TW202428605A - 抗體表徵方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露關於表徵低量免疫原結合蛋白之方法，該免疫原結合蛋白係例如直接從單獨培養的B細胞的上清液獲得的免疫原結合抗體。該等避免融合瘤形成的方法關於提供分泌免疫原結合抗體的B細胞的製劑，以及在適於該等B細胞將該等免疫原結合抗體分泌到培養上清液中之條件下單獨培養該等B細胞。從該等單獨培養的B細胞收集含有所分泌的抗體之該等培養上清液，並且使其經受一或多種結合測定以表徵來自該B細胞製劑的該等免疫原結合抗體。

Description

抗體表徵方法
本揭露關於使用來自單獨培養的B細胞的含抗體上清液表徵抗體-靶蛋白相互作用的高通量方法。
治療性單株抗體（mAb）之發現典型地從動物免疫、B細胞分離以及融合瘤形成和培養開始，以產生針對靶標的大mAb組（panel）。從該等大組中鑒定治療候選物關於評估結合親和力、交叉反應性、表位結合、阻斷活性和抗體鏈成分。鑒於鑒定具有所需功能屬性的候選抗體的重要性，融合瘤形成和培養一直被認為是發現過程的必要組成部分，以確保足夠量的抗體可用於全面評估。然而，由於融合瘤產生所關於的時間漫長，可能需要超過15週的時間來鑒定初始候選分子。由於開發治療性mAb的成本高，更快速且低成本地鑒定優質先導物的能力將提供優於先前技術方法的顯著優勢。本揭露旨在克服本領域的該等和其他缺陷。
本揭露之第一方面涉及一種表徵來自B細胞製劑的免疫原結合抗體之方法。此方法包括提供非永生化B細胞製劑，其中該製劑之B細胞分泌免疫原結合抗體；以及在有效使該等B細胞將該等免疫原結合抗體分泌到培養上清液中之條件下單獨培養該製劑之B細胞。從該等單獨培養的B細胞收集含有所分泌的抗體之培養上清液，並且使所收集的每份上清液經受兩種或更多種不同的結合測定以表徵來自該B細胞製劑的免疫原結合抗體。
本揭露之另一方面涉及一種表徵來自B細胞製劑的抗體之結合親和力之方法。此方法包括提供非永生化B細胞製劑，其中該製劑之B細胞分泌免疫原結合抗體。該方法進一步關於在有效使該等B細胞將免疫原結合抗體分泌到培養上清液中之條件下單獨培養該製劑之B細胞。從該等單獨培養的B細胞收集含有所分泌的抗體之培養上清液，並且將每份培養上清液暴露於漸增濃度的該免疫原、該免疫原的片段或該免疫原的同源物。該方法進一步關於檢測該培養上清液的所分泌的抗體與在每種漸增濃度下的該免疫原、其片段或其同源物之間的締合和解離。基於所述檢測表徵所分泌的抗體之結合親和力。
用於鑒定抗原特異性抗體的經典方法關於從經免疫的動物（例如，小鼠）收穫脾和/或淋巴結，從所收穫的組織收集B細胞，並且由於與B細胞的離體培養和存活相關的挑戰，使所收集的B細胞永生化。典型地經由將該等B細胞與永生化骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤來實現永生化。將該等永生化細胞鋪板到孔中並培養以產生富含抗體的上清液，其可以用於各種測定，如抗原結合、親和力、阻斷活性（例如，受體-配體阻斷）、輕鏈確定、表位分箱（binning）等，以選擇具有所需特徵的先導抗體（參見圖1A）。在選擇先導物後，開始定序以解析結合和序列轉移所需的抗體重鏈和輕鏈的序列以用於重組生產。
融合瘤技術的主要缺點係時間。該方案（不包括免疫）需要約4-6個月的時間來鑒定先導候選抗體（參見Pedrioli, A.和Oxenium, A., 「Single B Cell Technologies for Monoclonal Antibody Discovery [用於單株抗體發現的單B細胞技術],」 Trends Immunol.[免疫學趨勢] 42(12): 1143-1158 (2021)）。另外，就融合效率和融合瘤形成而言，該程序可能是低通量的，並且一些融合瘤係低產率抗體生產者。
為了減少與融合瘤技術相關的所關於的時間和其他缺點，已經在確定原代B細胞的培養條件方面取得了進展，該等培養條件避免了永生化並允許實現單B細胞篩選方法。該等篩選方法中有許多關於將單獨的B細胞放置在含有可檢測抗原（懸浮或固定）的微型化孔或室、微毛細管或油包水液滴中，以快速鑒定B細胞抗體的結合特異性（參見Pedrioli, A.和Oxenium, A.的綜述文章「Single B Cell Technologies for Monoclonal Antibody Discovery [用於單株抗體發現的單B細胞技術],」 Trends Immunol.[免疫學趨勢] 42(12): 1143-1158 (2021)的1151-1153處和圖2）。一旦鑒定出目的B細胞，便回收該等細胞，並且獲得抗體編碼序列以用於重組生產（參見圖1B）。雖然該等方法係高通量的以有助於抗原特異性抗體產生細胞的迅速鑒定，但它們迄今為止還無法適應鑒定潛在先導抗體所必需的功能測定，例如結合親和力（參見同上的1153處）。
開發並實施本文所述之方法以克服抗體發現過程中之上述缺陷。在此方法中，將非永生化B細胞（例如，分離自經免疫的動物的原代B細胞）單獨鋪板到孔中。培養該等B細胞以允許將抗體分泌到培養上清液中，隨後收集該培養上清液以在一次實驗運行中篩選所分泌的抗體之多種所需特徵，包括結合特異性、結合親和力、表位結合、阻斷活性、輕鏈組成和其他基於蛋白質的相互作用（參見圖1C和圖2）。歷史融合瘤技術與本文所述之方法之間的關鍵差異在於，本揭露之方法中之B細胞在抗體表徵之前沒有永生化，從而顯著減少了該方法中所關於的時間和資源。本揭露之方法與目前的單B細胞篩選策略的差異還在於本揭露之方法有助於評估包括結合親和力在內的兩種或更多種功能特徵，這允許在發現過程的顯著較早階段（即，在抗體的定序和基於細胞的重組產生之前）進行候選先導物選擇。另外，因為本文所述之方法中之B細胞培養與篩選過程分開，所以不需要用於從篩選測定中回收所需抗體分泌細胞的特殊技術。
因此，本文所述之方法藉由鑒定用於使用標稱量的抗體（如由單獨培養的B細胞產生的抗體）測定幾個功能終點的方法提供了對抗體發現過程的實質性改進。因為在不需要融合瘤形成或抗體定序之情況下鑒定所需功能特徵，所以本發明描述的方法顯著減少了鑒定值得進一步治療開發的候選先導抗體所需的時間和資源。
根據35 U.S.C. §119(e)特此要求2022年10月31日提交的美國臨時申請案號63/420,965之權益，並且將該臨時申請的揭露內容藉由援引特此併入本文。
本揭露描述了方法和測定的開發，該等方法和測定能夠實現從包含標稱量的結合蛋白（如約1 ng至約250 ng的總結合蛋白）的樣本中進行結合蛋白（如抗體）的早期生物化學表徵和先導物選擇。在表徵結合蛋白的像結合親和力、阻斷活性、交叉反應性、表位結合以及其他特徵等屬性之前，放棄諸如融合瘤形成和結合蛋白的基於細胞的重組生產等方法以產生較大量的結合蛋白的能力節省了大量的時間和資源，並且提供了鑒定適於進一步研究的先導結合蛋白所需的功能資訊。
因此，本揭露涉及表徵來自包含標稱量的結合蛋白的樣本的結合蛋白（如抗體）之方法。在第一方面，此方法關於表徵從B細胞製劑分泌的免疫原結合抗體，其中B細胞上清液包含標稱量的所分泌的免疫原結合抗體。此方法包括提供非永生化B細胞製劑，其中製劑之B細胞分泌免疫原結合抗體。該方法進一步關於在有效使B細胞將免疫原結合抗體分泌到培養上清液中之條件下單獨培養製劑之B細胞。從單獨培養的B細胞收集含有所分泌的抗體之培養上清液，並且使所收集的每份上清液經受兩種或更多種不同的結合測定以表徵來自B細胞製劑的免疫原結合抗體。
根據本揭露之此方面和所有方面，適於從功能上表徵來自非永生化B細胞製劑的免疫原結合抗體的結合測定包括而不限於表徵抗體結合親和力、抗體結合親合力、抗體交叉反應結合（例如，與不同物種的相同免疫原的交叉反應結合或與在結構上相似的免疫原的交叉反應結合）、抗體阻斷活性（例如，阻斷免疫原與其同源結合配偶體的結合）、免疫原結合條件（例如，抗體-免疫原結合的最佳pH條件）、抗體鏈成分（例如，抗體輕鏈成分）、抗體表位結合、抗體對抗體交叉競爭的結合測定以及前述測定的任何組合。在下文中揭露了示例性測定和用於進行該等測定的試劑。
在任何實施方式中，在固體支持物（例如，生物感測器晶片）上進行用於表徵免疫原結合抗體的兩種或更多種結合測定。固體支持物包含多個反應表面，其中每個反應表面包含固定到表面的捕獲試劑。根據此實施方式，在有效使來自所收集的培養上清液的所分泌的抗體與在反應表面上的所固定的捕獲試劑結合的條件下使所收集的每份培養上清液與固體支持物接觸，以形成捕獲抗體陣列。因此，固體支持物上的每個反應表面含有來自不同培養上清液的固定的抗體。將捕獲抗體陣列暴露於第一結合分析物，並且檢測第一結合分析物與捕獲抗體之間的相互作用的存在或不存在，以確定抗體的第一結合特徵。該方法進一步關於用第二結合分析物重複暴露和檢測步驟以確定抗體的第二結合特徵。可以使用第三、第四、第五等結合分析物重複暴露和檢測步驟以確定抗體的另外的結合特徵。較佳的是，將捕獲抗體陣列以這樣的順序暴露於結合分析物（即，第一、第二、第三等結合分析物），該順序在不同的結合分析物之間需要最少的洗滌步驟或不需要洗滌步驟，並且不需要在反應表面上補充所固定的抗體。這允許在一次實驗運行中從一個上清液樣本確定抗體的多種功能特徵。本文更詳細地描述了實現該等目標的示例性反應順序。
根據本揭露之此實施方式和所有實施方式，適於固定來自非永生化B細胞製劑的免疫原結合抗體以用於表徵的固體支持物可以由任何多孔或無孔材料（如二氧化矽、玻璃、金屬、塑膠或聚合物）形成。例如，固體支持物可以包含諸如金屬、玻璃、陶瓷、二氧化矽、聚合物材料（例如，聚(甲基丙烯酸酯)（PMMA）、聚苯乙烯、聚碳酸酯和環烯烴共聚物（COC））或該等材料的任何組合等材料。固體支持物可以包含固體表面或光纖表面。固體支持物（如果不是金屬）可以用金屬（例如，金、鉑、銀或金屬奈米顆粒）塗覆，使其與無標記的即時檢測系統（例如，表面電漿共振平臺和生物膜層干涉平臺）相容。
可以用金、銀或另一種感測器相容性金屬塗覆的固體支持物的表面也可以被官能化以促進或增強免疫原結合抗體的附著。適於官能化固體支持物的表面的材料包括而不限於聚合物材料，如聚羧酸酯水凝膠或羧甲基葡聚糖水凝膠。在任何實施方式中，官能化表面進一步包含適於將培養上清液的免疫原結合抗體固定到固體支持物表面的固定的捕獲試劑，例如鏈黴親和素、蛋白A/G、一或多個聚次氮基三乙酸基團、捕獲抗體或其他結合部分。
適於固定來自培養上清液或如本文所述之其他樣本的抗體之固體支持物係可商購的，參見例如可從Carterra ®公司獲得的聚羧酸酯和羧甲基葡聚糖水凝膠感測器晶片。
在任何實施方式中，固體支持物表面包含適於將免疫原結合抗體固定到固體支持物表面的固定的捕獲試劑，例如鏈黴親和素、蛋白A/G、一或多個聚次氮基三乙酸基團、捕獲抗體。在任何實施方式中，所固定的捕獲試劑係抗體。在任何實施方式中，所固定的捕獲試劑係多株抗體試劑。在任何實施方式中，所固定的捕獲試劑係單株抗體試劑。在任何實施方式中，所固定的捕獲試劑係與抗體重鏈或輕鏈的恒定部分（例如，抗體重鏈的Fc部分）結合的抗體。在任何實施方式中，所固定的捕獲試劑係選自抗IgG抗體、抗IgM抗體、抗IgD抗體、抗IgE抗體或抗IgA抗體的抗Fc特異性抗體。在任何實施方式中，抗體係抗人Fc特異性抗體，例如抗人IgG抗體、抗人IgM抗體、抗人IgD抗體、抗人IgE抗體或抗人IgA抗體。適於在本揭露之方法中使用的抗Fc抗體係本領域容易已知的並且係可商購的（參見例如，可從例如而不限於安迪生物科技公司（R&D Systems）和南方生物技術公司（SouthernBiotech）獲得的抗Fc抗體）。合適的抗Fc特異性抗體的選擇將根據免疫原結合抗體的重鏈組成而變化。可以使用本領域已知的方法鑒定合適的捕獲抗體，其中合適的抗體涵蓋具有高結合親和力（例如，＜ 200 pM、＜ 150 pM、＜ 100 pM或 ＜ 50 pM）的抗體。
在任何實施方式中，所固定的抗體捕獲試劑係抗輕鏈特異性抗體，如抗κ鏈抗體或抗λ鏈抗體。在任何實施方式中，抗輕鏈抗體對人抗體輕鏈（例如，抗人κ輕鏈或抗人λ輕鏈）具有特異性。適於在本文所揭露之方法中用作固定的捕獲試劑的抗輕鏈抗體係本領域容易已知的並且係可商購的（參見例如，可從例如而不限於艾博抗公司（Abcam）和安迪生物科技公司獲得的抗λ和抗κ抗體）。合適的抗輕鏈特異性抗體的選擇將根據免疫原結合抗體的輕鏈組成而變化。可以使用本領域已知的方法鑒定合適的抗輕鏈捕獲抗體，其中合適的抗體涵蓋具有高結合親和力（例如，＜ 200 pM、＜ 150 pM、＜ 100 pM或 ＜ 50 pM）之抗體。
如本文更詳細地所述，從單獨培養的B細胞收集含有用於在固體支持物上分析的免疫原結合抗體的培養上清液。在任何實施方式中，B細胞係原代B細胞。如本文提及的「原代細胞」係直接分離自體外或體內的生物樣本（例如，組織（例如，脾、淋巴結）、血液、血漿、血清或骨）的終末細胞。重要的是，原代細胞係終末、非永生化細胞。因此，與可從更典型地利用的融合瘤B細胞或基於細胞的重組系統獲得的抗體之量相比，由原代B細胞產生並分泌到培養上清液中之免疫原結合抗體的量在濃度上係有限的。因此，利用合適的抗體捕獲試劑（例如，抗Fc特異性抗體）有助於將足夠量的免疫原結合抗體捕獲到固體支持物表面上，以檢測所固定的免疫原結合抗體與如本文所述之一或多種結合分析物之間的相互作用的存在或不存在。
根據本揭露之此方面和所有方面，合適的B細胞係抗體分泌B細胞，並且包括產生和分泌抗體的任何類型的B細胞。因此，B細胞製劑可以包含漿母細胞（短壽命漿細胞）、漿細胞（例如，長壽命漿細胞）和生髮細胞（GC）B細胞。在任何實施方式中，B細胞製劑係產生和分泌人抗體的原代B細胞之製劑。產生和分泌人抗體之B細胞包括人B細胞以及已經被修飾以產生人抗體之非人B細胞。在一個實施方式中，B細胞源自產生人B細胞的轉基因動物，如轉基因小鼠。B細胞產生人抗體的合適的轉基因小鼠包括而不限於XenoMouse ®、HuMab Mouse ®、VelocImmune ®小鼠（VelociMouse ®）、Harbor Mice ®、OmniMouse ®、Alloy小鼠和Trianni小鼠。能夠從其B細胞產生人抗體的其他轉基因動物包括而不限於轉基因雞（例如，OmniChicken ®）、轉基因大鼠（例如，OmniRat ®）、轉基因美洲駝、轉基因兔和轉基因牛（例如，轉染色體（Tc）牛）（參見例如，Brüggemann等人, Human Antibody Production in Transgenic Animals [人抗體在轉基因動物中之產生],」 Arch. Immunol. Ther. Exp.[免疫學與治療實驗文件案] 63:101-108 (2015)，將其藉由援引以其全文特此併入）。由源自轉基因動物模型的B細胞產生和分泌的所有形式的抗體（包括完整的免疫球蛋白分子及其較小的結構域（例如，VhH））都適於根據本文所述之方法進行表徵。
在另一個實施方式中，B細胞產生並分泌非人抗體，例如源自非人動物的產生非人抗體的原代B細胞。合適的非人B細胞製劑包括任何哺乳動物B細胞製劑。示例性非人哺乳動物B細胞可以獲自例如而不限於非人靈長類動物、馬、豬、牛、山羊、綿羊、美洲駝、駱駝、兔、狗、貓、大鼠、豚鼠、沙鼠和小鼠。在另一個實施方式中，在本文所述之方法中利用的B細胞源自非人動物，如鳥（例如，雞和鴨）、鯊魚、魚或七鰓鰻。
在任何實施方式中，B細胞製劑分離自或獲自用目的免疫原免疫的受試者。經免疫的受試者可為任何經免疫的動物，例如經免疫的哺乳動物。用於免疫的合適的哺乳動物包括而不限於人、非人靈長類動物、馬、豬、牛、山羊、綿羊、美洲駝、駱駝、兔、狗、貓、大鼠、豚鼠、沙鼠和小鼠。在其他實施方式中，經免疫的受試者不是哺乳動物。用於免疫的合適的非哺乳動物包括而不限於鳥（例如，雞和鴨）、鯊魚、魚或七鰓鰻。
在任何實施方式中，非人動物可為能夠產生人抗體的天然動物或轉基因動物，例如轉基因非人動物。用於免疫非人動物的合適的技術係本領域已知的。參見例如，Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice [單株抗體：原理與實踐], 第3版, Academic Press Limited [學術出版社有限公司], San Diego, CA [加利福尼亞州聖地牙哥], 1996（將其藉由援引以其全文特此併入）。描述於例如以下文獻中之基因槍方法也可以用於免疫非人動物：Barry等人, Biotechniques[生物技術] 16(4):616-8, 620 (1994)；Tang等人, Nature[自然] 356(6365): 152-4 (1992)；Bergmann-Leitner和Leitner, Methods Mol Biol[分子生物學方法] 1325: 289-302 (2015)；Aravindaram和Yang, Methods Mol Biol[分子生物學方法] 542: 167-178 (2009)；Johnston和Tang, Methods Cell Biol[細胞生物學方法] 43 PtA: 353-365 (1994)；和Dileo等人, Human Gene Ther[人類基因療法] 14(1): 79-87 (2003)（將其藉由援引以其全文特此併入）。替代性地，可以藉由向非人動物投與表現抗原的細胞或投與負載抗原的樹突細胞、腫瘤細胞疫苗或基於免疫細胞的疫苗來免疫非人動物。參見例如，Sabado等人, Cell Res[細胞研究] 27(1): 74-95 (2017)、Bot等人, 「Cancer Vaccines [癌症疫苗]」, Plotkin’s Vaccines [疫苗學]. 第7版, 編輯: Plotkin等人, Elsevier Inc. [愛思唯爾公司], 2018以及Lee和Dy, 「The Current Status of Immunotherapy in Thoracic Malignancies [胸部惡性腫瘤的免疫治療現狀]」, Immune Checkpoint Inhibitors in Cancer [癌症中之免疫檢查點抑制劑]. 編輯: Ito和Emstoff, Elsevier Inc. [愛思唯爾公司], 2019（將其藉由援引以其全文特此併入）。在各種情況下，可以藉由微針遞送（參見例如，Song等人, Clin Vaccine Immunol[臨床與疫苗免疫學] 17(9): 1381-1389 (2010)（將其藉由援引以其全文特此併入））；用病毒樣顆粒（VLP）（參見例如，Temchura等人, Viruses[病毒] 6(8): 3334-3347 (2014)（將其藉由援引以其全文特此併入））；或者藉由本領域已知的任何手段來進行免疫。參見例如，Shakya等人, Vaccine[疫苗] 33(33): 4060-4064 (2015)和Cai等人, Vaccine[疫苗] 31(9): 1353-1356 (2013)（將其藉由援引以其全文特此併入）。用於免疫和免疫原製備的另外的策略（包括例如向抗原添加T細胞表位）也適合使用並且描述於Chen和Murawsky, Front Immunol[免疫學前沿] 9: 460 (2018)（將其藉由援引以其全文特此併入）中。
因此，在任何實施方式中，本文所述之方法可以進一步包括用目的免疫原免疫受試者，並且使用本領域已知的B細胞分離技術從經免疫的受試者的脾、淋巴結、血液和/或血漿收集和分離原代B細胞（參見例如，Moore等人 「Isolation of B-cells using Miltenyi MACS Bead Isolation Kits [使用Miltenyi MACS珠分離套組分離B細胞],」 PLoS One[公共科學圖書館·綜合] 14(3): e0213832 (2019)，將其藉由援引以其全文特此併入）。然後單獨培養分離的B細胞，並且如本文所述對包含所分泌的抗體之上清液進行分析。
在另一個實施方式中，B細胞製劑分離自或獲自患有自體免疫性病症的受試者，其中受試者的B細胞產生結合自體免疫原的抗體。合適的受試者包括哺乳動物和非哺乳動物受試者。示例性哺乳動物受試者包括而不限於人、非人靈長類動物、馬、豬、牛、山羊、綿羊、美洲駝、駱駝、兔、狗、貓、大鼠、豚鼠、沙鼠和小鼠。
在另一個實施方式中，B細胞製劑分離自或獲自患有或先前患有病毒或細菌感染的受試者，其中受試者的B細胞產生結合病毒或細菌免疫原的抗體。合適的受試者包括哺乳動物和非哺乳動物受試者。示例性哺乳動物受試者包括而不限於人、非人靈長類動物、馬、豬、牛、山羊、綿羊、美洲駝、駱駝、兔、狗、貓、大鼠、豚鼠、沙鼠和小鼠。
在任何實施方式中，B細胞製劑分離自或獲自體外免疫類器官模型，其中將模型的B細胞暴露於免疫原以用於抗體產生之目的。體外免疫類器官模型可以包含來自任何哺乳動物和/或非哺乳動物的免疫細胞，該哺乳動物和/或非哺乳動物包括而不限於人、非人靈長類動物、馬、豬、牛、山羊、綿羊、美洲駝、駱駝、兔、狗、貓、大鼠、豚鼠、沙鼠、小鼠、鳥、鯊魚、魚、七鰓鰻或其任何組合。
一旦分離出或獲得，便單獨培養產生和分泌免疫原結合抗體的原代B細胞，即將單個原代B細胞置於細胞培養孔中以接種培養物。使用適於B細胞培養的標準細胞培養方法培養和擴增原代B細胞，參見例如Weitkamp等人, 「Generation of Recombinant Human Monoclonal Antibodies to Rotavirus from Single Antigen-specific B Cells Selected with Fluorescent Virus-like Particles [從用螢光病毒樣顆粒選擇的單抗原特異性B細胞產生針對輪狀病毒的重組人單株抗體],」 J. Immunol. Meth.[免疫學方法雜誌] 275:223-37 (2003)和Lagerkvist等人, 「Single, Antigen-Specific B cells Used to Generate Fab Fragments using C40-mediated Amplification of Direct PCR Cloning [用於使用C40介導的直接PCR選殖擴增產生Fab片段的單個抗原特異性B細胞],」 BioTechniques[生物技術] 18:862-69 (1995)，將其藉由援引以其全文特此併入。
在任何實施方式中，維持原代B細胞培養物，至少直至培養上清液中之抗體濃度為約20 ng/mL至約100 ng/mL或更高。然後使上清液樣本與固體支持物之反應表面接觸。在任何實施方式中，使約50 µL至約250 µL的上清液樣本與固體支持物接觸，其中上清液樣本包含或被稀釋至包含約20 ng/mL至約100 ng/mL的抗體濃度。因此，與固體支持物之反應表面接觸的免疫原結合抗體的總量為至少約1 ng至約25 ng，更較佳的是至少約3 ng至約20 ng。在任何實施方式中，與固體支持物之反應表面接觸以進行分析的免疫原結合抗體的總量為至少約1 ng、2 ng、3 ng、4 ng、5 ng、6 ng、7 ng、8 ng、9 ng、10 ng、11 ng、12 ng、13 ng、14 ng、15 ng、16 ng、17 ng、18 ng、19 ng、20 ng、21 ng、22 ng、23 ng、24 ng或25 ng。
在任何實施方式中，使約150 µL至約250 µL的上清液樣本與固體支持物接觸，其中上清液樣本包含或被稀釋至包含約20 ng/mL至約100 ng/mL的抗體濃度。在任何實施方式中，與固體支持物接觸的上清液樣本包含約或至少20 ng/mL、約或至少25 ng/mL、約或至少30 ng/mL、約或至少35 ng/mL、約或至少40 ng/mL、約或至少45 ng/mL、約或至少50 ng/mL、約或至少55 ng/mL、約或至少60 ng/mL、約或至少65 ng/mL、約或至少70 ng/mL、約或至少75 ng/mL、約或至少80 ng/mL、約或至少85 ng/mL、約或至少90 ng/mL、約或至少95 ng/mL、或約100 ng/mL的抗體濃度。
在任何實施方式中，在有效將足夠量的所分泌的抗體捕獲到固體支持物表面上的條件下使所收集的培養上清液樣本與固體支持物接觸。在任何實施方式中，這種接觸可以關於使上清液樣本以重複方式（例如，使用連續流微印跡（continuous flow microspotting）技術）流經固體支持物之反應表面。使用此方法，在適於上清液中之抗體與固定在固體支持物表面上的捕獲試劑（例如，抗Fc抗體）結合的條件下使上清液樣本循環流經反應表面。在任何實施方式中，以雙向方式進行含抗體培養上清液的流動，以使上清液中之抗體向固體支持物表面的暴露最大化。在任何實施方式中，上清液在表面上的流動持續至少10分鐘的持續時間。在任何實施方式中，流動持續約10至約40分鐘的持續時間，例如至少或約15分鐘、至少或約20分鐘、至少或約25分鐘、至少或約30分鐘、至少或約35分鐘、或至少或約40分鐘。在任何實施方式中，循環流動持續約40分鐘的持續時間。在任何實施方式中，循環流動持續大於30分鐘的持續時間。在任何實施方式中，循環流動持續30至40分鐘的持續時間。
適於將所分泌的抗體固定在固體支持物表面上的印跡裝置和方法係本領域已知的，參見例如Gale等人的美國專利案號10,300,450、Gale等人的美國專利案號8,210,119和Gale的美國專利案號9,682,372，將其藉由援引以其全文特此併入。
根據本文所揭露之方法，固體支持物適於高通量分析，並且因此包含適於抗體固定的多個反應表面。因此，在任何實施方式中，該方法允許分析96至384個上清液樣本。在任何實施方式中，固體支持物包含96個反應表面，每個反應表面適於捕獲來自不同B細胞培養上清液的抗體。在任何實施方式中，固體支持物包含 ＞ 96個反應表面，每個表面適於捕獲來自不同B細胞培養上清液的抗體。在任何實施方式中，固體支持物包含192個反應表面，每個反應表面適於捕獲來自不同B細胞培養上清液的抗體。在任何實施方式中，固體支持物包含288個反應表面，每個反應表面適於捕獲來自不同B細胞培養上清液的抗體。在任何實施方式中，固體支持物包含384個反應表面，每個反應表面適於捕獲來自不同B細胞培養上清液的抗體。
將來自B細胞培養上清液的抗體固定到固體支持物上形成捕獲抗體陣列，其適於分析和檢測第一結合分析物與捕獲抗體之間的相互作用的存在或不存在，以確定捕獲抗體的第一結合特徵。第一結合分析物可為適於在結合測定中使用以確定培養上清液中之抗體之一或多種特徵的任何分析物。合適的結合分析物包括生物分子，即由活生物體產生的任何分子，包括但不限於蛋白質、肽、核酸分子（例如，去氧核糖核酸（DNA）分子、核糖核酸（RNA）分子、雜合DNA-RNA分子）、脂質和碳水化合物（例如，單糖、二糖或多糖）。根據本文所述之方法，合適的結合分析物包括 (i) 在活生物體（例如，細胞）中製備並分離以供使用的生物分子，和 (ii) 重組或合成製備的生物分子。
在任何實施方式中，第一結合分析物係適於表徵捕獲抗體的結合交叉反應性的生物分子。如本文所用，術語「交叉反應性」係指抗體與除針對其產生抗體的免疫原之外的免疫原的結合。交叉反應性涵蓋抗體與來自不同物種的同源免疫原的結合。例如，針對人免疫原產生的抗體可以展現出與來自不同物種（例如，小鼠或猴）的對應免疫原的交叉反應結合。交叉反應性還涵蓋抗體與在結構上與針對其產生抗體的免疫原相似（例如，一級、二級、三級或四級結構）的蛋白質（或其他生物分子）的結合。例如，針對人免疫原產生的抗體可以展現出與和目的免疫原屬於相同蛋白質超家族的在結構上相似的蛋白質的交叉反應結合。
適於表徵抗體的交叉反應結合活性的示例性生物分子包括而不限於與抗體結合的靶免疫原同源（即，在序列或結構上相似）的蛋白質或肽。在任何實施方式中，蛋白質或肽係相同的免疫原，但是來自不同的物種，例如，可以評估與人免疫原特異性結合的人抗體與該人免疫原的食蟹猴同源物的交叉反應結合。在另一個實施方式中，蛋白質或肽係與免疫原屬於相同或相關蛋白質家族和/或與靶免疫原具有胺基酸序列或結構的蛋白質或肽。
在另一個實施方式中，結合分析物係適於表徵捕獲抗體的結合親和力或結合親合力的生物分子。如本文所用的術語「結合親和力」係指兩個分子（例如，抗體及其抗原的表位）之間的相互作用的強度。這種相互作用可以包括氫鍵合、離子鍵、范德華相互作用和靜電相互作用。典型地根據相互作用的平衡解離常數（K D）來測量和報告結合親和力。藉由將抗體-免疫原複合物解離時的速率（k off）除以抗體-免疫原複合物形成時的速率（k on）來計算此解離常數，並且將其表示為莫耳濃度（M）。K D和親和力係負相關的。因此，K D值越低，抗體對其抗原的結合親和力越大。
術語「結合親合力」描述蛋白質-蛋白質複合物的總體或累積強度（即，抗體與其抗原之間的所有非共價相互作用的總強度）的量度。藉由以下三個參數確定結合親合力：(i) 抗體-抗原複合物的結合親和力、(ii) 抗體的效價和 (iii) 抗體及其抗原在複合物中之結構排列。
用於評估捕獲抗體的結合親和力和親合力的合適的結合分析物包括抗體的免疫原或包含抗體結合的表位的免疫原片段。當需要與同源免疫原的交叉反應結合時，例如，當通常需要與人免疫原的食蟹猴同源物的交叉反應結合時，還可以評估與該同源免疫原或其片段的結合親和力和/或結合親合力。
在另一個實施方式中，結合分析物包含適於表徵抗體的阻斷活性的一或多種生物分子。如本文所用的抗體之「阻斷活性」係指抗體阻斷或破壞免疫原與其同源結合配偶體的結合的能力。例如，如果免疫原係受體配體，則如果抗體阻斷或破壞受體配體免疫原與其同源受體之間的相互作用，則抗體具有阻斷活性。用於測試抗體阻斷活性的合適的生物分子包括免疫原或其片段和免疫原的結合配偶體。為了測試所固定的捕獲抗體的阻斷活性，在適於在免疫原與抗體之間發生結合的條件下使捕獲抗體陣列與免疫原或其片段接觸。一旦已經形成抗體-免疫原複合物，便引入免疫原結合配偶體。如果免疫原結合配偶體與抗體結合的免疫原結合，則抗體不具有阻斷活性。相反，如果免疫原結合配偶體不與抗體結合的免疫原結合，則抗體具有阻斷活性。
在另一個實施方式中，結合分析物係適於表徵捕獲抗體的免疫原結合的一或多種生物分子。在一個實施方式中，結合分析物包含免疫原與第二免疫原結合抗體的組合。首先使捕獲抗體陣列與其免疫原接觸，並且允許在捕獲抗體與免疫原之間發生結合。隨後引入第二免疫原結合抗體。如果第二免疫原結合抗體不能與免疫原（其與捕獲抗體複合）結合，則當與免疫原的相同區域結合時，捕獲抗體與第二免疫原結合抗體可以「分箱」在一起。這種類型的測定通常被稱為抗體對抗體交叉競爭測定。
在另一個實施方式中，適於表徵捕獲抗體的免疫原結合的一或多種生物分子包含免疫原的片段。根據此實施方式，將捕獲抗體陣列依序暴露於覆蓋免疫原長度的一系列免疫原片段。檢測一或多個免疫原片段與所固定的捕獲抗體的結合可以鑒定捕獲抗體結合的免疫原的表位區域。
在另一個實施方式中，還可以使用捕獲抗體陣列評估抗體-免疫原結合的條件。例如，如果抗體的所需特性係它在選擇性pH條件下結合靶免疫原，則可以使免疫原以順序方式與抗體陣列接觸，其中隨著每次引入，含有免疫原的緩衝液的pH逐步增加或降低。在不同條件下檢測免疫原與捕獲抗體的結合將允許選擇具有所需結合特徵的抗體。
在另一個實施方式中，結合分析物係適於表徵捕獲抗體的鏈組成的一或多種生物分子。例如，用於表徵捕獲抗體的輕鏈組成的示例性生物分子包括抗κ鏈抗體和/或抗λ鏈抗體。適於在本文所述之方法中使用的輕鏈抗體（即，抗κ鏈抗體和抗λ鏈抗體）係本領域已知的並且係可商購的（例如，小鼠和兔抗人抗κ和抗λ抗體可從例如而不限於艾博抗公司、英傑公司（Invitrogen）和安迪生物科技公司獲得）。用於表徵鏈組成的其他示例性生物分子包括而不限於Fc特異性抗體，例如抗IgG抗體、抗IgA抗體、抗IgE抗體、抗IgM抗體、抗IgD抗體。適於在本文所述之方法中使用的Fc特異性抗體（例如，抗人Fc抗體）係本領域已知的並且係可商購的。
在本文所揭露之方法的任何實施方式中，將使捕獲抗體陣列暴露於第一結合分析物並檢測第一結合分析物與捕獲抗體之間的相互作用的存在或不存在以確定抗體的第一結合特徵的步驟重複一次或多次。例如，當第一結合分析物係免疫原或其片段並且要表徵捕獲抗體的結合親和力時，將捕獲抗體重複暴露於漸增濃度的免疫原或其片段，並且利用在每種濃度的免疫原下對結合締合和解離速率的檢測來計算K D值並提供結合親和力的測量結果。
在其他實施方式中，用不同的結合分析物（例如，第一結合分析物和第二結合分析物）將暴露和檢測步驟重複至少兩次，以在單次測定運行（即，相同的捕獲抗體樣本）中確定抗體的至少兩種不同的結合特徵。在另一個實施方式中，用不同的結合分析物（例如，第一、第二和第三結合分析物）將暴露和檢測步驟重複至少三次，以在單次測定運行中確定抗體的至少三種不同的結合特徵。在又另一個實施方式中，用四種不同的結合分析物將暴露和檢測步驟重複至少四次，以在單次測定運行中確定抗體的至少四種不同的結合特徵。較佳的是，以最小化或消除在引入不同的結合分析物之間的洗滌步驟和/或抗體再生步驟的順序進行暴露和檢測步驟。
在任何實施方式中，按順序將暴露和檢測步驟重複兩次或更多次，該順序允許以連續方式（即，在使用單個捕獲抗體樣本的一次測定運行中）表徵捕獲抗體的兩種或更多種結合特徵。重要的是，如本文的實例所展示，可以在單個上清液樣本上用第二和視需要的第三、第四或更多結合分析物重複暴露和檢測步驟以確定抗體的另外的結合特徵，而不需要提供另外的上清液樣本。由於來自單獨培養的原代B細胞的上清液中存在標稱量的抗體，因此評估來自單個抗體樣本的多種結合特徵的能力對於獲得足夠的表徵數據以從抗體競爭中選擇潛在先導抗體之子集係至關重要的。
因此，在一個實施方式中，按順序重複暴露和檢測步驟，該順序允許至少表徵交叉反應結合活性、結合親和力、受體-配體阻斷活性和輕鏈組成（以該順序）。圖2提供了此方法和由其生成的傳感圖數據的示意性概述，其在本文的實例2中有進一步描述。正如所示的，可以利用該等參數的組合評估來在小於一天（約11小時）內從原代B細胞培養上清液樣本組中鑒定出具有所需特徵的先導候選抗體。
根據此實施方式，引入固定的原代B細胞分泌的抗體陣列的第一結合分析物包含適於表徵捕獲抗體的結合交叉反應性的一或多種生物分子。如上文所述，用於此目的之示例性第一結合分析物包含與免疫原同源的一或多種生物分子。同源生物分子可為在結構上與免疫原相似（例如，來自相同或相關蛋白質家族的蛋白質或來自不同物種的蛋白質同源物）或在結構上與免疫原不相似的蛋白質、核酸分子、碳水化合物或脂質。根據此實施方式，可以將適於評估捕獲抗體的結合交叉反應性的一或多種不同的結合分析物依序與所固定的抗體接觸。在檢測到不需要的交叉反應結合的程度上，將結合至交叉反應抗原的所固定的抗體排除在潛在先導候選物之外，並且因此，用於確定結合特徵的後續測定與該等抗體無關。
然後用漸增濃度的適於測量捕獲抗體的結合親和力的第二結合分析物重複暴露和檢測步驟。如上所述，此第二結合分析物可以包含免疫原、免疫原的片段或免疫原的同源物。
在將抗體陣列暴露於免疫原或其片段後，陣列上之目的抗體應當結合至其免疫原。為了測試捕獲抗體的阻斷活性，用包含免疫原的結合配偶體（例如，免疫原的受體或配體）的第三結合分析物重複暴露和檢測步驟。如果檢測到受體或配體與抗體結合的免疫原的結合，則所固定的抗體不是阻斷性抗體。如果沒有檢測到受體或配體與抗體結合的免疫原的結合，則所固定的抗體係阻斷性抗體。如果以低水平檢測到受體或配體與抗體結合的免疫原的結合，則可以將所固定的抗體表徵為部分阻斷性抗體。
替代性地，第三結合分析物可以包含第二免疫原結合抗體以進行抗體對抗體競爭測定。如上文所述，如果第二免疫原結合抗體不能結合陣列上存在的（來自第二分析物測定的）抗體-免疫原，則所固定的抗體可能與第二免疫原結合抗體結合免疫原的相同區域。因此，所固定的抗體和第二免疫原結合的抗體將具有相同的表位箱。
在將抗體陣列暴露於第三結合分析物後，所固定的抗體可以與免疫原、與免疫原和免疫原結合配偶體或與免疫原和第二免疫原結合抗體複合。無論所固定的抗體之複合性質如何，仍然可以用第四結合分析物將暴露和檢測步驟再重複至少一次，其中第四結合分析物包含適於表徵捕獲抗體的輕鏈組成的一或多種生物分子。例如，可以通過添加抗λ鏈抗體、抗κ鏈抗體及其組合來重複暴露和檢測步驟。該等抗體之一與所固定的抗體或抗體複合物的結合將鑒定固定的抗體之輕鏈身份。
本揭露之另一方面涉及表徵來自B細胞製劑的抗體之結合親和力之方法。此方法包括提供非永生化B細胞製劑，其中製劑之B細胞分泌免疫原結合抗體。該方法進一步關於在有效使B細胞將免疫原結合抗體分泌到培養上清液中之條件下單獨培養製劑之B細胞。從單獨培養的B細胞收集含有所分泌的抗體之培養上清液，並且將每份培養上清液暴露於漸增濃度的免疫原、免疫原的片段或免疫原的同源物。該方法進一步關於檢測培養上清液的所分泌的抗體與在每種漸增濃度下的免疫原、其片段或其同源物之間的締合和解離，以及基於所述檢測表徵所分泌的抗體之結合親和力。
根據本揭露之此方面，此方法可以進一步包括提供包含多個反應表面的固體支持物，其中每個反應表面包含固定到如上文所述之表面的捕獲試劑。在有效使來自所收集的一份培養上清液的所分泌的抗體與在一個反應表面上的所固定的捕獲試劑結合的條件下使所收集的每份培養上清液與固體支持物接觸，以在固體支持物上形成捕獲抗體陣列。在固體支持物上將培養上清液暴露於漸增濃度的免疫原、免疫原的片段或免疫原的同源物，並且檢測培養上清液的抗體與免疫原、其片段或其同源物之間的締合和解離。
在任何實施方式中，此方法可以視需要進一步關於使捕獲抗體陣列與和免疫原同源的生物分子接觸，以及確定同源生物分子與捕獲抗體之間的相互作用的存在或不存在，以鑒定捕獲抗體的結合交叉反應性。如上所述，同源生物分子係在結構上與免疫原相似的任何生物分子，例如蛋白質、核酸分子、脂質或碳水化合物。在較佳的實施方式中，在確定結合親和力之前確定捕獲抗體的交叉反應性。如果所測試的交叉反應性係不需要的，這樣做可以取消對某些免疫原結合抗體的進一步分析。在另一個實施方式中，在結合親和力之後確定捕獲抗體的交叉反應性。在此方法中，可以包括洗滌步驟以從捕獲抗體陣列中除去結合的免疫原。
該方法可以視需要進一步包括在評估對免疫原的結合親和力之後，使捕獲抗體陣列與一或多種另外的結合分析物接觸，以及鑒定一或多種另外的結合分析物與捕獲抗體之間的相互作用的存在或不存在，以表徵捕獲抗體的一或多種另外的特徵。在任何實施方式中，在將一或多種另外的結合分析物引入固體支持物反應表面時，捕獲抗體結合至免疫原（抗體-免疫原複合物）。
在任何實施方式中，一或多種另外的結合分析物係免疫原的結合配偶體，並且如上文所述表徵捕獲抗體的阻斷活性。在任何實施方式中，一或多種另外的結合分析物係結合抗體輕鏈的試劑，並且如上文所述表徵捕獲抗體的輕鏈組成。在任何實施方式中，一或多種另外的結合分析物包含另一種免疫原結合抗體，並且如上文所述表徵捕獲抗體的表位分箱。在任何實施方式中，一或多種另外的結合分析物包含一或多個免疫原片段，並且如上文所述表徵捕獲抗體的表位定位。
用於分析結合親和力、結合動力學、交叉反應性和其他結合相互作用的方法係本領域已知的（參見例如，Ernst等人, Determination of Equilibrium Dissociation Constants [平衡解離常數的確定], Therapeutic Monoclonal Antibodies [治療性單株抗體] (Wiley & Sons [威利父子公司] 編輯 2009)，將其藉由援引以其全文特此併入），並且適於在進行本文所述之方法中使用。該等方法包括但不限於固相結合測定（例如，ELISA測定）、免疫沈澱、流動式細胞分析術、螢光激活細胞分選（FACS）、表面電漿共振（SPR）、表面電漿共振成像（SPRi）（例如，Carterra ®LSA（猶他州鹽湖城）和Biacore™（通用電氣醫療集團（GE Healthcare），新澤西州皮斯卡塔韋））、動力學排除測定（例如，KinExA®）、生物膜層干涉法（例如，Octet™（賽多利斯公司（Sartorius），加利福尼亞州弗里蒙特））、微量熱泳動（MST）（例如，NanoTemper Monolith（諾坦普科技股份有限公司（NanoTemper Technologies GmbH），德國慕尼克））和等溫滴定量熱法（ITC）（例如，Microcal ITC200（瑪律文帕納科公司（Malvern Panalytical），英國瑪律文））。
在任何實施方式中，使用表面電漿共振（SPR）檢測源自原代B細胞的免疫原結合抗體的結合相互作用的存在或不存在。SPR技術綜述於例如以下文獻中：Hahnfeld等人, 「Determination of Kinetic Data Using SPR Biosensors [使用SPR生物感測器確定動力學數據],」 Methods Mol. Med. [分子醫學方法] 94:299-320 (2004)和Nguyen等人, 「Surface Plasmon Resonance: A Versatile Technique for Biosensor Applications [表面電漿共振：一種用於生物感測器應用的通用技術],」 Sensors(Basel) [感測器（巴塞爾）] 15(5): 10481-510 (2015)，將其藉由援引以其全文特此併入。在典型的SPR實驗中，將B細胞衍生的抗體固定在流動池中之SPR活性、金塗覆的載玻片上，並且引入含有本文所述之結合分析物之一的樣本以流過表面。當給定波長的多色光以特定角度（入射角）照射在金表面上時，一部分光能激發表面上的電子。入射角受到結合在金表面上或附近的材料的折射率的強烈影響。因此，當在所固定的抗體與潛在結合分析物之間發生結合相互作用時，折射率增加並改變入射角。測量入射角之變化以即時產生反應曲線，從其中可以推測結合的動力學。
在任何實施方式中，使用SPR成像（SPRi）或SPR顯微術測得源自B細胞的免疫原結合抗體的結合相互作用。SPRi遵循與傳統SPR相同的一般原理，然而，所測量之資訊和檢測方法略有不同，允許實現研究結合相互作用的更高通量方法。具體地，偏振光束（與多色光相反）顯示在薄金膜上，並且利用電荷耦合器件（CCD）相機捕獲結合區域的高解析度圖像。
如本文的實例所展示，採用高通量表面電漿共振成像（HT-SPRi）來測量生物分子的動力學相互作用的Carterra ®LSA儀器係用於以高通量方式進行本文所述之方法的特別合適的平臺。以高通量方式利用SPR檢測的其他儀器也適於檢測和測量如本文所述之動力學相互作用，該等儀器包括例如Biacore T200和Biacore 8K儀器（思拓凡公司（Cytiva），麻塞諸塞州瑪律伯勒）。
可以用於本文所述之方法中之替代性的合適的檢測方法關於基於生物膜層干涉法（BLI）的檢測。此技術描述於例如Wilson等人, Biochemistry and Molecular Biology Education[生物化學與分子生物學教育], 38:400-407 (2010)和Dysinger等人, J. Immunol. Methods[免疫學方法雜誌], 379:30-41 (2012)中，將其藉由援引以其全文特此併入。BLI係一種藉由分析從生物感測器尖端的表面反射的白光的干涉圖案來測量大分子相互作用的光學技術。在典型的BLI實驗中，將B細胞衍生的抗體固定在生物感測器尖端上，並且將尖端引入含有如本文所述之結合分析物之一的溶液孔中。分析物與生物感測器尖端上的所固定的抗體之結合引起即時測量的干涉圖案的偏移。來自賽多利斯公司的Octet® BLI無標記檢測系統適於以高通量方式進行本文所述之方法。
如本文的實例所展示，免疫原結合蛋白的多種結合特徵可以從包含標稱抗體濃度的B細胞上清液樣本準確地表徵。因此，本文所述之方法適於表徵包含最小濃度的結合蛋白的其他樣本中之結合蛋白。因此，本揭露之另一方面涉及表徵包含小於或等於250 ng的結合蛋白的樣本中之結合蛋白之方法。在任何實施方式中，可以使用包含約1 ng至約250 ng的結合蛋白的樣本、在包含1 ng至約100 ng的結合蛋白的樣本中以及在包含1 ng至約25 ng的結合蛋白的樣本中進行根據本文所述之方法表徵結合蛋白之方法。此方法關於使樣本與包含多個反應表面的固體支持物接觸，其中每個反應表面包含固定到所述表面的捕獲試劑。在有效使樣本中之結合蛋白與反應表面上的所固定的捕獲試劑結合的條件下使樣本與固體支持物接觸，從而在固體支持物上形成捕獲結合蛋白陣列。該方法進一步關於使捕獲結合蛋白陣列經受兩種或更多種不同的結合測定，以表徵樣本中之結合蛋白。
上文描述了用於固定來自樣本的結合蛋白以形成捕獲結合蛋白陣列的合適的固體支持物和捕獲試劑。如本文的實例所述，藉由使樣本流經固體支持物之反應表面並在固體支持物之反應表面上重複或循環流動至少15分鐘來使含有少量結合蛋白的樣本與固體支持物反應表面接觸。在任何實施方式中，以雙向方式進行含有結合蛋白的樣本的流動，以使樣本中之結合蛋白向固體支持物表面上的捕獲試劑的暴露最大化。在任何實施方式中，樣本在表面上的流動持續至少10分鐘的持續時間。在任何實施方式中，流動持續約10至約40分鐘的持續時間，例如至少或約15分鐘、至少或約20分鐘、至少或約25分鐘、至少或約30分鐘、至少或約35分鐘、或至少或約40分鐘。在任何實施方式中，循環流動持續約40分鐘的持續時間。在任何實施方式中，循環流動持續大於30分鐘的持續時間。在任何實施方式中，循環流動持續30至40分鐘的持續時間。
如上文所述，樣本中結合蛋白的濃度為約1 ng至約25 ng。更較佳的是，樣本中結合蛋白的濃度為約3 ng至約20 ng。為了使樣本中之結合蛋白至固體支持物的固定最大化，使樣本體積為約50 µL至約250 µL的包含約20 ng/mL至約100 ng/mL的結合蛋白的樣本與如上所述之固體支持物之反應表面接觸。在任何實施方式中，使約150 µL至約250 µL的樣本與固體支持物接觸，其中樣本包含或被稀釋至包含約20 ng/mL至約100 ng/mL的結合蛋白濃度。在任何實施方式中，與固體支持物接觸的樣本的樣本體積為約150 µL至約250 µL，並且總結合蛋白量包含以下項或由以下項組成：約1 ng、約2 ng、約3 ng、約4 ng、約5 ng、約6 ng、約7 ng、約8 ng、約9 ng、約10 ng、約11 ng、約12 ng、約13 ng、約14 ng、約15 ng、約16 ng、約17 ng、約18 ng、約19 ng、約20 ng、約21 ng、約22 ng、約23 ng、約24 ng或約25 ng。
根據本揭露之此方面，可以在所描述的方法中表徵的合適的結合蛋白包括抗體，即完整的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白結構域（例如，VhH結構域、unidab）及其片段（Fab、Fab'、F(ab')2）；抗體衍生物（例如，scFv、雙抗體、三抗體、微型抗體等）；以及合成結合物（如微型結合物）。
根據本揭露之此方面，如上文所揭露使捕獲結合蛋白陣列經受兩種或更多種不同的結合測定以表徵樣本中之結合蛋白，即將捕獲結合蛋白陣列暴露於第一結合分析物，並且檢測第一結合分析物與捕獲結合蛋白之間的相互作用的存在或不存在，以確定結合蛋白的第一結合特徵。依序用第二和視需要的第三、第四、第五結合分析物重複暴露和檢測的此過程，以確定結合蛋白的另外的結合特徵。
重要的是，如本文的實例所展示，可以在單個樣本上用第二和視需要第三、第四或更多結合分析物重複暴露和檢測步驟以確定抗體的另外的結合特徵，而不需要提供另外的樣本。較佳的是，如上文所述將捕獲抗體陣列以這樣的順序暴露於結合分析物（即，第一、第二、第三等結合分析物），該順序在不同的結合分析物之間需要最少的洗滌步驟或不需要洗滌步驟，並且不需要在反應表面上補充結合蛋白。這允許在一次實驗運行中從一個上清液樣本確定結合蛋白的多種功能特徵。本文更詳細地描述了實現該等目標的示例性反應順序。
適於從功能上表徵來自樣本的結合蛋白的結合測定包括而不限於表徵抗體結合親和力、抗體結合親合力、抗體交叉反應結合（例如，與不同物種的相同免疫原的交叉反應結合或與在結構上相似的免疫原的交叉反應結合）、抗體阻斷活性（例如，阻斷免疫原與其同源結合配偶體的結合）、免疫原結合條件（例如，抗體-免疫原結合的最佳pH條件）、抗體鏈成分（例如，抗體輕鏈成分）、抗體表位結合、抗體對抗體交叉競爭的結合測定以及前述測定的任何組合。在上文中揭露了示例性測定和用於進行該等測定的試劑。
在已經描述了本發明以後，藉由說明而非限制的方式提供以下實例。 實例 實例 1 ： 測定優化
Carterra ®LSA儀器（猶他州鹽湖城）係選擇用於進行從原代B細胞的上清液收集的免疫原結合抗體的結合和親和力測量的儀器。因此，第一步係確定從單獨培養的B細胞的上清液捕獲低濃度抗體的最佳條件。在此實例中優化的三種條件包括捕獲抗體的固定、最小上清液抗體濃度和抗體印跡時間。
為了製備抗體固定表面，用運行緩衝液（Hepes緩衝斯坦伯格溶液（Steinberg’s Solution）（HBS-T）；50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Tween 20）預先處理Carterra ®LSA儀器的單流道（SFC）和96印跡頭（96PH）。藉由標準胺偶合在SFC中製備捕獲表面。通過經10分鐘注射新鮮製備的0.4 M EDC + 0.1 M NHS + 0.1 M MES pH 5.5的1 : 1 : 1（v/v）混合物來活化HC30-M晶片（Carterra ®LSA，目錄號4279）。在10 mM乙酸鈉pH 4.5（Carterra ®，目錄號3628）中以100 µg/mL製備單選殖小鼠抗人Fc抗體（mAb1.35.1），並且使其與HC30-M晶片偶合20分鐘。通過經7分鐘注射1 M乙醇胺HCl pH 8.5（Carterra ®，目錄號3626）阻斷過量的反應性酯。
為了研究所需的最小免疫原結合抗體濃度和抗體印跡時間，使用Carterra ®LSA 96PH來將已知濃度的免疫原結合抗體印跡到如上所述與mAb1.35.1偶合的晶片上持續不同次數。將四十八個抗體樣本在運行緩衝液（Hepes緩衝斯坦伯格溶液（HBS-T）；50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Tween 20）中稀釋至500、100、50或25 ng/mL。將500、100和50 ng/mL樣本印跡10分鐘，並且將25 ng/mL樣本印跡30分鐘。目標係確定達到至少100 RU的抗體印跡信號所需的最低抗體濃度。發現印跡30分鐘的25 ng/mL抗體樣本產生大約200至250 RU的信號（參見圖3），其優於從在晶片上將50 ng/mL抗體樣本印跡10分鐘獲得的RU信號。
為了證實在較長印跡時間下的低水平抗體濃度足以用於親和力測量，進行以下親和力測定。在如上所述以100、50或25 ng/mL印跡抗體之後，藉由使用SFC以從100 nM開始的1 : 3稀釋系列（即，100、33.33、11.11、3.7、1.23和0.41 nM）依序注射6種濃度的靶免疫原來準備非再生動力學測定。稀釋液在運行緩衝液中，並且從低濃度到高濃度注射，且在注射之間沒有再生。締合持續10分鐘，且解離時間為20分鐘。數據係雙重參考的，因為減去了局部參考和零納莫耳分析物濃度（緩衝液）兩者。使用Carterra ®Kinetic工具將雙重參考數據全域擬合到1 : 1 Langmuir結合模型，允許測得每個點的k a和k d值來確定K D。分析表明，印跡30分鐘的25 ng/mL的抗體濃度提供與印跡10分鐘的100 ng/mL的抗體濃度相似的親和力數據（比較圖4的100 ng/mL和25 ng/mL傳感圖）。數據還表明，印跡10分鐘的50 ng/mL的抗體濃度沒有捕獲足夠的抗體用於良好的親和力測量（參見圖4，陰影圖））。 實例 2 - 使用來自原代 B 細胞的含抗體上清液進行抗體表徵
使用Carterra ®LSA儀器來在一次連續實驗運行中表徵從原代XenoMouse ®B細胞收集的免疫原結合抗體的交叉反應性、結合親和力、受體-配體（RL）阻斷和輕鏈組成（如圖2所描繪）。在此實例中，所需抗體特徵包括與介白素細胞介素蛋白靶標（在本文中稱為「靶蛋白」）的高親和力結合，而不與相關介白素細胞介素（在本文中稱為「脫靶蛋白」）結合。另外，期望候選抗體與靶蛋白的結合阻斷靶蛋白與其受體的結合。
圖5示出了此實驗運行的累積傳感圖，其中在約11小時的時間內在一次運行（來自一個B細胞上清液樣本）中依序評估從原代B細胞分泌的mAb組的交叉反應性、結合親和力、RL阻斷和輕鏈組成中之每一種。下面更詳細地描述了實驗運行的每個組成部分，且累積傳感圖的對應部分在圖6-圖9中示出。
為了製備測定表面，用運行緩衝液（Hepes緩衝斯坦伯格溶液（HBS-T）；50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Tween 20）預先處理Carterra ®LSA儀器的單流道（SFC）和96印跡頭（96PH）。藉由標準胺偶合在SFC中製備捕獲表面本身。通過經10分鐘注射新鮮製備的0.4 M EDC + 0.1 M NHS + 0.1 M MES pH 5.5的1 : 1 : 1（v/v）混合物來活化HC30-M晶片（Carterra ®LSA，目錄號4279）。在10 mM乙酸鈉pH 4.5（Carterra，目錄號3628）中以100 µg/mL製備單選殖小鼠抗HuFc抗體（mAb1.35.1），並且使其與表面偶合20分鐘。通過經7分鐘注射1 M乙醇胺HCl pH 8.5（Carterra，目錄號3626）阻斷過量的反應性酯。最終偶合量大於1000個響應單位（RU）。
以約1 : 4.5稀釋包含 ＞ 100 ng/mL抗體的原代B細胞產生的抗體樣本（40 µL的上清液加140 µL的運行緩衝液）。使用96PH將稀釋的樣本在包含mAb1.35.1抗體的HC30-M晶片表面上印跡30分鐘。
在印跡之後，使用SFC注射100 nM脫靶蛋白用於篩選所固定的免疫原結合抗體的交叉反應性。圖6示出了各個抗體樣本的SPRi傳感圖（響應單位（RU）與時間的關係圖）。通過在引入脫靶蛋白後增加的SPRi信號（RU）容易鑒定到mAb群體與脫靶蛋白的結合。
接下來，藉由使用SFC以從100 nM開始的1 : 3稀釋系列（即，100、33.33、11.11、3.7、1.23和0.41 nM）依序注射6種濃度的靶蛋白來準備非再生動力學測定。稀釋液在運行緩衝液中，並且從低濃度到高濃度注射，且在注射之間沒有再生。締合持續10分鐘，且解離時間為20分鐘。圖7示出了所測試的幾種抗體的親和力傳感圖。傳感圖的上部小圖示出了高親和力結合物（即，K D＜ 100 pM），並且中間和下部小圖示出了高到中親和力抗體候選物，如可辨別的解離速率所證明的。
抗體與脫靶蛋白的結合可能潛在地干擾親和力測量。然而，因為脫靶結合係不需要的，所以立即取消對展現出與脫靶蛋白的交叉反應結合的任何抗體的進一步研究。因此，認為任何親和力或R-L阻斷數據（在下面所述）與展現出脫靶蛋白結合的抗體無關。
在動力學循環之後，立即經10分鐘單次注射在運行緩衝液中之100 nM的靶蛋白受體，以測量免疫原結合抗體的R-L阻斷活性。圖8之傳感圖示出了非阻斷性抗體、部分阻斷性抗體和完全阻斷性抗體的反應。SPR傳感圖首先示出了在將靶蛋白引入含有免疫原結合抗體的HC30-M晶片後的結合反應（參見傳感圖的「靶標結合」部分）。然後將靶蛋白受體引入晶片，並且記錄結合反應（參見傳感圖的「受體結合」部分）。當引入靶蛋白受體時，阻斷受體與靶蛋白結合的抗體顯示出可忽略的結合反應。注意，因為靶蛋白受體顯著大於靶蛋白，所以由受體-靶標結合產生的結合信號同樣更大。
最後，經20分鐘以5 µg/mL依序注射抗人κ和抗人λ抗體允許鑒定免疫原結合抗體的輕鏈亞型，如圖9的傳感圖所示。
基於在1,222個抗體樣本的此實驗運行中生成的數據，確定1021（83.6%）種抗體沒有展現出與非靶蛋白的交叉反應結合，182種抗體（14.9%）展現出所需高親和力靶蛋白結合（即，親和力 ＜ 100 pM），並且該等抗體中有26種（2.1%）係靶蛋白受體阻斷性抗體。因此，在篩選的1,222種抗體中，這種篩選方法在僅11小時內便從原代B細胞上清液中鑒定出26種具有所需結合特異性、親和力和阻斷活性的潛在先導候選物。 實例 3 - 使用來自原代 B 細胞的含抗體上清液進行 IL-11 抗體表徵
在此實例中，使用Carterra® LSA儀器來表徵從原代XenoMouse ®B細胞收集的免疫原結合抗體的結合親和力和受體-配體（RL）阻斷活性。此實例的B細胞分泌的抗體之靶蛋白係介白素11（IL-11）。
為了製備測定表面，用運行緩衝液（Hepes緩衝斯坦伯格溶液（HBS-T）；50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Tween 20）預先處理LSA儀器的單流道（SFC）和96印跡頭（96PH）。藉由標準胺偶合在SFC中製備捕獲表面。通過經10分鐘注射新鮮製備的0.4 M EDC + 0.1 M NHS + 0.1 M MES pH 5.5的1 : 1 : 1（v/v）混合物來活化HC30-M晶片（Carterra ®LSA，目錄號4279）。在10 mM乙酸鈉pH 4.5（Carterra，目錄號3628）中以100 ug/mL製備單選殖小鼠抗HuFc抗體mAb1.35.1，並且使其偶合20分鐘。通過經7分鐘注射1 M乙醇胺HCl pH 8.5（Carterra，目錄號3626）阻斷過量的反應性酯。最終偶合量大於1000個響應單位（RU）。
以約1 : 6.6稀釋估計具有 ＞ 100 ng/mL的抗體濃度的B細胞上清液樣本（30 µL上清液加170 µL的Carterra緩衝液（Hepes緩衝斯坦伯格溶液（HBS-T）；50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，0.1% Tween 20）），並且將其使用96PH印跡30分鐘。在印跡之後，藉由使用SFC以從100 nM開始的1 : 3稀釋系列（100、33.33、11.11、3.7、1.23和0.41 nM）依序注射6種濃度的靶標（IL11，新諾生物技術公司（Sino Biological）/12225-HNCE）來準備非再生動力學測定。稀釋液在運行緩衝液中，並且從低濃度到高濃度注射，且在注射之間沒有再生。締合持續10分鐘，且解離時間為20分鐘。
在動力學循環之後，立即經10分鐘單次注射在運行緩衝液中之100 nM的IL11受體（安迪生物科技公司/8895-MR-MTO）以測量RL阻斷。
圖10示出了此實驗運行的累積傳感圖，其中在僅4小時內在一次運行中依序評估從原代B細胞分泌的IL-11 mAb組的結合親和力和RL阻斷中之每一種。圖11示出了所測試的幾種抗體的親和力傳感圖。傳感圖的最左側小圖示出了高親和力結合物（＜ 100 pM），中間小圖示出了中親和力結合物（1 nM至100 pM），並且最右側小圖示出了低親和力結合物（＞ 1 nM）。
圖12的表格總結了三種候選IL-11抗體（即，抗體LIBC729450-1、LIBC729919-1和LIBC729812-1）的親和力數據和阻斷活性。所有三種抗體都展現出高結合親和力，而在將靶受體蛋白（IL-11受體）引入含有結合至其靶蛋白（IL-11）的抗體之HC30-M晶片後，僅LIBC729450-1抗體基於RU發揮受體阻斷性抗體的作用。抗體LIBC729919-1和LIBC729812-1基於其RU值發揮受體與IL-11結合的非阻斷劑和部分阻斷劑的作用。
在此實例中，篩選了96個抗體樣本。其中，23種抗體具有 ＜ 40 pM的所需結合親和力，並且在這23種抗體中，其中有11種阻斷了IL-11受體與IL-11的結合。因此，本文所述之方法在僅4小時內便從原代B細胞上清液中鑒定出11種具有所需結合特異性和阻斷活性的潛在先導候選物。
無
[ 圖 1A- 圖 1C]提供了抗體發現和先導物選擇的先前技術方法（圖1A和圖1B）與本文所揭露之優化的抗體發現和先導物選擇方法（圖1C）之示意性比較。如圖1A所示，標準融合瘤篩選流程關於從經免疫的小鼠收穫B細胞和融合瘤細胞形成。篩選來自培養的融合瘤細胞的培養基中具有所需免疫原結合、結合親和力、功能等的抗體。這個關於融合瘤形成的過程需要15週以上的時間來完成。圖1B示出了關於對從單獨的B細胞產生的抗體進行的抗原結合篩選的過程的改進。一旦鑒定出產生目的抗體之B細胞，便對抗體進行定序並重組生產，以提供足夠量的抗體來進行結合親和力、功能等的另外表徵。圖1B的過程典型地需要約7週的時間來完成。相比之下，如圖1C所描繪的本揭露之方法關於例如藉由從經免疫的小鼠收穫B細胞並且在不進行融合瘤產生或重組生產之情況下直接培養所收集的B細胞來獲得B細胞製劑。儘管來自培養的B細胞的上清液含有有限濃度的所分泌的抗體（由於原代B細胞的終末性質），但本文所述之方法允許評估上清液中所分泌的抗體之兩種或更多種結合特徵（包括結合親和力）。使用此方法在僅3週內便鑒定出候選先導抗體。
[ 圖 2]提供了可以如何利用從依序進行的表徵測定獲得的表面電漿共振（SPR）數據來在單次實驗（大約11小時）中鑒定直接從原代B細胞獲得的先導免疫原結合抗體之示意圖。在此示例中，先導抗體係不展現出與脫靶蛋白的交叉反應結合、展現出與靶蛋白的高親和力結合、阻斷受體與靶蛋白的結合並且具有κ輕鏈之抗體。
[ 圖 3]係示出了負載在與抗人Fc抗體（mAb1.35.1）偶合的HC30-M晶片（Carterra ®LSA）上的逐步調整濃度的抗體樣本（即，500、100、50和25 ng/ml的抗體）的負載信號響應單位（RU）之圖。將500、100和50 ng/mL樣本在晶片上印跡標準的10分鐘時間段，而將25 ng/mL樣本印跡30分鐘，以允許捕獲存在的少量免疫球蛋白。
[ 圖 4]係示出了使用印跡在HC30-M晶片上的逐步調整的抗體樣本（500、100、50和25 ng/ml抗體）用Carterra ®LSA儀器獲得的結合親和力測量結果的一系列SPR成像（SPRi）傳感圖。如上所述，將25 ng/mL樣本印跡30分鐘。為了進行親和力測量，依序注射六種濃度（100 nM、33.33 nM、11.11 nM、3.7 nM、1.23 nM和0.41 nM）的抗體靶蛋白。締合持續10分鐘，且解離時間為20分鐘。使用Carterra ®Kinetic軟體工具生成數據。每個傳感圖示出了響應單位（RU；y軸）隨時間（以秒計）（x軸）之變化。
[ 圖 5]係展示了根據本文所述之方法和實例2進行的實驗的輸出的傳感圖讀數集合，在該實驗中從原代B細胞分泌的mAb組被HC30-M晶片上的二抗捕獲。依序評估固定的mAb組的 (i) 與脫靶蛋白的結合（第3列）、(ii) 與靶蛋白的結合親和力（第7-12列）、(iii) 受體與靶標結合的阻斷（第13列），最後係藉由與抗κ（第15列）或抗λ（第16列）mAb結合測得的輕鏈組成。
[ 圖 6]示出了利用本申請之方法來檢測和區分從B細胞上清液收集的免疫原結合抗體之交叉反應結合活性。用Carterra ®LSA儀器獲得的SPRi傳感圖示出了如實例2中所述引入脫靶蛋白後捕獲的抗體樣本的結合反應，並且完整的實驗數據示於圖5中。藉由增加的SPR信號（RU）容易鑒定到mAb群體與脫靶蛋白的結合。
[ 圖 7]示出了如實例2中所述從原代B細胞上清液收集的幾種免疫原結合抗體的並且來自圖5中描繪的完整實驗數據的代表性結合親和力SPRi傳感圖。將從100 nM開始的1 : 3稀釋系列的五種濃度的靶蛋白引入包含免疫原結合抗體上清液樣本的HC30-M Carterra ®晶片。締合持續10分鐘，且解離時間為20分鐘。使用Carterra ®Kinetic軟體工具生成數據。每個傳感圖示出了響應單位（RU；y軸）隨時間（以秒計）（x軸）的變化。傳感圖的上部小圖示出了非常高親和力抗體候選物（＜ 100 pM），並且中間和下部小圖示出了高到中親和力抗體候選物，如可辨別的解離速率所證明的。
[ 圖 8]示出了利用本申請之方法來檢測和區分如實例2中所述從原代B細胞上清液收集的代表性免疫原結合抗體的並且來自圖5描繪的完整實驗數據的受體-配體（RL）阻斷活性。SPRi傳感圖示出了在將靶蛋白引入含有免疫原結合抗體的HC30-M晶片後的結合反應（時間 = 0至約2600秒），隨後是引入靶受體蛋白時的結合反應（時間 = 約2600至5000秒）。當引入受體時，阻斷受體與靶蛋白結合的抗體顯示出可忽略的結合（即，RU可忽略的增加）。注意，因為在這種情況下受體顯著大於靶蛋白，所以結合信號同樣較大。
[ 圖 9]示出了利用本申請之方法來確定從原代B細胞上清液收集的免疫原結合抗體的輕鏈組成。中間和右側傳感圖示出了在引入抗κ抗體（中間傳感圖）或抗λ抗體（右側傳感圖）後選定免疫原-抗體樣本的結合反應。左側的傳感圖係僅緩衝液對照的反應。
[ 圖 10]係展示了根據本文所述之方法和實例3進行的第二實驗的輸出的傳感圖讀數集合，在該實驗中從原代B細胞分泌的mAb（結合IL-11的抗體）組被HC30-M晶片上的二抗捕獲。依序評估固定的mAb組對靶蛋白（IL-11）的結合親和力（第2-7列）和阻斷受體（IL-11R）與IL-11靶標結合的能力（第8列）。
[ 圖 11A- 圖 11C]示出了如實例3中所述從原代B細胞上清液收集的高親和力（圖11A）、中親和力（圖11B）和低親和力（圖11C）IL-11結合抗體的並且來自圖10描繪的完整實驗數據的代表性結合親和力SPRi傳感圖。將從100 nM開始的1 : 3稀釋系列的五種濃度的靶蛋白引入包含免疫原結合抗體上清液樣本的HC30-M Carterra ®晶片。締合持續10分鐘，且解離時間為20分鐘。使用Carterra ®Kinetic軟體工具生成數據。
[ 圖 12]係總結使用本文所揭露之方法確定的三種候選IL-11抗體的親和力數據和阻斷活性之表格。
無

Claims (53)

  1. 一種表徵來自B細胞製劑的抗體之結合親和力之方法，所述方法包括： 提供非永生化B細胞製劑，其中該製劑之B細胞分泌免疫原結合抗體； 在有效使所述B細胞將免疫原結合抗體分泌到培養上清液中之條件下單獨培養該製劑之B細胞； 收集含有來自該等單獨培養的B細胞的所分泌的抗體之該等培養上清液； 將每份培養上清液暴露於漸增濃度的該免疫原、該免疫原的片段或該免疫原的同源物； 檢測該培養上清液的所分泌的抗體與在每種漸增濃度下的該免疫原、其片段或其同源物之間的締合和解離；以及 基於所述檢測表徵所述所分泌的抗體之結合親和力。
  2. 如請求項1所述之方法，該方法進一步包括： 提供包含多個反應表面的固體支持物，其中每個反應表面包含固定到所述表面的捕獲試劑； 在有效使來自所收集的一份培養上清液的所分泌的抗體與在一個反應表面上的所固定的捕獲試劑結合的條件下使所收集的每份培養上清液與該固體支持物接觸，以在該固體支持物上形成捕獲抗體陣列，其中所述暴露、檢測和表徵在該固體支持物上進行。
  3. 如請求項2所述之方法，該方法進一步包括： 使該捕獲抗體陣列與候選交叉反應結合分子接觸，之後進行所述暴露並且 確定該候選交叉反應結合分子與該等捕獲抗體之間的相互作用的存在或不存在；以及 作為所述確定的結果鑒定該等捕獲抗體之結合交叉反應性。
  4. 如請求項2所述之方法，該方法進一步包括： 在所述表徵之後，使該捕獲抗體陣列與一或多種另外的結合分析物接觸，以及 確定該一或多種另外的結合分析物與該等捕獲抗體之間的相互作用的存在或不存在，以表徵該等捕獲抗體之另外的結合特徵。
  5. 如請求項4所述之方法，其中該一或多種另外的結合分析物包含該免疫原的結合配偶體，並且基於所述確定來表徵該等捕獲抗體之阻斷活性。
  6. 如請求項4所述之方法，其中該一或多種另外的結合分析物係結合抗體輕鏈的試劑，並且基於所述確定來表徵該等捕獲抗體之輕鏈組成。
  7. 如請求項2所述之方法，其中使用表面電漿共振成像進行所述檢測和表徵。
  8. 如請求項2所述之方法，其中所述接觸包括： 使每份培養上清液流經該固體支持物表面之反應表面，以及 重複所述流動至少15分鐘。
  9. 如請求項8所述之方法，其中所述重複進行約20分鐘至約40分鐘。
  10. 如請求項8所述之方法，其中所述流動包括雙向流動。
  11. 如請求項2所述之方法，其中與該固體支持物之反應表面接觸的每份培養上清液包含約150 µl至約200 µl的體積，並且含有約20 ng/mL至約100 ng/mL的所分泌的抗體。
  12. 如請求項2所述之方法，其中該固體支持物包含96至384個反應表面，並且所述接觸包括： 使每個反應表面與不同的培養上清液接觸，從而在該固體支持物上捕獲來自96至384份不同培養上清液的抗體。
  13. 一種表徵來自B細胞製劑的免疫原結合抗體之方法，所述方法包括： 提供非永生化B細胞製劑，其中該製劑之B細胞分泌免疫原結合抗體； 在有效使所述B細胞將該等免疫原結合抗體分泌到培養上清液中之條件下單獨培養該製劑之B細胞； 收集含有來自該等單獨培養的B細胞的所分泌的抗體之該等培養上清液；以及 使所收集的每份上清液經受兩種或更多種不同的結合測定，以表徵來自該B細胞製劑的該等免疫原結合抗體。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該兩種或更多種結合測定選自結合親和力測定、結合親合力測定、結合交叉反應性測定、確定免疫原結合條件的測定、阻斷活性測定、確定抗體鏈成分的測定、表位結合測定和抗體對抗體交叉競爭測定。
  15. 如請求項13所述之方法，其中該兩種或更多種結合測定之一係結合親和力測定。
  16. 如請求項13所述之方法，其中所述經受包括： 提供包含多個反應表面的固體支持物，其中每個反應表面包含固定到所述表面的捕獲試劑； 在有效使來自所收集的培養上清液的所分泌的抗體與在反應表面上的所固定的捕獲試劑結合的條件下使所收集的每份培養上清液與該固體支持物接觸，從而在該固體支持物上形成捕獲抗體陣列； 將該捕獲抗體陣列暴露於第一結合分析物； 檢測該第一結合分析物與該等捕獲抗體之間的相互作用的存在或不存在，以確定所述抗體的第一結合特徵； 用至少第二結合分析物依序重複所述暴露和所述檢測，以確定所述抗體的至少第二結合特徵。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該第一結合分析物和該第二結合分析物係獨立地選自蛋白質、核酸分子、碳水化合物和脂質的生物分子。
  18. 如請求項17所述之方法，其中該第一結合分析物和該第二結合分析物獨立地選自由以下項組成之群組：適於表徵該等捕獲抗體之結合交叉反應性的生物分子、適於表徵該等捕獲抗體之結合親和力的生物分子、適於表徵該等捕獲抗體之結合親合力的生物分子、適於表徵該等捕獲抗體之阻斷活性的一或多種生物分子、適於表徵該等捕獲抗體之表位結合的生物分子、適於表徵該等捕獲抗體之抗體交叉競爭的一或多種生物分子以及適於表徵該等捕獲抗體之鏈組成的一或多種生物分子。
  19. 如請求項16所述之方法，該方法進一步包括： 用第三和視需要的第四結合分析物依序重複所述暴露和所述檢測，以確定所述抗體的另外的結合特徵。
  20. 如請求項16-19中任一項所述之方法，其中該第一結合分析物包含適於表徵該等捕獲抗體之結合交叉反應性的一或多種生物分子。
  21. 如請求項20所述之方法，其中該第一結合分析物包含與該免疫原同源的生物分子。
  22. 如請求項16-19中任一項所述之方法，其中該第二結合分析物係適於表徵該等捕獲抗體之結合親和力的生物分子。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該第二結合分析物係該免疫原或該免疫原的片段。
  24. 如請求項22所述之方法，其中該第二結合分析物係該免疫原的同源物或其片段。
  25. 如請求項19所述之方法，其中該第三結合分析物係適於表徵該等捕獲抗體之阻斷活性的生物分子。
  26. 如請求項25所述之方法，其中該第三結合分析物係該免疫原的結合配偶體。
  27. 如請求項25所述之方法，其中該第四結合分析物包含適於表徵該等捕獲抗體之抗體鏈成分的一或多種生物分子。
  28. 如請求項27所述之方法，其中該一或多種生物分子適於表徵抗體輕鏈組成，並且選自抗λ鏈抗體、抗κ鏈抗體及其組合。
  29. 如請求項16-28中任一項所述之方法，該方法進一步包括： 基於所述檢測，從該捕獲抗體陣列中選擇一或多種候選抗體以用於定序，以及 對所選擇的一或多種候選抗體進行定序。
  30. 如請求項16-28中任一項所述之方法，其中使用表面電漿共振成像（SPRi）進行所述檢測。
  31. 如請求項16所述之方法，其中所收集的每份上清液含有在約150 µl至約200 µl體積中之約20 ng/mL至約100 ng/mL的所分泌的抗體。
  32. 如請求項2或請求項16所述之方法，其中所固定的捕獲試劑包含抗Fc特異性抗體。
  33. 如請求項2或請求項16所述之方法，其中所固定的捕獲試劑包含抗輕鏈特異性抗體。
  34. 如請求項16所述之方法，其中所述接觸包括： 使所收集的上清液流經該固體支持物表面之反應表面，以及 重複所述流動至少15分鐘。
  35. 如請求項34所述之方法，其中所述重複進行約20分鐘至約40分鐘。
  36. 如請求項34所述之方法，其中所述流動包括雙向流動。
  37. 如請求項13所述之方法，其中在 ＜ 12小時內進行所述經受。
  38. 如請求項16所述之方法，其中該固體支持物包含96至384個反應表面，並且所述接觸包括： 使每個反應表面與不同的培養上清液接觸，從而在該陣列上捕獲來自96至384份不同培養上清液的抗體。
  39. 如請求項1或請求項13所述之方法，其中該B細胞製劑係原代B細胞製劑。
  40. 如請求項1或請求項13所述之方法，其中該B細胞製劑來自用該免疫原免疫的受試者。
  41. 如請求項40所述之方法，其中經免疫的受試者選自人、非人靈長類動物、馬、豬、牛、山羊、綿羊、美洲駝、駱駝、兔、狗、大鼠和小鼠。
  42. 如請求項1或請求項13所述之方法，其中該B細胞製劑來自患有自體免疫性障礙的受試者。
  43. 如請求項1或請求項13所述之方法，其中該製劑之B細胞產生人抗體。
  44. 如請求項1或請求項13所述之方法，其中該等免疫原結合抗體係人抗體。
  45. 一種表徵結合蛋白之方法，所述方法包括： 提供一或多個樣本，每個樣本包含約1 ng至約25 ng的結合蛋白； 使該一或多個樣本與包含多個反應表面的固體支持物接觸，其中每個反應表面包含固定到所述表面的捕獲試劑，並且其中所述接觸在有效使來自樣本的結合蛋白與在反應表面上的所固定的捕獲試劑結合的條件下進行，從而在該固體支持物上形成捕獲結合蛋白陣列； 使該捕獲結合蛋白陣列經受兩種或更多種不同的結合測定，以表徵該一或多個樣本中之每一個中的該等結合蛋白。
  46. 如請求項45所述之方法，其中所述經受包括： 將該捕獲結合蛋白陣列暴露於第一結合分析物； 檢測該第一結合分析物與該等捕獲結合蛋白之間的相互作用的存在或不存在，以確定所述結合蛋白的第一結合特徵；以及 用至少第二結合分析物依序重複所述暴露和所述檢測，以確定所述結合蛋白的至少第二結合特徵。
  47. 如請求項45所述之方法，其中所述接觸包括： 使該樣本流經該固體支持物表面之反應表面，以及 重複所述流動至少15分鐘。
  48. 如請求項47所述之方法，其中所述重複進行約20分鐘至約40分鐘。
  49. 如請求項47或請求項48所述之方法，其中所述流動包括雙向流動。
  50. 如請求項45-49中任一項所述之方法，其中每個樣本含有約3 ng至約20 ng的結合蛋白。
  51. 如請求項45-49中任一項所述之方法，其中每個樣本含有在約150 µl至約200 µl體積中之約20 ng/mL至約100 ng/mL的結合蛋白。
  52. 如請求項45所述之方法，其中該兩種或更多種結合測定選自結合親和力測定、結合親合力測定、結合交叉反應性測定、確定免疫原結合條件的測定、阻斷活性測定、確定抗體鏈成分的測定、表位結合測定和抗體對抗體交叉競爭測定。
  53. 如請求項45所述之方法，其中該兩種或更多種結合測定之一係結合親和力測定。
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