JP7286627B2 - 試料における細胞間相互作用を検出するためのキット、方法、およびそれらの使用 - Google Patents

試料における細胞間相互作用を検出するためのキット、方法、およびそれらの使用 Download PDF

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Description

本発明は、特に固定試料における細胞間相互作用を検出するキットおよび方法に関する。本発明は、細胞間相互作用の定量化をさらに提供する。具体的には、本発明は、極めて近接した２つの異なる細胞で発現される２つの分子間の相互作用の検出に関する。例えば、本発明は、極めて近接した異なる細胞の細胞表面にディスプレイされた細胞レベルでの免疫チェックポイントタンパク質間の相互作用、例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２との間の相互作用に関する。
本発明は、近接ライゲーションアッセイ、一致検出、またはフェルスター（蛍光）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）等の一致アッセイを、単独で、またはチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）等の酵素活性化系と組み合わせて使用して、試料における細胞間相互作用の検出を改善するキットおよび方法に関する。より具体的には、本発明は、２つの部位が異なる細胞で発現される異なる分子（例えば、タンパク質）上にある二部位方法に関する。この方法およびキットを使用して、チェックポイントタンパク質阻害剤ががんの治療に有効である可能性が高いかを決定することができる。
本発明は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路の阻害等のがん治療に応答する可能性の高い患者を予測および特定し、かつかかる治療に応答しない患者を層別化して、患者の応答者／無応答者プロファイルに基づいて患者に治療選択肢の決定を提供するためのキットおよび方法にも関する。
本発明を使用して、腫瘍試料を分析することができ、本発明を、がん患者の診断、監視、層別化、および治療、ならびにがん分野における薬物開発に適用することができる。
多細胞生物が機能するためには、細胞間コミュニケーションが絶対不可欠である。細胞間シグナル伝達の調節、過剰刺激、または機能停止により、様々な病状が引き起こされ得る。したがって、（ａ）新たな治療標的の決定、（ｂ）患者選択の導き、および（ｃ）様々な病状における治療有効性の監視を目的として、細胞間相互作用の試験および解明に焦点を合わせた研究努力がなされている。
細胞間相互作用の検出および定量化が絶対不可欠である一態様は、健康な免疫系の維持における免疫細胞と非免疫細胞との間の相互作用の試験にある。この文脈での崩壊または異常な相互作用により、過活動性免疫応答から低活動性免疫応答を引き起こす炎症性病状および腫瘍までの様々な病状が引き起こされ得る。
実際には、Ｔ細胞の結合および阻害によって免疫細胞媒介性破壊を回避する腫瘍細胞の能力の理解、測定、および定量化が、大きな関心事になっている。これを理解できないことが、阻害性Ｔ細胞－腫瘍細胞相互作用を制限する治療的適用が特定のＴ細胞タンパク質と腫瘍細胞タンパク質との相互作用の調節に限定される主な理由のうちの１つであると考えられる。
がん免疫療法研究は、免疫媒介性破壊を回避する腫瘍細胞の能力を打開し、個体の免疫系を刺激して腫瘍細胞を標的とすることを試みている。
免疫細胞媒介性破壊を回避する腫瘍細胞の能力を打開するための最も有望なアプローチのうちの１つは、免疫チェックポイントマーカーの遮断である。免疫チェックポイントとは、非病原性組織への不必要な損傷を最小限に抑えるための自己寛容の維持および免疫応答の重症度の調節に不可欠な多数の免疫阻害経路を指す。腫瘍細胞が腫瘍抗原に特異的なＴ細胞による破壊を回避する主要機構としての役割を果たすこれらの免疫抑制性チェックポイント経路をハイジャックすることが知られている。それ故に、Ｔ細胞表面チェックポイントタンパク質と腫瘍細胞表面チェックポイントタンパク質との間の阻害性相互作用が、がん治療にとって魅力的な治療標的である。
実際には、Ｔ細胞：腫瘍細胞チェックポイント阻害性相互作用を遮断する治療用抗体が、臨床状況下で腫瘍体積の低減を成功させた。しかしながら、これらの治療は、どの免疫チェックポイントががん治療に有望な標的であろうかを検出するのに利用可能な方法またはアッセイが存在しないため、ごく小数の免疫チェックポイントに限定されている。さらに、未だ発見されていないが、存在する可能性の高い潜在的に多数のチェックポイント相互作用が存在する。明らかに、Ｔ細胞：腫瘍細胞チェックポイント相互作用等の細胞間相互作用の検出を可能にする方法が必要とされている。
十分に特徴付けされた免疫チェックポイントタンパク質相互作用は、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）受容体、別名、クラスター分類（ＣＤ）２７９と、リガンドであるプログラム細胞死－リガンド１または２（ＰＤ－Ｌ１または２）、別名、それぞれ、ＣＤ２７４またはＣＤ２７３のいずれかとの結合である。ＰＤ－１が活性化Ｔ細胞の表面に発現する一方で、ＰＤ－Ｌ１／２は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞およびマクロファージ、ならびに腫瘍細胞に発現する。ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１／２への結合により、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を停止させるか、または制限する阻害シグナルがＴ細胞内で生成される。ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／２相互作用により、免疫系が正しい時点で活性化されることが確実になり、それ故に、潜在的な自己免疫を最小限に抑える。がん腫瘍細胞は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２チェックポイント経路を利用して、検出、およびその後のＴ細胞媒介性破壊を回避するための機構を提供する。ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２を遮断する療法により、様々ながん型において前例のない持続的腫瘍応答率が示されている（Ｒｉｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；２０（１９）２０１４）。
別の十分に特徴付けされた免疫チェックポイントタンパク質相互作用は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、別名、ＣＤ１５２と、リガンドであるクラスター分類８０（ＣＤ８０）または８６（ＣＤ８６）、別名、それぞれ、Ｂ７－１およびＢ７－２のいずれかとの結合である。ＣＴＬＡ－４が活性化Ｔ細胞に発現する一方で、ＣＤ８０およびＣＤ８６は、樹状細胞またはマクロファージ等の抗原提示細胞に発現する。ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０／８６への結合により、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を停止させるか、または制限する阻害シグナルがＴ細胞に生成される。ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０／８６相互作用により、免疫系が正しい時点で活性化されることが確実になり、それ故に、潜在的な自己免疫を最小限に抑える。がん腫瘍細胞は、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０／８６チェックポイント経路を利用して、Ｔ細胞による検出、およびその後の破壊を回避するための機構を提供する。ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０／８６を遮断するモノクローナル抗体イピリムマブ等の療法により、様々ながん型における免疫系の増加した活性化および腫瘍退縮がもたらされる（Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ，ＥＩ ＆ Ｄｅｓａｉ，Ａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；３９（１）２０１６）。
細胞間相互作用の評価は、部分的には固定試料における細胞間相互作用の検出を可能にする利用可能な方法／技術の欠如により、大々的に報告されていない。典型的には、腫瘍試料に適用される通例のプロテオミクスは、相対タンパク質含量を決定するための免疫組織化学（ＩＨＣ）、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の抽出およびプロセシングに依存する。従来のＩＨＣは、操作を最小限に抑え、組織の組織化を保持するが、その特異性が限定されている（一部位アッセイ）。ＥＬＩＳＡ型アプローチは、特異性をもたらす（二部位アッセイ）が、プロセシングを必要とし、プロセシングにより、試料サイズの課題が提示され、空間的情報が破壊される。現在のシステムは、溶液（可溶性組換えタンパク質）中または単一細胞内のいずれかの分子間の相互作用を検出するためのみに使用されている。例えば、ＦＲＥＴによるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２の相互作用が以前に研究されているが、組換えまたは精製タンパク質を使用した溶液中でのアッセイとの関連のみである。
ＷＯ２０１４／１４０５５４は、二部位検出方法におけるチラミド活性化系（ＴＳＡ）と組み合わせた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用した試料中の分子を検出するための方法を記載している。しかしながら、かかる方法の使用は、同じタンパク質上の二部位または同じ細胞との関連で異なるタンパク質上の２つの部位の検出および定量化に限定された。したがって、現在の検出方法の特異性および感度が限定されており、細胞レベルでの相互作用を検出および定量化することができない。
当該技術分野で既知の以前の方法は、重複免疫シグナルの共局在化を検出して細胞間相互作用を検出し、重複シグナルの数を手動で計数し、かつシグナルの数：核の数の比率を推定することによる、定性的な強度に基づく評価に依存する。
がん患者を特定および治療するための改善された有効な方法の開発を助けるために、２つの別個の細胞の細胞表面に提示される分子（例えば、２つのタンパク質）間の相互作用、具体的には免疫チェックポイントタンパク質相互作用を検出および定量化するための高感度の特異的な方法の提供が依然として必要とされている。
本発明の目的は、組織切片等の固定試料における２つの異なる細胞に発現する２つの分子間の細胞間相互作用、具体的には異なる細胞の表面の免疫チェックポイントタンパク質相互作用（ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２、腫瘍組織適合性複合体（ＭＨＣ）Ｉ－ＩＩ：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ８／ＣＤ３またはＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０／８６等）を検出するための改善された方法およびキットを提供することである。本発明のさらなる目的は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路、ＭＨＣ Ｉ－ＩＩ：ＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３経路、またはＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０／８６経路の阻害等のがん治療に応答する可能性の高い患者を予測および特定し、かつかかる治療に応答しない患者を層別化して、患者の応答者／無応答者プロファイルに基づいて患者に治療選択肢の決定を提供するための有効な方法およびキットを提供することである。
本発明は、細胞間相互作用を検出および定量化するための方法を提供する。具体的には、本発明は、タンパク質が各々異なる細胞の表面にある、すなわち、トランス形態であるタンパク質間相互作用等の異なる細胞上の分子間の相互作用を検出および定量化するための方法に関する。具体的には、本発明は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用、またはＣＴＬＡ－４もしくはＣＤ２８とＣＤ８０もしくは８６との間の相互作用、またはＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩペプチドと、ＴＣＲ、ＣＤ８３、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせとの間の相互作用等の細胞レベルでの免疫チェックポイントタンパク質相互作用の検出および定量化に関する。
本発明によれば、細胞間相互作用を検出するためのインビトロ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１の分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２の分子に結合し、第１の一次結合剤および第２の一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）細胞を含む単離された試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）二次結合剤間の相互作用を検出することと、を含む、インビトロ方法が提供される。
本発明の方法、キット、および使用では、二次結合剤間の相互作用を検出することは、発せられた蛍光を検出することにより得る。
本発明の方法、キット、および使用では、二次結合剤間の相互作用を検出することは、変化した蛍光挙動を検出することにより得る。好ましくは、変化した蛍光挙動を検出することは、時間分解である。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞および第２の細胞は、同じ細胞型であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞および第２の細胞は、異なる細胞型、すなわち、同じ細胞型ではない細胞型であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、単離された試料は、固定細胞試料であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、単離された試料は、固定腫瘍細胞試料であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１および第２の分子は、タンパク質、好ましくは、内因性タンパク質であり得る。好ましくは、タンパク質は、免疫チェックポイントタンパク質である。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、ＰＤ－１であり得、第２の分子は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８であり得、第２の分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドであり得、第２の分子は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせから選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、全免疫グロブリン、抗体足場、抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの二次結合剤は、全免疫グロブリン、抗体足場、または抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、二次結合剤のうちの少なくとも１つは、抗体足場、抗体、または抗原結合断片であり得る。本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの二次結合剤は、抗体足場、抗体結合断片、または抗原結合断片であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、抗体足場は、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環式ペプチド、センチリン、システインノット、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメイン、オボディ、およびＴｎ３であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、一次結合剤は、標識されていなくてもよい。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の一次結合剤は、マウス結合剤であり得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、ウサギ結合剤であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の一次結合剤は、ＰＤ－１に結合し得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の一次結合剤は、第１の細胞上のＰＤ－１に結合し得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、第２の細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、方法は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２への結合を検出し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８であり得、第２の分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の一次結合剤は、第１の細胞上のＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、第２の細胞上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、方法は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８のＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を検出し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドであり得、第２の分子は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせから選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の一次結合剤は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩペプチドに結合し得、第２の一次結合剤は、第２の細胞上のＴＣＲ、ＣＤ８３、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせに結合し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、方法は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩペプチドの、ＴＣＲ、ＣＤ８３、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせへの結合を検出し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞は、リンパ球であり得、好ましくは、第１の細胞は、Ｔ細胞であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第２の細胞は、非リンパ球細胞であり得、好ましくは、第２の細胞は、抗原提示細胞であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１のリンパ球細胞上のＰＤ－１と第２の非リンパ球細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用が検出され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１のリンパ球細胞上のＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８と第２の非リンパ球細胞上のＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用が検出され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１のリンパ球細胞上のＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドと、第２の非リンパ球細胞上のＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせとの間の相互作用が検出され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の二次結合剤は、抗マウス結合剤であり得、少なくとも１つの他の二次結合剤は、抗ウサギ結合剤であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、ＦＲＥＴドナーは、ＯＲＧ ４８８、ＧＦＰ、フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＡＴＴＯ４８８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、ＦＲＥＴアクセプターは、ＡＬＸ ５９４、ｍＲＦＰ、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、ダブシル、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、酵素は、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、酵素は、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、基質は、チラミドであり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞は、Ｔ細胞であり得、第２の細胞は、腫瘍細胞であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、互いに同時にまたは順次に接触し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの二次結合剤は、互いに同時にまたは順次に接触し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、少なくとも２つの二次抗体と同時に試料と接触し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、少なくとも２つの二次結合剤の前に試料と接触し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、洗浄ステップは、少なくとも２つの一次結合剤が試料と接触した後に、かつ少なくとも２つの二次結合剤が試料と接触する前に行われ得る。
本発明の方法、キット、および使用では、方法は、第１の細胞上の第１の部位と第２の細胞上の第２の部位との間の相互作用を定量化するステップをさらに含み得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞は、リンパ球であり得、第２の細胞は、非リンパ球細胞型であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、方法は、第１のリンパ球細胞上のＰＤ－１と第２の非リンパ球細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を検出し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、第１の細胞の細胞表面上にあり得、第２の分子は、第２の細胞の細胞表面上にあり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。
本発明のいくつかの方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
本発明は、第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するための前述のインビトロ方法の使用も提供する。
本発明は、細胞間相互作用を検出するためのインビトロ方法における使用のためのキットであって、本キットが、
ａ）少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１の分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２の分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
ｂ）少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、
ｃ）方法を行うための指示であって、この方法が、
ｉ．細胞を含む単離された試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
ｉｉ．試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
ｉｉｉ．洗浄ステップを行うことと、
ｉｖ．二次結合剤間の相互作用を検出することと、を含む、指示と、を含む、キットをさらに提供する。
本発明のキットでは、二次結合剤間の相互作用を検出するための指示は、発せられた蛍光を検出することによる検出のためであり得る。
本発明のキットでは、二次結合剤間の相互作用を検出するための指示は、変化した蛍光挙動を検出することによる検出のためであり得る。
本発明のキットでは、変化した蛍光挙動を検出することは、時間分解であり得る。
本発明のキットでは、第１の細胞および第２の細胞は、同じ細胞型であり得る。
本発明のキットでは、第１の細胞および第２の細胞は、異なる細胞型、すなわち、同じ細胞型ではない細胞型であり得る。本発明のキットでは、単離された試料は、固定細胞試料であり得る。
本発明のキットでは、単離された試料は、固定腫瘍細胞試料であり得る。
本発明のキットでは、第１および第２の分子は、タンパク質、好ましくは、内因性タンパク質であり得る。好ましくは、タンパク質は、免疫チェックポイントタンパク質である。
本発明のキットでは、第１の分子は、ＰＤ－１であり得、第２の分子は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２であり得る。
本発明のキットでは、第１の分子は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８であり得、第２の分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６であり得る。
本発明のキットでは、第１の分子は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドであり得、第２の分子は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせから選択され得る。
本発明のキットでは、少なくとも２つの一次結合剤は、全免疫グロブリン、抗体足場、抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、少なくとも２つの二次結合剤は、全免疫グロブリン、抗体足場、または抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、二次結合剤のうちの少なくとも１つは、抗体足場、抗体、または抗原結合断片であり得る。本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの二次結合剤は、抗体足場、抗体結合断片、または抗原結合断片であり得る。
本発明のキットでは、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
本発明のキットでは、抗体足場は、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環式ペプチド、センチリン、システインノット、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメイン、オボディ、およびＴｎ３であり得る。
本発明のキットでは、一次結合剤は、標識されていなくてもよい。
本発明のキットでは、第１の一次結合剤は、マウス結合剤であり得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、ウサギ結合剤であり得る。
本発明のキットでは、第１の一次結合剤は、ＰＤ－１に結合し得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し得る。
本発明のキットでは、第１の一次結合剤は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し得、第２の一次結合剤は、ＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかに結合し得る。
本発明のキットでは、第１の一次結合剤は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドに結合し得、第２の一次結合剤は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせに結合し得る。
本発明のキットでは、第１の二次結合剤は、抗マウス結合剤であり得、少なくとも１つの他の結合剤結合剤は、抗ウサギ結合剤であり得る。
本発明のキットでは、ＦＲＥＴドナーは、ＯＲＧ ４８８、ＧＦＰ、フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＡＴＴＯ４８８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、ＦＲＥＴアクセプターは、ＡＬＸ ５９４、ｍＲＦＰ、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、ダブシル、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、酵素は、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、酵素は、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群から選択され得る。好ましくは、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、基質は、チラミドであり得る。
本発明のキットでは、第１の細胞は、Ｔ細胞であり、第２の細胞は、腫瘍細胞である。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの一次結合剤を互いに同時にまたは順次に接触させることを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの二次結合剤を互いに同時にまたは順次に接触させることを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの一次結合剤を、少なくとも２つの二次結合剤と同時に、試料と接触させることを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの一次結合剤を、少なくとも２つの二次結合剤の前に、試料と接触させることを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの一次結合剤が試料と接触した後に、かつ少なくとも２つの二次結合剤が試料と接触する前に、洗浄ステップを行うことを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、第１の細胞上の第１の部位と第２の細胞上の第２の部位との間の相互作用を定量化するステップをさらに含む方法を提供する。
本発明のキットでは、第１の細胞は、リンパ球であり得、第２の細胞は、非リンパ球細胞型であり得る。
本発明のキットでは、指示は、第１のリンパ球細胞上のＰＤ－１と第２の非リンパ球細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を検出する方法を提供し得る。
本発明のキットでは、第１の分子は、第１の細胞の細胞表面上にあり得、第２の分子は、第２の細胞の細胞表面上にあり得る。
本発明のキットでは、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。
本発明のキットのいくつかの態様では、少なくとも２つの一次結合剤は、阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
本発明は、細胞間相互作用を検出するためのインビトロ方法における本発明の前述のキットの使用も提供する。好ましくは、キットの使用は、第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するためのインビトロ一致アッセイ方法における使用である。
本発明は、がんを有する患者を治療のために選択する方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）患者由来の単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することであって、
ａ．意図された療法が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、または
ｉｉ．全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
ｂ．意図された療法が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント阻害剤を含む場合、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、方法をさらに提供する。
本発明の方法では、第１のチェックポイント標的分子は、ＰＤ－１であり得、第２のチェックポイント標的分子は、ＰＤ－Ｌ１であり得、蛍光シグナルスコアを決定する際に、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－１：Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２結合剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－１：Ｌ１、または抗ＰＤ－Ｌ２結合剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する。
本発明の方法では、第１のチェックポイント標的分子は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８であり得、第２のチェックポイント標的分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６であり得、蛍光シグナルスコアを決定する際に、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が抗ＣＴＬＡ－４／ＣＤ２８結合剤または抗ＣＤ８０／８６結合剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が抗ＣＴＬＡ－４／ＣＤ２８結合剤または抗ＣＤ８０／８６結合剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する。
本発明の方法では、第１のチェックポイント標的分子は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドであり得、第２のチェックポイント標的分子は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせであり得、蛍光シグナルスコアを決定する際に、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が抗ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ結合剤または抗ＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３結合剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が抗ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ結合剤または抗ＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３結合剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する。
本発明の方法のいくつかの態様では、患者は、がん療法を以前に受けていない、または患者は、チェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法を以前に受けていない。
本発明の方法では、全スコアが０．５％～５％である場合、これは、患者がチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法に応答しないであろうことを示し得る。
本発明の方法では、全スコアが５％～１０％である場合、これは、患者がチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法に応答するかもしれないことを示し得る。
本発明の方法では、全スコアが１０％を超える場合、これは、患者がチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法に応答するであろうことを示し得る。
本発明の方法では、全スコアが０．５％～５％である場合、これは、患者がＭＨＣクラスＩ／ＩＩ－ＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３相互作用を標的とする療法に応答するであろうことを示し得る。
本発明の方法では、全スコアが５％～１０％である場合、これは、患者がＭＨＣクラスＩ／ＩＩ－ＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３相互作用を標的とする療法に応答するかもしれないことを示し得る。
本発明の方法では、全スコアが１０％を超える場合、これは、患者がＭＨＣクラスＩ／ＩＩ－ＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３相互作用を標的とする療法に応答しないであろうことを示し得る。
本発明の方法では、全スコアは、ＦＲＥＴ効率パーセンテージであり得る。
本発明の方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。
本発明の方法のいくつかの態様では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
本発明は、がんを有する患者の治療のための選択における本発明の前述の方法の使用であって、
ａ．意図された療法が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、または
ｉｉ．全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
ｂ．意図された療法が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
ｉｉ．全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、使用も提供する。
本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）試料をチェックポイント活性化剤または阻害剤と接触させることと、
（ｆ）二次結合剤間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
ａ．チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法をさらに提供する。
本発明の方法では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１結合剤であり得、第１の一次結合剤は、ＰＤ－１に結合し得、第２の一次結合剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し得る。
本発明の方法では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８結合剤であり得、第１の一次結合剤は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し得、第２の一次結合剤は、ＣＤ８０またはＣＤ８６に結合し得る。
本発明の方法では、チェックポイント活性化剤は、抗ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ結合剤であり得、第１の一次結合剤は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩに結合し得、第２の一次結合剤は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせに結合し得る。本発明の方法では、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＤＸ １１０６、またはＯＮＯ－４５３８）、ペムブロリズマブ（イアムブロリズマブまたはＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－Ｑ１ １）、ＥＤ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＡＭＰ－２２４、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１ １０５）、ＥＤ ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４８）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ならびにそれらの断片および塩からなる群から選択され得る。
本発明の方法では、ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の増加は、チェックポイント活性化剤が有効であろうことを示し得る。
本発明の方法では、ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の減少は、チェックポイント阻害剤が有効であろうことを示し得る。
本発明の方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。
本発明の方法のいくつかの態様では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
本発明は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であろうかを検出するための本発明の前述のインビトロ一致アッセイ方法の使用であって、
ａ．チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、使用も提供する。
本発明は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するためのインビトロ一致アッセイ方法における使用のためのキットであって、本キットが、
（ａ）少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
（ｂ）少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、
（ｃ）方法を行うための指示であって、この方法が、
ａ．単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
ｂ．試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
ｃ．洗浄ステップを行うことと、
ｄ．全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
ｅ．試料をチェックポイント活性化剤または阻害剤と接触させることと、
ｆ．二次結合剤間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｖ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、検出することと、を含む、指示と、を含む、キットをさらに提供する。
本発明のキットでは、二次結合剤間の相互作用を検出するための指示は、発せられた蛍光を検出することによる検出のためであり得る。
本発明のキットでは、二次結合剤間の相互作用を検出するための指示は、変化した蛍光挙動を検出することによる検出のためであり得る。
本発明のキットでは、変化した蛍光挙動を検出することは、時間分解であり得る。
本発明のキットでは、第１の細胞および第２の細胞は、同じ細胞型であり得る。
本発明のキットでは、第１の細胞および第２の細胞は、異なる細胞型、すなわち、同じ細胞型ではない細胞型であり得る。本発明のキットでは、単離された試料は、固定細胞試料であり得る。
本発明のキットでは、単離された試料は、固定腫瘍細胞試料であり得る。
本発明のキットでは、第１および第２の分子は、タンパク質、好ましくは、内因性タンパク質であり得る。好ましくは、タンパク質は、免疫チェックポイントタンパク質である。
本発明のキットでは、第１の分子は、ＰＤ－１であり得、第２の分子は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２であり得る。
本発明のキットでは、第１の分子は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８であり得、第２の分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６であり得る。
本発明のキットでは、第１の分子は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドであり得、第２の分子は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせから選択され得る。
本発明のキットでは、少なくとも２つの一次結合剤は、全免疫グロブリン、抗体足場、抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、少なくとも２つの二次結合剤は、全免疫グロブリン、抗体足場、または抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、二次結合剤のうちの少なくとも１つは、抗体足場、抗体、または抗原結合断片であり得る。本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの二次結合剤は、抗体足場、抗体結合断片、または抗原結合断片であり得る。
本発明のキットでは、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
本発明のキットでは、抗体足場は、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環式ペプチド、センチリン、システインノット、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメイン、オボディ、およびＴｎ３であり得る。
本発明のキットでは、一次結合剤は、標識されていなくてもよい。
本発明のキットでは、第１の一次結合剤は、マウス結合剤であり得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、ウサギ結合剤であり得る。
本発明のキットでは、第１の一次結合剤は、ＰＤ－１に結合し得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し得る。
本発明のキットでは、第１の一次結合剤は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し得、第２の一次結合剤は、ＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかに結合し得る。
本発明のキットでは、第１の一次結合剤は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドに結合し得、第２の一次結合剤は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせに結合し得る。
本発明のキットでは、第１の二次結合剤は、抗マウス結合剤であり得、少なくとも１つの他の二次結合剤は、抗ウサギ結合剤であり得る。
本発明のキットでは、ＦＲＥＴドナーは、ＯＲＧ ４８８、ＧＦＰ、フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＡＴＴＯ４８８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、ＦＲＥＴアクセプターは、ＡＬＸ ５９４、ｍＲＦＰ、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、ダブシル、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、酵素は、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、酵素は、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群から選択され得る。好ましくは、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼからなる群から選択され得る。
本発明のキットでは、基質は、チラミドであり得る。
本発明のキットでは、第１の細胞は、Ｔ細胞であり、第２の細胞は、腫瘍細胞である。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの一次結合剤を互いに同時にまたは順次に接触させることを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの二次結合剤を互いに同時にまたは順次に接触させることを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの一次結合剤を、少なくとも２つの二次結合剤と同時に、試料と接触させることを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの一次結合剤を、少なくとも２つの二次結合剤の前に、試料と接触させることを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、少なくとも２つの一次結合剤が試料と接触した後に、かつ少なくとも２つの二次結合剤が試料と接触する前に、洗浄ステップを行うことを提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、第１の細胞上の第１の部位と第２の細胞上の第２の部位との間の相互作用を定量化するステップをさらに含む方法を提供する。
本発明のキットでは、第１の細胞は、リンパ球であり得、第２の細胞は、非リンパ球細胞型であり得る。
本発明のキットでは、指示は、第１のリンパ球細胞上のＰＤ－１と第２の非リンパ球細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を検出する方法を提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、第１のリンパ球細胞上のＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８と第２の非リンパ球細胞上のＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用を検出する方法を提供し得る。
本発明のキットでは、指示は、第１のリンパ球細胞上のＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドと、第２の非リンパ球細胞上のＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせとの間の相互作用を検出する方法を提供し得る。
本発明のキットでは、第１の分子は、第１の細胞の細胞表面上にあり得、第２の分子は、第２の細胞の細胞表面上にあり得る。
本発明のキットでは、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。
本発明のキットのいくつかの態様では、少なくとも２つの一次結合剤は、阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
本発明は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するためのインビトロ一致アッセイ方法における本発明の前述のキットの使用であって、
チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｖ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、使用も提供する。
本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するインビトロ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉｖ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｖ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｖｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療前に患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を、少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）ステップ（ａ）におけるチェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療中に患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を使用して、ステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、
（ｆ）試料間の全蛍光スコアを比較することであって、
ａ．療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、比較することと、を含む、インビトロ方法をさらに提供する。
本発明の方法では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１結合剤であり得、第１の一次結合剤は、ＰＤ－１に結合し得、第２の一次結合剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し得る。第１の一次薬剤および第２の一次薬剤は、チェックポイント阻害剤と同じではない場合があり、チェックポイント阻害剤と同じエピトープに結合しない場合がある。
本発明の方法では、チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８結合剤であり得、第１の一次結合剤は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し得、第２の一次結合剤は、ＣＤ８０またはＣＤ８６に結合し得る。
本発明の方法では、チェックポイント阻害剤は、ニボイウマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＤＸ １１０６、またはＯＮＯ－４５３８）、ペムブロイイズマブ（イアムブロイイズマブまたはＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－Ｑ１ １）、ＥＤ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＡＭＰ－２２４、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１ １０５）、ＥＤ ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４８）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ならびにそれらの断片および塩からなる群から選択され得る。
本発明の方法では、全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の増加は、チェックポイント活性化剤を含む療法が有効であろうことを示し得る。
本発明の方法では、全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の減少は、チェックポイント阻害剤を含む療法が有効であろうことを示し得る。
本発明の方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。
本発明の方法のいくつかの態様では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するための本発明の前述の方法の使用であって、
ａ．療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、使用も提供する。
本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するインビトロ方法における使用のためのキットであって、本キットが、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、
方法を行うための指示であって、この方法が、
（ａ）チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療前に患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を、少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）ステップ（ａ）におけるチェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療中に患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を使用して、ステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、
（ｆ）試料間の全蛍光スコアを比較することであって、
ａ．療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、比較することと、を含む、指示と、を含む、キットをさらに提供する。
本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するインビトロ方法における本発明の前述のキットの使用であって、
ａ．療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、使用も提供する。
本発明は、目的とする分子がチェックポイント活性化剤であるかチェックポイント阻害剤であるかを特定するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）試料を目的とする分子と接触させることと、
（ｆ）二次結合剤間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
ａ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤である、または
ｂ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント阻害剤である、または
ｃ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤でもチェックポイント阻害剤でもない、検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法をさらに提供する。
本発明の方法では、ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の増加は、目的とする分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤であることを示し得る。
本発明の方法では、ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの５％～０．５％、好ましくは１０％～５％、より好ましくは１０％超の減少は、目的とする分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント阻害剤であることを示し得る。
本発明の方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、目的とする分子が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。
本発明の方法のいくつかの態様では、少なくとも２つの一次結合剤は、目的とする分子の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
本発明は、がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するインビトロ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上のＰＤ－１に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光シグナルスコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することであって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、インビトロ方法も提供する。
本発明の方法では、試料は、固定腫瘍細胞試料であり得る。
本発明の方法では、方法は、
（ｉ）ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する単剤での治療、またはＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤および少なくとも１つの他の抗腫瘍剤での併用療法における治療の選択についての決定を導くために、治療前に患者から得られた生体試料に、かつ
（ｉｉ）対象の現在の治療レジメンへの応答を監視し、かつ単剤ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２遮断療法での治療または併用療法での治療の選択についての決定を導くために、治療中に患者から得られた少なくとも１つの生体試料に行われ得る。
本発明は、がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するための本発明の前述のインビトロ方法の使用であって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、使用も提供する。
本発明は、がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するインビトロ方法における使用のためのキットであって、本キットが、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上のＰＤ－１に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、
方法を行うための指示であって、この方法が、
ａ．患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
ｂ．試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
ｃ．洗浄ステップを行うことと、
ｄ．全蛍光シグナルスコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することであって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、指示と、を含む、キットをさらに提供する。
本発明のキットでは、試料は、固定腫瘍細胞試料であり得る。
本発明のキットでは、方法を行うための指示は、方法を、
（ｉ）ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する単剤での治療、またはＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤および少なくとも１つの他の抗腫瘍剤での併用療法における治療の選択についての決定を導くために、治療前に患者から得られた生体試料に、かつ
（ｉｉ）対象の現在の治療レジメンへの応答を監視し、かつ単剤ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２遮断療法での治療または併用療法での治療の選択についての決定を導くために、治療中に患者から得られた少なくとも１つの生体試料に行うための指示をさらに含み得る。
本発明は、がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するインビトロ方法における本発明の前述のキットの使用であって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、使用をさらに提供する。
本発明は、第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
第１および第２の融合タンパク質であって、各融合タンパク質が、検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインを含む、第１および第２の融合タンパク質を含み、
検出ドメインが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、さらなる検出ドメインと協働して同族特異的ヌクレオチド配列に結合することができ、
認識ドメインが、標的分子に結合することができ、
コネクタードメインが、一方の末端で検出ドメインに融合しており、他方の末端で認識ドメインに融合しており、
検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインが互いに異種であり、
本方法が、
（ｉ）試料を第１のおよび融合タンパク質と接触させるステップと、
（ｉｉ）インキュベートして結合を許容するステップと、
（ｉｉｉ）結合していない融合タンパク質を除去するステップと、
（ｉｖ）試料を、同族特異的ヌクレオチド配列を含む核酸と接触させるステップと、
（ｖ）インキュベートして核酸のヘテロ三量体結合を許容するステップと、
（ｖｉ）試料に結合した核酸を検出するステップと、を含み、
核酸がステップ（ｖｉ）で検出された場合、これは、２つの標的分子が試料中に同時に存在することを示す、インビトロ一致アッセイ方法をさらに提供する。
本発明の方法、キット、および使用では、二次結合剤間の相互作用を検出することは、発せられた蛍光を検出することにより得る。
本発明の方法、キット、および使用では、二次結合剤間の相互作用を検出することは、変化した蛍光挙動を検出することにより得る。好ましくは、変化した蛍光挙動を検出することは、時間分解である。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞および第２の細胞は、同じ細胞型であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞および第２の細胞は、異なる細胞型、すなわち、同じ細胞型ではない細胞型であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、単離された試料は、固定細胞試料であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、単離された試料は、固定腫瘍細胞試料であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１および第２の分子は、タンパク質、好ましくは、内因性タンパク質であり得る。好ましくは、タンパク質は、免疫チェックポイントタンパク質である。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、ＰＤ－１であり得、第２の分子は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８であり得、第２の分子は、ＣＤ８０またはＣＤ８６であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドであり得、第２の分子は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせから選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの二次結合剤は、全免疫グロブリン、抗体足場、または抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、二次結合剤のうちの少なくとも１つは、抗体足場、抗体、または抗原結合断片であり得る。本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの二次結合剤は、抗体足場、抗体結合断片、または抗原結合断片であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、抗体または抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、抗体足場は、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環式ペプチド、センチリン、システインノット、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメイン、オボディ、およびＴｎ３であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、一次結合剤は、標識されていなくてもよい。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の一次結合剤は、マウス結合剤であり得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、ウサギ結合剤であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の一次結合剤は、ＰＤ－１に結合し得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の一次結合剤は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し得、第２の一次結合剤は、ＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかに結合し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の一次結合剤は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドに結合し得、少なくとも１つの他の一次結合剤は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、またはそれらの組み合わせに結合し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の二次結合剤は、抗マウス結合剤であり得、少なくとも１つの他の二次結合剤は、抗ウサギ結合剤であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、ＦＲＥＴドナーは、ＯＲＧ ４８８、ＧＦＰ、フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＡＴＴＯ４８８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、ＦＲＥＴアクセプターは、ＡＬＸ ５９４、ｍＲＦＰ、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、ダブシル、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、酵素は、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、酵素は、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼからなる群から選択され得る。
本発明の方法、キット、および使用では、基質は、チラミドであり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞は、Ｔ細胞であり得、第２の細胞は、腫瘍細胞であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、互いに同時にまたは順次に接触し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの二次結合剤は、互いに同時にまたは順次に接触し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、少なくとも２つの二次結合剤と同時に試料と接触し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、少なくとも２つの二次結合剤の前に試料と接触し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、洗浄ステップは、少なくとも２つの一次結合剤が試料と接触した後に、かつ少なくとも２つの二次結合剤が試料と接触する前に行われ得る。
本発明の方法、キット、および使用では、方法は、第１の細胞上の第１の部位と第２の細胞上の第２の部位との間の相互作用を定量化するステップをさらに含み得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞は、リンパ球であり得、第２の細胞は、非リンパ球細胞型であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、方法は、第１のリンパ球細胞上のＰＤ－１と第２の非リンパ球細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を検出し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞は、リンパ球であり得、第２の細胞は、非リンパ球細胞型であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、方法は、第１のリンパ球細胞上のＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８と第２の非リンパ球細胞上のＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用を検出し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の細胞は、リンパ球であり得、第２の細胞は、非リンパ球細胞型であり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、方法は、第１のリンパ球細胞上のＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドと、第２の非リンパ球細胞上のＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、またはそれらの組み合わせとの間の相互作用を検出し得る。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、第１の細胞の細胞表面上にあり得、第２の分子は、第２の細胞の細胞表面上にあり得る。
本発明の方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。
本発明のいくつかの方法、キット、および使用では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
当業者であれば、上に概説される任意の特徴が、本発明の方法、使用、およびキットに組み合わせで適用され得ることを理解するであろう。
本発明の非限定的な実施形態が、図を参照してこれからさらに説明される。
抗ＲＴＫ薬物およびＰＤ－１を遮断する結合剤で処置した患者におけるＴＳＡ－ＦＲＥＴによるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の変化を示す。 ＴＳＡ－ＦＲＥＴによるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の変化を示す。 遮断モノクローナル結合剤の存在下および不在下でのＰＤ－１のみおよびＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１の代表的な強度および寿命画像を示す。 免疫ＦＲＥＴ（ＦＲＥＴ）によって定量化したＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を示す。 抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブの不在下または存在下での単一細胞におけるＣＴＬＡ－４：ＣＤ８０相互作用の変化を示す。 免疫ＦＲＥＴ（ｉＦＲＥＴ）によって定量化したＣＴＬＡ－４：ＣＤ８０相互作用を示す。 抗ＣＴＬＡ－４抗体イピリムマブの不在下または存在下での転移性メラノーマ組織におけるＣＴＬＡ－４：ＣＤ８０相互作用の変化（Ａ）および各試料についての各結果の定量化（Ｂ）を示す。 原発性腎細胞癌組織におけるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用を示す。 明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）組織におけるプログラム死受容体－１（ＰＤ－１）とプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）との相互作用を決定するための免疫－フェルスター共鳴エネルギー移動（ｉ－ＦＲＥＴ）アッセイの使用を示す。
本発明は、細胞レベルでの分子間の相互作用の検出における、ＦＲＥＴ、増幅を伴うＦＲＥＴ（例えば、ＴＳＡ－ＦＲＥＴ）、近接ライゲーション、および一致検出を含む一致アッセイの方法、キット、および使用を提供する。具体的には、特許請求される発明は、タンパク質が各々異なる細胞の細胞表面にある、すなわち、トランス形態である２つのタンパク質の相互作用の検出および定量化を初めて提供する。本発明は、異なる細胞で発現される２つのタンパク質間の相互作用の検出および／または定量化を提供する。
本発明は、第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１の分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２の分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）細胞を含む単離された試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）二次結合剤間の相互作用を検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法を提供する。
本発明は、第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するための上記のインビトロ一致アッセイ方法の使用も提供する。
本発明は、第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するための上記のインビトロアッセイ方法における使用のためのキットをさらに提供する。
本発明は、がんを有する患者を治療のために選択する方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）患者由来の単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することであって、
ａ．意図された療法が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、または
ｉｉ．全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
ｂ．意図された療法が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント阻害剤を含む場合、
（ｉｉｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｖ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、方法をさらに提供する。
本発明は、がんを有する患者を治療のために選択するための上記のインビトロ一致アッセイ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
さらなる態様では、本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）試料をチェックポイント活性化剤または阻害剤と接触させることと、
（ｆ）二次結合剤間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
ａ．チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法を提供する。
本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するための上記のインビトロ一致アッセイ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
さらなる態様では、本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するインビトロ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療前に患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を、少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）ステップ（ａ）におけるチェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療中に患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を使用して、ステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、
（ｆ）試料間の全蛍光スコアを比較することであって、
ａ．療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、比較することと、を含む、インビトロ方法を提供する。
本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するための上記のインビトロ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
本発明は、目的とする分子がチェックポイント活性化剤であるかチェックポイント阻害剤であるかを特定するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）試料を目的とする分子と接触させることと、
（ｆ）二次結合剤間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
ａ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤である、または
ｂ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント阻害剤である、または
ｃ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤でもチェックポイント阻害剤でもない、検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法をさらに提供する。
本発明は、目的とする分子がチェックポイント活性化剤であるかチェックポイント阻害剤であるかを特定するための上記のインビトロ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
本発明は、がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するインビトロ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上のＰＤ－１に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光シグナルスコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することであって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、インビトロ方法をさらに提供する。
本発明は、がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するための上記のインビトロ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
本発明は、第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
第１および第２の融合タンパク質であって、各融合タンパク質が、検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインを含む、第１および第２の融合タンパク質を含み、
検出ドメインが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、さらなる検出ドメインと協働して同族特異的ヌクレオチド配列に結合することができ、
認識ドメインが、標的分子に結合することができ、
コネクタードメインが、一方の末端で検出ドメインに融合しており、他方の末端で認識ドメインに融合しており、
検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインが互いに異種であり、
本方法が、
（ｉ）試料を第１および第２の融合タンパク質と接触させるステップと、
（ｉｉ）インキュベートして結合を許容するステップと、
（ｉｉｉ）結合していない融合タンパク質を除去するステップと、
（ｉｖ）試料を、同族特異的ヌクレオチド配列を含む核酸と接触させるステップと、
（ｖ）インキュベートして核酸のヘテロ三量体結合を許容するステップと、
（ｖｉ）試料に結合した核酸を検出するステップと、を含み、
核酸がステップ（ｖｉ）で検出された場合、これは、２つの標的分子が試料中に同時に存在することを示す、インビトロ一致アッセイ方法をさらに提供する。
本発明の方法およびキットは、細胞レベルでの分子間の相互作用の検出における、ＦＲＥＴ、増幅を伴うＦＲＥＴ（例えば、ＴＳＡ－ＦＲＥＴ）、近接ライゲーション、および一致検出を含む一致アッセイを提供する。
本発明は、第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するための上記のインビトロ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
本発明の方法、キット、および使用は、シグナル／ノイズ比が改善された低コストの包括的なロバスト方法論における、タンパク質が各々異なる細胞の細胞表面にある、すなわち、トランス形態である２つのタンパク質の相互作用の検出および定量化を初めて提供するという利点を有する。
本発明の新規の使用は、具体的には、タンパク質が異なる細胞で発現される細胞レベルでのタンパク質（好ましくは、内因性タンパク質）間相互作用の研究の課題に対処し、とりわけ、検出および定量化されるリンパ球細胞型および非リンパ球細胞型で発現される免疫チェックポイント阻害剤間の相互作用を可能にする役目を果たすために使用され得る。
したがって、本発明は、チェックポイント阻害剤の有効性を特定し、かつ患者が、がん療法、例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ２、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＭＨＣクラスＩ、抗ＭＨＣクラスＩＩ、抗ＴＣＲ、抗ＣＤ８、および／または抗ＣＤ３療法に応答する可能性が高いかを決定するための改善された方法をもたらし得る。本発明は、患者により的を絞ったがん療法を提供する助けとなるように、がん療法、例えば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－Ｌ２、抗ＣＴＬＡ－４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗ＭＨＣクラスＩ、抗ＭＨＣクラスＩＩ、抗ＴＣＲ、抗ＣＤ８、および／または抗ＣＤ３療法への応答に対して患者を層別化するための改善された方法も提供する。
定義
本発明は、極めて近接した２つの結合剤（例えば、抗体）の検出を可能にする様々な「一致アッセイ」の使用を用いることができる。本発明の例示的な一致アッセイには、フェルスター（蛍光）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、増幅を伴うＦＲＥＴ（例えば、チラミド－シグナル増幅ＦＲＥＴ（ＴＳＡ－ＦＲＥＴ））、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）、生体分子蛍光相補性（ＢｉＦＣ）、酵素断片相補性、および細菌発現系で産生される組換えタンパク質の生体検出器を使用するオリゴヌクレオチド捕捉を伴う一致生体検出が含まれる。
「近接ライゲーションアッセイ」とは、極めて近接した２つの結合剤の検出を可能にする一致アッセイを指す。異なる抗原は、サークル形成オリゴヌクレオチドで共有結合的に修飾された種特異的二次結合剤によって結合される種の異なる一次結合剤によって検出される。サークル形成オリゴヌクレオチドは、ライゲートされ得、ローリングサークル増幅および蛍光検出の鋳型として使用され得る。あるいは、種の異なる一次結合剤は、サークル形成オリゴヌクレオチドと直接ライゲートされ得、サークル形成オリゴヌクレオチドは、ライゲートされ得、ローリングサークル増幅および蛍光検出の鋳型として使用され得る。これらの方法は、最大約４０ｎｍの抗体距離を検出し得る。好ましくは、これらの方法は、最大約２８ｎｍの抗体距離を検出し得る。
「一致生体検出」とは、２つの標的分子の一致を検出する方法を指す。本方法は、２つの融合タンパク質を含み、各融合タンパク質は、検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインを含む。検出ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインを含み得、さらなる検出ドメインと協働して同族特異的ヌクレオチド配列に結合することができる。認識ドメインは、標的分子に結合することができる。コネクタードメインは、一方の末端で検出ドメインに融合しており、他方の末端で認識ドメインに融合している。検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインは、互いに異種である。本方法は、（ｉ）試料を融合タンパク質と接触させるステップと、（ｉｉ）インキュベートして結合を許容するステップと、（ｉｉｉ）結合していない融合タンパク質を除去するステップと、（ｉｖ）試料を、同族特異的ヌクレオチド配列を含む核酸と接触させるステップと、（ｖ）インキュベートして核酸のヘテロ三量体結合を許容するステップと、（ｖｉ）試料に結合した核酸を検出するステップとを含む。核酸がステップ（ｖｉ）で検出された場合、これは、２つの標的分子が前記試料中に同時に存在することを示す。かかる方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１１／１６１４２０に開示されている。
より具体的には、これは、２つのはっきりと異なる親和性プローブ（認識モジュールを有する融合タンパク質）が極めて近接した２つの標的タンパク質における２つの異なる部位／エピトープに結合する一致結合アッセイを指す。本方法は、細菌発現系で産生される組換えタンパク質の生体検出器を使用し得る。融合タンパク質の検出ドメインは、それらの標的二本鎖ＤＮＡ配列（ＤＮＡコンセンサス配列と称される）とヘテロ三量体複合体を形成し得る。各々がリンカー（コネクタードメイン）によって連結された検出モジュールおよび認識モジュールを含む組換え融合タンパク質が、本アッセイで使用され得る。リンカーは、５ｎｍ～４０ｎｍの長さを有し得る。好ましくは、リンカーは、５ｎｍ～３０ｎｍ、より好ましくは５ｎｍ～２０ｎｍ、または５ｎｍ～１０ｎｍの長さを有する。リンカーは、１０ｎｍ、２０ｎｍ、もしくは３０ｎｍの最小長さ、または４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、もしくは１０ｎｍの最大長さも有し得る。シグナルは、検出ドメインがそれらのＤＮＡコンセンサス配列に同時に結合してヘテロ三量体複合体を形成し、かつ認識ドメインが極めて近接したそれらの特異的エピトープ標的に結合したときにのみ、生成される。リンカーの長さは、上に詳述されるように、標的エピトープ間の距離を調節するように変化し得る。以下の図は、一致生体検出の原理を示す。
Figure 0007286627000001
「フェルスター（蛍光）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）」も、極めて近接した２つの結合剤（例えば、抗体）の検出を可能にする一致アッセイで使用され得る。ＦＲＥＴは、本方法で単独で、または酵素活性化系（例えば、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ））等の増幅と組み合わせて使用され得る。
ＦＲＥＴとは、エネルギーが無放射双極子間相互作用により励起されたＦＲＥＴ（ドナー）フルオロフォアから隣接するＦＲＥＴ（アクセプター）フルオロフォアに移動する光物理的プロセスである。エネルギー移動の効率は、距離の６乗に逆比例して変化し、ドナーフルオロフォアとアクセプターフルオロフォアを分離し、それ故に、ＦＲＥＴが生じ得る距離が９ｎｍに制限される。したがって、ＦＲＥＴは、分子の近接性を測定するために使用される「化学定規」である。
以下の図は、ＦＲＥＴの原理を示す。
Figure 0007286627000002
ＦＲＥＴは、蛍光色素対で標識された極めて近接した（１０ｎｍ未満の）２つのタンパク質間の相互作用（会合または解離）の測定を可能にする。
「ＦＲＥＴドナー」とは、ＦＲＥＴアクセプターよりも短い励起／発光波長を有する発色基質または蛍光発生基質を指す。上の図では、ＦＲＥＴドナーは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）である。
「ＦＲＥＴアクセプター」とは、ＦＲＥＴドナーよりも長い励起／発光波長を有する発色基質または蛍光発生基質を指す。上の図では、ＦＲＥＴアクセプターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である。
ドナー発色団（ＦＲＥＴドナー）は、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルが重複したときに、アクセプター分子（ＦＲＥＴアクセプター）を励起する。ＦＲＥＴドナー分子とＦＲＥＴアクセプター分子は、極めて近接（１０ｎｍ未満）していなければならない。ドナーとアクセプターとの間の距離が１０ｎｍ未満である場合、アクセプターの励起が生じ、測定可能な蛍光レポーターシグナルを提供する。レポーターシグナルの検出と同様に、レポーターシグナルを定量化することも可能である。このアプローチを使用して、ドナー発色団とアクセプター発色団との間の距離を決定することができる。このアプローチを使用して、タンパク質間相互作用、タンパク質－脂質相互作用、タンパク質－ＤＮＡ相互作用、およびタンパク質の立体構造変化、例えば、個々のタンパク質の立体構造修飾状態および翻訳後修飾状態を測定することもできる。
ＦＲＥＴ効率（Ｅ）とは、エネルギー移動遷移の量子収率、すなわち、ＦＲＥＴドナー励起事象毎に生じるエネルギー移動事象の分率である。
Figure 0007286627000003
 式中、ｋETｋETは、エネルギー移動速度であり、ｋf ｋf は、放射減衰速度であり、ｋi ｋi は、任意の他の脱励起経路の速度定数である。
ＦＲＥＴ効率は、ドナーとアクセプターとの間の距離、ＦＲＥＴドナー発光スペクトルとＦＲＥＴアクセプター吸収スペクトルとのスペクトル重複、およびＦＲＥＴドナー発光双極子モーメントとＦＲＥＴアクセプター吸光双極子モーメントとの相対配向を含む多くの物理的パラメータに依存する。
ＥＥは、ＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターとの分離距離ｒｒに依存し、逆６乗法則は、双極子－双極子カップリング機構に起因する。
Figure 0007286627000004
 式中、Ｒ0 Ｒ0 は、このＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターとの対のフェルスター距離である。これは、エネルギー移動効率が約５０％である距離である。
本発明のドナーには、ＯＲＧ ４８８、ＧＦＰ、フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、およびＡＴＴＯ４８８が含まれる。
本発明のアクセプターには、ＡＬＸ ５９４、ｍＲＦＰ、フルオレセイン、テトラメチルローダミン、ダブシル、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ならびにＱＳＹ ７色素およびＱＳＹ ９色素が含まれる。
上記のドナーとアクセプターとの対の組み合わせが本発明に包含される。
他の例示的なドナー－アクセプター対には、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）－黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＹＦＰ－ＣＦＰ、ＯＲＧ４８８－ＡＬＸ５９４、およびＡＴＴＯ４８８－ＡＬＸ５９４が含まれる。
ドナーおよびアクセプターは、２つの異なる型のもの（異種ＦＲＥＴ）または同じ型のもの（同種ＦＲＥＴ）であり得る。同種ＦＲＥＴの場合、スペクトル差は、ＦＲＥＴを検出および測定するために使用されない。代わりに、ドナーおよびアクセプターを励起する光と発せられる光との間の異方性の差が検出および測定され得る。同種ＦＲＥＴを検出するための例示的な方法には、ＦＲＥＴ異方性イメージングが含まれる。定量化された異方性のレベル（励起ビームと発光ビームとの間の偏光の差）により、いくつのＦＲＥＴ事象が生じたかの指標が提供される。
以下の表は、例示的なＦＲＥＴドナー－アクセプター対をそれらの典型的なＲ0 値とともに提供する。
Figure 0007286627000005
ドナーまたはアクセプターによって発せられた蛍光の変化を監視することによってＦＲＥＴ効率を測定する方法がいくつか存在する。増感発光、光退色ＦＲＥＴ、および寿命測定等のこれらの方法は、当業者に既知であり、本発明に包含される。
ＦＲＥＴの例示的な使用には、タンパク質の構造および立体構造の決定、タンパク質複合体の分布および集合の決定、受容体／リガンド相互作用の決定、免疫アッセイ、酵素アッセイ、単一分子間相互作用の精査、核酸の構造および立体構造の決定、リアルタイムＰＣＲアッセイおよびＳＮＰ検出、核酸ハイブリダイゼーションの検出、突然変異を検出するためのプライマー伸長アッセイ、自動ＤＮＡ配列決定、脂質の分布および輸送の決定、膜融合アッセイ、膜電位感知、環状ＡＭＰおよびカルシウムの指標、ならびに乳房腫瘍等の腫瘍におけるＡｋｔ活性化の検出および定量化が含まれる。
「一致ＦＲＥＴ」または「二部位」ＦＲＥＴは、２つのはっきりと異なる部位上の単一タンパク質をドナーとアクセプターとの対で同時に標識し、かつそれらの間のＦＲＥＴを検出する方法を説明する。
「酵素活性化系」とは、少なくとも１つの酵素が当業者に既知の任意の様式で特異的結合対のメンバーにカップリングされる酵素系を指す。例えば、酵素は、特異的結合対にコンジュゲートまたは融合し得る。本発明では、特異的結合対は、抗体上にあり得る。ある特定の実施形態では、特異的結合対は、第１の一次抗体、第２の一次抗体、第１の二次抗体、および第２の二次抗体、ならびにそれらの組み合わせから選択される抗体上にある。
酵素は、単独で、または第２の酵素と一緒にのいずれかで、検出可能に標識された基質を含むコンジュゲートと反応して、活性化コンジュゲートを形成する。活性化コンジュゲートは、その酵素に隣接する分子表面上の受容体（例えば、電子豊富な部分）に結合する。結合は、共有結合により得る。活性化コンジュゲートは、活性化コンジュゲートの受容体（例えば、電子豊富な部分）が見られるいずれの場所にも沈着し得る。分子表面上の受容体（例えば、電子豊富な部分）は、酵素活性化系と反応しない。したがって、検出可能に標識された基質は、検出可能に標識された基質が酵素によって活性化されて活性化コンジュゲートを形成した場合のみ、受容体（例えば、電子豊富な部分）に結合する。酵素の不在下では、検出可能に標識された基質は、活性化コンジュゲートを形成しない。
コンジュゲートの検出可能に標識された基質は、１つ以上の成分を含み得る。一実施形態では、検出可能に標識された基質は、受容体（例えば、電子豊富な部分）の結合部位および検出可能な標識を含む１つの成分を含む。別の実施形態では、基質は、２つの成分を含み、一方の成分が、容体（例えば、電子豊富な部分）の結合部位を含み、検出可能に標識され得る。他方の成分は、酵素がコンジュゲートを活性化するまで、受容体（例えば、電子豊富な部分）への結合を阻止または妨害する構成物を含み得る。
「検出可能に標識された」という用語は、基質が、検出可能な標識に直接カップリングされるか、検出可能な標識に間接的にカップリングされるかのいずれかを意味する。
基質は、当業者に周知の方法を使用して検出可能に標識され得る。
間接標識の場合、基質は、特異的結合対の標識されていない第１のメンバーにカップリングされ得る。活性化コンジュゲートによる活性化および受容体（例えば、電子豊富な部分）への結合後、特異的結合対の第１のメンバーは、検出可能な標識にカップリングされる特異的結合対の第２のメンバーと反応し得る。あるいは、特異的結合対の第１のメンバーは、活性化コンジュゲートによる活性化および受容体（例えば、電子豊富な部分）の結合の前に、レポーターにカップリングされる特異的結合対の第２のメンバーと事前に反応し得る。
本発明では、検出可能な標識は、ＦＲＥＴアクセプターまたはＦＲＥＴドナーを含み得る。好ましい実施形態では、検出可能な標識は、ＦＲＥＴアクセプターを含む。本発明のいくつかの態様では、基質は、チラミドを含む。いくつかの実施形態では、検出可能に標識された基質は、ＦＲＥＴドナーで標識されたチラミドを含む。好ましい実施形態では、検出可能に標識された基質は、ＦＲＥＴアクセプターで標識されたチラミドを含む。
酵素は、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、およびそれらの組み合わせから選択され得る。ある特定の実施形態では、酵素は、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される。好ましい実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される。
「活性化コンジュゲート」という用語は、酵素活性化系に特異的であり、かつその系の酵素によって活性化された検出可能に標識された基質を含むコンジュゲートを指す。活性化後、活性化コンジュゲートは、その酵素に隣接する分子表面上の受容体（例えば、電子豊富な部分）に結合し得る。試料は、活性化コンジュゲートを形成するために酵素に基質の活性化を触媒させるのに十分な反応条件に供される。
酵素に基質の活性化を触媒させるのに十分な反応条件は、当業者に周知である。チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）の場合、用いられる酵素は、水素ペルオキシダーゼであり、検出可能に標識された基質は、検出可能に標識されたチラミドである。反応条件は、水素ペルオキシダーゼが検出可能に標識されたチラミドの活性化を触媒して、検出可能に標識されたチラミドラジカルを含む活性化コンジュゲートを形成するために、過酸化水素の存在を必要とする。好ましい実施形態では、検出可能な標識は、ＦＲＥＴアクセプターまたはＦＲＥＴドナーである。特に好ましい実施形態では、検出可能な標識は、ＡＬＸ５９４またはＯＲＧ４８８である。他の好ましい実施形態では、検出可能な標識は、ＡＬＸ５９４またはＡＴＴＯ４８８である。
好ましい実施形態では、検出可能に標識された基質は、ＦＲＥＴアクセプターで標識されたチラミドを含み、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）は、チラミドを活性化して、ＦＲＥＴアクセプターにカップリングされた反応性の高い短命のチラミドラジカルを含む活性化コンジュゲートを形成し、これらのラジカルは、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に共有結合的にカップリングし得る。好ましい実施形態では、電子豊富な残基は、チロシン残基である。分子表面は、タンパク質または核酸配列であり得る。
「増幅」という用語は、酵素活性化系によって活性化された検出可能に標識された基質を含むコンジュゲートの、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分への結合により、検出可能に標識された基質の検出可能な標識によって提供されるレポーターシグナルの増幅を指す。本発明では、レポーターシグナルは、蛍光を含み得る。いくつかの実施形態では、報告されたシグナルは、ＦＲＥＴアクセプターまたはＦＲＥＴドナーによって発せられた蛍光を含む。好ましい実施形態では、レポーターシグナルは、ＦＲＥＴアクセプターによって発せられた蛍光を含む。
本発明の酵素活性化系は、第１の一次抗体、第２の一次抗体、第１の二次抗体、第２の二次抗体、またはそれらの組み合わせに適用され得るが、但し、その系が第１の二次抗体および第２の二次抗体のうちの少なくとも一方に適用されることを条件とする。
酵素活性化系との関連で「に隣接する」とは、酵素に極めて近接した位置にある受容体を指す。例えば、酵素と受容体との間の距離は、約２～９ｎｍまたは１００ｋＤａ未満の球状タンパク質（好ましくは、２～９ｎｍ、２～７ｎｍ、２～６ｎｍ、２～５ｎｍ、２～４ｎｍまたは２～３ｎｍまたは９０ｋＤａ未満、８０ｋＤａ未満、７０ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満、または１０ｋＤａ未満）であり得る。
本発明の単一の酵素活性化系の１つの特定の実施形態は、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）系である。この系は、レポーターにカップリングされたチラミドを活性化して、反応性の高い短命のチラミドラジカルを含む活性化コンジュゲートを形成する西洋ワサビペルオキシダーゼの触媒活性を利用し、これらのラジカルは、西洋ワサビペルオキシダーゼに隣接する分子表面上のチロシン残基に共有結合的にカップリングし得る。分子表面は、タンパク質または核酸残基であり得る。
ある特定の態様では、細胞試料は、治療前にまたは治療中に患者から得られる。「治療前に対象から得られる」とは、がんの治療を以前に受けた患者、例えば、抗腫瘍剤で以前に治療された患者から得られることを意味し得るか、またはがんの治療を以前に受けていない患者、すなわち、治療を受けていない患者から得られることを意味し得る。
ある特定の態様では、「細胞試料」は、腫瘍細胞試料である。細胞試料は、好ましくは、固定細胞試料である。細胞試料は、患者周辺組織（例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞等）を含む腫瘍細胞試料であり得る。細胞試料は、腫瘍生検であり得る。
「腫瘍細胞」という用語は、がん細胞を含む。これには、原発性腫瘍細胞、二次（転移性）腫瘍細胞、固形腫瘍、および関連患者組織（例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞等）が含まれる。腫瘍試料は、例えば、患者から得られた腫瘍生検または外科的切開であり得る。典型的には、腫瘍試料は、浸潤性腫瘍マージンを含む。腫瘍試料は、転移性病巣から得られ得る。試料は、末梢血を含み得る。患者は、転移性がんを有する疑いのある者であり得る。がんの例としては、メラノーマ、肺癌（例えば、非小細胞肺癌を含む）、乳癌、頭頸部癌、尿路上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない。がんのさらなる例としては、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血液癌、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、上衣腫、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、ユーイングファミリー腫瘍（ＰＮＥＴ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼癌、眼内メラノーマ、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、性腺外胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、下咽頭癌、島細胞癌、腎癌（腎細胞癌）、喉頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇口腔癌、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および他の形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、膵癌、島細胞癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、形質細胞腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、直腸癌、腎細胞癌、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、カポジ肉腫、メラノーマ、小腸癌、軟部組織肉腫、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌、胸腺腫、悪性甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、肉腫、膣癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
「抗ＰＤ－１抗体」または「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」という用語は、例えば、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を妨害するか、ＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２と相互作用しているかとは無関係にＰＤ－１の活性化を遮断するか、またはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２がＰＤ－１と相互作用した時点で誘発されるＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２シグナル伝達経路を遮断することによって、プログラム死１（ＰＤ－１）分子またはＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を標的とする抗体を指す。
「抗ＰＤ－１」または「抗ＰＤ－Ｌ１療法」という用語は、例えば、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２との間の確立された現在の相互作用を妨害するか、またはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との間の未来の相互作用を遮断するか、ＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２と相互作用しているかとは無関係にＰＤ－１の活性化を遮断するか、またはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２がＰＤ－１と相互作用した時点で誘発されるＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２シグナル伝達経路を遮断することによって、プログラム死１（ＰＤ－１）分子またはＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２を標的とする治療方針を意味する。抗ＰＤ－１免疫療法薬の例としては、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、およびピディリズマブが挙げられるが、これらに限定されない。抗ＰＤ－Ｌ１免疫療法薬の例としては、ＢＭＳ－９３６５５９およびアテゾイイズマブが挙げられるが、これらに限定されない。
「抗ＣＴＬＡ－４」または「抗ＣＤ８０／８６」という用語は、例えば、ＣＴＬＡ－４とそのリガンドＣＤ８０もしくはＣＤ８６との間の相互作用を妨害するか、ＣＴＬＡ－４がＣＤ８０もしくはＣＤ８６と相互作用しているかとは無関係にＣＴＬＡ－４の活性化を遮断するか、またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６がＣＴＬＡ－４と相互作用した時点で誘発されるＣＤ８０もしくはＣＤ８６シグナル伝達経路を遮断することによって、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）分子またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を標的とする治療方針を意味する。
「抗ＣＴＬＡ－４療法」または「抗ＣＤ８０／８６療法」という用語は、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）とそのリガンドＣＤ８０もしくはＣＤ８６との間の確立された現在の相互作用を妨害するか、またはＣＴＬＡ－４とＣＤ８０もしくはＣＴＬＡ－４とＣＤ８６との間の未来の相互作用を遮断するか、ＣＴＬＡ－４がＣＤ８０もしくはＣＤ８６と相互作用しているかとは無関係にＣＴＬＡ－４の活性化を遮断するか、またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６がＣＴＬＡ－４と相互作用した時点で誘発されるＣＤ８０もしくはＣＤ８６シグナル伝達経路を遮断することによって、ＣＴＬＡ－４分子またはＣＤ８０およびＣＤ８６を標的とする治療方針を意味する。抗ＣＴＬＡ－４免疫療法薬の例としては、イピリムマブが挙げられるが、これに限定されない。
「抗ＭＨＣクラスＩ」、「抗ＭＨＣクラスＩＩ」、または「抗ＴＣＲ」という用語は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とそのリガンドＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩとの間の相互作用を妨害するか、ＴＣＲがＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩと相互作用しているかとは無関係にＴＣＲの活性化を遮断するか、またはＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩがＴＣＲと相互作用した時点で誘発されるＴＣＲシグナル伝達経路を遮断することによって、ＴＣＲまたはＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩを標的とする治療方針を意味する。
「抗ＴＣＲ療法」、「抗ＭＨＣクラスＩ療法」、または「抗ＭＨＣクラスＩＩ療法」という用語は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とそのリガンドＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩとの間の確立された現在の相互作用を妨害するか、またはＴＣＲとＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩとの間の未来の相互作用を遮断するか、ＴＣＲがＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩと相互作用しているかとは無関係に活性化を遮断するか、またはＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩがＴＣＲと相互作用した時点で誘発されるＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩシグナル伝達経路を遮断することによって、Ｔ細胞受容体分子またはＭＨＣクラスＩもしくはＭＨＣクラスＩＩを標的とする治療方針を意味する。
患者における疾患を「治療すること」またはその「治療」とは、（１）症状または疾患が疾患の症状をまだ呈していないヒトまたは動物に発症するのを予防すること、（２）疾患を阻害することまたはその進行を抑止すること、または（３）疾患もしくは疾患に関連する症状を改善することまたはその退縮を引き起こすことを指す。
結合剤との関連で「免疫学的にはっきりと異なる」とは、異なる宿主種または同じ種由来の異なるアイソタイプで産生された結合剤を指す。本発明の一実施形態では、一次結合剤は、第１の抗体および第２の抗体であり、第１の一次抗体は、第２の一次抗体とは異なる宿主種で産生されるか、または第１の一次抗体は、ある種由来の第１のアイソタイプであり、第２の一次抗体は、同じ種由来の第２のアイソタイプであり、第１のアイソタイプおよび第２のアイソタイプは異なる。例示的な宿主種としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ、またはウマが挙げられる。例えば、第１の一次抗体は、マウスで産生され得、第２の一次抗体は、ウサギで産生され得る。これにより、第１の二次結合剤が一般的な抗マウス抗体（ドナーで標識される）になり、第２の二次結合剤が一般的な抗ウサギ抗体（酵素にコンジュゲートしている）になることが可能になる。これにより、一般的なハイスループット方法論が提供される。好ましい一実施形態では、第１の一次抗体は、抗ＰＤ－１マウス抗体であり、第２の一次抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２ウサギ抗体である。他の好ましい実施形態では、第１の一次抗体は、抗ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８マウス抗体であり、第２の一次抗体は、抗ＣＤ８０またはＣＤ８６ウサギ抗体である。別の好ましい実施形態では、第１の一次抗体は、抗ＭＨＣクラスＩまたはＩＩマウス抗体であり、第２の一次抗体は、抗ＴＣＲウサギ抗体、抗ＣＤ８ウサギ抗体、抗ＣＤ３ウサギ抗体、および／またはそれらの組み合わせである。
「結合剤」とは、別の分子に結合することができる任意の分子を指し、全免疫グロブリン、抗体足場、および抗体または抗原結合断片を必然的に含み得るが、これらに限定されない。
「抗体」は、最も広義に使用され、全免疫グロブリン、ならびに抗体またはその抗原結合断片、例えば、可変ドメインを具体的に包含する。例示的な全免疫グロブリンとしては、全長および天然抗体、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体が挙げられる。
「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る自然発生突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、エピトープとも称される単一の抗原決定基に対して向けられる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、およびファージ抗体ライブラリからの単離を含む、当該技術分野で既知の任意の技法または方法論によって作製され得る。
対照的に、「ポリクローナル抗体」は、典型的には、免疫グロブリンアイソタイプおよび／またはクラスの異種の集団であり、様々なエピトープ特異性も呈する。
「キメラ抗体」とは、重鎖および／または軽鎖の１つ以上の領域またはドメインにおけるアミノ酸配列の一部分または完全なアミノ酸配列が、別の種由来であるか、または別の免疫グロブリンクラスもしくはアイソタイプに属するか、またはコンセンサス配列由来のモノクローナル抗体における対応する配列と同一であるか、それと相同であるか、またはそのバリアントである一種のモノクローナル抗体のタイプを指す。キメラ抗体には、かかる抗体の断片が含まれるが、但し、抗体が、その親抗体の所望の生物学的活性、例えば、同じエピトープへの結合を呈することを条件とする。
「抗体または抗原結合断片」とは、親抗体の可変領域または機能的能力、例えば、特異的エピトープ結合が保持される全長抗体の一部分を指す。本発明の抗体または抗原結合断片は、二次認識のために定常領域に保存されたエピトープを有する。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体断片から形成された他の多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体足場とは、非天然抗原結合タンパク質、ペプチド、または抗体断片を指す。抗体足場としては、アドネクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環式ペプチド、センチリン、システインノット、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメイン、オボディ、およびＴｎ３が挙げられる。
「Ｆａｂ断片」は、抗原に結合する抗体上の領域である断片－抗原結合断片を指す。これは、重鎖および軽鎖の各々の１つの定常および１つの可変ドメインから構成される。これらのドメインは、その断片のアミノ末端に抗原結合部位を形成する。２つの可変ドメインは、それらの特異的抗原上のエピトープに結合する。本発明のＦａｂ断片は、二次抗体認識のために定常領域に保存されたエピトープを有する。
Ｆａｂ断片を調製する方法は当業者に周知であり、例えば、酵素パパインを使用して、全免疫グロブリンを２つのＦａｂ断片およびＦｃ断片に切断することができる。
Ｆａｂ断片は、当業者に既知の方法を使用してさらに切断されて、Ｆ（ａｂ’）2 およびＦａｂ’断片を形成することができる。例えば、酵素ペプシンを使用して、ヒンジ領域下のＦａｂ断片を切断して、Ｆ（ａｂ’）2 断片およびｐＦｃ’断片を産生することができる。あるいは、酵素ＩｄｅＳ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の免疫グロブリン分解酵素、商標名ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ）を使用して、配列特異的様式でＩｇＧを中性ｐＨで切断して、Ｆ（ａｂ’）2 断片を産生することができる。Ｆ（ａｂ’）2 断片は、例えば、穏和な還元によって、２つのＦａｂ’断片に分割され得る。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片とは、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶH ）軽鎖可変ドメイン（ＶL ）を含む一本鎖Ｆｖバリアントであり、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在し、抗原を認識し、それに結合することができる。本発明のｓｃＦｖ断片は、二次抗体認識のために定常領域に保存されたエピトープを有する。ｓｃＦｖポリペプチドは、任意選択的に、ｓｃＦｖが抗原結合のために所望の三次元構造を形成することを可能にする、ＶH ドメインとＶL ドメインとの間に位置付けられたポリペプチドリンカーを含む。
ｓｃＦｖを産生するための方法は、当業者に周知である。例えば、別個のＶH 鎖およびＶL 鎖が、一緒に融合し得る。ｓｃＦｖは、Ｆａｂ断片のサイズのおよそ半分であり、親抗体の本来の特異性を依然として保持する。
「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指す。Ｅａｃｈ断片は、ＶL に連鎖されてＶH －ＶL またはＶL －ＶH ポリペプチドを形成するＶH ドメインを含む。同じ鎖上のこれらの２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎる同じ鎖リンカーを使用することにより、連結されたＶH －ＶL ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成させられ、２つの抗原結合部位を作製する。
「直鎖状抗体」とは、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶH －ＣH １－ＶH －ＣH １）を含む抗体を指す。直鎖状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
本発明の抗体、抗体足場、および抗体またはその抗原結合断片は、タグ付けされ得る。好ましい実施形態では、タグは、ＦＬＡＧである。
「一次結合剤」とは、別の分子に結合することができる任意の分子を指し、全免疫グロブリン、抗体足場、および抗体または抗原結合断片を必然的に含み得るが、これらに限定されない。例えば、一次結合剤は、タンパク質、ＤＮＡ、または脂質等の分子上の第１の部位に結合する抗体、抗体足場、または抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。一次結合剤は、分子上の部位に対する結合特異性を有する。第１の一次結合剤は、タンパク質等の分子上の第１の部位に結合する。
好ましい実施形態では、第１の部位は、ＰＤ－１である。第２の一次結合剤は、タンパク質等の分子上の第２の部位に結合する。好ましい実施形態では、第２の部位は、ＰＤ－Ｌ１である。
他の好ましい実施形態では、第１の部位は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８である。第２の一次結合剤は、タンパク質等の分子上の第２の部位に結合する。好ましい実施形態では、第２の部位は、ＣＤ８０またはＣＤ８６である。
別の好ましい実施形態では、第１の部位は、抗ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドである。第２の一次結合剤は、タンパク質等の分子上の第２の部位に結合する。好ましい実施形態では、第２の部位は、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、および／またはそれらの組み合わせである。
好ましい実施形態では、一次結合剤は、標識されていない。他の実施形態では、一次結合剤は、標識されていてもよい。例えば、標識は、ＦＬＡＧタグ等のタグであり得る。
本発明の実施形態では、一次結合剤は、全免疫グロブリン、抗体足場、または抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。上記の組み合わせも想定される。好ましい抗体断片は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片である。例えば、本発明の方法では、第１の一次抗体および第２の一次抗体の両方が、全免疫グロブリンであり得る。あるいは、第１の一次抗体および第２の一次抗体の両方が、抗体または抗原結合断片であり得る。いくつかの実施形態では、第１の一次抗体および第２の一次抗体は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、またはそれらの組み合わせである。あるいは、第１の一次は、全免疫グロブリンであり得、第２の一次抗体は、抗体または抗原結合断片であり得るか、または第２の一次抗体は、抗体または抗原結合断片であり得、第２の一次抗体は、全免疫グロブリンであり得る。いくつかの実施形態では、一次抗体は、タグ付けされ得（例えば、ＦＬＡＧタグで）、二次抗体は、タグ（例えば、抗ＦＬＡＧ）に対する結合特異性を有し得る。
「二次結合剤」とは、別の分子に結合することができる任意の分子を指し、全免疫グロブリン、抗体足場、および抗体または抗原結合断片を必然的に含み得るが、これらに限定されない。例えば、二次結合剤は、第１もしくは第２の一次結合剤等の一次結合剤、またはＦＬＡＧタグ等の一次結合剤上の標識に結合する抗体、抗体足場、または抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。
本発明の実施形態では、二次結合剤は、全免疫グロブリン、抗体足場、または抗体もしくはその抗原結合断片であり得る。上記の組み合わせも想定される。好ましい抗体断片は、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片である。特に好ましい実施形態では、少なくとも１つの二次結合剤は、抗体、抗体足場、または抗原結合断片である。好ましい実施形態では、第１の一次結合剤および第２の一次結合剤の両方が、抗体、抗体足場、または抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、第１の二次結合剤および第２の二次結合剤は、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、またはそれらの組み合わせである。あるいは、第１の二次結合剤は、抗体、抗体足場、または抗原結合断片であり得、第２の二次結合剤は、全免疫グロブリンであり得るか、または第１の二次結合剤は、全免疫グロブリンであり得、第２の二次結合剤は、抗体、抗体足場、または抗原結合断片であり得る。いくつかの実施形態では、第１の二次結合剤および第２の二次結合剤はいずれも全免疫グロブリンではない。第１の二次結合剤および第２の二次結合剤の両方が全免疫グロブリンである場合、本発明がいくつかの二次結合剤に機能しないことが見出され、これは、恐らく、ＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターとの間の距離をＦＲＥＴが生じるのに必要とされる距離よりも長くする（１０ｎｍ超）立体構造の問題のためである。一次結合剤および二次結合剤の適用の順序にかかわらず、そうであることが見出された。
いくつかの実施形態では、酵素は、二次結合剤にコンジュゲートまたは融合している。好ましい実施形態では、酵素は、第２の二次結合剤にコンジュゲートまたは融合している。第２の二次結合剤がｓｃＦｖ断片である実施形態では、ｓｃＦｖ断片は、酵素に組換えで融合し得る。
本発明では、第１の部位は、第２の部位とは異なり、ＦＲＥＴが異なる部位間で検出されることが可能になる。好ましい実施形態では、第１の部位および第２の部位は、同じ分子上にある。特に好ましい実施形態では、第１の部位および第２の部位は、同じタンパク質上にある。他の実施形態では、第１の部位および第２の部位は、異なる分子、例えば、複合体中の異なるタンパク質上にある。好ましくは、単離された試料中で検出されるタンパク質は、内因性タンパク質である。
「単離された」試料とは、対象から単離された生体試料、例えば、単離された腫瘍試料である。生体試料には、臓器、組織、細胞、および／または体液が含まれ得る。
「対象」という用語は、任意の動物、具体的には、ヒト、家畜化動物および家畜、ならびに動物園の動物、競技用動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含む哺乳動物に分類される動物を指す。好ましくは、対象は、ヒトである。
本発明との関連での「洗浄ステップ」は、免疫組織化学におけるその通常の意味で使用されて、試料が生理食塩水溶液等の許容される溶液で洗浄されることを意味する。例えば、洗浄ステップを使用して、前のステップから任意の結合していない結合剤を除去するか、または活性化コンジュゲートを形成するように活性化されていない任意の検出可能に標識された基質を除去することができる。
「チェックポイントタンパク質」は、当該技術分野で既知である。通常の生理学的条件下で、免疫チェックポイントは、免疫系が病原性感染に応答しているときに、自己免疫を予防し、組織を損傷から保護する。チェックポイントタンパク質の発現は、免疫耐性機構の一部として腫瘍によって調節不全になり得る。免疫チェックポイントタンパク質は、免疫チェックポイント経路活性化剤または阻害剤であり得、抗腫瘍免疫応答を提供することによって様々ながんの治療に、または炎症性疾患に使用されて、免疫応答の分解能を向上させることができる。具体的には、チェックポイントタンパク質の阻害または活性化により、抗原特異的Ｔ細胞応答の増幅が提供され得る。例示的なチェックポイントタンパク質としては、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、ＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）、ＰＤ２リガンド（ＰＤ－Ｌ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、Ｂ７ファミリータンパク質、ＴＮＦファミリータンパク質、ＣＤ４０Ｌ、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、Ｂ７関連タンパク質１（Ｂ７ＲＰ１）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ガラクチン９（ＧＡＬ９）、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）、誘発性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、インターロイキン（ＩＬ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ならびにＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドが挙げられる。好ましいチェックポイント標的は、ＰＤ－１である。ＰＤ－Ｌ１も好ましいチェックポイント標的である。ＣＴＬＡ－４は、好ましいチェックポイント標的である。ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドも好ましいチェックポイント標的である。ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、およびＴＩＭ３も好ましいチェックポイント標的である。
ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、およびＴＩＭ３は、阻害性受容体である。ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ３、およびＢ７－Ｈ４は、阻害性リガンドである。これらは全て、様々ながん治療のために臨床開発を経ている。
ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞で排他的に発現され、そこで、ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞活性化の初期段階の振幅を主に調節する。主に、ＣＴＬＡ－４は、Ｔ細胞共刺激受容体ＣＤ２８の活性と対抗する。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ－４は、同一のリガンドＣＤ８０（別名、Ｂ７．１）およびＣＤ８６（別名、Ｂ７．２）を共有する。
ＰＤ－１は、感染への炎症応答時に末梢組織におけるＴ細胞の活性を制限し、かつ自己免疫を制限する免疫チェックポイント受容体である。ＰＤ－１発現は、Ｔ細胞が活性化されたときに誘導される。その２つのリガンドＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２（Ｂ７ファミリーメンバー）のうちの一方によって会合されると、ＰＤ－１は、Ｔ細胞活性化に関与するキナーゼを阻害する。ＰＤ－Ｌ１は、ＣＤ８０とも相互作用し得る。
膜結合型リガンドのＢ７ファミリーは、共刺激受容体および阻害性受容体の両方に結合し得る。Ｂ７ファミリーメンバーの全ておよびそれらの既知のリガンドは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。
同族ＴＮＦ受容体ファミリー分子に結合する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバーは、調節リガンド－受容体対の第２のファミリーを代表するものである。これらの受容体は、それらの同族リガンドによって会合されたときに、主に共刺激シグナルを伝達する。
Ｔ細胞の活性化を調節するシグナル別の主要なカテゴリーは、微環境下における可溶性サイトカインに由来する。Ｔ細胞とＡＰＣとの間の伝達は、二方向性である。いくつかの場合では、これは、リガンド自体がＡＰＣにシグナル伝達したときに生じる。他の場合では、活性化Ｔ細胞は、ＡＰＣ上の同族受容体を会合するＣＤ４０Ｌ等のリガンドを上方調節する。Ａ２ａＲ（アデノシンＡ２ａ受容体）、Ｂ７ＲＰ１（Ｂ７関連タンパク質１）、ＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター）、ＧＡＬ９（ガレクチン９）、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリーメディエーター）、ＩＣＯＳ（誘発性Ｔ細胞共刺激因子）、ＩＬ（インターロイキン）、ＫＩＲ（キラー細胞免疫グロブリン様受容体）、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）、ＰＤＬ（ＰＤ－１リガンド）、ＴＧＦβ（形質転換成長因子－β）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３）。
「チェックポイント標的分子」とは、本発明の一致アッセイ方法によって標的とされるタンパク質等の分子を指す。上で説明されるように、「チェックポイント」とは、自己免疫を予防し、免疫系が病原性感染に応答しているときに組織を損傷から保護する免疫チェックポイントである。チェックポイントタンパク質の発現は、免疫耐性機構の一部として腫瘍によって調節不全になり得る。例示的なチェックポイント標的分子としては、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、ＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）、ＰＤ２リガンド（ＰＤ－Ｌ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、Ｂ７ファミリータンパク質、ＴＮＦファミリータンパク質、ＣＤ４０Ｌ、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、Ｂ７関連タンパク質１（Ｂ７ＲＰ１）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ガラクチン９（ＧＡＬ９）、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）、誘発性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、インターロイキン（ＩＬ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ならびにＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドが挙げられる。好ましいチェックポイント標的は、ＰＤ－１である。ＰＤ－Ｌ１も好ましいチェックポイント標的である。ＣＴＬＡ－４は、好ましいチェックポイント標的である。ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドも好ましいチェックポイント標的である。ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、およびＴＩＭ３も好ましいチェックポイント標的である。
「チェックポイント活性化剤」とは、免疫チェックポイント経路を活性化するタンパク質等の分子を意味する。例示的なチェックポイント活性化剤としては、ＣＤ４０（ＴＮＦＳＦＲ５）アゴニスト、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体、ＴＮＦＳＦＲ１８）刺激因子、ＯＸ４０（ＣＤ１３４、ＴＮＦＳＦＲ４）アゴニスト、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＳＦＲ９）アゴニスト、ＣＤ２７（ＴＮＦＳＦＲ７）アゴニスト、ＩＣＯＳ（誘発性共刺激因子）分子アゴニスト、Ｔｒａｉｌ受容体アゴニスト、および／またはＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリーメディエーター）受容体アゴニストを含む、ＴＮＦ受容体およびＢ７－ＣＤ２８スーパーファミリー由来のものが挙げられる。好ましいチェックポイント活性化剤としては、ＯＸ－４０、ＧＩＴＲ、および／または４－１ＢＢアゴニストが挙げられる。
「チェックポイント阻害剤」とは、免疫チェックポイント経路を阻害するタンパク質等の分子を意味する。例示的なチェックポイント阻害剤としては、抗ＰＤ－１結合剤、抗ＰＤ－Ｌ１結合剤、抗ＰＤ－Ｌ２結合剤、抗ＣＴＬＡ－４結合剤、抗ＭＨＣクラスＩ結合剤、および／または抗ＭＨＣクラスＩＩ結合剤が挙げられる。例示的な抗ＣＴＬＡ－４結合剤は、イピリムマブである。例示的な抗ＰＤ－１結合剤としては、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＤＸ １１０６、またはＯＮＯ－４５３８）およびペムブロリズマブ（イアムブロリズマブまたはＭＫ－３４７５）が挙げられる。
例示的なチェックポイント阻害剤としては、イピリムマブ、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＤＸ １１０６、またはＯＮＯ－４５３８）、ペムブロリズマブ（イアムブロリズマブまたはＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－Ｑ１ １）、ＥＤ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＡＭＰ－２２４、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１ １０５）、ＥＤ ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４８）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ならびにそれらの断片および塩を含むか、またはそれらからなる群から選択されるものが挙げられる。
本発明の方法
本発明の方法は、細胞間相互作用、具体的には、各々異なる細胞の細胞表面にある２つのタンパク質の相互作用の検出および定量化に使用され得る。好ましくは、単離された試料中で検出されるタンパク質は、内因性タンパク質である。
有利には、本発明の方法およびキットは、アクセプター発色団の存在下でのドナー発色団の寿命の低下を測定することによってＦＲＥＴを定量的に計算することによって、細胞間相互作用を測定することができる。したがって、本発明は、試料における第１の細胞で発現される１つの分子および第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用の総量の平均測定値を提供する。これにより、測定可能な相互作用の改善されたダイナミックレンジがもたらされ、これは、がん患者をいくつかの群に層別化して療法によく応答するであろう患者を決定し、かつある細胞の別の細胞への結合を調節する新治療薬等の治療薬の有効性も層別化する臨床状況において有用である。
本発明の方法の例示的な使用は、ＰＤ－１と、様々ながんにおける腫瘍進行に関与すると特定された免疫チェックポイントタンパク質であるＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との相互作用の試験における使用である。
本発明の方法のさらなる例示的な使用は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８と、様々ながんにおける腫瘍進行に関与すると特定された免疫チェックポイントタンパク質であるＣＤ８０またはＣＤ８６との相互作用の試験における使用である。
本発明の方法のさらなる例示的な使用は、ＭＨＣ－ペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ）とＴＣＲ（またはＣＤ８もしくはＣＤ３）との相互作用の試験における使用である。具体的には、本発明の方法は、Ｔ細胞上のＴＣＲ複合体のメンバー（例えば、ＴＣＲもしくはＣＤ８またはＣＤ３複合体の任意のメンバー）と、抗原ペプチドと複合体形成されたＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩとの間の相互作用の検出および／または定量化使用され得る。
本発明の方法を使用して、本明細書に例証されるもの等の他の免疫チェックポイントタンパク質間の相互作用を試験することもできる。
本発明の方法は、高感度であり、定量的であり、従来の結合剤を使用して（改変された）分子経路の局在化の決定を可能にする。かかる方法は、薬力学的マーカーの検出に役立ち、新規の小分子阻害剤の創薬／開発を促進する。
本発明の方法は、好ましくは、一致アッセイを利用する。
本発明の方法は、蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ＦＬＩＭ）による検出と組み合わせて使用され得る。時間分解ＦＲＥＴは、単一細胞にかかる情報を提供し得る。
増幅を伴わない二部位ＦＲＥＴ
一態様では、本発明は、増幅を伴わない二部位ＦＲＥＴを使用する。
本発明の増幅を伴わない二部位ＦＲＥＴ法では、この方法論は、異なる標的分子に結合し、免疫学的にはっきりと異なる少なくとも２つの一次結合剤と、それぞれの一次結合剤に結合し、それぞれ、ＦＲＥＴドナーおよびＦＲＥＴアクセプターで標識される少なくとも２つの二次結合剤とを用いる。具体的には、第１の一次結合剤は、第１の細胞上の第１の分子（例えば、チェックポイント標的タンパク質）に結合し、第２の一次結合剤は、第２の細胞上の第２の分子（例えば、別のまたは異なるチェックポイント標的タンパク質）に結合し、第１の一次結合剤および第２の一次結合剤は、免疫学的にはっきりと異なる。第１の二次結合剤は、ＦＲＥＴドナーで標識されており、第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤は、ＦＲＥＴアクセプターで標識されており、第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤は、第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤は、第１の一次結合剤に結合しない。
結合された第１の二次結合剤上のＦＲＥＴドナーが第２の二次結合剤上のＦＲＥＴアクセプターに十分に極めて近接している（１０ｎｍ以下）実施形態では、正のＦＲＥＴシグナルが検出され得る。
結合された第１の二次結合剤上のＦＲＥＴドナーが第２の二次結合剤上のＦＲＥＴアクセプターに十分に極めて近接していない（１０ｎｍ超）場合、ＦＲＥＴシグナルは、減少するか、または不在であろう。
第１の分子または第２の分子のいずれかまたはそれらのいずれも試料中に存在しない場合、ＦＲＥＴシグナルは検出されないであろう。
一例では、一次全免疫グロブリン抗ＰＤ－１（マウス）および抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔ３０８）（ウサギ）が、がん患者由来の固定腫瘍細胞試料と接触する。二次Ｆａｂ断片抗マウス－ＯＲＧ４８８および抗ウサギ－ＡＬＸ５９４が試料と接触し、それぞれ、抗ＰＤ－１（マウス）および抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔ３０８）（ウサギ）抗体に結合する。正のＦＲＥＴシグナルが、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１が異なる細胞の細胞表面上で極めて近接している（１０ｎｍ以下）ＯＲＧ４８８とＡＬＸ５９４との間に生成される。ＦＲＥＴシグナルが、多周波ドメインＦＬＩＭ（ｍＦＤ－ＦＬＩＭ）によって時間分解様式で検出され得る。
増幅を伴う二部位ＦＲＥＴ
別の態様では、本発明は、少なくとも２つの一次結合剤、少なくとも２つの二次結合剤、およびコンジュゲート（例えば、二部位ＴＳＡ－ＦＲＥＴ等の増幅を伴う二部位ＦＲＥＴ）を用いる方法論を提供する。
第１の一次結合剤は、第１の細胞上の第１の分子（例えば、チェックポイント標的タンパク質）に結合し、第２の一次結合剤は、第２の細胞上の第２の分子（例えば、別のまたは異なるチェックポイント標的タンパク質）に結合し、第１の一次結合剤および第２の一次結合剤は、免疫学的にはっきりと異なる。
第１の二次結合剤は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーで標識されており、第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤は、酵素にコンジュゲートしており、第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤は、第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤は、第１の一次結合剤に結合しない。
コンジュゲートは、ＦＲＥＴアクセプターおよび酵素に特異的な基質を含み、基質が酵素と反応すると、活性化コンジュゲートになり、活性化コンジュゲートは、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する。
本発明の方法は、細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させるステップと、試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させるステップと、洗浄ステップを行うステップと、試料をコンジュゲートと接触させるステップと、ＦＲＥＴアクセプターによって生成されたいずれのＦＲＥＴシグナルも検出するステップとを含み得る。
本発明の方法を使用して、第１の分子および第２の分子が低レベルで発現される場合でさえも、第１の分子と第２の分子が空間的に極めて近接している（９ｎｍ以下）場合にＦＲＥＴシグナルを検出することが可能である。
本発明の方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、細胞試料と接触する。少なくとも２つの一次結合剤は、互いに同時にまたは互いに順次に試料と接触し得る。したがって、第１の一次結合剤が試料と最初に接触し得、その後、第２の一次結合剤が試料と接触し得る。あるいは、第２の一次結合剤が試料と最初に接触し得、その後、第２の一次結合剤が試料と接触し得る。第１の一次結合剤および第２の一次結合剤が互いに順次に試料と接触する場合、任意選択的な洗浄ステップは、ステップ間でその順に行われ得る。
第１の一次結合剤は、試料中に存在する第１の細胞上の任意の第１の分子に結合し、第２の一次結合剤は、試料中に存在する第２の細胞上の任意の第２の分子に結合する。任意選択的な洗浄ステップは、任意の結合していない一次結合剤を除去する。
少なくとも２つの二次結合剤は、少なくとも２つの一次結合剤と同時に細胞試料と接触し得るか、または少なくとも２つの一次結合剤は、少なくとも２つの二次結合剤の前に試料と接触し得る。少なくとも２つの二次結合剤は、互いに同時にまたは互いに順次に試料と接触し得る。したがって、第１の二次結合剤が試料と最初に接触し得、その後、第２の二次結合剤が試料と接触し得る。あるいは、第２の二次結合剤が試料と最初に接触し得、その後、第１の二次結合剤が試料と接触し得る。第１の二次結合剤および第２の二次結合剤が互いに順次に試料と接触する場合、任意選択的な洗浄ステップは、ステップ間でその順に行われ得る。少なくとも２つの一次結合剤が少なくとも２つの二次結合剤の前に試料と接触する実施形態では、任意選択的な洗浄ステップは、少なくとも２つの一次結合剤の投与と少なくとも２つの二次結合剤の投与との間で行われ得る。
第１の二次結合剤は、第１の一次結合剤に結合し、第２の一次結合剤は、第２の一次結合剤に結合する。任意選択的な洗浄ステップは、いずれの結合していない二次結合剤、または第１もしくは第２の部位に結合していない一次結合剤（すなわち、結合していない一次結合剤）に結合しているいずれの二次結合剤も除去する。
少なくとも２つの一次結合剤および少なくとも２つの二次結合剤を試料と接触させた後、洗浄ステップは、コンジュゲートが試料と接触する前に行われる。洗浄ステップは、その標的（例えば、第１の部位、第２の部位、第１の一次結合剤、または第２の一次結合剤）に結合していないいずれの結合剤（一次または二次）も除去する。本発明の方法では、生理食塩水溶液または別の好適な溶液を使用して、洗浄ステップを行うことができる。洗浄ステップに使用される条件は、当業者に周知である。
いくつかの態様では、洗浄ステップ後、コンジュゲートが試料と接触する。第２の一次結合剤が第２の分子に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合している場合、コンジュゲートの基質は、第２の二次結合剤にコンジュゲートして活性化コンジュゲートを形成する酵素と反応する。活性化コンジュゲートは、その酵素に隣接する分子表面（例えば、タンパク質表面）上の電子豊富な部分に結合するであろう。この酵素は、複数のコンジュゲートを活性化することができ、複数の活性化コンジュゲートの、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分への結合を提供する。これは、第２の部位の近くで結合されたＦＲＥＴアクセプターを含む活性化コンジュゲートの数を増幅する。
ＦＲＥＴアクセプターによって生成されたいずれのＦＲＥＴシグナルも検出される。
結合された第１の二次抗体上のＦＲＥＴドナーが結合された活性化コンジュゲート上のＦＲＥＴアクセプターに十分に極めて近接している（１０ｎｍ以下）実施形態では、正のＦＲＥＴシグナルが検出され得る。
結合された第１の二次抗体上のＦＲＥＴドナーが結合された活性化コンジュゲート上のＦＲＥＴアクセプターに十分に極めて近接していない（１０ｎｍ超）場合、ＦＲＥＴシグナルは、減少するか、または不在であろう。
第１の分子または第２の分子のいずれかまたはそれらのいずれも試料中に存在しない場合、ＦＲＥＴシグナルは検出されないであろう。
本発明の別の態様では、酵素活性化系は、第２の二次結合剤に加えて第１の二次結合剤に適用され得る。これにより、ＦＲＥＴドナーシグナルおよびＦＲＥＴアクセプターシグナルの両方が有利に増幅される。この態様では、第１の二次結合剤は、ＦＲＥＴドナーの代わりに酵素にコンジュゲートしている。本方法は、ＦＲＥＴドナーおよび酵素に特異的な基質を含む第２のコンジュゲートをさらに用い、基質が酵素と反応すると、第２の活性化コンジュゲートが生じ、第２の活性化コンジュゲートは、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する。基質は、第２の二次結合剤にコンジュゲートしている酵素と反応しない。
本発明の方法は、適宜に適応される。例えば、本方法は、試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させるステップと、試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させるステップと、洗浄ステップを行うステップと、試料を、第１の二次結合剤にコンジュゲートしている酵素に特異的な第１のコンジュゲートおよび第２の二次結合剤にコンジュゲートしている酵素に特異的な第２のコンジュゲートと接触させるステップと、ＦＲＥＴアクセプターによって生成されたいずれのＦＲＥＴシグナルも検出するステップとを含み得る。第１のコンジュゲートは、第２のコンジュゲートに同時にまたは順次に適用され得る。例えば、第１のコンジュゲートが試料と最初に接触し得、その後、第２のコンジュゲートが試料と接触し得る。あるいは、第２のコンジュゲートが試料と最初に接触し得、その後、第１のコンジュゲートが試料と接触し得る。第１のコンジュゲートおよび第２のコンジュゲートが互いに順次に試料と接触する場合、任意選択的な洗浄ステップは、ステップ間でその順に行われ得る。
結合された第１の活性化コンジュゲート上のＦＲＥＴドナーが結合された第２の活性化コンジュゲートのＦＲＥＴアクセプターに十分に極めて近接している（１０ｎｍ以下）実施形態では、正のＦＲＥＴシグナルが検出され得る。
結合された第１の活性化コンジュゲート上のＦＲＥＴドナーが結合された第２の活性化コンジュゲート上のＦＲＥＴアクセプターに十分に極めて近接していない（９ｎｍ超）場合、ＦＲＥＴシグナルは、減少するか、または不在であろう。
第１の分子または第２の分子のいずれかまたはそれらのいずれも試料中に存在しない場合、ＦＲＥＴシグナルは検出されないであろう。
本発明の一態様では、一次結合剤は、標識されていない。例えば、一次結合剤は、ＦＲＥＴドナーでもＦＲＥＴアクセプターでも標識されていない。これは、本発明の方法が、多大な時間および費用を必要とするＦＲＥＴドナーまたはＦＲＥＴアクセプターで標識されている個別の結合特異性を有する一次結合剤の産生に依存しない一般的なハイスループット方法論を提供し得るという利点を有する。
一次結合剤は、標識されていてもよい。例えば、一次結合剤は、ＦＲＥＴドナーまたはＦＲＥＴアクセプターで標識されていてもよい。この態様では、二次結合剤は、省かれ得る。あるいは、標識された一次結合剤は、一次結合剤－第２の結合剤対およびコンジュゲートと組み合わせて使用され得る。例えば、ＦＲＥＴアクセプターで標識された第１の一次結合剤は、酵素にコンジュゲートしている第２の二次結合剤によって結合された第２の一次結合剤およびコンジュゲートと組み合わせて使用され得る。この例では、第１の二次結合剤は、省かれ得る。あるいは、ＦＲＥＴアクセプターで標識された第１の二次結合剤によって結合された第１の一次結合剤は、酵素にコンジュゲートしている第２の一次結合剤およびコンジュゲートと組み合わせて使用され得る。この例では、第２の二次結合剤は、省かれ得る。これらの実施形態では、酵素活性化系は、第２の一次／二次結合剤に加えて第１の一次結合剤に適用され得る。これにより、ＦＲＥＴドナーシグナルおよびＦＲＥＴアクセプターシグナルの両方が有利に増幅される。この態様では、第１の一次結合剤は、ＦＲＥＴドナーの代わりに酵素にコンジュゲートしている。本方法は、ＦＲＥＴドナーおよび酵素に特異的な基質を含む第２のコンジュゲートをさらに用い、基質が酵素と反応すると、第２の活性化コンジュゲートが生じ、第２の活性化コンジュゲートは、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する。基質は、第２の一次／二次結合剤にコンジュゲートしている酵素と反応しない。
本発明の方法は、適宜に適応される。例えば、本方法は、試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させるステップと、任意選択的に試料を少なくとも１つの二次結合剤と接触させるステップと、洗浄ステップを行うステップと、試料を、第１の一次／二次結合剤にコンジュゲートしている酵素に特異的な第１のコンジュゲートおよび第２の一次／二次結合剤にコンジュゲートしている酵素に特異的な第２のコンジュゲートと接触させるステップと、ＦＲＥＴアクセプターによって生成されたいずれのＦＲＥＴシグナルも検出するステップとを含み得る。第１のコンジュゲートは、第２のコンジュゲートに同時にまたは順次に適用され得る。例えば、第１のコンジュゲートが試料と最初に接触し得、その後、第２のコンジュゲートが試料と接触し得る。あるいは、第２のコンジュゲートが試料と最初に接触し得、その後、第１のコンジュゲートが試料と接触し得る。第１のコンジュゲートおよび第２のコンジュゲートが互いに順次に試料と接触する場合、任意選択的な洗浄ステップは、ステップ間でその順に行われ得る。
結合された第１の活性化コンジュゲート、第１の一次結合剤、または第１の二次結合剤上のＦＲＥＴドナーが結合された第２の活性化コンジュゲート上のＦＲＥＴアクセプターに十分に極めて近接している（１０ｎｍ以下）実施形態では、正のＦＲＥＴシグナルが検出され得る。
結合された第１の活性化コンジュゲート、第１の一次結合剤、または第１の二次結合剤上のＦＲＥＴドナーが結合された第２の活性化コンジュゲート上のＦＲＥＴアクセプターに十分に極めて近接していない（１０ｎｍ超）場合、ＦＲＥＴシグナルは、減少するか、または不在であろう。
第１の分子または第２の分子のいずれかまたはそれらのいずれも試料中に存在しない場合、ＦＲＥＴシグナルは検出されないであろう。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、２つより多くの一次結合剤を用いる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、２つより多くの二次結合剤を用いる。
本発明の試料は、単離された生体試料、単離された細胞、および組織切片を含む。好ましい実施形態では、試料は、乳房腫瘍組織切片を含む乳房腫瘍試料である。
有利には、本発明で用いられる二次結合剤は、抗体または抗原結合断片、例えば、全免疫グロブリンではなく、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片であり得る。二次結合剤は、Ｆａｂ断片、抗体足場、および全免疫グロブリンの組み合わせ（Ｆａｂ断片混合物）であり得る。二次結合剤に抗体もしくは抗原結合断片（例えば、５０ｋＤａ～１００ｋＤａのサイズ範囲）またはＦａｂ断片混合物を用いる本発明の実施形態が特に有効であることが見出された。具体的な利点は、ＦＲＥＴドナーからＦＲＥＴアクセプター発色団までの距離の低減およびＦＲＥＴ効率の増大、組織の容易な浸透およびそれらの標的への結合である。加えて、それらの固有の特異性は、それらがＦｃ領域を欠き、それ故に、内因性Ｆｃ受容体への非特異的結合に起因するいずれのバックグラウンドも著しく減少するという事実によってさらに強化される。これは、２つの標的部位が同じ分子上にある場合に特に有利である。
本発明のＦＲＥＴ方法と組み合わせた酵素活性化系の使用により、ＦＲＥＴ効率、特に二部位ＦＲＥＴのＦＲＥＴ効率が改善される。以前は、その系のサイズがＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターとの間の距離を増大させ、ＦＲＥＴの損失につながるであろうと予測されていた。しかしながら、本発明者らは、本発明の方法が、改善されたシグナル／ノイズ比、ならびに低費用の一般的かつロバストなハイスループット方法論を提供することを見出した。
有利には、酵素活性化系は、低発現タンパク質、好ましくは、内因性タンパク質の検出を増加させ、一次結合剤の希釈も可能にし、それ自体が非特異的相互作用を減少させ、それ故に、特異性を改善する。
本発明の方法は、バックグラウンドを増加させることなく感度を著しく増加させるという利点を有する。
一例では、一次全免疫グロブリン抗ＰＤ－１（マウス）および抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔ３０８）（ウサギ）が、がん患者由来の固定腫瘍細胞試料と接触する。二次Ｆａｂ断片抗マウス－ＯＲＧ４８８および抗ウサギ－ＨＲＰが試料と接触し、それぞれ、抗ＰＤ－１（マウス）および抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔ３０８）（ウサギ）抗体に結合する。洗浄ステップ後、チラミド（ＴＳＡ）－ＡＬＸ５９４が試料に適用される。ＨＲＰは、ＴＳＡ－ＡＬＸ５９４の複数のコピーの活性化を触媒する。結果として生じた短命のチラミドラジカルは、ＨＲＰに隣接する電子豊富な残基に共有結合的にカップリングし、ＰＤ－Ｌ１標的部位に隣接するＡＬＸ５９４の複数のコピーを沈着させる。チラミドラジカルの短半減期により、ＡＬＸ５９４シグナル局在化の拡散関連損失が最小限に抑えられる。正のＦＲＥＴシグナルが、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１が異なる細胞の細胞表面上で極めて近接している（１０ｎｍ以下）ＯＲＧ４８８とＡＬＸ５９４との間に生成される。ＦＲＥＴシグナルが、多周波ドメインＦＬＩＭ（ｍＦＤ－ＦＬＩＭ）によって時間分解様式で検出され得る。
一態様では、本発明は、高感度定量的一致アッセイに関する。ある特定の実施形態では、二部位ＴＳＡ－ＦＲＥＴは、感度および特異性を最大にするために、免疫蛍光チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）をＦａｂ断片二次抗体コンジュゲートと組み合わせる。
「プラグイン」アルゴリズムを使用して、ｍＦＤ－ＦＬＩＭを自動化することができる。かかる小型機器は、細胞における関心領域（ＲＯＩ）と腫瘍におけるＲＯＩを自動的に区別し、これにより、特定のＲＯＩの公平な選択が可能になる。
本発明の実施形態では、小型自動ｍＦＤ－ＦＬＩＭを二部位ＴＳＡ－ＦＲＥＴと組み合わせて使用して、腫瘍試料におけるＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２の活性化を容易に検出することができる。この方法を使用して、予後的、予測的、および診断的免疫チェックポイント阻害剤について日常的に通知することができる。
有利には、本発明の方法は、多周波ドメインＦＬＩＭ（ｍＦＤ－ＦＬＩＭ）によって検出された時間分解ＦＲＥＴの時空間的特質および定量的特質を、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）システムの感度と組み合わせる。
さらなる一例では、一次全抗ＣＴＬＡ－４または抗ＣＤ２８免疫グロブリン（マウス）および一次全抗ＣＤ８０または抗ＣＤ８６免疫グロブリン（ウサギ）が、がん患者由来の固定腫瘍細胞試料と接触する。二次Ｆａｂ断片抗マウス－ＯＲＧ４８８および抗ウサギ－ＨＲＰが試料と接触し、それぞれ、抗ＣＴＬＡ－４／ＣＤ２８（マウス）および抗ＣＤ８０／ＣＤ８６（ウサギ）抗体に結合する。洗浄ステップ後、チラミド（ＴＳＡ）－ＡＬＸ５９４が試料に適用される。ＨＲＰは、ＴＳＡ－ＡＬＸ５９４の複数のコピーの活性化を触媒する。結果として生じた短命のチラミドラジカルは、ＨＲＰに隣接する電子豊富な残基に共有結合的にカップリングし、ＣＤ８０／ＣＤ８６標的部位に隣接するＡＬＸ５９４の複数のコピーを沈着させる。チラミドラジカルの短半減期により、ＡＬＸ５９４シグナル局在化の拡散関連損失が最小限に抑えられる。正のＦＲＥＴシグナルが、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ２８とＣＤ８０／ＣＤ８６が異なる細胞の細胞表面上で極めて近接している（１０ｎｍ以下）ＯＲＧ４８８とＡＬＸ５９４との間に生成される。ＦＲＥＴシグナルが、多周波ドメインＦＬＩＭ（ｍＦＤ－ＦＬＩＭ）によって時間分解様式で検出され得る。
別の例では、一次全抗ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチド免疫グロブリン（マウス）および一次全抗ＴＣＲ、ＣＤ８、またはＣＤ３免疫グロブリン（ウサギ）が、がん患者由来の固定腫瘍細胞試料と接触する。二次Ｆａｂ断片抗マウス－ＯＲＧ４８８および抗ウサギ－ＨＲＰが試料と接触し、それぞれ、抗ＭＨＣクラスＩ／ＩＩペプチド（マウス）および抗ＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３（ウサギ）抗体に結合する。洗浄ステップ後、チラミド（ＴＳＡ）－ＡＬＸ５９４が試料に適用される。ＨＲＰは、ＴＳＡ－ＡＬＸ５９４の複数のコピーの活性化を触媒する。結果として生じた短命のチラミドラジカルは、ＨＲＰに隣接する電子豊富な残基に共有結合的にカップリングし、ＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３標的部位に隣接するＡＬＸ５９４の複数のコピーを沈着させる。チラミドラジカルの短半減期により、ＡＬＸ５９４シグナル局在化の拡散関連損失が最小限に抑えられる。正のＦＲＥＴシグナルが、ＭＨＣクラスＩ／ＩＩペプチドとＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３が異なる細胞の細胞表面上で極めて近接している（１０ｎｍ以下）ＯＲＧ４８８とＡＬＸ５９４との間に生成される。ＦＲＥＴシグナルが、多周波ドメインＦＬＩＭ（ｍＦＤ－ＦＬＩＭ）によって時間分解様式で検出され得る。当業者であれば、特許請求される方法、使用、およびキットを他の免疫チェックポイント標的対に適用して、細胞レベルでの免疫チェックポイント標的間の相互作用を検出および／または定量化することができることを理解するであろう。
近接ライゲーション
別の態様では、本発明は、ＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合した少なくとも２つの一次結合剤および少なくとも２つの二次結合剤を用いる方法論を提供する。第１の二次結合剤にコンジュゲートまたは融合したＤＮＡ配列は、第２の二次結合剤にコンジュゲートまたは融合したＤＮＡ配列とは異なり得る。ＤＮＡ配列は、ライゲートして、ローリングサークルＤＮＡ増幅によってサークルを形成し、増幅された環状ＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合される。
外部から適用されたＤＮＡプローブは、蛍光標識等の検出可能な標識で標識され得る。ＨＲＰおよび発色団等の他の検出可能な標識が想定される。
第１の一次結合剤は、第１の細胞上の第１の分子（例えば、チェックポイント標的タンパク質）に結合し、第２の一次結合剤は、第２の細胞上の第２の分子（例えば、別のまたは異なるチェックポイント標的タンパク質）に結合し、第１の一次結合剤および第２の一次結合剤は、免疫学的にはっきりと異なる。
第１の二次結合剤は、第１のＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤は、第２のＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、第２の一次ｖに結合する。第１のＤＮＡ配列および第２のＤＮＡ配列は、異なり得る。第１の二次ｖは、第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤は、第１の一次結合剤に結合しない。
ＤＮＡ配列は、ライゲートされてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合される。
より具体的には、ＰＬＡプローブと呼ばれるそれぞれの一次結合剤の定常領域に対して向けられた二次結合剤は、それぞれの一次結合剤に結合する。第１のＰＬＡプローブと呼ばれる第１の一次結合剤の定常領域に対して向けられた第１の二次結合剤は、第１の一次結合剤に結合する。第２のＰＬＡプローブと呼ばれる第２の一次結合剤の定常領域に対して向けられた第２の二次結合剤は、第２の一次結合剤に結合する。第１のＰＬＡプローブおよび第２のＰＬＡプローブは、それらに結合した異なる短いＤＮＡ鎖を有する。第１のＰＬＡプローブと第２のＰＬＡプローブが極めて近接している（最大約４０ｎｍ、好ましくは最大約２８ｎｍ）場合、すなわち、目的とする２つの標的細胞が極めて近接している場合、ＤＮＡ鎖は、ライゲートされ、その後、適切な基質および酵素の存在下で増幅され得る。ライゲーションは、プローブが極めて近接している（最大約４０ｎｍ、好ましくは最大約２８ｎｍ）ときにライゲーションが生じるように、ＰＬＡプローブ間の距離によって決定される。ライゲートされると、増幅が適切な基質および酵素の存在下で生じる。かかる基質および酵素は、当該技術分野で既知である。
ローリングサークルＤＮＡ合成ステップにより、ＤＮＡサークルの数百倍の増幅がもたらされ得、増幅されたＤＮＡに結合する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブと接触したときに、高濃度の蛍光が、例えば、蛍光顕微鏡法によって検出され得る。
本発明の方法は、細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させるステップと、試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させるステップと、洗浄ステップを行うステップと、ローリングサークルＤＮＡ増幅を行うステップと、試料を、増幅された環状ＤＮＡ配列のものに相補的な蛍光標識ＤＮＡプローブと接触させるステップと、生成されたいずれの蛍光シグナルも検出するステップとを含み得る。
本発明の方法を使用して、第１の分子と第２の分子が空間的に極めて近接している（約４０ｎｍ未満、好ましくは約２８ｎｍ未満）場合に、蛍光シグナルを検出することが可能である。
本発明の方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、細胞試料と接触する。少なくとも２つの一次結合剤は、互いに同時にまたは互いに順次に試料と接触し得る。したがって、第１の一次結合剤が試料と最初に接触し得、その後、第２の一次結合剤が試料と接触し得る。あるいは、第２の一次結合剤が試料と最初に接触し得、その後、第２の一次結合剤が試料と接触し得る。第１の一次結合剤および第２の一次結合剤が互いに順次に試料と接触する場合、任意選択的な洗浄ステップは、ステップ間でその順に行われ得る。
第１の一次結合剤は、試料中に存在する第１の細胞上の任意の第１の分子に結合し、第２の一次結合剤は、試料中に存在する第２の細胞上の任意の第２の分子に結合する。任意選択的な洗浄ステップは、任意の結合していない一次結合剤を除去する。
少なくとも２つの二次結合剤は、少なくとも２つの一次結合剤と同時に細胞試料と接触し得るか、または少なくとも２つの一次結合剤は、少なくとも２つの二次結合剤の前に試料と接触し得る。少なくとも２つの二次結合剤は、互いに同時にまたは互いに順次に試料と接触し得る。したがって、第１の二次結合剤が試料と最初に接触し得、その後、第２の二次結合剤が試料と接触し得る。あるいは、第２の二次結合剤が試料と最初に接触し得、その後、第１の二次結合剤が試料と接触し得る。第１の二次結合剤および第２の二次結合剤が互いに順次に試料と接触する場合、任意選択的な洗浄ステップは、ステップ間でその順に行われ得る。少なくとも２つの一次結合剤が少なくとも２つの二次結合剤の前に試料と接触する実施形態では、任意選択的な洗浄ステップは、少なくとも２つの一次結合剤の投与と少なくとも２つの二次結合剤の投与との間で行われ得る。
第１の二次結合剤は、第１の一次結合剤に結合し、第２の一次結合剤は、第２の一次結合剤に結合する。任意選択的な洗浄ステップは、いずれの結合していない二次結合剤、または第１もしくは第２の部位に結合していない一次結合剤（すなわち、結合していない一次結合剤）に結合しているいずれの二次結合剤も除去する。
少なくとも２つの一次結合剤および少なくとも２つの二次結合剤を試料と接触させた後、洗浄ステップは、コンジュゲートが試料と接触する前に行われる。洗浄ステップは、その標的（例えば、第１の部位、第２の部位、第１の一次抗体、または第２の一次結合剤）に結合していないいずれの結合剤（一次または二次）も除去する。本発明の方法では、生理食塩水溶液または別の好適な溶液を使用して、洗浄ステップを行うことができる。洗浄ステップに使用される条件は、当業者に周知である。
ローリングサークルＤＮＡ増幅行われる。ＤＮＡ配列がライゲートされてサークルを形成し、その後、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅される。その後、増幅されたＤＮＡが、増幅された環状ＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブと接触する。任意選択的な洗浄ステップが行われる。その後、結合されたプローブがそれらの検出可能な標識によって検出される。
ローリングサークルＤＮＡ増幅ステップは、標的分子相互作用の存在を示す外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合された環状ＤＮＡ配列の数を増幅する。生成されたいずれの検出可能なシグナルも検出される。
第１の標的分子が第２の標的分子に十分に極めて近接している（約４０ｎｍ未満、好ましくは約２８ｎｍ未満）実施形態では、正の検出可能な（蛍光）シグナルが検出され得る。
第１の標的分子が第２の標的分子に十分に極めて近接していない（約４０ｎｍ超、好ましくは約２８ｎｍ超える）場合、検出可能な（蛍光）シグナルは、減少するか、または不在であろう。
第１の分子または第２の分子のいずれかまたはそれらのいずれも試料中に存在しない場合、検出可能な（蛍光）シグナルは検出されないであろう。
本発明の方法は、適宜に適応される。例えば、本方法は、試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させるステップと、試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させるステップと、洗浄ステップを行うステップと、ローリングサークルＤＮＡ増幅を行うステップと、試料を、増幅された環状ＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブと接触させるステップと、生成されたいずれの検出可能な（蛍光）シグナルも検出するステップとを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、２つより多くの一次結合剤を用いる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、２つより多くの二次結合剤を用いる。
有利には、本発明で用いられる二次結合剤は、抗体または抗原結合断片、例えば、全免疫グロブリンではなく、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片であり得る。二次結合剤は、Ｆａｂ断片、抗体足場、および全免疫グロブリンの組み合わせ（Ｆａｂ断片混合物）であり得る。二次結合剤に抗体もしくは抗原結合断片（例えば、５０ｋＤａ～１００ｋＤａのサイズ範囲）またはＦａｂ断片混合物を用いる本発明の実施形態が特に有効であることが見出された。具体的な利点は、標的距離の低減および蛍光効率の増大、組織の容易な浸透およびそれらの標的への結合である。加えて、それらの固有の特異性は、それらがＦｃ領域を欠き、それ故に、内因性Ｆｃ受容体への非特異的結合に起因するいずれのバックグラウンドも著しく減少するという事実によってさらに強化される。
本発明の方法は、バックグラウンドを増加させることなく感度を著しく増加させるという利点を有する。
一例では、一次全免疫グロブリン抗ＰＤ－１（マウス）および抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔ３０８）（ウサギ）が、がん患者由来の固定腫瘍細胞試料と接触する。ＤＮＡ配列に融合した二次Ｆａｂ断片抗マウス－および別のＤＮＡ配列に融合した二次Ｆａｂ断片抗ウサギ－が試料と接触し、それぞれ、抗ＰＤ－１（マウス）および抗ＰＤ－Ｌ１（Ｔ３０８）（ウサギ）抗体に結合する。
ＤＮＡ配列がライゲートされてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１が異なる細胞の細胞表面上で極めて近接している（約４０ｎｍ未満、好ましくは約２８ｎｍ未満）増幅された環状ＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合される。蛍光シグナルが蛍光顕微鏡法によって検出され得る。本発明は、高感度定量的一致アッセイに関する。
さらなる一例では、一次全抗ＣＴＬＡ－４または抗ＣＤ２８免疫グロブリン（マウス）および一次全抗ＣＤ８０または抗ＣＤ８６免疫グロブリン（ウサギ）が、がん患者由来の固定腫瘍細胞試料と接触する。ＤＮＡ配列に融合した二次Ｆａｂ断片抗マウス－および別のＤＮＡ配列に融合した二次Ｆａｂ断片抗ウサギ－が試料と接触し、それぞれ、抗ＣＴＬＡ－４／ＣＤ２８（マウス）および抗ＣＤ８０／ＣＤ８６（ウサギ）抗体に結合する。
ＤＮＡ配列がライゲートされてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ２８とＣＤ８０／ＣＤ８６が異なる細胞の細胞表面上で極めて近接している（約４０ｎｍ未満、好ましくは約２８ｎｍ未満）増幅された環状ＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合される。蛍光シグナルが蛍光顕微鏡法によって検出され得る。本発明は、高感度定量的一致アッセイに関する。
別の例では、一次全抗ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチド免疫グロブリン（マウス）および一次全抗ＴＣＲ、ＣＤ８、またはＣＤ３免疫グロブリン（ウサギ）が、がん患者由来の固定腫瘍細胞試料と接触する。ＤＮＡ配列に融合した二次Ｆａｂ断片抗マウス－および別のＤＮＡ配列に融合した二次Ｆａｂ断片抗ウサギ－が試料と接触し、それぞれ、抗ＭＨＣクラスＩ／ＩＩペプチド（マウス）および抗ＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３（ウサギ）抗体に結合する。
ＤＮＡ配列がライゲートされてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、ＭＨＣクラスＩ／ＩＩペプチドとＴＣＲ／ＣＤ８／ＣＤ３が異なる細胞の細胞表面上で極めて近接している（約４０ｎｍ未満、好ましくは約２８ｎｍ未満）増幅された環状ＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合される。蛍光シグナルが蛍光顕微鏡法によって検出され得る。本発明は、高感度定量的一致アッセイに関する。
本発明の方法がＰＬＡを用いることができるが、かかる方法論が２０ｎｍ～４０ｎｍの範囲の距離しか決定しないことが見出された。２０ｎｍ未満のＰＬＡ距離を決定することができなかった。
対照的に、本発明の二部位ＴＳＡ ＦＲＥＴ方法は、１０ｎｍ以下の範囲の距離を測定することができた。かかる方法は、一般的に適用される（特定のがん型または特定の細胞間相互作用に限定されない）単に質的アッセイではなく定量的アッセイも可能にする。
一致検出
別の態様では、本発明は、別個の細胞の表面上に提示される２つの標的分子間の相互作用を検出するための一致検出方法を使用する。
本方法は、２つの融合タンパク質を含み、各融合タンパク質は、検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインを含む。検出ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインを含み得、さらなる検出ドメインと協働して同族特異的ヌクレオチド配列に結合することができる。認識ドメインは、標的分子に結合することができる。コネクタードメインは、一方の末端で検出ドメインに融合しており、他方の末端で認識ドメインに融合している。検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインは、互いに異種である。本方法は、（ｉ）試料を融合タンパク質と接触させるステップと、（ｉｉ）インキュベートして結合を許容するステップと、（ｉｉｉ）結合していない融合タンパク質を除去するステップと、（ｉｖ）試料を、同族特異的ヌクレオチド配列を含む核酸と接触させるステップと、（ｖ）インキュベートして核酸のヘテロ三量体結合を許容するステップと、（ｖｉ）試料に結合した核酸を検出するステップとを含む。核酸がステップ（ｖｉ）で検出された場合、これは、２つの標的分子が前記試料中に同時に存在することを示す。かかる方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＷＯ／２０１１／１６１４２０に開示されている。
本発明は、第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
第１および第２の融合タンパク質であって、各融合タンパク質が、検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインを含む、第１および第２の融合タンパク質を含み、
検出ドメインが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、さらなる検出ドメインと協働して同族特異的ヌクレオチド配列に結合することができ、
認識ドメインが、標的分子に結合することができ、
コネクタードメインが、一方の末端で検出ドメインに融合しており、他方の末端で認識ドメインに融合しており、
検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインが互いに異種であり、
本方法が、
（ｉ）試料を第１のおよび融合タンパク質と接触させるステップと、
（ｉｉ）インキュベートして結合を許容するステップと、
（ｉｉｉ）結合していない融合タンパク質を除去するステップと、
（ｉｖ）試料を、同族特異的ヌクレオチド配列を含む核酸と接触させるステップと、
（ｖ）インキュベートして核酸のヘテロ三量体結合を許容するステップと、
（ｖｉ）試料に結合した核酸を検出するステップと、を含み、
核酸がステップ（ｖｉ）で検出された場合、これは、２つの標的分子が試料中に同時に存在することを示す、インビトロ一致アッセイ方法を提供する。
一例では、第１の融合タンパク質は、ＰＤ－１を検出し、第２の融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１を検出する。別の例では、第１の融合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し、第２の融合タンパク質は、ＣＤ８０またはＣＤ８６に結合する。さらなる一例では、第１の融合タンパク質は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドに結合し、第２の融合タンパク質は、ＴＣＲ、ＣＤ８、またはＣＤ３に結合する。
がん患者の選択および層別化
本発明は、がんを有する患者を治療のために選択する方法を提供する。本方法は、患者をがん治療のために選択する方法における使用のための、ＦＲＥＴ、増幅を伴うＦＲＥＴ（例えば、ＴＳＡ－ＦＲＥＴ）、近接ライゲーション、および一致検出を含む一致アッセイを提供する。本方法は、患者選択を導くために細胞レベルでの分子間の相互作用の検出を提供する。
本発明は、がんを有する患者を治療のために選択する方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉｖ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｖ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｖｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ｅ）患者由来の単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｆ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｇ）洗浄ステップを行うことと、
（ｈ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することであって、
ａ．意図された療法が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、または
ｉｉ．全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
ｂ．意図された療法が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント阻害剤を含む場合、
（ｖ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｖｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、方法を提供する。
本発明は、がんを有する患者を治療のために選択するための上記のインビトロ一致アッセイ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
患者は、がん療法を以前に受けていなくてもよく、またはがん療法を以前に受けていてもよいが、患者が前述の方法で選択される標的分子（例えば、チェックポイント標的タンパク質）とは異なる標的分子に対するものである。
全スコアが０．５％～５％である場合、これは、患者がチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法に応答しないであろうことを示す。全スコアが５％～１０％である場合、これは、患者がチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法に応答するかもしれないことを示す。全スコアが１０％を超える場合、これは、患者がチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法に応答するであろうことを示す。全スコアは、ＦＲＥＴ効率パーセンテージであり得る。
いくつかの方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合する。いくつかの方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
腫瘍細胞試料は、異なる標的分子に対する治療前にまたは治療後に患者から得られ得る。
細胞試料は、好ましくは、固定細胞試料である。腫瘍細胞試料は、原発性腫瘍細胞、二次（転移性）腫瘍細胞、固形腫瘍、および関連患者組織（例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞等）を含み得る。細胞試料は、患者から得られた腫瘍生検または外科的切開であり得る。典型的には、腫瘍試料は、浸潤性腫瘍マージンを含む。腫瘍試料は、転移性病巣から得られ得る。試料は、末梢血を含み得る。
患者は、転移性がんを有する疑いのある者であり得る。がんの例としては、メラノーマ、肺癌（例えば、非小細胞肺癌を含む）、乳癌、頭頸部癌、尿路上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない。がんのさらなる例としては、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血液癌、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、上衣腫、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、ユーイングファミリー腫瘍（ＰＮＥＴ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼癌、眼内メラノーマ、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、性腺外胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、下咽頭癌、島細胞癌、腎癌（腎細胞癌）、喉頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇口腔癌、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および他の形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、膵癌、島細胞癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、形質細胞腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、直腸癌、腎細胞癌、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、カポジ肉腫、メラノーマ、小腸癌、軟部組織肉腫、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌、胸腺腫、悪性甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、肉腫、膣癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
一例では、第１の融合タンパク質は、第１の細胞上の第１のチェックポイントタンパク質標的に結合し、第２の融合タンパク質は、第２の細胞上の第２のチェックポイントタンパク質標的を検出し、これにより、これらの融合タンパク質が細胞間相互作用を検出するようになる。
例示的なチェックポイント標的分子としては、プログラム細胞死－１（ＰＤ－１）受容体、ＰＤ－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＰＤ－リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）、Ｂ７ファミリータンパク質、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリータンパク質、クラスター分類４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、Ｂ７関連タンパク質１（Ｂ７ＲＰ１）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ガラクチン９（ＧＡＬ９）、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）、誘発性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、インターロイキン（ＩＬ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、形質転換成長因子－β（ＴＧＦ－β）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ならびにＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドが挙げられる。好ましいチェックポイント標的は、ＰＤ－１である。ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２も好ましいチェックポイント標的である。ＣＴＬＡ－４は、好ましいチェックポイント標的である。ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドも好ましいチェックポイント標的である。ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、およびＴＩＭ３も好ましいチェックポイント標的である。
一例では、第１の融合タンパク質は、ＰＤ－１に結合し第２の融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する。蛍光シグナルスコアを決定する際、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する。
別の例では、第１の融合タンパク質は、ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し、第２の融合タンパク質は、ＣＤ８０またはＣＤ８６に結合する。蛍光シグナルスコアを決定する際、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ８０抗体、または抗ＣＤ８６抗体での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ８０抗体、または抗ＣＤ８６抗体での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する。
さらなる一例では、第１の融合タンパク質は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドに結合し、第２の融合タンパク質は、ＴＣＲ、ＣＤ８、またはＣＤ３に結合する。蛍光シグナルスコアを決定する際、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者が抗ＭＨＣクラスＩ抗体、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ８抗体、または抗ＣＤ３抗体での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者が抗ＭＨＣクラスＩ抗体、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体、抗ＴＣＲ抗体、抗ＣＤ８抗体、または抗ＣＤ３抗体での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する。
さらなる態様では、本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）試料をチェックポイント活性化剤または阻害剤と接触させることと、
（ｆ）二次結合剤間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
ａ．チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法を提供する。
本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するための上記のインビトロ一致アッセイ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
例示的なチェックポイント阻害剤としては、抗ＰＤ－１結合剤、抗ＰＤ－Ｌ１結合剤、抗ＰＤ－Ｌ２結合剤、抗ＣＴＬＡ－４結合剤、抗ＭＨＣクラスＩ結合剤、および／または抗ＭＨＣクラスＩＩ結合剤が挙げられる。例示的な抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブである。例示的な抗ＰＤ－１結合剤としては、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＤＸ １１０６、またはＯＮＯ－４５３８）およびペムブロリズマブ（イアムブロリズマブまたはＭＫ－３４７５）が挙げられる。
さらなる例示的なチェックポイント阻害剤としては、イピリムマブ、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＤＸ １１０６、またはＯＮＯ－４５３８）、ペムブロリズマブ（イアムブロリズマブまたはＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－Ｑ１ １）、ＥＤ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＡＭＰ－２２４、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１ １０５）、ＥＤ ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４８）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ならびにそれらの断片および塩を含むか、またはそれらからなる群から選択されるものが挙げられる。
例示的なチェックポイント活性化剤としては、ＣＤ４０（ＴＮＦＳＦＲ５）アゴニスト、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体；ＴＮＦＳＦＲ１８）刺激因子、ＯＸ４０（ＣＤ１３４；ＴＮＦＳＦＲ４）アゴニスト、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＳＦＲ９）アゴニスト、ＣＤ２７（ＴＮＦＳＦＲ７）アゴニストＣＤ２７（ＴＮＦＳＦＲ７）アゴニスト、ＩＣＯＳ（誘発性共刺激因子）分子アゴニスト、Ｔｒａｉｌ受容体アゴニスト、および／またはＨＶＥＭ（ヘルペスウイルスエントリーメディエーター）受容体アゴニストを含むＴＮＦ受容体およびＢ７－ＣＤ２８スーパーファミリー由来のものが挙げられる。好ましいチェックポイント活性化剤としては、ＯＸ－４０、ＧＩＴＲ、および／または４－１ＢＢアゴニストが挙げられる。
上記の方法では、ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の増加は、チェックポイント活性化剤が有効であろうことを示す。ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の減少は、チェックポイント阻害剤が有効であろうことを示す。
上記の方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。いくつかの態様では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
さらなる態様では、本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するインビトロ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療前に患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を、少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）ステップ（ａ）におけるチェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療中に患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を使用して、ステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、
（ｆ）試料間の全蛍光スコアを比較することであって、
ａ．療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、比較することと、を含む、インビトロ方法を提供する。
本発明は、チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するための上記のインビトロ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
本発明は、がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するインビトロ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上のＰＤ－１に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉｖ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｖ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｖｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ｄ）患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｅ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｆ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光シグナルスコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することであって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、全スコアは、患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、インビトロ方法をさらに提供する。
本方法は、
（ｉｉｉ）ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する単剤での治療、またはＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤および少なくとも１つの他の抗腫瘍剤での併用療法における治療の選択についての決定を導くために、治療前に患者から得られた生体試料に、
（ｉｖ）対象の現在の治療レジメンへの応答を監視し、かつ単剤ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２遮断療法での治療または併用療法での治療の選択についての決定を導くために、治療中に患者から得られた少なくとも１つの生体試料に行われ得る。
上記の方法では、ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の減少は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路が有効であろうことを示す。
上記の方法は、免疫チェックポイント経路を遮断するか、または免疫チェックポイント経路を活性化する他の薬剤にも適用され得る。例示的なチェックポイント阻害剤および活性化剤は、上述されている。例えば、本製剤は、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ２８、ＣＤ８０、および／またはＣＤ８６を遮断し得る。本製剤は、ＭＨＣクラスＩペプチド、ＭＨＣクラスＩＩペプチド、ＴＣＲ、ＣＤ８および／またはＣＤ３を遮断し得る。
本製剤がチェックポイント阻害剤である場合、ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の減少は、本製剤が有効であろうことを示す。
本製剤がチェックポイント活性化剤である場合、ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の増加は、本製剤が有効であろうことを示す。
上記の方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。いくつかの態様では、少なくとも２つの一次結合剤は、チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
上記の方法で使用される試料は、固定腫瘍細胞試料であり得る。ある特定の態様では、細胞試料は、治療前にまたは治療中に患者から得られる。試料は、がんの治療を以前に受けた患者、例えば、抗腫瘍剤で以前に治療された患者から得られ得るか、またはがんの治療を以前に受けていない患者、すなわち、治療を受けていない患者から得られることを意味し得る。
細胞試料は、原発性腫瘍細胞、二次（転移性）腫瘍細胞、固形腫瘍、および関連患者組織（例えば、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞等）を含み得る。腫瘍試料は、例えば、患者から得られた腫瘍生検または外科的切開であり得る。典型的には、腫瘍試料は、浸潤性腫瘍マージンを含む。腫瘍試料は、転移性病巣から得られ得る。試料は、末梢血管を含み得る。患者は、転移性がんを有する疑いのある者であり得る。がんの例としては、メラノーマ、肺癌（例えば、非小細胞肺癌を含む）、乳癌、頭頸部癌、尿路上皮癌が挙げられるが、これらに限定されない。がんのさらなる例としては、副腎皮質癌、肛門癌、膀胱癌、血液癌、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、上衣腫、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮内膜癌、食道癌、肝外胆管癌、ユーイングファミリー腫瘍（ＰＮＥＴ）、頭蓋外胚細胞腫瘍、眼癌、眼内メラノーマ、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、性腺外胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、下咽頭癌、島細胞癌、腎癌（腎細胞癌）、喉頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇口腔癌、肝癌、小細胞肺癌、リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および他の形質細胞腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性障害、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口腔癌、口腔咽頭癌、骨肉腫、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、膵癌、島細胞癌、副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、形質細胞腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、直腸癌、腎細胞癌、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、カポジ肉腫、メラノーマ、小腸癌、軟部組織肉腫、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌、胸腺腫、悪性甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、肉腫、膣癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
チェックポイント阻害剤または活性化剤を選択する方法
本発明は、目的とする分子がチェックポイント活性化剤であるかチェックポイント阻害剤であるかを特定するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、本方法が、
少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、第１の一次結合剤および二次一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合し、第１の二次結合剤が第２の一次結合剤に結合せず、第２の二次結合剤が第１の一次結合剤に結合せず、
（ｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）第１の二次結合剤および第２の二次結合剤がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、その酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、
本方法が、
（ａ）単離された腫瘍細胞試料を少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
（ｂ）試料を少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって二次結合剤間の相互作用を検出することと、
（ｅ）試料を目的とする分子と接触させることと、
（ｆ）二次結合剤間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
ａ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤である、または
ｂ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント阻害剤である、または
ｃ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、分子が第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤でもチェックポイント阻害剤でもない、検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法をさらに提供する。
ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の増加は、目的とする分子が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤であることを示す。ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの５％～０．５％、好ましくは１０％～５％、より好ましくは１０％超の減少は、目的とする分子が、第１のチェックポイント標的分子および第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント阻害剤であることを示す。
上記の方法では、少なくとも２つの一次結合剤は、目的とする分子が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、第１の分子または第２の分子に結合し得る。
いくつかの態様では、少なくとも２つの一次結合剤は、目的とする分子の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない。
本発明は、目的とする分子がチェックポイント活性化剤であるかチェックポイント阻害剤であるかを特定するための上記のインビトロ方法の使用、およびこの点における使用のためのキットも提供する。
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してより詳細に記載されており、これらの実施例は、本発明をより完全に説明するために提供されており、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
本発明の方法を使用して、ドナー寿命の変化を定量化することができる。
実施例１：固定組織切片におけるハイスループット周波数ドメイン蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ｆ－ＦＬＩＭ）によって分析した二部位ＴＳＡ－ＦＲＥＴ
ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用研究のために、ＦＦＰＥ切片を覆い、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液で加熱し、その後、さらに１０分間インキュベートした。その後、スライド容器を２０～３０分間冷却した後、ＰＢＳで２回、５分間洗浄した。スライドをＰＡＰペンでマークして、次のステップで液体が組織から漏出するのを防いだ。液体を組織に添加する度に、組織が完全に覆われるように十分な液体を添加した。内因性ペルオキシダーゼ抑制因子を室温で３０分間添加することによって内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、その後、組織をＰＢＳで洗浄した。その後、ＰＢＳ中（１０ｍｇ／ｍＬ）ＢＳＡを使用して組織を室温で６０分間遮断した。
その後、組織切片を２つの条件：ドナーのみ（Ｄ）とドナー／アクセプター（Ｄ／Ａ）に分けた。使用した２つの一次抗体は、それぞれ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中１：１００希釈および１：５００希釈のマウス抗ＰＤ－１およびウサギ抗ＰＤ－Ｌ１であった。ドナーのみ条件をマウス抗ＰＤ－１とインキュベートし、ドナー／アクセプター条件をマウス抗ＰＤ－１およびウサギ抗ＰＤ－Ｌ１の両方とインキュベートした。一次抗体インキュベーションを４℃で一晩放置した。
インキュベーション後、組織切片をＰＢＳ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０で２回洗浄して、一次抗体の非特異的結合を除去した。マウス抗ＰＤ－１のみ（ドナーのみ）で標識した切片を、抗マウスＦＡＢ－ＡＴＴＯ４８８（１：１００）とさらにインキュベートした。マウス抗ＰＤ－１およびウサギ抗ＰＤ－Ｌ１で標識した切片を、抗マウスＦＡＢ－ＡＴＴＯ４８８（１：１００）および抗ウサギＦａｂＨＲＰ（１：２００）の両方とインキュベートした。その後、抗ウサギＦａｂＨＲＰ抗体をチラミド－Ａｌｅｘａ ５９４とさらに反応させ、それで増幅した。組織を室温で２時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、スライドをチラミド緩衝液と室温で２０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、スライドをマウントした。
異なる種の４期メラノーマを有する３名の患者を、抗受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）薬物およびＰＤ－１を遮断する抗体で処置した。
組織試料をそれらの３名の患者から採取し、これらの組織試料は以下の特徴を有した。
●ＭＭ１４（４期粘膜メラノーマを有する８２歳女性）
○ＢＲＡＦ野生型
○ｃＫＩＴ突然変異体
○ＫＩＴは、高活性突然変異を経る受容体チロシンキナーゼである
○現在進行中の療法なし
○チロシンキナーゼ阻害剤であるニロチニブで以前に治療された患者
○組織は、リンパ節転移であった
●ＭＭ１７（４期皮膚メラノーマを有する６１歳男性）
○ＢＲＡＦ野生型
○現在進行中の療法なし
○イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）およびニボルマブ（抗ＰＤ－１）で以前に治療されていた
○組織は、リンパ節転移であった
●ＭＭ１９（４期皮膚メラノーマを有する４９歳男性）
○ＢＲＡＦ野生型
○ＮＲＡＳ突然変異体
○ＮＲＡＳは、ＭＡＰＫ経路の高活性化を引き起こす癌遺伝子である
○治療を受けていない
○組織は、リンパ節転移および横行結腸転移であった
結果を図１および図２に示す。図１および図２は、抗ＲＴＫおよびＰＤ－１を遮断する抗体で処置した患者におけるＴＳＡ－ＦＲＥＴによるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の変化を示す。ドナー（ＰＤ－１）、ＡＴＴＯ４８８の寿命の変化が、アクセプター（ＰＤ－Ｌ１）フルオロフォア、ＡＬＸ ５９４の存在下での寿命の短縮によって図１に示される。
図２は、ＦＲＥＴ効率中央値を示し、かつＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用の変化を強調する箱ひげプロットを提供する。Ｐ値は、ＦＲＥＴ効率の極めて有意な差を示す。各データ点は、最も高い受容体（ＰＤ－１）濃度が存在した提供された組織上の領域を表す。結果は、本発明の方法が組織におけるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用等の分子間相互作用の定量化を可能にし、かつ薬物処置後に分子間相互作用の差を検出することができることを示す。
実施例２：細胞におけるハイスループット周波数ドメイン蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ｆ－ＦＬＩＭ）によって分析した二部位ＴＳＡ－ＦＲＥＴ
細胞におけるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を、以下のアッセイを使用して決定した。実験を、表１に示されるように８つのウェルプレートを使用して抗ＰＤ－１抗体の存在下で行った。
Figure 0007286627000006
ＰＤ－Ｌ１ ＡＰＣ／ＣＨＯ－Ｋ１細胞を８つのウェルプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ2 のインキュベーター内で１９時間インキュベートした。培地を除去し、２５μｇ／ｍＬの抗ＰＤ－１遮断抗体をウェルプレートの半数に添加し、アッセイ緩衝液を残りのウェルプレートに添加した。ＰＤ－１エフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ2 のインキュベーター内で２２時間インキュベートした。
結合していない細胞を除去し、ウェルプレートをＰＢＳで２回洗浄した。細胞を４％ＰＦＡで固定し、再度ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に４℃で保管した。抗体処置前に、細胞にはいずれの洗剤も浸透させなかった。
ＦＲＥＴプロトコル：
内因性ペルオキシダーゼを、内因性ペルオキシダーゼ抑制因子を使用して室温で３０分間クエンチした。ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、１％ＢＳＡで、室温で１時間遮断し、ＰＢＳで２回洗浄した。
ウェルを１％ＢＳＡ中８０μＬのＰＤ－１に対する一次抗体（１：１００）と４℃で一晩インキュベートし、ドナー／アクセプター条件の場合、それらをＰＤ－Ｌ１に対する一次抗体（１：５００）と同時にインキュベートした。ウェルプレートを０．０２％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した。
ドナーのみ条件を二次抗マウスＦａｂＡＴＴＯ ４８８（１：１００）で標識し、ドナー／アクセプター条件を二次抗マウスＦａｂＡＴＴＯ ４８８（１：１００）および抗ウサギＦａｂ－ＨＲＰ（１：２００）の両方で標識した。Ｆａｂ断片をこれらの両方の条件において２時間インキュベートした。ウェルプレートを０．０２％ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、アクセプターの増幅のためにチラミドシグナル増幅を利用した。その後、スライドをマウントした。相互作用の妨害を促進するモノクローナル遮断抗体を陰性対照として使用した。
時間分解ＦＲＥＴ取得：
自動多周波ハイスループット寿命イメージング顕微鏡を、Ｌａｍｂｅｒｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの多周波ドメインＦＬＩＭ寿命イメージング顕微鏡を改変することによって作製した。
ＦＲＥＴ効率（Ｅf ）を、以下の式：Ｅf （％）１／４［［１（ｔDA／ｔD ）］１００］（式中、（ＦＲＥＴ ｔD ／A ≪ｔD であるとき）ｔD がドナー寿命であり、ｔD／A がドナー＋アクセプター寿命である）を使用して決定した。
データ取得を、６０倍油浸対物レンズ（開口数１．４９）を使用して行い、ＡＴＴＯ ４８８のドナー寿命および強度を、４０ＭＨｚの変調した４７３ｎｍレーザービームおよび７０ミリ秒の露光時間（閾値３５％）を使用して７０ｍＷのピーク電力で決定した。アクセプター強度取得のために、ＴＲＩＴＣ励起／発光フィルターを有する水銀源を、８倍中性密度フィルターとともに１ミリ秒使用した。
データ分析：
結果を図３および図４に示す。図３の上パネルは、アクセプターＰＤ－Ｌ１の存在下での１．３９ナノ秒から１．１９ナノ秒へのドナー寿命短縮を示す。この寿命短縮は、これらの２つのタンパク質の相互作用に起因する。遮断抗体の存在下で、ドナー（アクセプター有り）の寿命は、１．２９ナノ秒である。したがって、遮断抗体有りでのドナー寿命は、同じ程度に短縮しなかった。
ＦＲＥＴ効率を、遮断抗体有りまたは無しでのアクセプターの存在下でのドナー寿命から計算し、図４に示されるように箱ひげ分布としてプロットした。
図４は、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用をＦＲＥＴによって定量化することができることを示す。データは、受容体／リガンド相互作用および遮断抗体でのその阻害の極めて有意な差を示す。箱ひげプロット上の各点は、平均５個の細胞を含む関心領域であった。Ｐ値をマンホイットニーノンパラメトリック検定によって決定した。
結果は、本発明の方法が細胞におけるＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用等の分子間相互作用の定量化を可能にし、かつ薬物処置後に分子間相互作用の差を検出することができることを示す。
実施例３：細胞培養におけるＣＴＬＡ－４：ＣＤ８０相互作用についてのｉ－ＦＲＥＴアッセイ
細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４／クラスター分類８０相互作用（ＣＴＬＡ－４－ＣＤ８０）の抗体遮断を発光によって測定するために元来設計されたＰｒｏｍｅｇａ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ（ＣＳ１８６９０７）プロトコルを、ｉ－ＦＲＥＴプロトコルに適応させた。
プレート調製
Ｐｒｏｍｅｇａ遮断バイオアッセイによって提供されたＣＴＬＡ－４発現Ｊｕｒｋａｔ細胞を、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）８ウェルプレート上に１００μＬ／ウェルで播種した。Ｑｕａｌａｓｅｐｔから入手した抗ＣＴＬＡ－４抗体（イピリムマブ）をウェルの半分に添加して、１００μＬ／ｍＬの最終濃度にした（表１）。１００μＬのＣＤ８０発現Ｒａｊｉ細胞を各ウェルに添加し、プレートを３７℃および５％ＣＯ2 で１９時間インキュベートした。結合していない細胞をＰＢＳ洗浄によって除去し、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１２分間固定した。ＰＦＡを除去し、全てのウェルをＰＢＳで洗浄した。
Figure 0007286627000007
抗ＣＴＬＡ－４および抗ＣＤ８０での一次抗体染色
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＰｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒを各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１％（１０ｍｇ／ｍＬ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１時間インキュベートし、再度ＰＢＳで洗浄した。一次抗体染色を、それぞれ、ＡｂｃａｍおよびＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅから入手したマウスモノクローナル抗ＣＴＬＡ－４およびウサギポリクローナル抗ＣＤ８０を使用して行った。それらのいずれもＢＳＡ中で希釈した（１：１００）。抗ＣＴＬＡ－４を使用してドナーのみ条件（１～４）を標識し、抗ＣＴＬＡ－４および抗ＣＤ８０の両方を使用してドナー／アクセプター条件（５～８）を標識した。プレートを４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ中０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で２回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。
抗マウスＦａｂ－ＡＴＴＯ４８８および抗ウサギＦａｂ－ＨＲＰでの二次染色
二次ＦａｂＡＴＴＯ４８８を、１％ＢＳＡを使用して希釈し（１：１５）、ドナーウェルおよびドナー／アクセプターウェル（１～８）の両方に添加した。ＦａｂＡＴＴＯ４８８コンジュゲーションは、Ｆａｂ断片タンパク質１分子当たり４．１分子のＡＴＴＯ４８８を含有した。二次ＦａｂＨＲＰを、１％ＢＳＡを使用して希釈し（１：２００）、ドナー／アクセプターウェル（５～８）のみに添加した。プレートを２時間インキュベートした後、０．０２％ＰＢＳＴで２回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。
チラミド増幅
Ａｌｅｘａ５９４コンジュゲートチラミドを、０．１５％Ｈ2 Ｏ2 の存在下で、増幅緩衝液中で希釈した（１：１００）。この混合物のうち、１００μＬを各ドナー／アクセプターウェル（５～８）に添加し、プレートを暗所で２０分間インキュベートした。チラミド除去するために、ウェルをＰＢＳＴで２回洗浄し、ＰＢＳで１回洗浄した。５μＬのＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ褪色防止マウント剤を各ウェルに添加し、カバースリップを使用してマウントした。
ｉ－ＦＲＥＴを使用して決定したＣＴＬＡ－４－ＣＤ８０相互作用
細胞間ＣＴＬＡ－４－ＣＤ８０相互作用を、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して評価した。ＣＴＬＡ－４強度およびＣＤ８０強度を、それぞれ、４０ＭＨｚの変調した４７３ｎｍレーザービームおよび水銀源を使用して決定した。ＣＴＬＡ－４強度、ＣＤ８０強度、および寿命マップを図５に提示する。ドナーのみウェルとドナー／アクセプターウェルを比較すると、ドナー寿命（τ）のより著しい短縮が、１００μＬイピリムマブ条件と比較して処置なし条件で観察される。
ＦＲＥＴ効率値（図６）は、１００μＬ／ｍＬイピリムマブ条件と比較して０μＬ／ｍＬイピリムマブ条件で有意に（*** ）高い（ｐ＝０．０００４４、ｐ＝０．０００２４）。ＦＲＥＴ値は、イピリムマブを含有していないウェル間で有意な差はなかった（ｐ＝０．０５４）。
結論
１）細胞間接触を、ＣＴＬＡ－４－ＣＤ８０対を使用してｉ－ＦＲＥＴによって定量化することができる。
２）ＦＲＥＴ効率は、未処理細胞と比較してイピリムマブの存在下で有意に低下する。
３）ＦＲＥＴ効率値は、１００μＬ／ｍＬイピリムマブ条件で低下し、これは、イピリムマブの不在下で観察された相互作用がＣＴＬＡ－４とＣＤ８０との間の特異的相互作用に起因したことを強く示唆する。
実施例４：転移性メラノーマ組織におけるＣＴＬＡ－４：ＣＤ８０相互作用についてのｉＦＲＥＴアッセイ
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質－４（ＣＴＬＡ－４）とクラスター分類８０（ＣＤ８０）との間の相互作用を決定する免疫－フェルスター共鳴エネルギー移動（ｉ－ＦＲＥＴ）アッセイを転移性メラノーマ組織で行った。試料を、表３（以下）に詳述される異なる患者から得た。
方法
抗原回収
抗原回収をＦａｓｔｂａｓｅ研究室でＰＴＬｉｎｋを使用して行った後、１～２滴／スライドのＰｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒを添加して、内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、３０分間インキュベートした。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した３００μＬの１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を各スライドに添加して、非特異的一次抗体結合を阻止した。両インキュベーションを加湿トレイ内で行った。
一次抗体染色
一次抗体染色を、マウスモノクローナル抗ＣＴＬＡ－４およびウサギポリクローナル抗ＣＤ８０を使用して行った。それらのいずれもＰＢＳ中１％ＢＳＡ中で希釈した（１：１００）。抗ＣＴＬＡ－４を使用してドナーのみ条件を標識し、抗ＣＴＬＡ－４および抗ＣＤ８０の両方を使用してドナー／アクセプター条件を標識した。１５０μＬを各スライドに添加した後、一晩インキュベートした。
二次抗体染色
ドナーのみスライドを抗マウスＦａｂ－ＡＴＴＯ４８８（１：１５）最終希釈液とインキュベートし、ドナーアクセプタースライドを抗マウスＦａｂ－ＡＴＴＯ４８８（１：１５）＋抗ウサギＦａｂ－ＨＲＰ（１：２００）最終希釈液とインキュベートした。希釈液を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを使用して作製した。１５０μＬを各スライドに添加した後、加湿トレイ内で、室温で２時間インキュベートした。
チラミド標識
Ａｌｅｘａ５９４コンジュゲートチラミドを、０．１５％Ｈ2 Ｏ2 の存在下で、増幅緩衝液中で希釈した（１：１００）。この混合物のうち、１５０μＬを各ドナー／アクセプタースライドに添加し、暗所で、室温で２０分間インキュベートした。１５０μＬのＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ褪色防止マウント剤を各スライドに添加し、カバースリップを使用してマウントした。
ヘマトキシリンおよびエオシン染色
ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、追加で提供された対応する試料のスライド上で行った。Ｈ＆Ｅ染色により、免疫細胞浸潤領域を特定するための病理学的分析が可能になった。選択された領域は、このアッセイにおけるｉ－ＦＲＥＴ分析の焦点であった。
表３は、遺伝的背景、過去の治療および現在進行中の治療の詳細、ならびに試料起源を含む、このアッセイに使用した試料の患者背景を示す。
Figure 0007286627000008
図６は、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０との間の相互作用を転移性メラノーマ組織におけるＦＲＥＴによって測定することができることを示す。
実施例５：ｉ－ＦＲＥＴ－ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１対を使用した腎細胞癌における細胞間接触の検出
プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）とプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）との間の相互作用、ひいては細胞間接触を決定する免疫－フェルスター共鳴エネルギー移動（ｉ－ＦＲＥＴ）アッセイを腎細胞癌組織で行った。試料を異なる患者から得て、様々な腎細胞癌、すなわち、明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、乳頭状腎細胞癌（ＰＲＣＣ）、および嫌色素性腎細胞癌（ＣｈＲＣＣ）を含んだ。全ての試料は、原発腫瘍であった。
方法
抗原回収
抗原回収をＦａｓｔｂａｓｅ研究室でＰＴＬｉｎｋを使用して行った後、１～２滴／スライドのＰｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒを添加して、内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、３０分間インキュベートした。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した３００μＬの１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を各スライドに添加して、非特異的一次抗体結合を阻止した。両インキュベーションを加湿トレイ内で行った。
一次抗体染色
一次抗体染色を、それぞれ、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中で希釈（１：１００）および（１：５００）した、マウスモノクローナル抗ＰＤ－１およびウサギモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１を使用して行った。抗ＰＤ－１を使用してドナーのみ条件を標識し、抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１の両方を使用してドナー／アクセプター条件を標識した。１５０μＬを各スライドに添加した後、一晩インキュベートした。
二次抗体染色
ドナーのみスライドを抗マウスＦａｂ－ＡＴＴＯ４８８（１：１５）最終希釈液とインキュベートし、ドナーアクセプタースライドを抗マウスＦａｂ－ＡＴＴＯ４８８（１：１５）＋抗ウサギＦａｂ－ＨＲＰ（１：２００）最終希釈液とインキュベートした。希釈液を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを使用して作製した。１５０μＬを各スライドに添加した後、加湿トレイ内で、室温で２時間インキュベートした。
チラミド標識
Ａｌｅｘａ５９４コンジュゲートチラミドを、０．１５％Ｈ2 Ｏ2 の存在下で、増幅緩衝液中で希釈した（１：１００）。この混合物のうち、１５０μＬを各ドナー／アクセプタースライドに添加し、暗所で、室温で２０分間インキュベートした。１５０μＬのＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ褪色防止マウント剤を各スライドに添加し、カバースリップを使用してマウントした。
上記の実施例の結果を図７に示す。
実施例６：ｉ－ＦＲＥＴ－ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１対を使用したｃｃＲＣＣ組織における細胞間相互作用の検出
プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）およびプログラム死－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）相互作用、ひいては細胞間相互作用を決定する免疫－フェルスター共鳴エネルギー移動（ｉ－ＦＲＥＴ）アッセイを、明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）組織で行った。試料をＣｒｕｃｅｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｉｌｂａｏ）から入手した。アッセイ前に、試料がＰＤ－Ｌ１＋／＋であるかＰＤ－Ｌ１－／－であるかを決定した。
方法
抗原回収
抗原回収をＦＡＳＴＢＡＳＥ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ研究室でＰＴＬｉｎｋを使用して行った後、１～２滴／スライドのＰｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒを添加して、内因性ペルオキシダーゼをクエンチし、３０分間インキュベートした。その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中３００μＬの１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を各スライドに添加して、非特異的一次抗体結合を阻止した。両インキュベーションを加湿トレイ内で行った。
一次抗体標識
一次抗体標識を、それぞれ、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中で希釈（１：１００）および（１：５００）した、マウスモノクローナル抗ＰＤ－１およびウサギモノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１を使用して行った。抗ＰＤ－１を使用してドナーのみ条件を標識し、抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１の両方を使用してドナー／アクセプター条件を標識した。１５０μＬを各スライドに添加した後、一晩インキュベートした。
二次抗体標識
ドナーのみスライドを抗マウスＦａｂ－ＡＴＴＯ４８８（１：１５）最終希釈液とインキュベートし、ドナーアクセプタースライドを抗マウスＦａｂ－ＡＴＴＯ４８８（１：１５）＋抗ウサギＦａｂ－ＨＲＰ（１：２００）最終希釈液とインキュベートした。希釈液を、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを使用して作製した。１５０μＬを各スライドに添加した後、加湿トレイ内で、室温で２時間インキュベートした。
チラミド標識
Ａｌｅｘａ５９４コンジュゲートチラミドを、０．１５％Ｈ2 Ｏ2 の存在下で、増幅緩衝液中で希釈した（１：１００）。この混合物のうち、１５０μＬを各ドナー／アクセプタースライドに添加し、暗所で、室温で２０分間インキュベートした。１５０μＬのＰｒｏｌｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ褪色防止マウント剤を各スライドに添加し、カバースリップを使用してマウントした。
上記の実施例の結果を図８に示し、ｉ－ＦＲＥＴが低ＰＤ－Ｌ１発現で浸潤領域におけるＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の特異的相互作用を決定することを示す。この事実は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の近接性を低ＰＤ－Ｌ１発現では検出することができないＰＬＡを使用したときには当てはまらない。さらに、浸潤領域の不均一性をｉ－ＦＲＥＴによって定量化することができる。ｉ－ＦＲＥＴの精度により、治療的治療のための他の方法では恐らく除外される外れ値の特定が可能になる。
実施例７：固定組織切片におけるハイスループット周波数ドメイン蛍光寿命イメージング顕微鏡法（ｆ－ＦＬＩＭ）によって分析した二部位ＴＳＡ－ＦＲＥＴ
Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上のＭＨＣ分子（ｐＭＨＣ）中に埋め込まれたペプチドとの相互作用によって抗原を認識する。細胞傷害性Ｔリンパ球ＴＣＲは、「自己」抗原と外来抗原（ウイルス感染細胞）を区別し、腫瘍細胞によって提示される新抗原も区別するために、体内の細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されたエピトープを認識する。ヘルパーＴ細胞ＴＣＲは、抗原提示免疫細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されたエピトープを認識する。他の型のＴ細胞上のＴＣＲも、ＣＤ１ｄファミリー由来のＭＨＣ様分子と相互作用し、例えば、インバリアントＮＫＴ細胞によって発現されたセミインバリアントＴＣＲとＣＤ１ｄ－脂質複合体との間の相互作用、Ｍｕｃｏｓａｌ関連インバリアントＴ細胞（ＭＡＩＴ細胞）によって発現されたＴＣＲとＭＨＣ様分子ＭＲ１との相互作用である（Ｂｈａｔｉ ｅｔ ａｌ，２０１３）。
ＴＣＲは、ＣＤ３分子と相互作用して、ＴＣＲ複合体を形成する。ＣＤ３は、３つのはっきりと異なるポリペプチド鎖、γ、ε、およびδを含む。ＴＣＲ複合体も、ＴＣＲを発現するＴ細胞の型に応じてＣＤ４分子またはＣＤ８分子とさらに相互作用することができる。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、ＴＣＲまたはＴＣＲ複合体の他のメンバー（ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３δ、またはＣＤ８もしくはＣＤ４、ならびにそれらの組み合わせを含む）であり得、第２の分子は、抗原負荷ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、またはＭＨＣ様分子、例えば、ＣＤ１ｄまたはＭＲであり得る。
ＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用の測定は、これまで、組換えｐＭＨＣ複合体（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ，２０１０）または蛍光ペプチドに結合したＭＨＣ（Ａｘｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，２０１５）を使用して、ＦＲＥＴによって達成されている。しかしながら、固定組織上での内因的に発現されたＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用を測定するための方法を欠いている。
本発明の方法、キット、および使用では、第１の分子は、内因的に発現されたＴＣＲまたはＴＣＲ複合体の他のメンバー（ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、およびＣＤ３δ、またはＣＤ８もしくはＣＤ４、ならびにそれらの組み合わせを含む）であり得、第２の分子は、内因的に発現された抗原負荷ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、またはＭＨＣ様分子、例えば、ＣＤ１ｄまたはＭＲ１であり得る。
ＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用研究のために、ＦＦＰＥ切片を覆い、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液で加熱し、その後、実施例１に記載の方法に従って処理する。
その後、組織切片を２つの条件：ドナーのみ（Ｄ）とドナー／アクセプター（Ｄ／Ａ）に分けた。使用した２つの一次抗体は、例えば、それぞれ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中で１：１００および１：５００に希釈した、マウス抗ＴＣＲおよびウサギ抗ＭＨＣである。ドナーのみ条件をマウス抗ＴＣＲ抗体とインキュベートし、ドナー／アクセプター条件をマウス抗ＴＣＲおよびウサギ抗ＭＨＣの両方とインキュベートする。
本明細において、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」とは、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）またはからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」を意味し、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）またはからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を意味する。
特定の形態で、または開示される機能を行う手段または開示される結果を得るための方法もしくはプロセスの観点で表される、前述の発明を実施するための形態に開示される特徴、または以下の特許請求の範囲、または添付の図面は、必要に応じて、別々に、またはかかる特徴の任意の組み合わせで、本発明を実現するためにそれらの多様な形態で利用され得る。
本発明は、これから、以下の条項を参照することにより定義される。
条項１．第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、前記方法が、
少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体が第１の細胞上の第１の分子に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上の第２の分子に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、を含み、
前記方法が、
（ａ）細胞を含む単離された試料を前記少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
（ｂ）前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）前記二次抗体間の相互作用を検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法。
条項２．前記二次抗体間の相互作用を検出することが、発せられた蛍光を検出することによる、条項１に記載の方法。
条項３．前記二次抗体間の相互作用を検出することが、変化した蛍光挙動を検出することによる、条項１に記載の方法。
条項４．前記変化した蛍光挙動を検出することが、時間分解である、条項３に記載の方法。
条項５．前記第１の細胞および前記第２の細胞が、同じ細胞型である、条項１に記載の方法。
条項６．前記第１の細胞および前記第２の細胞が、同じ細胞型ではない、条項１に記載の方法。
条項７．前記単離された試料が、固定細胞試料である、条項１に記載の方法。
条項８．前記単離された試料が、固定腫瘍細胞試料である、条項７に記載の方法。
条項９．前記第１の分子および前記第２の分子が、タンパク質、好ましくは、内因性タンパク質である、条項１～８のいずれかに記載の方法。
条項１０．前記タンパク質が、免疫チェックポイントタンパク質である、条項９に記載の方法。
条項１１．前記第１の分子がＰＤ－１であり、前記第２の分子がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である、条項９または１０に記載の方法。
条項１２．前記第１の分子がＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８であり、前記第２の分子がＣＤ８０またはＣＤ８６である、条項９または１０に記載の方法。
条項１３．前記第１の分子が、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドから選択され、第２の分子が、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせから選択される、条項９または１０に記載の方法。
条項１４．前記少なくとも２つの一次抗体が、全免疫グロブリン、抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項１～１３のいずれかに記載の方法。
条項１５．前記二次抗体のうちの少なくとも１つが、抗体または抗原結合断片である、条項１～１４のいずれかに記載の方法。
条項１６．前記少なくとも２つの二次抗体が、抗体または抗原結合断片である、条項１～１５のいずれかに記載の方法。
条項１７．前記抗体または抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、またはそれらの組み合わせである、条項１～１６のいずれかに記載の方法。
条項１８．前記一次抗体が標識されていない、条項１～１７のいずれかに記載の方法。
条項１９．前記第１の一次抗体がマウス抗体であり、少なくとも１つの他の前記一次抗体がウサギ抗体である、条項１～１８のいずれかに記載の方法。
条項２０．前記第１の一次抗体がＰＤ－１に結合し、前記少なくとも１つの他の一次抗体がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する、条項１１に記載の方法。
条項２１．前記第１の一次抗体がＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し、前記第２の一次抗体がＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかに結合する、条項１２に記載の方法。
条項２２．前記第１の一次抗体がＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドに結合し、前記少なくとも１つの他の一次抗体が、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、またはそれらの組み合わせに結合する、条項１３に記載の方法。
条項２３．前記第１の二次抗体が抗マウス抗体であり、前記少なくとも１つの他の二次抗体が、抗ウサギ抗体である、条項１９に記載の方法。
条項２４．前記ＦＲＥＴドナーが、ＯＲＧ ４８８、ＧＦＰ、フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＡＴＴＯ４８８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項１～２３のいずれかに記載の方法。
条項２５．前記ＦＲＥＴアクセプターが、ＡＬＸ ５９４、ｍＲＦＰ、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、ダブシル、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項１～２４のいずれかに記載の方法。
条項２６．前記酵素が、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼからなる群から選択される、条項１～２５のいずれかに記載の方法。
条項２７．前記酵素が、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群から選択される、条項２６に記載の方法。
条項２８．前記酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼからなる群から選択される、条項２７に記載の方法。
条項２９．前記基質がチラミドである、条項１～２８のいずれかに記載の方法。
条項３０．前記第１の細胞がＴ細胞であり、前記第２の細胞が腫瘍細胞である、条項１～２９のいずれかに記載の方法。
条項３１．前記少なくとも２つの一次抗体が、互いに同時にまたは順次に接触する、条項１～３０のいずれかに記載の方法。
条項３２．前記少なくとも２つの二次抗体が、互いに同時にまたは順次に接触する、条項１～３１のいずれかに記載の方法。
条項３３．前記少なくとも２つの一次抗体が、前記少なくとも２つの二次抗体と同時に前記試料と接触する、条項１～３１に記載の方法。
条項３４．前記少なくとも２つの一次抗体が、前記少なくとも２つの二次抗体の前に前記試料と接触する、条項１～３１に記載の方法。
条項３５．洗浄ステップが、前記少なくとも２つの一次抗体が前記試料と接触した後に、かつ前記少なくとも２つの二次抗体が前記試料と接触する前に行われる、条項３４に記載の方法。
条項３６．前記方法が、前記第１の細胞上の前記第１の部位と前記第２の細胞上の前記第２の部位との間の相互作用を定量化するステップをさらに含む、条項１～３５のいずれかに記載の方法。
条項３７．前記第１の細胞がリンパ球であり、前記第２の細胞が非リンパ球細胞型である、条項１～３６のいずれかに記載の方法。
条項３８．前記方法が、前記第１のリンパ球細胞上のＰＤ－１と前記第２の非リンパ球細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を検出する、条項３７に記載の方法。
条項３９．前記第１の分子が、前記第１の細胞の細胞表面上にあり、前記第２の分子が、前記第２の細胞の細胞表面上にある、条項１～３８のいずれかに記載の方法。
条項４０．チェックポイント阻害剤または活性化剤が前記第１の分子または前記第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、前記少なくとも２つの一次抗体が前記第１の分子または前記第２の分子に結合する、条項１～３９のいずれかに記載の方法。
条項４１．前記少なくとも２つの一次抗体が、チェックポイント阻害剤または活性化剤の前記第１の分子または前記第２の分子への結合を阻害しない、条項１～４０のいずれかに記載の方法。
条項４２．第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するための、条項１～４１のいずれかに記載のインビトロ一致アッセイ方法の使用。
条項４３．第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するためのインビトロ一致アッセイ方法における使用のためのキットであって、前記キットが、
ａ）少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体が第１の細胞上の第１の分子に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上の第２の分子に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
ｂ）少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、
ｃ）方法を行うための指示であって、前記方法が、
ｉ．細胞を含む単離された試料を前記少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
ｉｉ．前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
ｉｉｉ．洗浄ステップを行うことと、
ｉｖ．前記二次抗体間の相互作用を検出すること、を含む、指示と、を含む、キット。
条項４４．前記二次抗体間の相互作用を検出するための前記指示が、発せられた蛍光を検出することによる検出のためである、条項４３に記載の使用のためのキット。
条項４５．前記二次抗体間の相互作用を検出するための前記指示が、変化した蛍光挙動を検出することによる検出のためである、条項４３に記載の使用のためのキット。
条項４６．前記変化した蛍光挙動を検出することが、時間分解である、条項４５に記載の使用のためのキット。
条項４７．前記第１の細胞および前記第２の細胞が、同じ細胞型である、条項４３に記載の使用のためのキット。
条項４８．前記第１の細胞および前記第２の細胞が、同じ細胞型ではない、条項４３に記載の使用のためのキット。
条項４９．前記単離された試料が、固定細胞試料である、条項４３に記載の使用のためのキット。
条項５０．前記単離された試料が、固定腫瘍細胞試料である、条項４９に記載の使用のためのキット。
条項５１．前記第１の分子および前記第２の分子が、タンパク質、好ましくは、内因性タンパク質である、条項４３～５０のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項５２．前記タンパク質が、免疫チェックポイントタンパク質である、条項５１に記載の使用のためのキット。
条項５３．前記第１の分子がＰＤ－１であり、前記第２の分子がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である、条項５１または５２に記載の使用のためのキット。
条項５４．前記第１の分子がＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８であり、前記第２の分子がＣＤ８０またはＣＤ８６である、条項５１または５２に記載の使用のためのキット。
条項５５．前記第１の分子が、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドであり、前記第２の分子が、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせから選択される、条項５１または５２に記載の使用のためのキット。
条項５６．前記少なくとも２つの一次抗体が、全免疫グロブリン、抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項４３～５５のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項５７．前記二次抗体のうちの少なくとも１つが、抗体または抗原結合断片である、条項４３～５６のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項５８．前記少なくとも２つの二次抗体が、抗体または抗原結合断片である、条項４３～５７のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項５９．前記抗体または抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、またはそれらの組み合わせである、条項４３～５８のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項６０．前記一次抗体が標識されていない、条項４３～５９のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項６１．前記第１の一次抗体がマウス抗体であり、少なくとも１つの他の前記一次抗体がウサギ抗体である、条項４３～６０のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項６２．前記第１の一次抗体がＰＤ－１に結合し、前記少なくとも１つの他の一次抗体がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する、条項５３に記載の使用のためのキット。
条項６３．前記第１の一次抗体がＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し、前記第２の一次抗体がＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかに結合する、条項５４に記載の使用のためのキット。
条項６４．前記第１の一次抗体がＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドに結合し、前記第２の一次抗体が、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせに結合する、条項５５に記載の使用のためのキット。
条項６５．前記第１の二次抗体が抗マウス抗体であり、前記少なくとも１つの他の二次抗体が抗ウサギ抗体である、条項６１に記載の使用のためのキット。
条項６６．前記ＦＲＥＴドナーが、ＯＲＧ ４８８、ＧＦＰ、フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＡＴＴＯ４８８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項４３～６５のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項６７．前記ＦＲＥＴアクセプターが、ＡＬＸ ５９４、ｍＲＦＰ、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、ダブシル、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、条項４３～６６のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項６８．前記酵素が、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼからなる群から選択される、条項４３～６７のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項６９．前記酵素が、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群から選択される、条項６８に記載の使用のためのキット。
条項７０．前記酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼからなる群から選択される、条項６９に記載の使用のためのキット。
条項７１．前記基質がチラミドである、条項４３～７０のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項７２．前記第１の細胞がＴ細胞であり、前記第２の細胞が腫瘍細胞である、条項４３～７１のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項７３．前記指示が、前記少なくとも２つの一次抗体を互いに同時にまたは順次に接触させることを提供する、条項４３～７２のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項７４．前記指示が、前記少なくとも２つの二次抗体を互いに同時にまたは順次に接触させることを提供する、条項４３～７３のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項７５．前記指示が、前記少なくとも２つの一次抗体を、前記少なくとも２つの二次抗体と同時に、前記試料と接触させることを提供する、条項４３～７３に記載の使用のためのキット。
条項７６．前記指示が、前記少なくとも２つの一次抗体を、前記少なくとも２つの二次抗体の前に、前記試料と接触させることを提供する、条項４３～７３に記載の使用のためのキット。
条項７７．前記指示が、前記少なくとも２つの一次抗体が前記試料と接触した後に、かつ前記少なくとも２つの二次抗体が前記試料と接触する前に、洗浄ステップを行うことを提供する、条項７６に記載の使用のためのキット。
条項７８．前記指示が、前記第１の細胞上の前記第１の部位と前記第２の細胞上の前記第２の部位との間の相互作用を定量化するステップをさらに含む方法を提供する、条項４３～７７のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項７９．前記第１の細胞がリンパ球であり、前記第２の細胞が非リンパ球細胞型である、条項４３～７８のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項８０．前記指示が、前記第１のリンパ球細胞上のＰＤ－１と前記第２の非リンパ球細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を検出する方法を提供する、条項７９に記載の使用のためのキット。
条項８１．前記第１の分子が、前記第１の細胞の細胞表面上にあり、前記第２の分子が、前記第２の細胞の細胞表面上にある、条項４３～８０のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項８２．チェックポイント阻害剤または活性化剤が前記第１の分子または前記第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、前記少なくとも２つの一次抗体が前記第１の分子または前記第２の分子に結合する、条項４３～８１のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項８３．前記少なくとも２つの一次抗体が、阻害剤または活性化剤の前記第１の分子または前記第２の分子への結合を阻害しない、条項４３～８２のいずれかに記載の使用のためのキット。
条項８４．第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するためのインビトロ一致アッセイ方法における、条項４３～８３のいずれかに記載のキットの使用。
条項８５．がんを有する患者を治療のために選択する方法であって、該方法が、
少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、を含み、
前記方法が、
（ａ）前記患者由来の単離された腫瘍細胞試料を前記少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
（ｂ）前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって前記二次抗体間の相互作用を検出することであって、
ａ．意図された療法が、前記第１のチェックポイント標的分子および前記第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが閾値スコア以下である場合、前記全スコアは、前記患者が前記意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、または
ｉｉ．全スコアが閾値スコアを超える場合、前記全スコアは、前記患者が前記意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
ｂ．意図された療法が、前記第１のチェックポイント標的分子および前記第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント阻害剤を含む場合、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、前記全スコアは、前記患者が前記意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、前記全スコアは、前記患者が前記意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、方法。
条項８６．前記第１のチェックポイント標的分子がＰＤ－１であり、前記第２のチェックポイント標的分子がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２であり、蛍光シグナルスコアを決定する際に、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、前記全スコアは、前記患者が抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、前記全スコアは、前記患者が抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または抗ＰＤ－Ｌ２抗体での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、条項７５に記載の方法。
条項８７．前記患者が、がん療法を以前に受けていない、または前記患者が、前記チェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法を以前に受けていない、条項８６または８７に記載の方法。
条項８８．全スコアが０．５％～５％である場合、これは、前記患者が前記チェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法に応答しないであろうことを示す、条項８６～８８に記載の方法。
条項８９．全スコアが５％～１０％である場合、これは、前記患者が前記チェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法に応答するかもしれないことを示す、条項８６～８８に記載の方法。
条項９０．全スコアが１０％を超える場合、これは、前記患者が前記チェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とする療法に応答するであろうことを示す、条項８６～８８に記載の方法。
条項９１．全スコアが、ＦＲＥＴ効率パーセンテージである、条項８６～９０に記載の方法。
条項９２．前記チェックポイント阻害剤または活性化剤が前記第１の分子または前記第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、前記少なくとも２つの一次抗体が前記第１の分子または前記第２の分子に結合する、条項８６～９１に記載の方法。
条項９３．前記少なくとも２つの一次抗体が、前記チェックポイント阻害剤または活性化剤の前記第１の分子または前記第２の分子への結合を阻害しない、条項８６～９２に記載の方法。
条項９４．がんを有する患者を治療のために選択する条項８６～９３に記載の方法の使用であって、
ａ．意図された療法が、前記第１のチェックポイント標的分子および前記第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが閾値スコア以下である場合、前記全スコアは、前記患者が前記意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、または
ｉｉ．全スコアが閾値スコアを超える場合、前記全スコアは、前記患者が前記意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
ｂ．意図された療法が、前記第１のチェックポイント標的分子および前記第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方を標的とするチェックポイント阻害剤を含む場合、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、前記全スコアは、前記患者が前記意図された療法に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、前記全スコアは、前記患者が前記意図された療法に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、使用。
条項９５．チェックポイント活性化剤または阻害剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、該方法が、
少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、を含み、
前記方法が、
（ａ）単離された腫瘍細胞試料を前記少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
（ｂ）前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって前記二次抗体間の相互作用を検出することと、
（ｅ）前記試料を前記チェックポイント活性化剤または阻害剤と接触させることと、
（ｆ）前記二次抗体間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
ａ．前記チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、前記チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．前記チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、前記チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法。
条項９６．前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体であり、前記第１の一次抗体がＰＤ－１に結合し、前記第２の一次抗体がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する、条項９５に記載の方法。
条項９７．前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＤＸ １１０６、またはＯＮＯ－４５３８）、ペムブロリズマブ（イアムブロリズマブまたはＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－Ｑ１ １）、ＥＤ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＡＭＰ－２２４、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１ １０５）、ＥＤ ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４８）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ならびにそれらの断片および塩からなる群から選択される、条項９５または９６に記載の方法。
条項９８．ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の増加は、前記チェックポイント活性化剤が有効であろうことを示す、条項９５～９７に記載の方法。
条項９９．ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の減少は、前記チェックポイント阻害剤が有効であろうことを示す、条項９５～９７に記載の方法。
条項１００．前記チェックポイント阻害剤または活性化剤が前記第１の分子または前記第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、前記少なくとも２つの一次抗体が前記第１の分子または前記第２の分子に結合する、条項９５～９９に記載の方法。
条項１０１．前記少なくとも２つの一次抗体が、前記チェックポイント阻害剤または活性化剤の前記第１の分子または前記第２の分子への結合を阻害しない、条項９５～１００に記載の方法。
条項１０２．チェックポイント阻害剤または活性化剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であろうかを検出するための条項９５～１０１のいずれかに記載のインビトロ一致アッセイ方法の使用であって、
ａ．前記チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、前記チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．前記チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、前記チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｖ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、使用。
条項１０３．チェックポイント阻害剤または活性化剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するためのインビトロ一致アッセイ方法における使用のためのキットであって、該キットが、
（ａ）少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
（ｂ）少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、
（ｃ）方法を行うための指示であって、前記方法が、
ａ．単離された腫瘍細胞試料を前記少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
ｂ．前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
ｃ．洗浄ステップを行うことと、
ｄ．全蛍光スコアを決定することによって前記二次抗体間の相互作用を検出することと、
ｅ．試料をチェックポイント活性化剤または阻害剤と接触させることと、
ｆ．前記二次抗体間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
前記チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、前記チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
前記チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、前記チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｖ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、検出することと、を含む、指示と、を含む、キット。
条項１０４．チェックポイント阻害剤または活性化剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するためのインビトロ一致アッセイ方法における条項８３に記載のキットの使用であって、
前記チェックポイント分子が阻害剤である場合、
ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、前記チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
前記チェックポイント分子が活性化剤である場合、
ｉｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、前記チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｖ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、使用。
条項１０５．チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するインビトロ方法であって、該方法が、
少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、を含み、
前記方法が、
（ａ）前記チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療前に患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を、少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
（ｂ）前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって前記二次抗体間の相互作用を検出することと、
（ｅ）ステップ（ａ）における前記チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療中に前記患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を使用して、ステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、
（ｆ）前記試料間の全蛍光スコアを比較することであって、
ａ．前記療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、前記療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、前記療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．前記療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、前記療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、前記療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、比較することと、を含む、インビトロ方法。
条項１０６．前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１抗体であり、前記第１の一次抗体がＰＤ－１に結合し、前記第２の一次抗体がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する、条項１０５に記載の方法。
条項１０７．前記チェックポイント阻害剤が、ニボイウマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＤＸ １１０６、またはＯＮＯ－４５３８）、ペムブロイイズマブ（イアムブロイイズマブまたはＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－Ｑ１ １）、ＥＤ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＡＭＰ－２２４、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１ １０５）、ＥＤ ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４８）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ならびにそれらの断片および塩からなる群から選択される、条項１０５または１０６に記載の方法。
条項１０８．全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の増加は、前記チェックポイント活性化剤を含む療法が有効であろうことを示す、条項１０５～１０７に記載の方法。
条項１０９．全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の減少は、前記チェックポイント阻害剤を含む療法が有効であろうことを示す、条項１０５～１０７に記載の方法。
条項１１０．前記チェックポイント阻害剤または活性化剤が前記第１の分子または前記第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、前記少なくとも２つの一次抗体が前記第１の分子または前記第２の分子に結合する、条項１０５～１０９に記載の方法。
条項１１１．前記少なくとも２つの一次抗体が、前記チェックポイント阻害剤または活性化剤の前記第１の分子または前記第２の分子への結合を阻害しない、条項１０５～１１０に記載の方法。
条項１１２．チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するための条項１０５～１１１に記載の方法の使用であって、
ｃ．前記療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、前記療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、前記療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｄ．前記療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、前記療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、前記療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、使用。
条項１１３．チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するインビトロ方法における使用のためのキットであって、該キットが、
少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、
方法を行うための指示であって、前記方法が、
（ａ）前記チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療前に前記患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を、前記少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
（ｂ）前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって前記二次抗体間の相互作用を検出することと、
（ｅ）ステップ（ａ）における前記チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む治療中に前記患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を使用して、ステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、
（ｆ）前記試料間の全蛍光スコアを比較することであって、
ａ．前記療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、前記療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、前記療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．前記療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、前記療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、前記療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、比較することと、を含む、指示と、を含む、キット。
条項１１４．チェックポイント活性化剤または阻害剤を含む療法が患者に有効であるかを決定するインビトロ方法における条項１１３に記載のキットの使用であって、
ａ．前記療法がチェックポイント阻害剤を含む場合、
ｉ．全スコアが減少した場合、前記療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、前記療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
ｂ．前記療法がチェックポイント活性化剤を含む場合、
ｉ．全スコアが増加した場合、前記療法が有効であることが示されるか、または予測される、または
ｉｉ．全スコアが変化しなかった場合、前記療法が有効ではないことが示されるか、または予測される、使用。
条項１１５．目的とする分子がチェックポイント活性化剤であるかチェックポイント阻害剤であるかを特定するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、該方法が、
少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、を含み、
前記方法が、
（ａ）単離された腫瘍細胞試料を前記少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
（ｂ）前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光スコアを決定することによって前記二次抗体間の相互作用を検出することと、
（ｅ）前記試料を前記目的とする分子と接触させることと、
（ｆ）前記二次抗体間の相互作用のいずれの変化も検出することであって、
ａ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、前記分子が前記第１のチェックポイント標的分子および前記第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤である、または
ｂ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、前記分子が前記第１のチェックポイント標的分子および前記第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント阻害剤である、または
ｃ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記分子が前記第１のチェックポイント標的分子および前記第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤でもチェックポイント阻害剤でもない、検出することと、を含む、インビトロ一致アッセイ方法。
条項１１６．ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％、好ましくは５％～１０％、より好ましくは１０％超の増加は、前記目的とする分子が、前記第１のチェックポイント標的分子および前記第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント活性化剤であることを示す、条項１１５に記載の方法。
条項１１７．ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの５％～０．５％、好ましくは１０％～５％、より好ましくは１０％超の減少は、前記目的とする分子が、前記第１のチェックポイント標的分子および前記第２のチェックポイント標的分子のうちの少なくとも一方に対するチェックポイント阻害剤であることを示す、条項１１５に記載の方法。
条項１１８．前記目的とする分子が前記第１の分子または前記第２の分子に同時にまたは続いて結合し得るような様式で、前記少なくとも２つの一次抗体が前記第１の分子または前記第２の分子に結合する、条項１１５～１１７に記載の方法。
条項１１９．前記少なくとも２つの一次抗体が、前記目的とする分子の前記第１の分子または前記第２の分子への結合を阻害しない、条項１１５～１１７に記載の方法。
条項１２０．がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するインビトロ方法であって、該方法が、
少なくとも２つの一次抗体であって、第１の一次抗体が第１の細胞上のＰＤ－１に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、を含み、
前記方法が、
（ａ）前記患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を前記少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
（ｂ）前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
（ｃ）洗浄ステップを行うことと、
（ｄ）全蛍光シグナルスコアを決定することによって前記二次抗体間の相互作用を検出することであって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、前記全スコアは、前記患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、前記全スコアは、前記患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、インビトロ方法。
条項１２１．前記試料が、固定腫瘍細胞試料である、条項１２０に記載の方法。
条項１２２．前記方法が、
（ｉ）ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する単剤での治療、またはＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤および少なくとも１つの他の抗腫瘍剤での併用療法における治療の選択についての決定を導くために、治療前に前記患者から得られた生体試料に、かつ
（ｉｉ）対象の現在の治療レジメンへの応答を監視し、かつ単剤ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２遮断療法での治療または併用療法での治療の選択についての決定を導くために、治療中に前記患者から得られた少なくとも１つの生体試料に行われる、条項１２０～１２１に記載の方法。
条項１２３．がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するための条項１２０～１２２のいずれかに記載のインビトロ方法の使用であって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、前記全スコアは、前記患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、前記全スコアは、前記患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、使用。
条項１２４．がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するインビトロ方法における使用のためのキットであって、該キットが、
第１の一次抗体が第１の細胞上のＰＤ－１に結合し、第２の一次抗体が第２の細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合し、前記第１の一次抗体および前記二次一次抗体が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次抗体と、
少なくとも２つの二次抗体であって、第１の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合し、第２の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合し、前記第１の二次抗体が前記第２の一次抗体に結合せず、前記第２の二次抗体が前記第１の一次抗体に結合せず、
（ｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体がＦＲＥＴアクセプターで標識されているか、
（ｉｉ）前記第１の二次抗体および前記第２の二次抗体がＤＮＡ配列にコンジュゲートまたは融合しており、前記ＤＮＡ配列が異なり、ライゲートしてサークルを形成し、ローリングサークルＤＮＡ増幅によって増幅され、前記増幅されたＤＮＡ配列のものに相補的な外部から適用された蛍光標識ＤＮＡプローブによって結合されるか、または
（ｉｉｉ）前記第１の二次抗体がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次抗体が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび基質特異的酵素を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次抗体と、
方法を行うための指示であって、前記方法が、
ａ．前記患者から得られた単離された腫瘍細胞試料を前記少なくとも２つの一次抗体と接触させることと、
ｂ．前記試料を前記少なくとも２つの二次抗体と接触させることと、
ｃ．洗浄ステップを行うことと、
ｄ．全蛍光シグナルスコアを決定することによって前記二次抗体間の相互作用を検出することであって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、前記全スコアは、前記患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、前記全スコアは、前記患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、検出することと、を含む、指示と、を含む、キット。
条項１２５．前記試料が、固定腫瘍細胞試料である、条項１２４に記載のキット。
条項１２６．前記方法を行うための前記指示が、前記方法を、
（ｉ）ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する単剤での治療、またはＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤および少なくとも１つの他の抗腫瘍剤での併用療法における治療の選択についての決定を導くために、治療前に前記患者から得られた生体試料に、かつ
（ｉｉ）対象の現在の治療レジメンへの応答を監視し、かつ単剤ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２遮断療法での治療または併用療法での治療の選択についての決定を導くために、治療中に前記患者から得られた少なくとも１つの生体試料に行うための指示をさらに含む、条項１２４～１２５のいずれかに記載のキット。
条項１２７．がんを有する患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤に応答性を示すであろうかを決定するインビトロ方法における条項１２４～１２６のいずれかに記載のキットの使用であって、
（ｉ）全スコアが閾値スコア以下である場合、前記全スコアは、前記患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答しないであろうことを示すか、または予測する、または
（ｉｉ）全スコアが閾値スコアを超える場合、前記全スコアは、前記患者がＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を遮断する薬剤での治療に応答するであろうことを示すか、または予測する、使用。
条項１２８．第１の細胞で発現される第１の分子と第２の細胞で発現される第２の分子との間の相互作用を検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、該方法が、
第１および第２の融合タンパク質であって、各融合タンパク質が、検出ドメイン、認識ドメイン、およびコネクタードメインを含む、第１および第２の融合タンパク質を含み、
前記検出ドメインが、ＤＮＡ結合ドメインを含み、さらなる検出ドメインと協働して同族特異的ヌクレオチド配列に結合することができ、
前記認識ドメインが、標的分子に結合することができ、
前記コネクタードメインが、一方の末端で前記検出ドメインに融合しており、他方の末端で前記認識ドメインに融合しており、
前記検出ドメイン、前記認識ドメイン、および前記コネクタードメインが互いに異種であり、
前記方法が、
（ｉ）前記試料を前記第１のおよび融合タンパク質と接触させるステップと、
（ｉｉ）インキュベートして結合を許容するステップと、
（ｉｉｉ）結合していない融合タンパク質を除去するステップと、
（ｉｖ）前記試料を、前記同族特異的ヌクレオチド配列を含む核酸と接触させるステップと、
（ｖ）インキュベートして前記核酸のヘテロ三量体結合を許容するステップと、
（ｖｉ）試料に結合した核酸を検出するステップと、を含み、
前記核酸がステップ（ｖｉ）で検出された場合、これは、前記２つの標的分子が前記試料中に同時に存在することを示す、インビトロ一致アッセイ方法。

Claims (59)

  1. 細胞間相互作用を検出するためのインビトロ方法であって、該方法が、
    ａ．少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１の分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２の分子に結合し、前記第１の一次結合剤および前記第２の一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
    ｂ．少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が前記第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が前記第２の一次結合剤に結合し、前記第１の二次結合剤が前記第２の一次結合剤に結合せず、前記第２の二次結合剤が前記第１の一次結合剤に結合せず、
    前記第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび酵素に特異的な基質を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、前記基質がチラミドであり、前記方法が、
    ｉ．細胞を含む単離された試料を前記少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
    ｉｉ．前記試料を前記少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
    ｉｉｉ．洗浄ステップを行うことと、
    ｉｖ．前記二次結合剤間の相互作用を検出することと、を含む、インビトロ方法。
  2. 前記二次結合剤間の相互作用を検出することが、発せられた蛍光を検出することによる、請求項１に記載のインビトロ方法。
  3. 前記二次結合剤間の相互作用を検出することが、変化した蛍光挙動を検出することによる、請求項１に記載のインビトロ方法。
  4. 前記変化した蛍光挙動を検出することは、時間分解である、請求項３に記載のインビトロ方法。
  5. 前記第１の細胞および前記第２の細胞が、同じ細胞型である、請求項１に記載のインビトロ方法。
  6. 前記第１の細胞および前記第２の細胞が、同じ細胞型ではない、請求項１に記載のインビトロ方法。
  7. 前記単離された試料が、固定細胞試料である、請求項１に記載のインビトロ方法。
  8. 前記固定細胞試料は、固定腫瘍細胞試料である、請求項７に記載のインビトロ方法。
  9. 前記第１の分子および前記第２の分子がタンパク質である、請求項１に記載のインビトロ方法。
  10. 前記タンパク質が内因性タンパク質である、請求項９に記載のインビトロ方法。
  11. 前記タンパク質が免疫チェックポイントタンパク質である、請求項９に記載のインビトロ方法。
  12. 前記第１の分子がＰＤ－１であり、前記第２の分子がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である、請求項９に記載のインビトロ方法。
  13. 前記第１の一次結合剤が、前記第１の細胞上のＰＤ－１に結合し、少なくとも１つの他の前記一次結合剤が、前記第２の細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する、請求項９に記載のインビトロ方法。
  14. 前記ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２への結合を検出する、請求項１３に記載のインビトロ方法。
  15. 前記第１の分子がＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８であり、前記第２の分子がＣＤ８０またはＣＤ８６である、請求項９に記載のインビトロ方法。
  16. 前記第１の一次結合剤が、前記第１の細胞上のＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し、前記第２の一次結合剤が、前記第２の細胞上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合する、請求項１５に記載のインビトロ方法。
  17. 前記ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８のＣＤ８０またはＣＤ８６への結合を検出する、請求項１６に記載のインビトロ方法。
  18. 前記第１の分子が、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドであり、前記第２の分子が、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項９に記載のインビトロ方法。
  19. 前記第１の一次結合剤が、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩペプチドに結合し、前記第２の一次結合剤が、前記第２の細胞上のＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせに結合する、請求項１８に記載のインビトロ方法。
  20. 前記ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩペプチドの、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせへの結合を検出する、請求項１９に記載のインビトロ方法。
  21. 前記第１の細胞がリンパ球であり、および／または、前記第２の細胞が非リンパ球細胞である、請求項１に記載のインビトロ方法。
  22. 前記第１の細胞がＴ細胞であり、前記第２の細胞が抗原提示細胞である、請求項２１に記載のインビトロ方法。
  23. 前記方法が、第１のリンパ球細胞上のＰＤ－１と、第２の非リンパ球細胞上のＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との間の相互作用を検出する、請求項２１に記載のインビトロ方法。
  24. 前記方法が、第１のリンパ球細胞上のＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８と、第２の非リンパ球細胞上のＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用を検出する、請求項２１に記載のインビトロ方法。
  25. 前記方法が、第１のリンパ球細胞上のＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドと、第２の非リンパ球細胞上のＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせとの間の相互作用を検出する、請求項２１に記載のインビトロ方法。
  26. 前記少なくとも２つの一次結合剤が、全免疫グロブリン、抗体足場、抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のインビトロ方法。
  27. 前記少なくとも２つの二次結合剤が、全免疫グロブリン、抗体足場、または抗体もしくはその抗原結合断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のインビトロ方法。
  28. 前記二次結合剤のうちの少なくとも１つが、抗体足場、抗体、または抗原結合断片である、請求項１に記載のインビトロ方法。
  29. 前記少なくとも２つの二次結合剤が、抗体足場、抗体結合断片、または抗原結合断片である、請求項１に記載のインビトロ方法。
  30. 前記抗体または抗原結合断片が、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、またはそれらの組み合わせである、請求項２６に記載のインビトロ方法。
  31. 前記抗体足場が、二環式ペプチド、システインノット、クニッツドメイン、オボディ、およびＴｎ３から選択される、請求項２６に記載のインビトロ方法。
  32. 前記第１および第２の一次結合剤が標識されていない、請求項１に記載のインビトロ方法。
  33. 前記第１の一次結合剤がマウス結合剤であり、前記第２の一次結合剤がウサギ結合剤である、請求項１に記載のインビトロ方法。
  34. 前記第１の二次結合剤が抗マウス結合剤であり、前記第２の二次結合剤が抗ウサギ結合剤である、請求項３３に記載のインビトロ方法。
  35. 前記ＦＲＥＴドナーが、ＯＲＧ ４８８、ＧＦＰ、フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＡＴＴＯ４８８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のインビトロ方法。
  36. 前記ＦＲＥＴアクセプターが、ＡＬＸ ５９４、ｍＲＦＰ、テトラメチルローダミン、フルオレセイン、ダブシル、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ９、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のインビトロ方法。
  37. 前記酵素が、オキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のインビトロ方法。
  38. 前記酵素が、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、およびグリコシダーゼからなる群から選択される、請求項３７に記載のインビトロ方法。
  39. 前記酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびベータ－ガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項３８に記載のインビトロ方法。
  40. 前記少なくとも２つの一次結合剤が、互いに同時にまたは順次に前記試料と接触する、請求項１に記載のインビトロ方法。
  41. 前記少なくとも２つの二次結合剤が、互いに同時にまたは順次に前記試料と接触し、
    前記少なくとも２つの一次結合剤が、前記少なくとも２つの二次結合剤と同時に、または、前記少なくとも２つの二次結合剤の前に、前記試料と接触する、請求項１に記載のインビトロ方法。
  42. 洗浄ステップが、前記少なくとも２つの一次結合剤が前記試料と接触した後に、かつ前記少なくとも２つの二次結合剤が前記試料と接触する前に行われる、請求項１に記載のインビトロ方法。
  43. 前記方法が、前記第１の細胞上の第１の分子と前記第２の細胞上の第２の分子との間の相互作用を定量化するステップをさらに含む、請求項１に記載のインビトロ方法。
  44. 前記第１の分子が、前記第１の細胞の細胞表面上にあり、前記第２の分子が、前記第２の細胞の細胞表面上にある、請求項１に記載のインビトロ方法。
  45. チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１の分子または第２の分子に同時にまたは続いて結合することができるような様式で、前記少なくとも２つの一次結合剤が前記第１の分子または前記第２の分子に結合する、請求項１に記載のインビトロ方法。
  46. 前記少なくとも２つの一次結合剤が、チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１の分子または第２の分子への結合を阻害しない、請求項１に記載のインビトロ方法。
  47. チェックポイント活性化剤または阻害剤が腫瘍応答の阻害または調節に有効であるかを検出するためのインビトロ一致アッセイ方法であって、該方法が、
    少なくとも２つの一次結合剤であって、第１の一次結合剤が第１の細胞上の第１のチェックポイント標的分子に結合し、第２の一次結合剤が第２の細胞上の第２のチェックポイント標的分子に結合し、前記第１の一次結合剤および前記第２の一次結合剤が免疫学的にはっきりと異なる、少なくとも２つの一次結合剤と、
    少なくとも２つの二次結合剤であって、第１の二次結合剤が前記第１の一次結合剤に結合し、第２の二次結合剤が前記第２の一次結合剤に結合し、前記第１の二次結合剤が前記第２の一次結合剤に結合せず、前記第２の二次結合剤が前記第１の一次結合剤に結合せず、
    前記第１の二次結合剤がＦＲＥＴドナーで標識されており、前記第２の二次結合剤が、酵素であって、ＦＲＥＴアクセプターおよび酵素に特異的な基質を含むコンジュゲートと反応して、前記酵素に隣接する分子表面上の電子豊富な部分に結合する活性化コンジュゲートを形成する、酵素に融合している、少なくとも２つの二次結合剤と、を含み、前記基質がチラミドであり、
    前記方法が、
    （ａ）単離された腫瘍細胞試料を前記少なくとも２つの一次結合剤と接触させることと、
    （ｂ）前記試料を前記少なくとも２つの二次結合剤と接触させることと、
    （ｃ）洗浄ステップを行うことと、
    （ｄ）蛍光スコアの全スコアを決定することによって前記二次結合剤間の相互作用を検出することと、
    （ｅ）前記試料を前記チェックポイント活性化剤または阻害剤と接触させることと、
    （ｆ）前記二次結合剤間の相互作用のいずれの変化も検出することと、を含み、
    ａ．前記試料をチェックポイント阻害剤と接触させる場合、
    ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で減少する場合、前記チェックポイント阻害剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
    ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント阻害剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、または
    ｂ．前記試料をチェックポイント活性化剤と接触させる場合、
    ｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で増加する場合、前記チェックポイント活性化剤が有効であることが示されるか、または予測される、または
    ｉｉ．全スコアがステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間で変化しない場合、前記チェックポイント活性化剤が有効ではないことが示されるか、または予測される、インビトロ一致アッセイ方法。
  48. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＰＤ－１結合剤であり、前記第１の一次結合剤がＰＤ－１に結合し、前記第２の一次結合剤がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に結合する、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８結合剤であり、前記第１の一次結合剤がＣＴＬＡ－４またはＣＤ２８に結合し、前記第２の一次結合剤がＣＤ８０またはＣＤ８６に結合する、請求項４７に記載の方法。
  50. 前記チェックポイント阻害剤が抗ＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチド結合剤であり、前記第１の一次結合剤がＭＨＣクラスＩまたはＩＩペプチドに結合し、前記第２の一次結合剤が、ＴＣＲ、ＣＤ８、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせに結合する、請求項４７に記載の方法。
  51. 前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、ＤＸ １１０６、またはＯＮＯ－４５３８）、ペムブロリズマブ（イアムブロリズマブまたはＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－Ｑ１ １）、ＥＤ－０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＡＭＰ－２２４、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１ １０５）、ＥＤ ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４８）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ならびにそれらの断片および塩からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  52. ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％の増加は、前記チェックポイント活性化剤が有効であろうことを示す、請求項４７に記載の方法。
  53. ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの５％～１０％の増加は、前記チェックポイント活性化剤が有効であろうことを示す、請求項４７に記載の方法。
  54. ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの１０％超の増加は、前記チェックポイント活性化剤が有効であろうことを示す、請求項４７に記載の方法。
  55. ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの０．５％～５％の減少は、前記チェックポイント阻害剤が有効であろうことを示す、請求項４７に記載の方法。
  56. ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの５％～１０％の減少は、前記チェックポイント阻害剤が有効であろうことを示す、請求項４７に記載の方法。
  57. ステップ（ｄ）とステップ（ｆ）との間の全スコアの１０％超の減少は、前記チェックポイント阻害剤が有効であろうことを示す、請求項４７に記載の方法。
  58. 前記チェックポイント阻害剤または活性化剤が第１のチェックポイント標的分子または第２のチェックポイント標的分子に同時にまたは続いて結合することができるような様式で、前記少なくとも２つの一次結合剤が第１のチェックポイント標的分子または第２のチェックポイント標的分子に結合する、請求項４７に記載の方法。
  59. 前記少なくとも２つの一次結合剤が、前記チェックポイント阻害剤または活性化剤の第１のチェックポイント標的分子または第２のチェックポイント標的分子への結合を阻害しない、請求項４７に記載の方法。
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