD137 또는 또 다른 면역 효과기 세포 공동자극 모이어티이고, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 PD-L1 또는 또 다른 종양 관련 모이어티 또는 면역 체크포인트 모이어티인 방법.
  17. 제1항 내지 제8항 및 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 모이어티에 대한 결합 특이성을 갖는 작용제가 이중특이적 또는 삼중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 다중특이적 항체가 CD137 또는 또 다른 면역 효과기 세포 공동자극 분자 및 PD-L1 또는 또 다른 종양 관련 모이어티 또는 면역 체크포인트 모이어티에 결합하는 이중특이적 항체인 방법.
  19. 제18항에 있어서, CD137에 결합하는 이중특이적 항체의 결합 도메인은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 바람직하게는 1개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 4, 8, 12, 16, 19, 23, 27, 30, 34, 38, 42, 45, 48, 또는 52 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)를 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, CD137에 결합하는 이중특이적 항체의 결합 도메인은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 바람직하게는 1개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 2, 6, 10, 14, 18, 21, 25, 32, 36, 40, 44, 또는 50 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1); 및/또는 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 바람직하게는 1개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 3, 7, 11, 15, 22, 26, 29, 33, 37, 41, 47, 또는 51 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)을 포함하는 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, CD137에 결합하는 이중특이적 항체의 결합 도메인은 서열 번호 1, 5, 9, 13, 17, 20, 24, 28, 31, 35, 39, 43, 46, 또는 49 중 어느 하나를 갖거나, 또는 그에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 서열 동일성을 갖는, 특히 그의 프레임워크 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 방법.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체의 결합 도메인은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 바람직하게는 1개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 56, 58, 61, 72, 76, 80, 84, 88, 91, 95, 99, 102, 또는 106 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 방법.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체의 결합 도메인은 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 바람직하게는 1개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 54, 60, 65, 68, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 또는 93 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR1 (HCDR1); 및/또는 그 안에 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 바람직하게는 1개의 아미노산 치환을 허용하는, 서열 번호 55, 3, 63, 66, 71, 75, 79, 83, 87, 94, 98, 101, 105, 또는 108 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함하는 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, PD-L1에 결합하는 이중특이적 항체의 결합 도메인은 서열 번호 53, 57, 59, 62, 64, 67, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 92, 96, 97, 100, 103, 104, 또는 107 중 어느 하나를 갖거나, 또는 그에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 서열 동일성을 갖는, 특히 그의 프레임워크 영역에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 방법.
  25. 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티, 특히 면역 효과기 세포 상에 발현된 모이어티 및 종양 세포 또는 면역 세포상에서 발현된 모이어티와 결합하는 작용제 또는 작용제들에 대한 대상체, 특히 암 환자의 반응성을 예측하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    - 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 구성원의 발현 수준을 검출하는 단계;
    - 대상체의 샘플 내 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현 수준이 임계값 수준 초과인지 미만인지를 결정하는 단계; 및
    - 대상체의 샘플 내 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티의 발현 수준이 임계값 수준 이상이면 대상체가 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 결합하는 작용제 또는 작용제들에 반응할 가능성이 있음을 예측하는 단계.
  26. 제25항에 있어서, 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 구성원의 발현 수준이 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 측정되는 것인 방법.
  27. 치료를 필요로 하는 대상체, 특히 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    - 제25항 또는 제26항에 따른 방법을 사용하여 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 작용제 또는 작용제들에 대한 대상체의 반응성을 예측하는 단계; 및
    - 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 작용제 또는 작용제들을 반응할 가능성이 있는 대상체에게 투여하는 단계.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 CD137 또는 또 다른 면역 효과기 세포 공동자극 모이어티인 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 PD-L1 또는 또 다른 종양 관련 모이어티 또는 면역 체크포인트 모이어티인 방법.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 CD137이고 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 PD-L1인 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 표면 모이어티에 결합하는 작용제가 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 또는 삼중특이적 항체, 특히 CD137 또는 또 다른 면역 효과기 세포 공동자극 모이어티 및 PD-L1 또는 또 다른 종양 관련 모이어티 또는 면역 체크포인트 모이어티에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체인 방법.
  32. 작용제의 유효성을 결정하는 방법으로서, 작용제는 적어도 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 작용제로 치료 중인 대상체의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와의 군집화를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  33. 작용제의 유효성을 결정하는 방법으로서, 작용제는 적어도 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 작용제로 치료 중인 대상체의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와의 군집화를 정량화하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 작용제의 작용 기전(MOA)을 확인하는 방법으로서, 작용제는 적어도 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 작용제로 치료 중인 대상체의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와의 군집화를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  35. 작용제의 작용 기전을 확인하는 방법으로서, 작용제는 적어도 제1 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 방법은 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 작용제로 치료 중인 대상체의 생물학적 샘플에서 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와의 군집화를 정량화하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 작용 기전이 작용제의 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 대한 동시 결합인 방법.
  37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 작용 방식이 2개 이상의 세포 표면 모이어티의 군집화인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 군집화가 면역 효과기 세포상에서 발현되는 2개 이상의 세포 표면 모이어티의 것, 특히 2개 이상의 CD137 단백질의 군집화인 방법.
  39. 치료를 필요로 하는 대상체, 특히 암을 앓는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 방법:
    - 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티에 결합하는 작용제로 대상체를 치료하는 단계;
    - 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 작용제의 유효성 또는 작용제의 작용 기전을 분석하는 단계.
  40. 제39항에 있어서, 분석 또는 확인의 결과에 기초하여 치료를 계속하거나 변경시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 적어도 제1 세포 표면 모이어티와 제2 세포 표면 모이어티와의 군집화를 유도하는 능력에 대해 하나 이상의 시험 제제를 선별하는 방법으로서, 상기 방법은 하기를 포함하는 방법:
    - 하나 이상의 시험 세포 배양물을 시험 제제와 접촉시키는 단계로서,
    여기서 시험 세포 배양물은 제1 세포 표면 모이어티를 발현하는 세포 및 제2 세포 표면 모이어티를 발현하는 세포를 포함하는 단계;
    - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 제1 및 제2 세포 표면 모이어티의 군집화 수준을 검출 또는 정량화하는 단계; 및
    - 상기 군집화 수준을 시험 제제와 접촉하지 않거나 참조 제제와 접촉한 대조군 세포 배양물에서 군집화에 대해 검출된 군집화 수준과 비교하는 단계로서,
    여기서 대조군 세포 배양물은 제1 세포 표면 모이어티 및 제2 세포 표면 모이어티를 포함하는 단계.
  42. 제41항에 있어서, 대조군 세포 배양물에서의 군집화 수준과 같거나 더 높은 수준의 군집화를 유도하는 시험 제제를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 CD137 또는 또 다른 면역 효과기 공동자극 모이어티인 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 PD-L1 또는 또 다른 종양 관련 모이어티 또는 면역 체크포인트 분자인 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 CD137이고 적어도 하나의 세포 표면 모이어티가 PD-L1인 방법.
  46. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 제제가 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, CD137 또는 또 다른 면역 효과기 공동자극 모이어티 및 PD-L1 또는 또 다른 종양 관련 모이어티 또는 면역 체크포인트 모이어티에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체인 방법.
  47. 제1 및 제2 세포 표면 모이어티에 특이적으로 결합하는 적어도 2개의 결합 분자로서, 선택적으로 여기서 결합 분자 중 하나는 절단 가능한 링커를 통해 이에 부착된 분자 태그를 포함하고 다른 결합 분자는 절단 유도 모이어티를 포함하는 분자, 및 환자 샘플을 선택적으로 분자 태그의 절단을 유도하기 위해 적어도 2개의 결합 분자와 접촉시키고; 환자 샘플을 적어도 2개의 결합 분자와 접촉시킴으로써 유도된 신호의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 지침을 포함하는 부품 키트.
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