CN112552409B - 一种抗sptssa的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种抗sptssa的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗SPTSSA的单克隆抗体及其应用，属于免疫学技术领域。该抗体是由鼠源杂交瘤细胞株1N1所分泌的，能够高特异性识别天然抗原SPTSSA。其制备方法为：1)制备小鼠免疫原和检测用抗原；2)制备抗SPTSSA杂交瘤细胞株；3)ELISA方法筛选SPTSSA阳性而正常人血清阴性的单克隆抗体；4)单克隆抗体的亚型鉴定；5)BALB/C小鼠体内生产单抗并纯化；6)采用免疫组化方法和ELISA方法对SPTSSA单克隆抗体进行功鉴定及应用。本发明不仅为进一步研究SPTSSA的生物学功能及其作用机理奠定了基础，而且在制备SPTSSA相关疾病的诊断性试剂和治疗性药物中具有潜在的应用前景。

Description

一种抗SPTSSA的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，涉及一种单克隆抗体，具体涉及一种抗 SPTSSA的单克隆抗体及其应用。
背景技术
丝氨酸棕榈酰转移酶(Serine palmitoyltransferase，SPT)是催化鞘脂生物合成中的第一个固定过程和限速过程中的重要的酶。SPTSSA(Serine palmitoyltransferase，small subunit A)是一个小的SPT亚基，它刺激SPPTC1、SPTLC2或SPTLC3的SPT催化异二聚体具有酰基辅酶A优先性。已有研究发现，SPTLC1表达降低与透明细胞肾细胞癌预后低相关且SPTLC1及其网络在炎症，缺氧和干扰素γ反应以及同种异体移植排斥途径中起重要作用，而生物信息学分析显示SPTSSA与SPPTC1显著相关。
近几年免疫治疗及免疫靶向治疗在多种疾病的综合治疗过程中已经开始逐渐发挥较大的作用。由于单克隆抗体的高度特异性并靶向结合抗原，抗体靶向治疗已经显示出良好的治疗效果，如肿瘤治疗，而抗体结合的药物治疗也在临床试验中显示出较强的作用，故可使用单克隆抗体治疗疾病。
就目前国内外文献的报道情况，尚未见具有高特异性抗SPTSSA的单克隆抗体，可用于免疫学方法的研究。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种抗 SPTSSA的单克隆抗体，本发明所要解决的另一技术问题是提供抗SPTSSA的单克隆抗体在制备SPTSSA相关疾病的诊断性试剂和治疗性药物中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
本申请所提供的分泌抗SPTSSA单克隆抗体S1N1的杂交瘤细胞株1N1，已于2020年9月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2020181；所制备得到的抗SPTSSA的单克隆抗体，命名为S1N1。
一种抗SPTSSA的单克隆抗体S1N1，是由鼠源杂交瘤细胞株1N1所分泌的。
进一步的，小鼠免疫原和检测用抗原是将如SEQ ID NO：1所示的氨基酸残基序列，即CMAGMALARAWKQ与KLH偶联得到，命名为2019-331-KLH。
从GenBank获取SPTSSA基因的核苷酸片段序列(accession No. NM13828)，设计并合成多肽2019-331：CMAGMALARAWKQ(序列)。
钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)是常用的载体蛋白，除具有良好的免疫原性，还具有足够多的反应侧链氨基酸残基，以便于与合成抗原连接，充分保持抗原的活性，协同激活体内的免疫反应。
免疫SPF BALB/C小鼠，用细胞融合技术筛选分泌抗SPTSSA的杂交瘤细胞，并最终产生单克隆抗体，然后使用免疫组织化学技术(IHC)对SPTSSA 抗体进行功能鉴定，使用ELISA法测试其效价。
抗SPTSSA的单克隆抗体S1N1在制备检测SPTSSA抗原试剂中的应用。
抗SPTSSA的单克隆抗体S1N1在制备SPTSSA相关疾病的治疗性药物、相关的诊断试剂及科研试剂中的应用。
有益效果：相比于现有技术，本发明的优点为：
从GenBank获取SPTSSA基因的核苷酸片段序列(accession No. NM13828)，运用单克隆抗体制备技术制备的抗SPTSSA单克隆抗体S1N1，可以应用于免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)和酶联免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)的研究，也可潜在用于SPTSSA相关疾病的诊断和治疗。
该抗体S1N1用于体外免疫学研究和诊断，具有无毒、多种免疫学研究方法用途的优点，原因在于：(1)S1N1抗体是一种免疫球蛋白，不会通过身体表面接触和呼吸道而伤害健康；(2)S1N1可应用于IHC和ELISA免疫学研究；(3) 可潜在用于SPTSSA相关疾病的诊断和治疗。
同时，该抗体S1N1可潜在应用于体内研究诊断和治疗SPTSSA相关疾病，具有广谱、低毒或无毒的优点，其原因在于：(1)虽然不同类型的疾病的特异性靶蛋白不同，但是靶向位置无本质差异，因此具有广谱性；(2)直接作用于丝氨酸棕榈酰转移酶，避免了疾病内部高压及药物分布的问题。
基于上述优点，该抗体可以潜在应用S1N1为活性成分制成与SPTSSA相关疾病的诊断及治疗的试剂或药物；且该抗体制备方法简单，可由杂交瘤细胞株 1N1直接分泌产生。
附图说明
图1是IHC检测S1N1抗体在胶质瘤组织中的表达情况图，图中，阳性定位在胶质瘤细胞的细胞质；
图2是IHC检测S1N1抗体在胃癌组织中的表达情况图，图中，阳性定位在胃癌细胞的细胞质；
图3是抗SPTSSA单克隆抗体S1N1与SPTSSA偶联多肽抗原的酶联免疫吸附试验检测结果图，显示S1N1抗体有较高的滴度反应。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，所用实验方法均为常规方法。
I、以下实施例中使用的主要试剂为：
(1)细胞融合用：
IMDM培养基；
IMDM完全培养基(含15％血清)；
2.2％甲基纤维素(SIGMA；货号：M0262-100G)；
新生牛血清；PEG1500(Roche；货号：78364)；
HAT(Sigma；货号：H0262-10VL)；
HT(Sigma；货号：H0137-10VL)。
(2)单克隆细胞筛选用：
包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)；PBS缓冲液(pH7.4)；
封闭液：含2％牛奶的PBS；
洗液：PBS-T(0.05％吐温，PBS)；
显色液：1％A液+10％B液(A液：1％TMB in DMSO；B液：0.1％H2O2的柠檬酸缓冲液)；
终止液：2M硫酸；
二抗：山羊抗小鼠IgG/HRP。
(3)单克隆细胞亚类鉴定用：
包被抗体(Southern Biotech)；
封闭液：2％BSA+3％蔗糖in PBS；
显色液：0.2mLA液+10μL 30％H2O2 in 10mL B液(A液：15mg/mL ABTS in H2O；B液：柠檬酸缓冲液，pH4.0)；
各型亚类二抗(Southern Biotech)。
(4)免疫组化用：
DAB染色液(增强聚合物法)试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)；
柠檬酸组织抗原修复液(100X)(福州迈新生物技术开发公司)；
内源性过氧化物酶阻断剂(福州迈新生物技术开发公司)；
反应增强液(福州迈新生物技术开发公司)；
酶标抗小鼠/兔IgG聚合物(福州迈新生物技术开发公司)。
(5)ELISA用：
ELISA包被液(北京索莱宝科技有限公司)；
ELISA终止液(北京索莱宝科技有限公司)；
单组分TMB显色液(北京索莱宝科技有限公司)；
羊抗小鼠IgG-HRP(北京索莱宝科技有限公司)。
II、以下实施例中使用的主要仪器为：
组织芯片系统(UT06，韩国，Unitma公司)；倒置显微镜(DMIRB，德国， Leica公司)；全自动酶标仪(SN209941，美国，Bio-Tek公司)；二氧化碳水套式培养箱(HEPACLASS 100，美国，ThermoFisher公司)；pH计(EL20，瑞士，Mettler Toledo公司)。
实施例1
1、制备小鼠免疫原和检测用抗原
多肽设计及合成2019-331：CMAGMALARAWKQ(序列)，多肽偶联：将偶联KLH后的多肽定量3.0mg/mL(命名：2019-331-KLH)。
2、用“2019-331-KLH”，按60μg蛋白/只小鼠的量，皮下注射初次免疫4只 SPFBALB/C雌性小鼠，编号为：1、2、3、4；两周后，皮下第一次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只；间隔两周后，皮下第二次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只；间隔两周后，皮下第三次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只；间隔两周后，皮下第四次加强免疫，免疫量为30μg蛋白/只；
腹腔冲击3天后，采用PEG法进行融合小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞，融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。
其中，细胞融合步骤：
(1)将状态良好的SP2/0细胞轻柔地从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50mL 离心管中；
(2)小鼠摘眼球取血，然后采用颈髓脱臼法处死，放入75％的酒精中浸泡 5分钟；
(3)在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中；用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上；用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装有SP2/0的离心管中，离心1500rad/分钟，5 分钟；
(4)用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎；将碾好的胸腺细胞吸到15mL 离心管中，再加入1mL的HAT，放在孵箱中备用；
(5)将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rad/分钟，5分钟)；
(6)将离心好的细胞上清尽量倒掉；拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1mL的PEG，加完后，在温水中静置 1分钟；然后2分钟内缓慢加入2mL的无血清的IMDM，接着2分钟内缓慢加入8mL无血清的IMDM；离心1000rad/分钟，5分钟；
(7)倒掉上清，加入10mL的血清，小心地将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞；再加入25mL灭过菌的半固体培养基，充分混匀；然后均匀倒入 30个细胞培养皿中；将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。
3、SPTSSA阳性单克隆抗体的筛选
两周后，挑10板×93个细胞单克隆，培养于96孔细胞培养板(事先用胸腺细胞铺板，100μL/孔)；
3天后，用“2019-331-BSA”包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，得到7株阳性杂交瘤细胞株。
实验步骤：
(1)用包被液稀释“2019-331-BSA”，终浓度为2μg/mL，100μL/孔，4℃，过夜；而后用洗液洗涤3次；
(2)2％牛奶封闭液封闭，200μL/孔，37℃孵箱，2小时；而后用洗液洗涤3次；
(3)加入一抗(细胞培养上清)、阴性对照(SP2/0培养上清)、空白对照 (PBS)、阳性对照(PBS稀释1000倍的阳性血清)，均为100μL/孔，37℃孵箱， 1小时；而后用洗液洗涤3次；
(4)加入PBS稀释20000倍的二抗，100μL/孔，37℃孵育1小时；取出后用洗液洗涤3次；
(5)显色，每孔加100μL显色液，显色时间为5分钟左右；
(6)每孔加入50μL终止液终止；
(8)双波长(450，630)测吸光值，检测结果大于正常鼠血清OD值2.5 倍的为SPTSSA阳性克隆，最终得到7株分泌抗SPTSSA抗体的杂交瘤细胞，分别命名为1N1、2N1、3N1、6N1、6N2、7N1、10N1，它们分泌的单抗分别命名为S1N1、S2N1、S3N1、S6N1、S6N2、S7N1、S10N1；
将7株阳性的细胞株，用“2019-331-BSA”再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到6株阳性杂交瘤细胞株1N1、2N1、3N1、6N2、7N1、10N1，它们分泌的单抗(细胞培养基上清)分别命名为S1N1、S2N1、S3N1、S6N2、 S7N1、S10N1。
4、单克隆细胞的亚型鉴定
将筛选出来的6株阳性细胞株进行亚类鉴定，最后得到6株IgG类型的阳性杂交瘤细胞株。
实验步骤：
(1)用100mM PBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5μg/mL，每孔加0.1mL，4 ℃，过夜；
(2)PBS-T洗2次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2小时；
(3)PBS-T洗3次，每孔加入100μL杂交瘤上清，37℃孵育1小时；
(4)PBS-T洗3次，用封闭液1∶10000(κ，λ)或1∶20000(其它的)稀释的HRP标记的抗体每孔0.1mL，分别加入适当的孔中，37℃孵育1小时；
(5)PBS-T洗3次；每孔加50μL底物溶液，10-20分钟内于双波长(450， 630)测吸光值，结果显示这6个杂交瘤细胞株的亚型依次为：G1、G1、G2b、 G1、G1、G2a。
5、BALB/C小鼠体内生产单抗并纯化
6周龄小鼠每只腹腔接种0.5mL降植烷，10天后腹腔接种RPMI-1640基础培养基稀释的1N1、2N1、3N1、6N2、7N1、10N1细胞悬液，同时用骨髓瘤细胞SP2/0做为对照组，每只小鼠接种5×106个细胞；10天后收集腹水，离心，取上清，用二氧化硅粉末去除杂质，接着用Protein G亲和层析柱对抗体进行纯化，纯化完毕置于-80℃冻存。
6、免疫组织化学技术(IHC)对SPTSSA抗体进行功能鉴定及应用
(1)于70℃的恒温箱中烤片(胶质瘤与胃癌切片)70分钟，再于60℃烘片60分钟，随后进行2次二甲苯脱蜡，每次5分钟，脱蜡完成后依次过100％、 95％、70％酒精，每次5分钟；
(2)在微波炉中进行抗原修复，先100％功率修复2.5分钟，再20％功率修复15分钟，待冷却后用PBS冲洗；
(3)用30％过氧化氢孵育15分钟，进行PBS-T冲洗，每次5分钟；
(4)用5％BSA的PBS溶液封闭30分钟；
(5)孵育一抗(纯化的抗体)，4℃过夜；
(6)从4℃取出组织芯片后常温放置半小时，而后PBS-T冲洗，每次5分钟；
(7)滴加二抗增强液，室温孵育20分钟，PBS-T冲洗，每次5分钟；
(8)滴加二抗，室温30分钟后，PBS-T冲洗，每次5分钟；
(9)用DAB进行显色，显色完全后立即终止显色；
(10)放入苏木素中30秒，过盐酸酒精分化，而后流水冲洗10分钟；
(11)依次过70％、95％、100％酒精，每次5分钟，过两次二甲苯，每次5 分钟，最后自然晾干，中性树胶封片；染色结果可见S1N1抗体有阳性染色结果 (图1、胶质瘤组织；图2、胃癌组织)，说明纯化的S1N1抗体效价、特异性最好。
7、酶联免疫法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)对SPTSSA 抗体进行功能鉴定及应用
(1)用包被液稀释SPTSSA的偶联多肽(2019-331-BSA)，终浓度分别为 0.005μg/mL、0.0025μg/mL、0.00125μg/mL，100μL/孔，4℃，过夜；后用PBS-T 洗涤2次；
(2)封闭液(1％BSAin PBS)封闭，200μL/孔，37℃孵箱，2小时；后用 PBS-T洗涤1次；
(3)纯化抗体(S1N1抗体，1.3mg/mL)用PBS从200倍开始2倍梯度稀释，空白对照为PBS，均为100μL/孔，37℃孵箱，1小时；后用PBS-T洗涤3 次；
(4)加入PBS稀释20000倍的二抗，100μL/孔，37℃孵箱，1小时；取出后用PBS-T洗涤3次；
(5)显色，显色液100μL/孔，显色时间为10分钟；
(6)每孔加入50μL终止液终止；
(7)酶标仪于450nm检测吸光度；
结果(图3)显示：当S1N1抗体浓度低至101.56ng/mL仍与SPTSSA的多肽抗原(浓度为0.00125μg/mL)有较好的结合活性，S1N1具有较好的ELISA 反应滴度。
获得的单克隆抗体S1N1是目的抗SPTSSA单抗，具有高特异性识别SPTSSA 蛋白抗原，可用于IHC的免疫学研究，也可潜在用于SPTSSA相关疾病的诊断和治疗。
序列表
<110> 南通大学附属医院
<120> 一种抗SPTSSA的单克隆抗体及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成多肽(artificial)
<400> 1
Cys Met Ala Gly Met Ala Leu Ala Arg Ala Trp Lys Gln
1 5 10

Claims (3)

1.一种抗SPTSSA的单克隆抗体S1N1，是由保藏号为CCTCC NO：C2020181的杂交瘤细胞株1N1所分泌的。
2.权利要求1所述的抗SPTSSA的单克隆抗体S1N1在制备检测SPTSSA抗原试剂中的应用。
3.分泌权利要求1所述的抗SPTSSA的单克隆抗体S1N1的杂交瘤细胞，是保藏号为CCTCCNO：C2020181的杂交瘤细胞株1N1。
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CN108424888A (zh) * 2018-05-14 2018-08-21 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司 一种人的丝氨酸棕榈酰转移酶1突变蛋白及其应用

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