CN103189392A

CN103189392A - ErbB3结合抗体

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Publication number: CN103189392A
Application number: CN2011800502017A
Authority: CN
Inventors: R·穆拉罗; S·伊亚科贝利; N·蒂纳里; G·萨拉; S·特莱尼
Original assignee: MediaPharma SRL
Current assignee: MediaPharma SRL
Priority date: 2010-10-18
Filing date: 2011-09-12
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2031-09-12
Also published as: JP5995851B2; US9346889B2; JP2014503181A; US20130224220A1; AU2011317743B2; WO2012052230A1; CA2813796A1; CA2813796C; EP2630160B1; CN103189392B; EP2630160A1; ES2632486T3; AU2011317743A1

Abstract

本发明涉及抗体，特别是单克隆抗体，其结合ErbB3受体，包含此种抗体的组合物以及使用此种抗体的方法。

Description

ErbB3结合抗体

描述

本发明涉及结合ErbB3受体的抗体，特别是单克隆抗体，其中所述结合减少ErbB3受体介导的信号转导，本发明涉及包含此种抗体的组合物以及使用此种抗体的方法。

癌症是特征在于经转化的细胞的不受控增殖的疾病，所述细胞侵袭并破坏邻近组织，并且可通过被称作转移的过程扩散至远端的解剖位点^1-4。在转移性疾病存在的情况下，癌症可在数月至数年的可变时间段内引起死亡^1-4。

癌症治疗最主要的药物是细胞毒性化疗剂（也称作增殖抑制剂或化疗剂）。这些药物通过损伤DNA或抑制细胞增殖而起作用。通过这种方式，它们杀死所有的迅速分裂中的细胞，不仅仅是癌细胞，也杀死正在进行细胞分裂的正常细胞。化疗药物对于癌细胞缺乏作用的特异性是引起施用它们之后的显著毒性的原因。在过去十年，基础科学研究已经显著增加了我们对于细胞转化和细胞增殖的分子机理的知识，这引起了“分子靶向”药物或“靶向疗法”的产生⁵。它们是指被特异性设计为作用于具有特定分子和/或功能异常的癌细胞的药物。然而，即使是靶向疗法也具有副作用的问题，在多数情况下它们仅能够暂时阻断肿瘤生长。

ErbB3受体，也称作HER-3，属于表皮生长因子受体酪氨酸激酶家族(ErbB)。该受体家族由四个成员组成：ErbB1(HER1),ErbB2(HER2),ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)。很多研究已经启示了ErbB受体在细胞存活、增殖和分化以及在恶性转化中具有关键作用^6-7。酪氨酸激酶受体介导的信号转导是复杂的，涉及与两类配体的相互作用：表皮生长因子(EGF)和EGF样配体(例如TGFα和双调蛋白(amphiregulin))，神经调节蛋白(Neuregulin)(NRG)，也称作Heregulin(HRG)或Neu分化因子(NDF)。与ErbB受体结合的配体诱导受体同二聚体和异二聚体的形成和内在激酶结构域的激活，导致细胞质尾内的特异性酪氨酸残基上的磷酸化。这些磷酸化的残基作为多种蛋白质的停泊位点，它们的募集导致细胞内信号途径的激活。一般地，异二聚化比同二聚化更为优选；ErbB2是其它ErbB受体的优选的异二聚化伴侣，所述其它ErbB受体包括ErbB1(由EGF或EGF样配体激活)和ErbB3及ErbB4(由神经调节蛋白NRG激活)。由ErbB受体激活的两个主要信号途径是Ras-Raf-MAPK和PI3K-AKT途径^8-10。

ErbB2基因在20%-30%的乳腺癌中被扩增并且与差的预后相关联。通过相同的方式，ErbB3受体也被表明在乳腺癌患者中过表达。ErbB2和ErbB3受体二者的高水平表达与肿瘤的攻击性生物学相关。事实上，在被NRG刺激之后，ErbB2/ErbB3异二聚体在可能的ErbB家族成员配对组合中递送最强的和长效的增殖性细胞内信号^8-11。数项研究已经启示了ErbB3受体在很多人类肿瘤类型的进展中具有重要作用，例如前列腺癌、黑素瘤和胃癌。

综合起来，实验和临床数据表明ErbB3在肿瘤发生和进展中具有关键作用，这启示了靶向ErbB3的试剂可为一些癌症的治疗提供新型和有前景的方法^12-24。

虽然新的化疗试剂和靶向疗法取得了科学上的进步并引入了临床实践，但是癌症仍然是难以治愈的疾病，其导致世界范围内大约13%的死亡^1-4。

因此，迫切需要开发新的抗肿瘤疗法，更有效的和可能毒性尽可能小的疗法。

本发明人发现：特异性ErbB3抑制剂能够诱导肿瘤消退。特别地，单克隆抗体MP-RM-1被用作抗-ErbB3抑制剂。

因此，本发明的第一个方面涉及结合ErbB3受体的抗体或其片段，其包含

a)SEQ ID NO:1编码的重链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少80%序列同一性的氨基酸序列；和/或

b)SEQ ID NO:2编码的轻链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

VH序列(SEQIDNO：1)

gacgtgcagctggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctctggattcactttcagtacctatggcatgtcttgggttcgccagactccagacaggaggctggagtgggtcgcaaccattagtcatggtgacggttatacctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgcacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagacatggggattacgacgatgattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctca

VL序列(SEQIDNO：2)

gatattgtgatgacccagtctccatcctccctgactgtgatagcaggagagaaggtcactatgagctgcaagtccagtcagagtctgttaaacagtggaaatcaaaagaactacttgacctggtaccaacagaaaccagggcagcctcctaaactgttgatctactgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctggaacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgtcagaatgaatatacttatccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacggg

如本文使用的术语“抗体”包括“片段”或“衍生物”，它们具有抗体的至少一个抗原结合位点和／或显示出相同的生物学活性。

此外，抗体优选包括至少一个免疫球蛋白重链和至少一个免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白链包括可变结构域和任选地恒定结构域。可变结构域可包括互补决定区(CDR)，例如CDR1、CDR2和／或CDR3区域，和框架区。

如本文使用的两个多肽序列之间的“序列同一性”表示在序列之间相同的那些氨基酸的百分率，优选在SEQ ID NO：1和／或SEQ ID NO：2编码的氨基酸序列的全长上。本发明的优选多肽序列具有至少80％，更优选85％，更优选90％，93％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性。

根据另一个优选实施方式，本发明的抗体减少ErbB3受体介导的信号转导。所述ErbB3受体介导的信号转导的减少优选是由ErbB3的下调引起的。根据另一个实施方式，ErbB3的下调优选是通过降低细胞表面上的ErbB3水平实现的，即优选地本发明的抗体具有降低细胞表面上的ErbB3水平的能力。

本发明的抗体可具有至少一个抗原结合位点，例如1个或2个抗原结合位点。

本发明的抗体优选结合ErbB3的细胞外结构域。

所述抗体可以是天然的和／或合成来源的任何抗体，例如哺乳动物来源的抗体。优选地，如果存在的话，恒定结构域是人恒定结构域。可变结构域优选为哺乳动物可变结构域，例如人源化或人可变结构域。

根据本发明的抗体可以是多克隆或单克隆抗体。单克隆抗体是优选的。本发明的抗体特别优选选自重组抗体、人源化或完全人抗体、嵌合抗体、多特异性抗体，特别是双特异性抗体，或其片段。

单克隆抗体可通过任何合适的方法产生，例如和Milstein的方法²⁵或通过重组DNA方法产生。也可以使用Clackson等人²⁶描述的技术从噬菌体抗体文库分离单克隆抗体。

可根据本领域已知的方法产生抗体的人源化形式，例如嵌合化或CDR接枝。用于产生人源化抗体的替代性方法是本领域熟知的，描述于例如EP-A1 0 239 400和WO90/07861。也可通过体外方法衍生人抗体。合适的实例包括但不限于噬菌体展示、酵母展示等。

根据本发明，“嵌合抗体”是指包含来自不同物种例如小鼠和人的多肽的抗体。嵌合抗体的产生描述于例如WO89/09622。

单特异性抗体是全部具有对于相同抗原的亲和性的抗体。多特异性抗体是具有针对数种抗原的亲和性的抗体。双特异性抗体具有针对两种不同抗原的亲和性。

术语抗体包括“片段”或“衍生物”，它们具有抗体的至少一个抗原结合位点。根据优选实施方式，抗体或其片段可以是Fab片段，Fab'片段，F(ab')片段，Fv片段，双特异抗体(diabody)，ScFv，小模块免疫药物(SMIP)，affibody，avimer，nanobody，结构域抗体和/或单链。

"Avimer"是指使用例如体外外显子改组和噬菌体展示工程化的多聚体结合蛋白或肽。多个结合结构域相连，产生相对于单表位免疫球蛋白结构域而言更大的亲和性和特异性。

"Nanobody"或单结构域抗体是指由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。

"Affibody"分子是被工程化以特异性结合大量靶蛋白的小的高亲和性蛋白。

本发明的抗体优选可以是IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgM,IgA1,IgA2,IgAsec,IgD和IgE抗体型的。将认识到，所产生的抗体无需最初具有这样的同种型，而是所产生的抗体可具有任何同种型并且抗体可进行同种型转换。

本发明的抗体或抗体片段任选为了治疗目的去免疫化。

在本发明的特别优选的实施方式中，抗体是MP-RM-1，于2009年10月15日保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSMACC3018。

根据另一个优选实施方式，抗体或其片段可以从杂交瘤细胞系DSMACC3018或其衍生物产生。

根据本发明的优选实施方式，从杂交瘤细胞系DSM ACC3018或其衍生物产生的抗体或片段是人源化抗体或其片段。优选地，该人源化抗体包含本发明的序列3-14中的至少一个。根据特别优选的实施方式，抗体选自下组：cMP-RM-1#1,cMP-RM-1#2,cMP-RM-1#3,cMP-RM-1#4,hMP-RM-1#5,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#7,hMP-RM-1#8,hMP-RM-1#9,hMP-RM-1#10,hMP-RM-1#11,hMP-RM-1#12,hMP-RM-1#13,hMP-RM-1#14,hMP-RM-1#15,hMP-RM-1#16,hMP-RM-1#17,hMP-RM-1#18,hMP-RM-1#19,hMP-RM-1#20(c：嵌合抗体；h：人源化抗体)。

特别优选的实施方式涉及选自下组的抗体：cMP-RM-1#4,hMP-RM-1#14,hMP-RM-1#17或hMP-RM-1#20。

另一个优选实施方式涉及下组抗体：hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#7,hMP-RM-1#8,hMP-RM-1#9,hMP-RM-1#10,hMP-RM-1#11,hMP-RM-1#12,hMP-RM-1#19和hMP-RM-1#20。特别优选的抗体组包括抗体hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10和hMP-RM-1#20。

对本领域技术人员明显的是本发明的抗体可进一步偶联其它部分，例如药物靶向和成像应用。此种偶联可于抗体或抗原表达至连接位点之后化学地进行或者偶联产物可以在DNA水平被工程化进入本发明的抗体或抗原。

因此，为了诊断目的，本发明的抗体或抗体片段可以被标记，即，偶联至标记基团。合适的标记物包括放射活性标记物，荧光标记物，合适的染料基团，酶标记物，色原体，化学发光基团，生物素基团，被次级报告分子识别的预先确定的多肽表位等等。

标记的抗体或抗体片段可特别用于免疫组化测定或用于体内分子成像。

对于治疗目的，本发明的抗体或抗体片段可以与效应子基团缀合，特别是治疗性效应子基团例如放射活性基团或细胞毒性基团。

标记基团或效应子基团可以通过多种长度的间隔子臂连接以减少潜在的空间位阻。

根据另一个方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其片段的核酸分子，或能够在严格条件下与其杂交的核酸。本发明的编码上述抗体、抗体片段或其衍生物的核酸分子可以是例如DNA,cDNA,RNA或合成产生的DNA或RNA或包含任何单独的或组合的那些核酸分子的重组产生的嵌合核酸分子。核酸分子也可以是对应于整个基因或其实质部分或对应于其片段和衍生物的基因组DNA。核苷酸序列可对应于天然产生的核苷酸序列或可以包含单个或多个核苷酸置换、缺失或添加。在本发明的特别优选的实施方式中，核酸分子是cDNA分子。

术语“在严格条件下杂交”是指两个核酸片段在标准化的杂交条件下彼此杂交，所述条件在例如下列中描述：Sambrook等人"Expressionof cloned genes in E.coli"，见Molecular Cloning:A laboratory manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA。此种条件是例如在6.0xSSC在大约45°C杂交，然后以2.0xSSC在50°C洗涤，优选2.0xSSC在65°C，或0.2xSSC在50°C，优选0.2xSSC在65°C。

本发明的另一个方面涉及包含本发明的核酸分子的载体。所述载体可以是例如噬菌体、噬菌粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是能够复制的或复制缺陷的。优选地，本发明的载体是表达载体，其中核酸分子可操作地连接于一种或多种允许在原核和/或真核宿主细胞中转化和任选表达的控制序列。

本发明还涉及包含本发明的载体的宿主。所述宿主可以是原核或真核细胞或非人转基因动物。存在于宿主中的本发明的多核苷酸或载体可整合进入宿主的基因组中或可以维持于染色体外。

宿主可以是原核或真核细胞，例如细菌、昆虫、真菌、植物、动物、哺乳动物或优选人细胞。优选的真菌细胞是例如酵母属的细胞，特别是酿酒酵母的细胞。

本发明还涉及用于制备抗体的方法，包括在允许合成所述抗体的条件下培养本发明的宿主，和从所述培养物回收所述抗体。

本发明的另一个方面涉及包含本发明的抗体或其片段、核酸分子、载体、本发明的宿主或通过本发明的方法获得的抗体的药物组合物。如本文使用的术语“组合物”包括至少一种本发明的化合物。优选地，此种组合物是治疗性/药物组合物或诊断性组合物。本发明的诊断性组合物可用于测定如本文所定义的过度增殖性疾病的发作或疾病状态。

组合物优选包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

合适的药学载体、赋形剂和/或稀释剂的实例是本领域熟知的，包括磷酸盐缓冲溶液，水，乳液例如油/水乳液，多种类型的润湿剂，无菌溶液等。包含此类载体、赋形剂和/或稀释剂的组合物可以通过熟知的常规方法配制。

合适的组合物的施用可通过不同的方式进行，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、表面、皮内、鼻内或支气管内施用。优选是静脉内、肌内和/或皮下施用。

这些药物组合物可以以合适的剂量向受试者施用。剂量方案可以由主治医生和临床因素决定。

本发明的组合物可以局部或系统性施用。用于胃肠外施用的制剂包括无菌水溶液或非水性溶液，悬浮液和乳液。非水溶剂的实例有丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄榄油，和可注射的有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水，醇/水溶液，乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。胃肠外介质包括氯化钠溶液，林格氏右旋糖，右旋糖和氯化钠，乳酸林格氏液或非挥发油。静脉内介质包括流体和营养补充物，电解质补充物(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。防腐剂和其它添加剂也可存在，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可包含其它试剂，这取决于药物组合物的期望用途。

根据特别优选的实施方式，组合物包含另外的活性试剂，例如另外的抗体或抗体片段。

优选地，本发明的组合物与至少一种另外的抗肿瘤试剂组合使用。所述组合对于例如抑制异常细胞生长是有效的。很多抗肿瘤试剂目前在本领域是已知的。一般地，该术语包括能够预防、缓解和/或治疗过度增殖性疾病的所有试剂。特别优选的是诱导细胞凋亡的抗肿瘤试剂。

优选地，抗肿瘤试剂选自抗体、小分子、抗代谢物、烷基化试剂、拓扑异构酶抑制剂、微管靶向试剂、激酶抑制剂、蛋白合成抑制剂、免疫治疗剂、激素或其类似物，和/或mTOR抑制剂。

可以与本文提供的抗体组合使用的抗肿瘤试剂的具体实例包括例如吉非替尼、拉帕替尼、sunitinib、培美曲塞、贝伐单抗、西妥昔单抗、伊马替尼、阿仑珠单抗、曲妥珠单抗、利妥昔单抗、埃罗替尼、硼替佐米等，特别是曲妥珠单抗。用于本文描述和要求保护的的组合物中的其它具体的抗肿瘤试剂包括例如，化疗剂例如紫杉醇、蒽环类、氟嘧啶、长春花生物碱类、铂盐，特别是卡培他滨、柔红霉素、道诺霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、胞嘧啶阿糖核苷、双氯乙基亚硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光辉霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲三聚氰胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、美法仑、环磷酰胺、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氮胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、4-羟基过氧基环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙碱、泰素、长春新碱、长春碱、依托泊甙、三甲曲沙、替尼泊甙、顺铂和己烯雌酚(DES)。

本发明的组合物可以与包含如上文描述的活性试剂的其它治疗性组合物和/或辐射和/或放疗组合施用。

根据优选实施方式，本发明的组合物用于治疗和/或预防过度增殖性疾病，特别是肿瘤性疾病或癌症。组合物也可用于制备用于治疗和/或预防过度增殖性疾病，特别是肿瘤性疾病或癌症的药物。

如本文定义的过度增殖性疾病包括任何肿瘤，即组织的任何异常和/或不受控的新的生长。如本文使用的术语“组织的不受控的新的生长”可依赖于功能紊乱和/或生长调节的缺失。过度增殖性疾病包括肿瘤疾病和/或癌症，例如转移性或侵袭性癌症。

过度增殖性疾病优选选自与ErbB3表达、过表达或过度活性相关、相伴或由其引起的病症，例如癌症，特别是黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胃肠/结肠癌、肺癌、肾的透明细胞癌和/或前列腺癌。特别地，对于这些肿瘤，已经证明了ErbB3对于促进癌症产生和生长的作用，因此，该蛋白的抑制可产生某些益处。

本发明还涉及治疗疾病的方法，其中将本发明的抗体施用至哺乳动物，并且其中所述疾病与ErbB3的异常表达水平或活性直接或间接相关。

本发明的另一个方面涉及抑制受试者中的EGF样配体介导的ErbB3磷酸化的方法，包括向所述受试者施用足以抑制EGF样配体介导的ErbB3磷酸化的量的如上文所述的抗体或其抗原结合部分。“ErbB3的磷酸化”是指氨基酸残基的磷酸化，优选酪氨酸残基的磷酸化。

本发明的另一个方面涉及诊断受试者中的与ErbB3相关的癌症的方法，包括

(a)离体或在体内将来自受试者的细胞与权利要求任一项所述的抗体或其抗原结合部分接触，和

(b)测定细胞上与ErbB3结合的水平，其中与ErbB3结合的异常高水平表示受试者具有与ErbB3相关的癌症。

在本发明的术语中，“异常高”意思是相对于不具有癌症的健康受试者更高的ErbB3结合水平。

优选地，受试者是动物，更优选是哺乳动物，特别优选是人。

附图说明

图1显示MP-RM-1减少乳腺癌细胞表面上的ErbB3受体的表达。

图2显示MP-RM-1下调乳腺癌细胞中的ErbB3受体。

图3显示MP-RM-1能够减少MDA-MB-435人乳腺癌细胞中的ErbB3受体的半衰期。

图4显示MP-RM-1能够减少SKBR-3人乳腺癌细胞中的ErbB3受体的半衰期。

图5显示MP-RM-1对于ErbB3受体半衰期的减少效应被溶酶体抑制剂氯喹阻断。

图6显示MP-RM-1在MDA-MB-435人乳腺癌细胞和IR-8人黑素瘤细胞中抑制受体配体NRG-1诱导的ErbB3和AKT的磷酸化。

图7显示MP-RM-1以时间依赖性方式抑制配体诱导的ErbB3和AKT的磷酸化。

图8显示MP-RM-1能够拮抗配体诱导的ErbB3和AKT的激活。

图9显示MP-RM-1迅速(30分钟)内化进入细胞。

图10比较了MP-RM-1和曲妥珠单抗对于人乳腺癌和前列腺癌细胞中配体诱导的ErbB3和AKT激活之效应。

图11显示MP-RM-1能够抑制MET扩增的MKN-45人胃癌细胞中的基础ErbB3和AKT磷酸化。

图12显示MP-RM-1抑制MDA-MB-435人乳腺癌细胞中的配体诱导的增殖。

图13显示MP-RM-1抑制DU145人前列腺癌异种移植物的生长。

图14显示在IR-8人黑素瘤异种移植物中，在注射进入小鼠4小时之后，MP-RM-1马上诱导ErbB3下调并抑制AKT激活。

图15显示以cMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10,hMP-RM-1#20MP-RM-1抗体变体处理IR-8人黑素瘤细胞减少了细胞表面上的ErbB3受体的表达。

图16显示人源化的变体hMP-RM-1#6迅速(30分钟)内化进入细胞。

图17显示了嵌合变体cMP-RM-1#1和人源化抗体变体hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10,hMP-RM-1#20对于IR-8人黑素瘤细胞中ErbB3半衰期的效应。

图18显示了cMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10和hMP-RM-1#20抗体变体对于人卵巢癌细胞(A)和胃癌细胞(B)中的ErbB3和AKT的磷酸化的抑制效应。

图19显示了cMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10和hMP-RM-1#20抗体变体对于软琼脂中人黑素瘤(A)或胃癌(B)细胞集落形成的抑制效应。

图20显示了以cMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10和hMP-RM-1#20抗体变体处理的小鼠的肿瘤异种移植物的生长显著小于对照小鼠。

实施例

实施例1：单克隆抗体MP-RM-1的产生

通过腹膜内注射以人ErbB3受体转染的活NIH/3T3细胞来免疫4周龄的Balb/c小鼠。7天后，再给予小鼠腹膜内注射免疫原。再7天之后，使用免疫原静脉内加强免疫，3天后取出脾脏用于细胞融合。通过将免疫脾细胞与鼠非分泌性骨髓瘤细胞系NS-1融合来制备体细胞杂种。基于与LTR-ErbB3转染的细胞、但不与LTR-neo NIH/3T3的差别性反应活性选择杂交瘤上清液。通过有限稀释法将所有的阳性杂交瘤细胞集落克隆两次，并进一步表征。发现选择的单克隆抗体，被命名为MP-RM-1(同种型IgG2a)，特异性识别ErbB3受体的细胞外结构域。

产生MP-RM-1抗体的杂交瘤鼠细胞系保藏于DSMZ(德国微生物菌种保藏中心)，保藏号为DSM ACC3018。

实施例2：MP-RM-1对于乳腺癌细胞表面上的ErbB3受体表达的效应

材料和方法：以10μg/ml MP-RM-1将MDA-MB-435人乳腺癌细胞维持于冰上30分钟，然后恢复至37°C。在所指明的时间，将细胞进行胰蛋白酶处理并以荧光素标记的山羊抗小鼠IgG抗体染色，通过FACS分析。

结果：MP-RM-1以时间依赖性方式减少细胞表面上的ErbB3受体表达(图1)。

实施例3：MP-RM-1对于乳腺癌细胞中的ErbB3受体的下调效应

材料和方法：MDA-MB-435人乳腺癌细胞在0.2%FBS DMEM中生长24小时，然后在存在或不存在10μg/ml MP-RM-1的情况下温育15,60,120和240分钟。在温育期结束时，将细胞裂解并使用抗-ErbB3和抗-AKT通过Western印迹分析ErbB3和AKT蛋白水平。以抗-PLCγ-1重探测同一滤器作为上样对照。

结果：MP-RM-1在120分钟后诱导ErbB3受体的下调(图2)。

实施例4：MP-RM-1对于乳腺癌细胞中的ErbB3受体半衰期的效应

材料和方法：MDA-MB-435人乳腺癌细胞在0.2%FBS DMEM中生长24小时，然后在有或无MP-RM-1的情况下，以10μg/ml的蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺刺激。将细胞裂解并使用抗-ErbB3和抗-AKT通过Western印迹分析ErbB3和AKT蛋白水平。以抗-PLCγ-1或抗-肌动蛋白重探测同一滤器作为上样对照。

结果：相对于PBS处理的对照细胞，环己酰亚胺刺激、MP-RM-1处理的MDA-MB-435细胞中的ErbB3受体半衰期显著降低(图3)。

实施例5：MP-RM-1对于乳腺癌细胞中的ErbB3受体半衰期的效应

材料和方法：SKBR-3人乳腺癌细胞在0.2%FBS DMEM中生长24小时，然后在存在或不存在MP-RM-1的情况下，以10μg/ml的蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺刺激。将细胞裂解并使用抗-ErbB3通过Western印迹分析ErbB3蛋白水平。

结果：相对于PBS处理的对照细胞，环己酰亚胺刺激、MP-RM-1处理的SKBR-3细胞中的ErbB3受体半衰期显著降低(图4)。

实施例6：氯喹对于MP-RM-1诱导的ErbB3受体下调的效应

材料和方法：MDA-MB-435人乳腺癌细胞在0.2%FBS中生长24小时，并以10μg/ml环己酰亚胺刺激3小时。在存在或不存在氯喹的情况下以MP-RM-1温育细胞。温育之后，将细胞裂解并使用抗-ErbB3通过Western印迹分析ErbB3蛋白水平。以抗-肌动蛋白重探测同一滤器作为上样对照。

结果：MP-RM-1诱导的ErbB3受体下调被氯喹阻断(图5)。

实施例7：MP-RM-1对于乳腺癌细胞和黑素瘤癌细胞中配体诱导的ErbB3和AKT磷酸化的效应

材料和方法：MDA-MB-435人乳腺癌细胞A375和IR-8人黑素瘤细胞在含有0.2%FBS的DMEM或RPMI中生长24小时。在存在或不存在1或10μg/ml MP-RM-1的情况下温育细胞2小时，然后以10ng/mlNRG-1刺激5分钟。温育之后，将细胞裂解并使用抗-ErbB3,抗-p-ErbB3,抗-AKT,抗-p-AKT和抗-p-Erks通过Western印迹分析ErbB3,p-ErbB3,AKT,p-AKT或p-Erks蛋白水平。以抗-肌动蛋白重探测同一滤器作为上样对照。

结果：以MP-RM-1预处理细胞显示出对于配体诱导的ErbB3和AKT磷酸化的剂量依赖性抑制(图6)。

实施例8：MP-RM-1对于配体诱导的ErbB3和AKT磷酸化的效应

材料和方法：MDA-MB-435人乳腺癌细胞在0.2%FBS DMEM中生长24小时，然后以10ng/ml NRG-1刺激5分钟。然后以10μg/mlMP-RM-1温育细胞15，60和120分钟，然后以NRG-1刺激。温育之后，将细胞裂解并使用抗-ErbB3,抗-p-ErbB3,抗-AKT和抗-p-AKT通过Western印迹分析ErbB3,p-ErbB3,AKT和p-AKT蛋白水平。

结果：以MP-RM-1预处理细胞显示出对于配体诱导的ErbB3和AKT磷酸化的剂量依赖性抑制(图7)。

实施例9：MP-RM-1对于配体诱导的ErbB3和AKT磷酸化的效应

材料和方法：MDA-MB-435人乳腺癌细胞在0.2%FBS DMEM中生长24小时，然后同时以10ng/ml NRG-1和10μg/ml MP-RM-1刺激5分钟。温育之后，将细胞裂解并使用抗-ErbB3,抗-p-ErbB3和抗-p-AKT通过Western印迹分析ErbB3,p-ErbB3和p-AKT蛋白水平。

结果：以MP-RM-1刺激5分钟不诱导ErbB3和AKT磷酸化，这表明MP-RM-1不是受体激动剂。相反，配体诱导的ErbB3和AKT磷酸化被MP-RM-1部分地抑制，这表明MP-RM-1是部分受体拮抗剂(图8)。

实施例10：MP-RM-1内化进MDA-MB-435乳腺癌细胞

材料和方法：MDA-MB-435人乳腺癌细胞铺板于22X22mm盖玻片并在0.2%FBS DMEM中生长24小时。然后以10μg/ml MP-RM-1温育细胞于冰上持续30分钟，恢复至37°C。30和60分钟之后，将细胞固定于4%多聚甲醛，以0.2%Triton-X100/PBS透化，然后以荧光素标记的山羊抗小鼠抗体染色(绿色染色)，以鬼笔环肽染色(红色染色)。细胞核复染为蓝色。黄色和白色箭头指示MP-RM-1分别定位在细胞膜和细胞质。

结果：MDA MB435细胞在以MP-RM-1于冰上温育30分钟之后显示出山羊抗小鼠膜阳性(黄色箭头)，这表明MP-RM-1抗体完全定位在质膜。在37°C温育30和60分钟之后，山羊抗小鼠信号完全在细胞内(白色箭头)，这表明MP-RM-1已经被细胞内化(图9)。

实施例11：MP-RM-1和曲妥珠单抗对于乳腺癌和前列腺癌细胞中配体诱导的ErbB3和AKT激活的效应比较

材料和方法：MDA-MB-435人乳腺癌细胞和DU145人前列腺癌细胞在0.2%FBS RPMI中生长24小时，然后以10ng/ml NRG-1刺激5分钟。然后以1或10μg/ml MP-RM-1或10μg/ml曲妥珠单抗温育细胞2小时，然后以配体刺激。温育之后将细胞裂解并使用抗-ErbB3,抗-p-ErbB3,抗-AKT,抗-p-AKT和抗-p-Erks通过Western印迹分析ErbB3,p-ErbB3,AKT,p-AKT和p-Erks蛋白水平。

结果：MP-RM-1抑制配体诱导的ErbB3和AKT磷酸化，其程度与曲妥珠单抗相同。然而，MP-RM-1诱导ErbB3的下调，曲妥珠单抗不诱导其下调(图10)。

实施例12：MP-RM-1对于MET扩增的胃癌细胞中的MET/ErbB3/AKT信号轴的效应

材料和方法：MKN-45人胃癌细胞在0.2%FBS DMEM中生长24小时。然后将细胞暴露于1和10μg/ml MP-RM-1，或10μg/ml曲妥珠单抗，或0.1、1和10μg/ml MET抑制剂SU11274。然后将细胞裂解并使用抗-ErbB3,抗-p-ErbB3,抗-AKT,抗-p-AKT和抗-p-MET通过Western印迹分析ErbB3,p-ErbB3,AKT,p-AKT和p-MET蛋白水平。

结果：MKN-45细胞显示出配体非依赖性的、MET依赖性的ErbB3受体和AKT磷酸化。MP-RM-1抑制该基础活性，而曲妥珠单抗不抑制该基础活性。此外，MP-RM-1能够在体内破坏配体非依赖性MET/ErbB3缔和(图11)。

实施例13：MP-RM-1对于乳腺癌细胞的配体诱导的增殖的效应

材料和方法：MDA-MB-435人乳腺癌细胞在0.2%FBS RPMI中生长24小时，然后在存在或不存在1或10μg/ml MP-RM-1的情况下，以10ng/ml NRG-1温育48小时。在温育结束时，将细胞进行胰蛋白酶处理并计数。

结果：MP-RM-1以剂量依赖性方式抑制MDA-MB-435细胞的配体诱导的增殖(图12)。

实施例14：MP-RM-1对于前列腺癌异种移植物的效应

材料和方法：通过皮下注射5x10⁶DU145细胞至5周龄CD1裸鼠建立人前列腺癌异种移植物。当异种移植物可触知时，将小鼠分为2组，每组10只。两个组具有相当的平均肿瘤体积。1个组接受腹膜内注射PBS缓冲液中的20mg/kg MP-RM-1，每周2次，而另一组仅接受PBS(对照组)。每天通过卡尺监视肿瘤体积。误差条表示每组的SE。*和**分别表示MP-RM-1处理的小鼠和PBS处理的小鼠(对照)之间的显著性差异(P=0.01)和(P=0.006)。

结果：MP-RM-1处理的小鼠显示出相对于对照小鼠达60%的肿瘤体积减小(0.42cm³vs0.96cm³)(图13)。

实施例15：MP-RM-1对于黑素瘤异种移植物中ErbB3下调和AKT磷酸化的体内效应

材料和方法：具有IR-8黑素瘤异种移植物的裸鼠经200μgMP-RM-1处理或不处理(U)。4小时、16小时和24小时后，收集肿瘤并在含有50mM Tris-HCl(pH7.4),5mM EDTA,0.1%NP-40,250mMNaCl,50mM NaF的裂解缓冲液(w:v,1:10)中，在存在亮抑酶肽、胃酶抑素、抑肽酶和苯基-甲基-磺酰基-氟化物的情况下使用Polytron匀浆器将肿瘤匀浆。在13,000rpm在4℃将匀浆物离心10分钟。使用抗-ErbB3、抗-AKT、抗-p-AKT通过Western印迹就ErbB3、AKT和p-AKT蛋白水平分析上清液的等份。以抗-PLCγ-1重探测同一滤器作为上样对照。

结果：在注射进入小鼠4小时之后，MP-RM-1开始诱导黑素瘤异种移植物中ErbB3下调并抑制AKT磷酸化(图14)。

实施例16：MP-RM-1抗体的嵌合和人源化形式的产生

用于人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。优选地，人源化抗体具有导入其中的来自非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称作“输入”残基，其通常来自“输入”可变结构域。可以基本上根据已经公开的程序进行人源化(27-29)，特别是通过将啮齿类CDR或CDR序列替换人抗体的相应序列。相应地，此种“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中实质上少于完整人可变结构域被来自非人物种的相应序列替换。在实践中，人源化抗体通常是这样的人抗体：其中一些CDR残基和可能有一些框架区(FR)残基被来自啮齿类抗体中的类似位点替换。

为了产生MP-RM-1抗体的嵌合和人源化形式，扩增了产生MP-RM-1抗体(保藏于DSMZ，保藏号是DSM ACC3018)的杂交瘤细胞，提取了总RNA，进行了RT-PCR以克隆和测序抗体的可变区，使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。

基于MP-RM-1抗体的可变区的序列信息，使用标准程序通过基因合成获得了所述区域的20种不同变体。

对于抗体嵌合，将鼠恒定区替换为人恒定区。在IgG1情景下产生了重链(HC)的两个嵌合形式，在IgG3的情景下产生了重链(HC)的两个嵌合形式。

对于抗体人源化，将来自鼠的互补决定区(CDR)接枝到人抗体框架区。

在IgG1和LC-K的情景下产生了16个人源化形式的重链(HC)。每种形式的特征在于FR中的特异性点突变。

序列信息

嵌合序列

序列3：嵌合IgG1HC序列

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序列4A：嵌合IgG2 HC序列

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序列4B：嵌合IgG3 HC序列

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序列5：嵌合LC K序列

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序列6：嵌合LCλ序列

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人源化序列

序列7：人源化IgG1HC序列1

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序列8：人源化IgG1 HC序列2

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序列9：人源化IgG1HC序列3

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序列10：人源化IgG1HC序列4

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序列11：人源化LCK序列1

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序列12：人源化LCK序列2

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序列13：人源化LCK序列3

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序列14：人源化LCK序列4

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o以小写字体表示信号肽(非斜体)

o以大写字体表示可变区，CDR以下划线标示

o以小写斜体表示恒定区

o以粗体表示点突变

将4个嵌合和16个人源化合成基因置于pCDNA3．1质粒表达载体中，然后转染进入中国仓鼠卵巢-S(CHO-S)细胞以获得单克隆抗体的合成。表1显示了20种不同的载体组合和各抗体名称。

表1：MP-RM-1抗体的20种不同变体的载体组合

c：嵌合抗体；h：人源化抗体

具有期望特性的抗体的最初筛选

就抑制IR-8人黑素瘤细胞中配体诱导的ErbB3和Akt磷酸化以及促进ErbB3下调的能力测试含有20种不同抗体变体的上清液。在长效测定中测定变体对于磷酸化的抑制性效应(以10μg/ml的抗体变体处理细胞2小时，然后以NRG-1刺激)，或在短效测定中测定(同时暴露于抗体变体和NRG-15分钟)。结果表明4个抗体变体即cMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10,hMP-RM-1#20在长效和短效测定中对于抑制ErbB3和AKT磷酸化以及ErbB3下调是最有活性的(表2)。

表2：MP-RM-1抗体变体的筛选

¹是指以NRG-1刺激5分钟后以抗体变体温育2小时的IR-8细胞的ErbB3和Akt的磷酸化状态。²是指以抗体变体和NRG-1同时温育5分钟的IR-8细胞的ErbB3和AKT的磷酸化状态；³是指抗体变体促进ErbB3下调的能力，如通过western印迹和FACS分析所测定。

基于这些结果，选择了4个抗体变体cMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10和hMP-RM-1#20，通过蛋白A捕获的方式进行纯化(HiTrap Protein A HP,GE Healthcare)，然后就它们的促进ErbB3受体内化、ErbB3受体下调以及体外和体内抑制人肿瘤细胞生长的能力进行测试。

实施例17：嵌合和人源化MP-RM-1抗体变体对于人黑素瘤细胞表面的ErbB3受体表达的效应

材料和方法：在存在10μg/ml嵌合(cMP-RM-1#1)或人源化(hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10,hMP-RM-1#20)MP-RM-1抗体变体的情况下将IR-8人黑素瘤细胞维持于冰上30分钟，然后恢复至37℃持续60分钟。收获细胞并以荧光素标记的山羊抗人IgG抗体染色，以FACS分析。

结果：嵌合和人源化MP-RM-1抗体变体诱导IR-8人黑素瘤细胞表面上的ErbB3受体表达的减少(图15)。

实施例18：hMP-RM-1#6在人黑素瘤细胞中的内化

材料和方法：将IR-8人黑素瘤细胞铺板于15X15mm盖玻片并在含0.2%FBS的RPMI中生长24小时。然后以10μg/ml人源化MP-RM-1#6在冰上温育细胞30分钟，在37°C恢复。30分钟之后，将细胞固定于4%多聚甲醛，以PBS中的0.2%Triton-X100中透化，然后以荧光素标记的山羊抗人抗体染色(绿色)，以鬼笔环肽(phalloidin)染色(红色)。细胞核复染为蓝色。绿色染色表示人源化的MP-RM-1#6抗体定位。

结果：在维持于冰上的IR-8人黑素瘤细胞中，hMP-RM-1#6抗体变体定位于细胞膜(绿色环)。将细胞转变为37℃30分钟后，抗体完全定位于细胞内，这表明内化(图16)。使用cMP-RM-1#1,hMP-RM-1#10和hMP-RM-1#20获得了相似的结果(未显示)。

实施例19：嵌合和人源化MP-RM-1抗体变体对于人黑素瘤细胞中ErbB3受体半衰期的效应

材料和方法：IR-8人黑素瘤细胞在含0.2%FBS的RPMI中生长24小时，然后在存在或不存在cMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10或hMP-RM-1#20抗体变体的情况下以10μg/ml的蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)刺激。将细胞裂解并使用抗p-ErbB3特异性抗体通过Western印迹分析p-ErbB3蛋白水平。以抗-AKT重探测同一滤器作为上样对照。

结果：环己酰亚胺刺激的IR-8人黑素瘤细胞暴露于抗体变体使得ErbB3受体半衰期相对于暴露于PBS的对照细胞显著降低(图17)。

实施例20：嵌合和人源化MP-RM-1抗体变体对于人卵巢和胃癌细胞中ErbB3和AKT磷酸化和ErbB3受体下调的效应

材料和方法：(A)OVCAR-8人卵巢癌细胞在含0.2%FBS的RPMI中生长24小时。然后以10μg/mlcMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10或hMP-RM-1#20抗体变体预处理细胞2小时，以10ng/mlNRG-1刺激10分钟。将细胞裂解并使用抗-ErbB3,抗-p-ErbB3,抗-AKT,抗-p-AKT特异性抗体通过Western印迹分析ErbB3,p-ErbB3,AKT,p-AKT水平。(B)MKN-45人胃癌细胞在含0.2%FBS的DMEM中生长24小时。然后将细胞暴露于10μg/mlcMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10或hMP-RM-1#20抗体变体或1μg/ml的MET抑制剂SU112742小时。将细胞裂解并使用抗-p-MET,抗-p-ErbB3和抗-ErbB3特异性抗体通过Western印迹分析p-MET,p-ErbB3和ErbB3水平。以抗-AKT重探测同一滤器作为上样对照。

结果:以抗体变体处理OVCAR-8人卵巢癌细胞抑制了配体诱导的ErbB-3和AKT磷酸化并促进ErbB3受体的下调(图18)。MKN-45细胞显示出配体非依赖性的、MET依赖性的ErbB3受体磷酸化。MP-RM-1抗体变体能够抑制该基础活性(图18)。

实施例21：嵌合和人源化MP-RM-1抗体变体抑制人黑素瘤和胃癌细胞的集落形成能力

材料和方法:1.5x104IR-8人黑素瘤或MKN-45人胃癌细胞悬浮于含有10%FBS的RPMI1640中的0.3%琼脂中，并铺层于6孔板平皿中的2ml0.5%琼脂床上。将细胞在37℃含有5%CO2的潮湿空气中温育。琼脂固化之后，将5-10-20μg/mlcMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10或hMP-RM-1#20抗体变体或PBS加入平皿。每隔一天重复进行处理。在10-16天之后通过光学显微镜测定10倍放大的4个不同显微镜视野中的集落数目。

结果:所示的MP-RM-1抗体变体减少了软琼脂中IR-8和MKN-45集落的数目和尺寸(图19A-B)。条柱代表每个中的集落数目。

实施例22:嵌合和人源化MP-RM-1抗体变体对于人卵巢癌异种移植物的效应

材料和方法:通过将5x10⁶细胞皮下注射于7周龄CD1裸鼠建立OVCAR-8人卵巢癌异种移植物。2天之后，将小鼠随机分为5组，每组10只动物，并腹膜内注射介质(PBS)或20mg/kgcMP-RM-1#1,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#10或hMP-RM-1#20抗体变体，每周2次，持续4周。通过卡尺监测肿瘤体积。误差条代表每组中的SE。箭头表示处理起始(S)和终止(E)。

结果:使用嵌合或人源化抗体变体处理的小鼠的肿瘤异种移植物显著比对照小鼠生长缓慢(P<0.05)(图20)。

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Claims

1.结合ErbB3受体的抗体或其片段，其包含：

(a)SEQIDNO:1编码的重链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少80%，优选90%序列同一性的氨基酸序列；和/或

(b)SEQIDNO:2编码的轻链氨基酸序列或至少其可变结构域或与其具有至少80%，优选90%序列同一性的氨基酸序列。

2.权利要求1的抗体，其中所述抗体与ErbB3的结合减少ErbB3介导的信号转导。

3.权利要求2的抗体，其中所述信号转导的减少是由ErbB3的下调引起的。

4.权利要求2或3的抗体，其具有降低细胞表面上的ErbB3水平的能力。

5.权利要求1-4任一项的抗体，其为多克隆抗体或单克隆抗体，特别是重组抗体，人源化抗体，嵌合抗体，多特异性抗体，特别是双特异性抗体，或其片段。

6.权利要求1-5任一项的抗体，其为Fab片段，Fab'片段，F(ab')片段，Fv片段，diabody，ScFv，SMIP，单链抗体，affibody，avimer，nanobody和/或结构域抗体。

7.权利要求1-6任一项的抗体，其中抗体同种型选自IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgM,IgA1,IgA2,IgAsec,IgD和IgE抗体。

8.权利要求1-7任一项的抗体，其为MP-RM-1，保藏于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSM ACC3018。

9.权利要求1-8任一项的抗体，由杂交瘤细胞系DSM ACC3018或其衍生物产生，并且其优选为人源化抗体。

10.权利要求1-9任一项的抗体，包含至少一个如序列3-14(SEQ IDNO:3-14)所示的序列，优选如序列7-14(SEQ ID NO:7-14)所示的序列。

11.选自下组的抗体：cMP-RM-1#1,cMP-RM-1#2,cMP-RM-1#3,cMP-RM-1#4,hMP-RM-1#5,hMP-RM-1#6,hMP-RM-1#7,hMP-RM-1#8,hMP-RM-1#9,hMP-RM-1#10,hMP-RM-1#11,hMP-RM-1#12,hMP-RM-1#13,hMP-RM-1#14,hMP-RM-1#15,hMP-RM-1#16,hMP-RM-1#17,hMP-RM-1#18,hMP-RM-1#19,hMP-RM-1#20(c：嵌合抗体；h：人源化抗体)。

12.权利要求1-11任一项的抗体，其偶联于标记基团。

13.权利要求1-12任一项的抗体，其偶联于效应子基因。

14.编码权利要求1-13任一项的抗体或抗体片段的核酸，或能够在严格条件下与其杂交的核酸。

15.包含权利要求14的核酸的载体。

16.权利要求15的载体，其为表达载体，并且核酸序列可操作地连接于控制序列。

17.包含权利要求14的核酸或权利要求15或16的载体的宿主细胞。

18.包含权利要求1-13任一项的抗体、权利要求14的核酸、和/或权利要求15或16的载体和优选地药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的药物组合物。

19.权利要求18的组合物，其用于治疗。

20.权利要求18的组合物，其用于诊断。

21.权利要求16-18任一项的组合物，其用于治疗和/或预防过度增殖性疾病，特别是肿瘤疾病或癌症。

22.权利要求21的组合物，其中所述疾病是黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胃肠道/结肠癌、肺癌、肾的透明细胞癌和/或前列腺癌。

23.权利要求18-22任一项的组合物，包含另外的活性剂，例如另外的抗体或抗体片段。

24.权利要求23的组合物，其中所述活性剂是抗肿瘤剂，优选选自抗体、小分子、抗代谢物、烷基化试剂、拓扑异构酶抑制剂、微管靶向试剂、激酶抑制剂、蛋白合成抑制剂、免疫治疗剂、激素或其类似物，和/或mTOR抑制剂。

25.权利要求18-24任一项的组合物，其通过静脉内、肌内和/或皮下施用。

26.权利要求18-25任一项的组合物，其与另外的治疗组合物和/或辐射组合施用。

27.抑制受试者中EGF样配体介导的ErbB3磷酸化的方法，包括向所述受试者施用足以抑制EGF样配体介导的ErbB3磷酸化的量的前述权利要求任一项的抗体或其抗原结合部分。

28.诊断受试者中的与ErbB3相关的癌症的方法，包括

(a)离体或在体内将来自受试者的细胞与前述权利要求任一项的抗体或其抗原结合部分接触，和

29.权利要求27或28的方法，其中所述受试者是人。

30.制备权利要求1-13任一项的抗体的方法，包括从权利要求17的宿主获得抗体的步骤。