CN101014625B

CN101014625B - 新抗-igf-ir抗体及其用途

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Publication number: CN101014625B
Application number: CN2005800251969A
Authority: CN
Inventors: 利莱昂斯·格奇; 纳塔莉·科尔巴兰
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2004-07-29
Filing date: 2005-07-27
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2025-07-27
Also published as: EP2365005A2; MX2007001109A; SV2006002182A; JP2008515773A; NO20071093L; IL229778A0; EP2380912A1; AU2005268505A1; WO2006013472A3; HK1102600A1; EP1771481B1; KR101220635B1; CN101014625A; EP2365005A3; US20120183559A1; AR050036A1; IL181025A0; CN103951752A; US8420085B2; JP2012153692A

Abstract

本发明涉及新抗体，其能够特异性结合人胰岛素样生长因子I受体IGF-IR和/或能够特异性抑制所述IGF-IR的酪氨酸激酶活性，尤其是鼠、嵌合和人源化来源的单克隆抗体，以及编码这些抗体的氨基酸和核酸序列。本发明也包含这些抗体作为用于预防性和/或治疗性处理过表达IGR-IR的癌症或者与所述受体过表达相关的任何疾病的药物的用途，以及这些抗体在诊断与IGF-IR过表达相关疾病的方法或试剂盒中的用途。最后本发明包含产品和/或组合物，其包含这些抗体与抗EGFR抗体和/或抗VEGF抗体和/或抗参与肿瘤进展或转移的其他生长因子的抗体和/或化合物和/或抗癌剂或与毒素偶联的药剂的组合，及其用于预防和/或治疗某些癌症的用途。

Description

新抗-IGF-IR抗体及其用途

被称为IGF-IR的胰岛素样生长因子I受体是已经充分描述的受体，具有与胰岛素受体IR 70％同源性的酪氨酸激酶活性。IGF-IR是分子量约为350,000的糖蛋白。

它是异四聚体受体，其中通过二硫桥连接的每一半由细胞外α-亚基和跨膜β-亚基组成。IGF-IR以非常高亲和力(Kd#1nM)结合IGF1和IGF2，但也能够以低100-1000倍的亲和力结合胰岛素。相反，IR以非常高亲和力结合胰岛素，而IGF仅以低100倍的亲和力结合至胰岛素受体。尽管位于α-亚基的富含半胱氨酸区域和β-亚基C-端部分分别具有较低同源性区段，但是IGF-IR和IR的酪氨酸激酶结构域具有非常高的序列同源性。在α-亚基中观察到的序列差异位于配体结合区段，因此是在IGF-IR和IR分别对IGF和胰岛素的相对亲和力的起源处。β-亚基C-端部分的差异导致两种受体信号途径的分化；IGF-IR介导促有丝分裂、分化和抗凋亡作用，而IR活化主要涉及代谢途径水平的作用(Baserga et al.，Bioehim.Biophys.Acta，1332：F105-126，1997；Baserga R.，Exp.Cell.Res.，253：1-6，1999)。

配体与受体细胞外结构域的结合活化了细胞质酪氨酸激酶蛋白质。激酶活化又涉及刺激不同的细胞内底物，包括IRS-1、IRS-2、Shc和Grb 10(Peruzzi F.et al.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，125：166-173，1999)。IGF-IR的两种主要底物是IRS和Shc，其通过活化大量的下游效应物，介导与IGF附着至该受体相关的大部分生长和分化作用。因此底物可用性可控制与IGF-IR活化相关的最终生物作用。当IRS-1占优势时，细胞趋向增殖和转化。当Shc占优势时，细胞趋向分化(Valentinis B.et al.，J.Biol.Chem.274：12423-12430，1999)。似乎参与抗凋亡保护作用的主要途径是磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3激酶)途径(Prisco M.et al.，Horm.Metab.Res.，31：80-89，1999；Peruzzi F.et al.，J.Cancer Res.Clin.Oncol.，125：166-173，1999)。

近十年中IGF系统在癌症发生中的作用已经成为大量研究的主题。这种兴趣是在发现以下事实之后：除了促有丝分裂和抗凋亡特性以外，建立和维持转化表型似乎也需要IGF-IR。事实上，已经在大量不同的细胞中明确，IGF-IR过量表达或者组成性活化，导致细胞在无胎牛血清的培养基中不依赖于支持物的生长，并导致在裸鼠中形成肿瘤。这本身不是独有性质，因为大量不同的过表达基因的产物可以转化细胞，包括很多的生长因子受体。然而，已经明确证实IGF-IR在转化中主要作用的关键发现已经证实，IGF-IR编码基因已经灭活的R-细胞对通常能转化细胞的不同因子完全有抗性，这些因子如牛乳头瘤病毒的E5蛋白、EGFR或PDGFR的过表达、SV40的T抗原、活化ras或最后两种因子的组合(Sell C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：11217-11221，1993；Sell C.et al.，Mol.Cell.Biol.，14：3604-3612，1994；Morrione A.J.，Virol.，69：5300-5303，1995；Coppola D.et al.，Mol.Cell.Biol.，14：4588-4595，1994；DeAngelis T.et al.，J.Cell.Physiol，164：214-221，1995)。

IGF-IR在大量不同肿瘤和肿瘤系中表达，并且IGF通过其与IGF-IR的附着促进肿瘤生长。IGF-IR在癌症发生中作用的其他争论来自使用抗该受体的鼠单克隆抗体或者使用IGF-IR显性负突变体的研究。实际上，抗IGF-IR的鼠单克隆抗体抑制大量培养细胞系的增殖和体内肿瘤细胞的生长(Arteaga C.et al.，Cancer Res.，49：6237-6241，1989；Li et al.，Biochem.Biophys.Res.Com.，196：92-98，1993；Zia F.et al.，J.Cell.Biol.，24：269-275，1996；Scotlandi K.et al.，Cancer Res.，58：4127-4131，1998)。与之相似在Jiang等人的工作中(Oncogene，18：6071-6077，1999)也已经显示IGF-IR的显性负突变体能够抑制肿瘤增殖。

癌症病理学的特征在于失控的细胞生长。在几种癌中，生长因子特异性结合它们的受体，然后将生长、转化和/或存活信号传递至肿瘤细胞。肿瘤细胞表面上生长因子受体的过表达被大量描述(Salomon D.S.et al.，Crit.Rev.Oncol.Hematol.，1995，19：183；Burrow S.et al.，J.Surg.Oncol.，1998，69：21；Hakam A.et al.，Hum.Pathol.，1999，30：1128；Railo M.J.et al.，Eur.J.Cancer，1994，30：307；Happerfield L.C.et al.，J.Pathol.，1997，183：412)。这种过表达或异常活化导致直接干扰细胞生长调节机制，也可以影响细胞对经典化疗或放疗诱导凋亡的敏感性。

在最近几年间，已经表明用各自的人源化(

)或嵌合(C225)抗体靶向肿瘤细胞表面过表达的生长因子受体如EGFR或Her2/neu，导致患者中肿瘤生长的显著抑制并导致经典化学疗法治疗功效的显著增加(Carter P.，Nature Rev.Cancer，2001，1(2)：118；Hortobagyi G.N.，Semin.Oncol.，2001，28：43；Herbst R.S.et al.，Semin.Oncol，2002，29：27)。在一些临床前研究中，其他受体如IGF-IR或VEGF-R(血管内皮生长因子受体)已经被鉴定为潜在靶标。

更具体而言，IGF-IR是酪氨酸激酶受体的一部分。它显示与胰岛素受体(IR)的高度同源性，所述胰岛素受体存在两种同种型A和B。

在NCBI GenBank中，IR同种型A和B的序列分别注册为登记号X02160和M10051。没有限制的、与IR相关的其他数据在此引入作为参考(Vinten et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：249-252；Belfiore etal.，2002，The Journal of Biological Chemistry，277：39684-39695；Dumesicet al.，2004，The Journal of Endocrinology&Metabolism，89(7)：3561-3566)。

IGF-IR和IR是四聚体糖蛋白，由通过二硫键连接的两个细胞外α-和两个跨膜β-亚基组成。包含配体结合位点的每个α-亚基大约是130-135kDa，而包含酪氨酸激酶结构域的每个β-亚基大约是90-95kDa。这些受体具有超过50％的总体氨基酸序列相似性和在酪氨酸激酶结构域中84％的相似性。在配体结合后，磷酸化受体募集并磷酸化停靠蛋白(dockingprotein)，包括胰岛素受体底物-1蛋白质家族(IRS1)、Gab1和Shc(Avruch，1998，Mol.Cell.Biochem.，182，31-48；Roth et al.，1988，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.53，537-543；White，1998，Mol.Cell.Biochem.，182，3-11；Laviola et al.，1997，J.Clin.Invest.99，830-837；Cheatham et al.，1995，Endocr.Rev.16，117-142)，导致不同细胞内介质的活化。尽管IR和IGF-IR相似地活化主要信号途径，但是两种受体之间在募集某些停靠蛋白和细胞内介质中存在差异(Sasaoka et al.，1996，Endocrinology 137，4427-4434；Nakae et al.，2001，Endocr.Rev.22，818-835；Dupont and LeRoith 2001，Horm.Res.55，Suppl.2，22-26；Koval et al.，1998，Biochem.J.330，923-932)。这些差异是IR活化引起的主要代谢作用的基础、和IGF-IR活化引起的主要促有丝分裂、转化和抗凋亡作用的基础(De Meyts et al.，1995，Ann.N.Y.Acad.Sci.，766，388-401；Singh et al.，2000，Prisco et al.，1999，Horm.Metab.Res.31，80-89；ICido et al.2001，J.Clin.Endocrinol.Metab.，86，972-979)。胰岛素以高亲和力结合至IR(比结合至IGF-IR高100倍)，而胰岛素样生长因子(IGF1和IGF2)以比结合至IR高100倍的亲和力结合至IGF-IR。

人IR存在两种同种型IR-A和IR-B，其由IR基因的选择性剪接产生，其在IRα-亚基的C-端排除或者包括由小外显子(外显子11)所编码的12个氨基酸残基。IR同种型的相对丰度受组织特异性和未知因子调节(Moller et al.，1989，Mol.Endocrinol.，3，1263-1269；Mosthaf et al，1990，EMBO J.，9，2409-2413)。IR-B是在正常成人组织(脂肪组织、肝脏和肌肉)中占优势的IR同种型，所述组织是胰岛素代谢作用的主要靶组织(Moller et al.，1989；Mosthaf et al.，1990)。IR-A是在胎儿组织中占优势的同种型并介导对IGF2应答的胎儿生长(Frasca et al.，1999，Mol.Cell.Biol.，19，3278-3288)，正如在转基因小鼠中实施的遗传研究所提示的(DeChiaraet al.，1990，Nature 345，78-80；Louvi et al.，1997，Dev.Biol.189，33-48)。而且，当细胞转化并变成恶性时，去分化经常与IR-A相对丰度增加相关(Pandini et al.，2002，The Journal of Biological Chemistry，Vol.277，N°42，pp39684-39695)。

基于其高度同源性，胰岛素和IGF-I半受体(由一个α-亚基和一个β-亚基组成)可以异二聚化，导致胰岛素/IGF-I杂合受体(杂合体-R)的形成(Soos et al.，1990，Biochem J.，270，383-390；Kasuya et al.，1993，Biochemistry 32，13531-13536；Seely et al.，1995，Endocrinology 136，1635-1641；Bailyes et al.，1997，Biochem J.327，209-215)。

两种IR同种型都能够与IGF-IR形成杂合体。然而，杂合体-R具有不同的功能特征。杂合体-RsB对IGF1并且尤其是对IGF2的亲和力降低。相反，杂合体-RsA对IGF1具有高亲和力，并且在生理浓度范围内也结合IGF2和胰岛素。杂合体-RsA的表达通过两种不同机制上调IGF系统，i)(以高亲和力)结合IGF1和IGF2并被其活化(对杂合体-RsB这不发生)，ii)胰岛素结合以后活化IGF-IR途径。胰岛素结合杂合体-RsA磷酸化IGF-IR β-亚基并活化IGF-IR-特异性底物(CrkII)，使得杂合体-RsA转换胰岛素至IGF-IR信号传递(Pandini et al.，2002)。

在几种组织中，例如肝、脾或胎盘中，杂合体-R比IGF-IR更具代表性(Bailyes et al.，1997)。当肿瘤组织过表达或者出现异常活化IGF-IR和IR-A时(Frasca et al.，1999；Sciacca et al.，1999，Oncogene 18，2471-2479；Vella et al.，2001，Mol.Pathol.，54，121-124)，杂合体-RsA也可以在多种人恶性肿瘤包括甲状腺和乳癌中过表达，对能对由生理浓度IGF1和/或IGF2以及胰岛素刺激后IGF-IR信号传递类型作出应答的恶性细胞提供选择性生长优势(Bailyes et al.，1997；Pandini et al.，1999，Clin.Cancer Res.，5，1935-1944；Belfiore et al.，1999，Biochimie(Paris)81，403-407；Frasca et al.1999，Sciacca et al.，1999；Vella et al.，2001)。

实现能够同时阻断这两种受体的这种“治疗工具”是特别感兴趣的，因为它们将允许避免在同一肿瘤中IGF-IR和杂合体-R的表达或异常活化所介导的逃逸现象。

关于对IGF-IR更尤其是对能结合或抑制IGF-IR酪氨酸激酶活性的单克隆抗体的增加的兴趣，申请人已经开发并表征了被称为7C10或h7C10(编码F50035)的人源化单克隆抗体。涉及这种抗体及其用途的国际专利申请PCT/FR 03/00178已经提交并在2003年7月24日以公开号WO03/059951公开。该专利申请的内容在此引入作为参考。

本发明的目的是能够具有可用的其他鼠单克隆抗体，优选嵌合或人源化抗体，其将特异性并以高亲和力识别IGF-IR。这些抗体将很少或者根本不与IR相互作用。在IGF1/IGF-IR和IGF2/IGF-IR相互作用期间，通过主要与被活化的信号转导途径相互作用，它们的附着将能够而体外抑制表达IGF-IR的肿瘤生长。对于所有表达IGF-IR的肿瘤，包括乳房的雌激素依赖性肿瘤和前列腺肿瘤，这些抗体能够在体内有活性。

本发明也可以通过产生能够结合至所述两种受体的高亲和力化合物、并更尤其是抗体，联合阻断杂合体-R和IGF-IR活性，并且也可以通过IGF1、IGF2或者胰岛素阻断它们的活化。

本发明也涉及根据本发明的分离抗体或其片段的用途，所述抗体或片段能够结合至i)人IGF-IR，和/或抑制其天然配体优选IGF1和/或IGF2的结合，和/或也能够特异性抑制所述IGF-IR的酪氨酸激酶活性，和/或所述抗体或片段能够结合至ii)杂合体-R，和/或抑制其天然配体优选IGF1、IGF2和/或胰岛素的结合，和/或也能够特异性抑制所述杂合体-R的酪氨酸激酶活性。

根据另一个优选实施方案，所述抗体被用于癌治疗，更特别地用于乳癌治疗。

事实上，已知乳房肿瘤细胞在其表面特异性存在IGF-IR以及大量的胰岛素受体，因此也有大量的杂合体-R(Frasca et al，1999；Sciacca et al.，1999；Vella et al.，2001)。

更具体而言，本发明涉及四种不同的抗-IGF-IR单克隆抗体。

在第一个方面中，本发明的主题是一种分离抗体、或其功能片段之一，所述抗体或其所述片段之一能够特异性结合至人胰岛素样生长因子I受体，并且如果必要，而且优选能够抑制IGF-IR的配体IGF1和/或IGF2的天然附着，和/或能够特异性抑制所述IGF-IR的酪氨酸激酶活性；其特征在于其包含轻链，所述轻链包含选自氨基酸序列SEQ ID Nos.1、2和3的CDR的至少一种互补决定区CDR，或者在与序列SEQ ID Nos.1、2和3最优比对之后其序列至少具有80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的至少一种CDR；或者其特征在于其包含重链，所述重链包含选自氨基酸序列SEQ ID Nos.4、5和6的CDR的至少一种互补决定区CDR，或者在与序列SEQ ID Nos.4、5和6的最优比对之后其序列至少具有80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的至少一种CDR。

在本说明书和相应的实施例中，这种抗体将被称为13F5。

在本说明书中，术语“结合”和“附着”具有相同含意并且是可以互换的。

在本说明书中，术语附着至抗体化合物或其序列的多肽、多肽序列、肽和蛋白质是可以互换的。

必须理解本发明不涉及天然形式的抗体，即是说，它们不是在其天然环境中，但是它们已经能够通过从天然来源中纯化而分离或获得，或者也可通过基因重组或化学合成获得，并且然后它们能够包含将进一步描述的非天然氨基酸。

CDR区或CDR意思是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如Kabatet al.所定义(Kabat et al.，Sequences of proteins of immunological interest，5th Ed.，U.S.Department of Health and Human Services，NIH，1991，以及以后版本)。存在三种重链CDR和三种轻链CDR。根据情况，本文所用术语CDR或CDRs是为了指示这些区域之一、或者这些区域的几个或者甚至全部，所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力而负责结合的大部分氨基酸残基。

对本发明来说，两种核酸或者氨基酸序列间的“一致性百分数”是指，在最佳比对(最优比对)后所获得的、待比较的两序列之间相同核苷酸或相同氨基酸残基的百分数，该百分数是纯粹统计学的并且两种序列间的差异随机分布并覆盖其全长。两种核酸或者氨基酸序列之间的序列比较通常是在以最优方式使它们匹配以后，通过比较这些序列而进行，所述比较能够通过区段或者通过“比较窗”实施。除了能够手工实施外，用于比较序列的最优比对，还能够通过Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2：482]的局部同源性算法、通过Neddleman和Wunsch的(1970)[J.MoI.Biol.48：443]局部同源性算法、通过Pearson和Lipman的(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)相似性搜索方法、通过使用这些算法的计算机软件实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA in the WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI，或者通过BLAST N or BLAST P比较软件)。

通过比较以最优方式匹配的两种序列，并且其中待比较核酸或氨基酸序列可以针对这两种序列间最优匹配的参考序列包含添加或者缺失，从而确定两种核酸或者氨基酸序列之间的一致性百分数。一致性百分数如下计算：通过确定两种序列间核苷酸或者氨基酸残基相同的一致性位置的数目，通过将该一致性位置数目除以“比较窗”中的总位置数并将所得结果乘以100，而获得这两种序列之间的一致性百分数。

例如，可以使用BLAST程序，“BLAST 2sequences”(Tatusova et al.，″Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences″，FEMS Microbiol Lett.174：247-250)，该程序可以从网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html获得，参数使用默认值(尤其是对于参数“open gap penalty”：5，和“extension gap penalty”：2；所选择矩阵为例如该程序建议的矩阵“BLOSUM 62”)，通过该程序直接计算待比较的两种序列间的一致性百分数。

通过与参考氨基酸序列具有至少80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的氨基酸序列，优选那些相对于参考序列具有某些修饰的序列，尤其是至少一个氨基酸的缺失、添加或替换、截短或延长。在替换一或多个连续或不连续氨基酸的情况下，优选用“等同”氨基酸替代被替换的氨基酸。表述“等同氨基酸”在此意思是指能够被基本结构的氨基酸之一所替换的任何氨基酸，然而，所述基本结构的氨基酸基本上不改变相应抗体的生物活性，并且例如将稍后定义，尤其是在实施例中。这些等同氨基酸可以通过根据与它们所替代氨基酸的结构同源性来确定，或者根据不同抗体之间生物活性的可实施比较试验结果来确定。

作为实例，需要提及的是可以实施而不导致相应修饰抗体生物活性的深度修饰的替换的可能性。从而，可以用缬氨酸或异亮氨酸替代亮氨酸、谷氨酸替代天冬氨酸、天冬酰胺替代谷氨酰胺、赖氨酸替代精氨酸等，在相同条件下进行反向替换自然是可以想到的。

在第二个方面，本发明的主题是一种分离抗体、或其功能片段之一，所述抗体或其所述片段之一能够特异性结合至人胰岛素样生长因子I受体并且，如果必要，而且优选能够抑制IGF-IR的配体IGF1和/或IGF2的天然附着，和/或能够特异性抑制所述IGF-IR的酪氨酸激酶活性；其特征在于其包含轻链，所述轻链包含选自氨基酸序列SEQ ID Nos.7、8和9的CDR的至少一种互补决定区CDR，或者在与序列SEQ ID Nos.7、8和9最优比对之后其序列至少具有80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的至少一种CDR；或者其特征在于其包含重链，所述重链包含选自氨基酸序列SEQ ID Nos.10、11和12的CDR的至少一种互补决定区CDR，或者在与序列SEQ ID Nos.10、11和12的最优比对之后其序列至少具有80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的至少一种CDR。

在以下的说明书中，这种抗体将被称为12D5。

在第三个方面中，本发明的主题是一种分离抗体、或其功能片段之一，所述抗体或其所述片段之一能够特异性结合至人胰岛素样生长因子I受体并且，如果必要，而且优选能够抑制IGF-IR的配体IGF1和/或IGF2的天然附着，和/或能够特异性抑制所述IGF-IR的酪氨酸激酶活性；其特征在于其包含轻链，所述轻链包含选自氨基酸序列SEQ ID Nos.13、14和15的CDR的至少一种互补决定区CDR，或者在与序列SEQ ID Nos.13、14和15最优比对之后其序列至少具有80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的至少一种CDR；或者其特征在于其包含重链，所述重链包含选自氨基酸序列SEQ ID Nos.16、17和18的CDR的至少一种互补决定区CDR，或者在与序列SEQ ID Nos.16、17和18的最优比对之后其序列至少具有80％、优选85％、90％、95％和98％一致性的至少一种CDR。

在以下的说明书中，这种抗体将被称为2D10。

最后，在另一个方面中，本发明的主题是一种分离抗体或其功能片段之一，所述抗体或其所述功能片段能够特异性结合至人胰岛素样生长因子I受体并且，如果必要，而且优选能够抑制IGF-IR的配体IGF1和/或IGF2的天然附着，和/或能够特异性抑制所述IGF-IR的酪氨酸激酶活性，其特征在于其由被称为21E3的抗体组成并且如下文所述在CNCM注册。

根据本发明的抗体，即13F5、12D5、2D10和21E3优选是特异性单克隆抗体，尤其是鼠、嵌合或者人源化来源，本领域技术人员可以根据公知的标准方法获得这些单克隆抗体。

通常，为了制备单克隆抗体或其功能片段，尤其是鼠源的单克隆抗体或其功能片段，可以参考尤其描述在手册“Antibodies”中的技术(Harlowand Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor NY，pp.726，1988)或者参考Kohler和Milstein描述的从杂交瘤细胞制备的技术(Nature，256：495-497，1975)。

例如，可以从抗IGF-IR或其片段免疫的动物细胞中获得根据本发明的单克隆抗体，所述片段包含被根据本发明的所述单克隆抗体特异性识别的表位。所述IGF-IR或其所述片段之一尤其可以根据常规工作方法来制备，通过从编码IGF-IR的cDNA序列中所含核酸序列开始的基因重组，或者通过从IGF-IR肽序列中所含氨基酸序列开始的肽合成。

根据本发明的单克隆抗体例如可以在亲和柱上纯化，已经预先在所述亲和柱上固定了IGF-IR或其包含可被根据本发明所述单克隆抗体特异性识别的表位的片段之一。更具体而言，所述单克隆抗体可以如此纯化，通过蛋白质A和/或G色谱，接或不接目的在于消除残留蛋白质污染物以及DNA和LPS的离子交换色谱，其本身接或不接在Sepharose凝胶上的排阻色谱以消除由于二聚体或其他多聚体存在而潜在的聚集体。在更优选的方式中，全部这些技术可以同时或者连续使用。

相似地，嵌合或人源化抗体也被包括在根据本发明的抗体中。

嵌合抗体，其意思是指包含来源于给定物种的天然可变(轻链和重链)区的抗体，并与另一物种抗体的轻链和重链恒定区相组合，所述另一物种对所述给定物种是异源的。

通过使用基因重组技术可以制备根据本发明的嵌合类型抗体或其片段。例如，所述嵌合抗体可以通过克隆重组DNA来生产，所述重组DNA包含启动子和编码根据本发明的非人尤其是鼠单克隆抗体可变区的序列、以及编码人抗体恒定区的序列。由这种重组基因编码的本发明嵌合抗体将是，例如，鼠-人嵌合体，该抗体的特异性由来源于鼠DNA的可变区确定，并且其同种型由来源于人DNA的恒定区来确定。对于制备嵌合抗体的方法，例如，可以参考文件Verhoeyn et al.(BioEssays，8：74，1988)。

人源化抗体，意思是指一种抗体，其包含来源于非人源抗体的CDR区、并且该抗体分子的其他部分来源于一种(或几种)人抗体。而且，为了保留结合亲和力，可以修饰骨架(称为FR)区段的一些残基(Jones et al.，Nature，321：522-525，1986；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536，1988；Riechmann et al.，Nature，332：323-327，1988)。

通过本领域技术人员已知的技术可以制备根据本发明的人源化抗体或其片段(例如，描述于文件Singer et al.，J.Immun.150：2844-2857，1992；Mountain et al.，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10：1-142，1992；或Bebbington et al.，Bio/Technology，10：169-175，1992)。根据本发明的这些抗体优选用于体外诊断方法、或者体内预防性和/或治疗性处理。

根据本发明的抗体的功能片段，意思尤其是指抗体片段如Fv、scFv(sc指单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半寿期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab′)2-PEG或Fab′-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)，所述片段具有至少一种根据本发明序列SEQ ID Nos.1-6、7-12或13-18的特征性CDR，并且尤其是其特征在于其能够以通常方式发挥其来源抗体的即使部分活性，例如尤其是识别并结合至IGF-IR的能力以及必要时抑制IGF-IR活性的能力。

优选地，所述功能片段将由其来源抗体的重或轻可变链的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于IGF-IR，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种功能片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。

优选这些功能片段将是Fv、scFv、Fab、F(ab′)2、F(ab′)、scFv-Fc类型的片段或者双抗体，其通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。根据本发明，通过诸如酶消化如胃蛋白酶或者木瓜蛋白酶的方法，和/或通过化学还原切割二硫键，从上述抗体中获得本发明的抗体片段。在另一种方式中，可以通过本领域技术人员熟知的基因重组技术，或者通过例如由公司Applied Biosystems等提供的自动肽合成仪进行肽合成，获得包含在本发明中的抗体片段。

更具体而言，本发明包含通过基因重组或者通过化学合成获得的、根据本发明的抗体或其功能片段，尤其是嵌合或者人源化抗体。

根据第一种方法，将通过重链序列定义抗体。

在第一个优选方式中，本发明涉及根据本发明的抗体或其功能片段之一，其特征在于其包含重链，所述重链包含三种CDR中的至少两种或者序列SEQ ID Nos.4-6的三种CDR，或者三种CDR中的至少两种或者在最优比对后与序列SEQ ID Nos.4-6分别具有至少80％一致性的三种CDR。

在第二个优选方式中，本发明涉及根据本发明的抗体或其功能片段之一，其特征在于其包含重链，所述重链包含三种CDR中的至少两种或者序列SEQ ID Nos.10-12的三种CDR，或者三种CDR中的至少两种或者在最优比对后与序列SEQ ID Nos.10-12分别具有至少80％一致性的三种CDR。

在第三个优选方式中，本发明涉及根据本发明的抗体或其功能片段之一，其特征在于其包含重链，所述重链包含三种CDR中的至少两种或者序列SEQ ID Nos.16-18的三种CDR，或者三种CDR中的至少两种或者在最优比对后与序列SEQ ID Nos.16-18分别具有至少80％一致性的三种CDR。

根据第二种方法，现将通过轻链序列定义抗体。

在同样优选的第一个实施方式中，根据本发明的抗体或其功能片段之一的特征在于其包含轻链，所述轻链包含至少一种CDR，其选自序列SEQID Nos.1-3的CDR、或者在最优比对后其序列与序列SEQ ID Nos.1-3具有至少80％一致性的CDR。

在第二个实施方式中，根据本发明的抗体或其功能片段之一的特征在于其包含轻链，所述轻链包含至少一种CDR，其选自序列SEQ ID Nos.7-9的CDR、或者在最优比对后其序列与序列SEQ ID Nos.7-9具有至少80％一致性的CDR。

在第三个实施方式中，根据本发明的抗体或其功能片段之一的特征在于其包含轻链，所述轻链包含至少一种CDR，其选自序列SEQ ID Nos.13-15的CDR、或者在最优比对后其序列与序列SEQ ID Nos.13-15具有至少80％一致性的CDR。

根据第三种方法，现将通过轻链序列和重链序列定义抗体。

在第一个优选方式中，根据本发明的抗体或其功能片段之一，其特征在于其包含重链，所述重链包含序列SEQ ID Nos.4-6的三种CDR、或者在最优比对后与序列SEQ ID Nos.4-6具有至少80％一致性的三种CDR，并且其特征在于其还包含轻链，所述轻链包含序列SEQ ID Nos.1-3的三种CDR、或者在最优比对后与序列SEQ ID Nos.1-3具有至少80％一致性的三种CDR。

在第二个优选方式中，根据本发明的抗体或其功能片段之一，其特征在于其包含重链，所述重链包含序列SEQ ID Nos.10-12的三种CDR、或者在最优比对后与序列SEQ ID Nos.10-12具有至少80％一致性的三种CDR，并且其特征在于其还包含轻链，所述轻链包含序列SEQ ID Nos.7-9的三种CDR、或者在最优比对后与序列SEQ ID Nos.7-9具有至少80％一致性的三种CDR。

在第三个优选方式中，根据本发明的抗体或其功能片段之一，其特征在于其包含重链，所述重链包含序列SEQ ID Nos.16-18的三种CDR、或者在最优比对后与序列SEQ ID Nos.16-18具有至少80％一致性的三种CDR，并且其特征在于其还包含轻链，所述轻链包含序列SEQ ID Nos.13-15的三种CDR、或者在最优比对后与序列SEQ ID Nos.13-15具有至少80％一致性的三种CDR。

在另一个优选实施方案中，根据本发明并被称为13F5的抗体或其功能片段之一，特征在于其包含序列含氨基酸序列SEQ ID No.20的重链，并且其还包含序列含氨基酸序列SEQ ID No.19的轻链。

在另一个优选实施方案中，根据本发明并被称为12D5的抗体或其功能片段之一，特征在于其包含序列含氨基酸序列SEQ ID No.22或23的重链，以及其还包含序列含氨基酸序列SEQ ID No.21的轻链。

在另一个优选实施方案中，根据本发明并被称为2D10的抗体或其功能片段之一，特征在于其包含序列含氨基酸序列SEQ ID No.25的重链，以及其还包含序列含氨基酸序列SEQ ID No.24的轻链。

作为本发明的部分，另一种可能性是一种抗体，其中重链的三种CDR随机选自各自13F5、12D5和2D10的CDR，并且其中轻链的三种CDR也随机选自各自13F5、12D5和2D10的CDR。

根据另一个方面，本发明的主题是根据本发明的抗体或其功能片段之一，其特征在于其不附着或者不以显著方式附着至人胰岛素受体IR。

在一个优选的方式中，根据本发明的所述功能片段将选自片段Fv、scFv、Fab、(Fab′)2、Fab′、scFv-Fc或者双抗体，或者可以通过化学修饰、尤其通过聚乙二醇化、或者通过掺入到脂质体中应可以增加半寿期的任何功能片段。

根据另一个方面，本发明涉及能够分泌根据本发明的单克隆抗体的鼠杂交瘤，尤其是例如存放在Centre National de Culture De Microorganisme(CNCM，国家微生物培养物中心)(Institut Pasteur，Paris，France)的鼠源杂交瘤。

本文被称为13F5的单克隆抗体或其功能片段之一当然是本发明的部分，其特征在于通过在2004年3月25日以编号CNCM I-3193存放在CNCM的杂交瘤分泌所述抗体。该杂交瘤是由免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系的细胞融合(Sp20Agl4)所得的鼠杂交瘤。

本文被称为12D5的单克隆抗体或其功能片段之一当然是本发明的部分，其特征在于通过在2004年4月8日以编号CNCM I-3195存放在CNCM的杂交瘤分泌所述抗体。该杂交瘤是由免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系(Sp20Agl4)的细胞融合所得的鼠杂交瘤。

本文被称为2D10的单克隆抗体或其功能片段之一当然是本发明的部分，其特征在于通过在2004年5月13日以编号CNCM I-3214存放在CNCM的杂交瘤分泌所述抗体。该杂交瘤也是由免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系(Sp20Agl4)的细胞融合获得的鼠杂交瘤。

本文被称为21E3的单克隆抗体或其功能片段之一当然是本发明的部分，其特征在于通过在2004年7月1日以编号CNCM I-3249存放在CNCM的杂交瘤分泌所述抗体。该杂交瘤也是由免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系的细胞融合(Sp20Agl4)的鼠杂交瘤。

根据一个同样具体的方面，本发明涉及根据本发明的嵌合抗体或其功能片段之一，其特征在于所述抗体还包含来源于对小鼠为异源物种尤其是人的抗体的轻链和重链恒定区，并且在一种优选方式中，其特征在于来源于人抗体的轻链和重链恒定区分别是κ和γ-1、γ-2或γ-4区。

根据一个新的方面，本发明涉及分离核酸，其特征在于其选自以下的核酸：

a)编码根据本发明的抗体或其功能片段之一的核酸，DNA或者RNA；

b)如a)中定义核酸的互补核酸。

核酸、核序列或核酸序列、多核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸序列、核苷酸序列，这些术语将在本发明中无差异地使用，意思是指准确连接的核苷酸，其被修饰或未被修饰，其允许定义核酸片段或区域，包含或不包含非天然核苷酸，并且能够对应双链DAN、单链DNA以及所述DNA的转录产物。

这里也必须应该理解，本发明不涉及在天然染色体环境即是说天然状态中的核苷酸序列。本发明涉及已经被分离和/或纯化的序列，即是说所述序列已经被直接或间接选择，例如通过拷贝，它们的环境至少已经被部分改变。从而，本发明也旨在指示通过例如宿主细胞的基因重组或者化学合成所获得的分离核酸。

在高严谨度条件下的杂交表示选择温度条件和离子强度条件，使得它们允许维持两个互补DNA片段之间的杂交。作为实例，对于定义上述多核苷酸片段目的的杂交步骤的高严谨度条件，有利地是以下条件。

以两个步骤实施DNA-DNA或者DNA-RNA杂交：(1)在42℃下，在含5x SSC(1x SSC对应0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、10x Denhardt′s、5％硫酸葡聚糖和1％鲑精DNA的磷酸缓冲液(20mM，pH 7.5)中预杂交3小时；(2)在取决于探针大小的温度下实际杂交20小时(即：对于探针大小＞100个核苷酸，42℃)，接着在20℃在2x SSC+2％SDS中洗涤20分钟进行2次，在0.1x SSC+0.1％SDS中洗涤20分钟进行1次。对于探针大小＞100个核苷酸在60℃下，在0.1x SSC+0.1％SDS中进行30分钟的最后洗涤。根据Sambrook et al.的教导(1989，Molecular cloning：a laboratory manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor)，对于更大或更小的寡核苷酸，上述对于确定大小多核苷酸的高严谨度杂交条件可以被本领域技术人员进行适应性修改。

本发明同样涉及包含根据本发明核酸的载体。

本发明目的尤其在于包含根据本发明核苷酸序列的克隆和/或表达载体。

根据本发明的载体优选包含允许在确定的宿主细胞中表达和/或分泌所述核苷酸序列的元件。因此所述载体必须包含启动子、翻译起始和终止信号、以及适当的转录调节区。它必须能够以稳定方式在宿主细胞中维持，并且能任选地具有指定所翻译蛋白质分泌的特定信号。作为所用宿主细胞的函数，由本领域技术人员选择和优化这些不同元件。为此，根据本发明的核苷酸序列可以被插入所选宿主的自主复制载体中，或者是所选宿主的整合载体。

这些载体由本领域技术人员通过当前使用的方法制备，并且通过标准方法可将所得克隆导入适当宿主中，所述标准方法例如脂转染、电穿孔、热休克、或者化学方法。

根据本发明的载体例如是质粒或病毒来源的载体。它们可用于转化宿主细胞，以克隆或表达根据本发明的核苷酸序列。

本发明也包含用根据本发明的载体转化或者包含根据本发明的载体的宿主细胞。

宿主细胞可以选自原核或者真核系统，例如细菌细胞以及酵母细胞或者动物细胞尤其是哺乳动物细胞。也可以使用昆虫细胞或者植物细胞。

本发明也涉及动物，人除外，其包含至少一种根据本发明转化的细胞。

根据另一个方面，本发明的主题是生产根据本发明的抗体或其功能片段之一的方法，其特征在于其包含以下步骤：

a)在培养基和适当培养条件下培养根据本发明的宿主细胞；和

b)回收从培养基或者所述培养细胞中开始产生的所述抗体或其功能片段之一。

根据本发明转化的细胞可以被用于根据本发明制备重组多肽的方法。根据本发明以重组方式制备多肽的方法本身被包含在本发明中，所述方法特征在于其利用根据本发明的载体和/或由载体转化的细胞。优选在允许表达所述多肽的条件下培养由根据本发明的载体转化的细胞并回收所述重组肽。

正如所说，宿主细胞可以选自原核或者真核系统。具体而言，可以鉴定根据本发明的核苷酸序列，辅助在这些原核或真核系统中的分泌。因此，携带这种序列的根据本发明载体可以有利地被用于生产旨在被分泌的重组蛋白质。对此，这些感兴趣重组蛋白质的纯化将受益于以下事实：它们存在于细胞培养物的上清液中而不是在宿主细胞内部。

也可以通过化学合成制备根据本发明的多肽。这种制备方法也是本发明的主题。本领域技术人员已知化学合成方法，例如使用固相的技术(尤其见Steward et al.，1984，Solid phase peptide synthesis，Pierce Chem.Company，Rockford，111，2nd ed.)或者使用部分固相的技术、通过片段缩合或者通过经典的溶液中合成。通过化学合成获得并能够包含相应非天然氨基酸的多肽同样也包含在本发明中。

通过根据本发明的方法能够获得的抗体或其功能片段之一同样包含在本发明中。

根据第二个实施方案，本发明涉及根据本发明如上进一步描述的抗体，其特征在于其还能够特异性结合至人表皮生长因子受体EGFR，和/或能够特异性抑制所述EGFR的酪氨酸激酶活性。

本发明也涉及药用组合物，其以活性成分的方式包含由根据本发明的抗体或其功能片段之一组成的化合物，优选与赋形剂和/或药用可接受的载体混合。

本发明的另一个补充实施方案是如上述的组合物，作为同时、分开或依次使用的组合产品，其还包含细胞毒性剂/细胞静止剂和/或分别对应于IGF-I和/或EGF受体的酪氨酸激酶活性的抑制剂。

“同时使用”被理解为意指在单个和同一药物形式中施用根据本发明组合物的两种化合物。

“分开使用”被理解为意指在同时、在不同的药物形式中施用根据本发明组合物的两种化合物。

“依次使用”被理解为意指各自在不同的药物形式中依次施用根据本发明组合物的两种化合物。

在常用方式中，根据本发明的组合物显著增加癌症治疗的功效。换句话说，通过施用细胞毒性剂，根据本发明的抗-IGF-IR抗体的治疗作用以出乎意料的方式被增强。根据本发明的组合物产生的另一个主要的相应优点涉及使用较低功效剂量的活性成分的可能性，其允许避免或者降低次要作用出现的风险，尤其是细胞毒性剂的作用。

另外，根据本发明的这种组合物允许更快获得期望的治疗效果。

在一个特别优选的实施方案中，所述组合物作为根据本发明的组合产品，其特征在于所述细胞毒性剂/细胞静止剂选自与DNA相互作用的药剂、抗代谢物、拓扑异构酶I或II抑制剂，或者纺锤体抑制剂或稳定剂，或者可被用于化学治疗的任何药剂。这些细胞毒性剂/细胞静止剂，对于前述类型细胞毒性剂的每一种，例如在VIDAL 2001版中在癌学和血液学栏“细胞毒性剂”相关化合物的页面中被引用，本文引用参考该文件所引用的这些细胞毒素化合物作为优选的细胞毒性剂。

在一个特别优选的实施方案中，所述组合物作为根据本发明的组合产品，其特征在于所述细胞毒性剂被化学偶联到所述抗体用于同时使用。

在一个特别优选的实施方案中，根据本发明的所述组合物特征在于所述细胞毒性剂/细胞静止剂选自纺锤体抑制剂或者稳定剂，优选长春瑞滨(vinorelbine)和/或长春氟宁(vinflunine)和/或长春新碱(vincristine)。

为了促进所述细胞毒性剂和根据本发明的所述抗体之间的偶联，尤其可以将间隔分子引入待偶联的两种化合物之间，如聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇、或者氨基酸，或者在另一个实施方案中，使用所述细胞毒性剂的活性衍生物，其中应当已经导入能够与根据本发明所述抗体反应的功能。这些偶联技术对本领域技术人员是公知的，并且将不在本说明书中详述。

在另一个优选实施方案中，IGF-I受体的酪氨酸激酶活性的所述抑制剂选自衍生的天然剂、双苯胺基苯邻二甲酰亚胺(dianilinophthalimides)、吡唑并或吡咯并吡啶并嘧啶、也或quinaziline。这些抑制剂对于本领域技术人员是熟知的并且描述于文献中(Ciardiello F.，Drugs 2000，Suppl.1，25-32)。

根据本发明另一个实施方案，如上述的组合物也可以包含另一种抗-HER2/neu受体细胞外结构域的抗体化合物，作为用于同时、分开或者依次使用的组合产品，其旨在预防和治疗癌症，尤其是过表达所述HER2/neu受体和受体IGF-IR的癌症，例如尤其是乳癌。

尤其可以参考Albanell et al.(J.of the National Cancer Institute，93(24)：1830-1831，2001)和Lu et al.(J.of the National Cancer Institute，93(24)：1852-1857，2001)的出版物，其支持将抗-HER2/neu抗体与根据本发明的抗-IGF-IR抗体相组合的意外兴趣。

在一种具体方式中，根据本发明组合物的所述抗-HER2/neu抗体是被称为Trastuzumab(也被称为Herceptin)的抗体。

在另一个方面中，本发明涉及一种组合物，其特征在于一种、至少一种所述抗体或其功能片段之一与细胞毒性剂和/或放射性元素偶联。

优选所述毒素或者所述放射性元素能够抑制表达IGF-IR的细胞的至少一种细胞活性，在更优选的方式中，能够阻止所述细胞的生长或者增殖，尤其是能够完全灭活所述细胞。

还优选，所述毒素是肠细菌毒素，尤其是假单胞菌外毒素A。

优选与所用抗体偶联用于治疗的放射性元素(或者放射性同位素)是发射γ射线的放射性同位素，并且优选碘¹³¹、钇⁹⁰、金¹⁹⁹、钯¹⁰⁰、铜⁶⁷、铋²¹⁷、和锑²¹¹。发射β和α射线的放射性同位素也可以用于治疗。

与根据本发明至少一种抗体或其功能片段之一偶联的毒素或者放射性元素，意思是指允许所述毒素或者所述放射性元素结合至所述至少一种抗体的任何方式，尤其是通过两种化合物间的共价偶联，可以引入或不引入连接分子。

在允许以化学(共价)、静电或者非共价方式结合偶联物的全部或部分组分的试剂中，尤其要提及的是苯醌、碳二亚胺并且更尤其是EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]-碳二亚胺盐酸盐)、二马来酰亚胺、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)、N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、具有一个或多个可与紫外线(U.V.)反应的叠氮苯基团的桥联剂，并优选N-[-4-(叠氮基水杨基氨基)丁基]-3’-(2’-吡啶基二硫代)-丙酰胺(APDP)、N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、6-肼基-烟酰胺(HYNIC)。

另一种形式的偶联，尤其对于放射性元素而言，可以存在于使用双功能离子螯合剂。

在这些螯合剂中，可以提及来源于EDTA(乙二胺四乙酸)或者DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)的螯合剂，其已经被开发用于结合金属尤其是放射性金属、和免疫球蛋白。因此，为了增加配体金属络合物的稳定性和刚度，可以在碳链上用不同基团取代DTPA及其衍生物(Krejcarek etal.，1977；Brechbiel et al.，1991；Gansow，1991；US patent 4,831,175)。

例如，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)及其衍生物，其已经以游离形式或者以与金属离子络合物的形式长期广泛用于医药和生物学中，具有与金属离子形成稳定螯合物的显著特性并且能与治疗或诊断兴趣的蛋白质如抗体偶联，以开发用于癌症治疗的放射性免疫偶联物(Meases et al.，1984；Gansow et al.，1990)。

同样优选，根据本发明形成所述偶联物的所述至少一种抗体选自其功能片段，尤其是截除其Fc部分的片段、如scFv片段。

本发明还包含根据本发明的组合物用于制备药物的用途。

更具体而言，根据另一个实施方案，本发明涉及抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备药物的用途，所述药物旨在预防或者治疗由IGF-I受体的过表达和/或异常活化所诱导的疾病、和/或与由1-IGF1或IGF2与IGF-IR相互作用所介导的信号转导途径的过度活化相关的疾病。

优选地，根据本发明的所述用途，其特征在于施用所述药物不诱导或者仅仅诱导与胰岛素受体IR抑制有关的轻微次级作用，即是说，由于存在所述药物抑制IR与其天然配体的相互作用，尤其是通过与所述药物与IR附着相关的竞争性抑制。

本发明还包含根据本发明的抗体优选人源化抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备药物的用途，所述药物旨在抑制正常细胞向具有肿瘤特征细胞的转化，所述肿瘤细胞优选具有IGF-依赖性、尤其是IGF1-和/或IGF2-依赖性。

本发明也涉及根据本发明的抗体优选人源化抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备药物的用途，所述药物旨在抑制肿瘤细胞生长和/或增殖，所述肿瘤细胞优选具有IGF-依赖性，尤其是IGF1-和/或IGF2-依赖性。

在通常方式中，本发明的一个主题是根据本发明的抗体优选人源化抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备药物的用途，所述药物旨在预防或者治疗癌症，所述癌症优选表达IGF-IR和/或优选具有通过IGF1或IGF2与IGF-IR相互作用所介导信号转导途径的过度活化，例如IRS1的过量表达。

本发明的一个主题也是根据本发明的抗体优选人源化抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备旨在预防或者治疗牛皮癣的药物的用途，所述牛皮癣的表皮过度增殖可以与IGF-IR的表达或过表达有关，和/或与IGF-IR与其天然配体相互作用所介导信号转导途径的过度活化有关(Wraight CJ.et al.，Nat.Biotechnol.，2000，18(5)：521-526.通过胰岛素样生长因子I受体反义寡核苷酸逆转牛皮癣中的表皮过度增殖)。在另一个实施方案中，本发明的一个目的是根据本发明的抗体优选人源化抗体或其功能片段之一、和/或组合物用于制备旨在预防或者治疗动脉粥样硬化的药物的用途。

在可以预防和/或治疗的癌症中，优选前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌或者结肠癌或者过表达IGF-IR的任何其他癌症。

根据另一个方面，本发明的一个主题是与IGF-I受体过表达或低表达、优选过表达、相关的疾病诊断方法，优选体外诊断方法，所述IGF-I受体来源于被怀疑异常存在IGF-I受体的生物样品，其特征在于所述生物样品与根据本发明的抗体或其功能片段之一相接触，如果必要，所述抗体可以被标记。

优选地，在所述诊断方法中与IGF-I过表达相关的疾病是癌症。

在另一个具体实施方案中，根据本发明的抗体也能够用于治疗、预防和/或诊断与不仅IGF-IR过表达而且杂合体-R过表达相关的疾病。

更具体而言，根据本发明的抗体特征在于其也能够结合杂合体-R、同种型A和/或B，并能抑制其天然配体的结合，优选此处指定IGF1和/或IGF2和/或胰岛素，和/或能够特异性抑制所述杂合体-R的酪氨酸激酶活性。

所述抗体或其功能片段之一可以免疫偶联物或者标记抗体的形式存在，以便获得可检测和/或可定量的信号。

根据本发明的标记抗体或其功能片段包括，例如被称为免疫偶联物的抗体，例如其可以偶联酶或分子，所述酶例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、α-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖淀粉酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶或者葡萄糖6-磷酸脱氢酶，所述分子例如生物素、地高辛或者5-溴脱氧尿苷。荧光标记物也可以偶联至根据本发明的抗体或其功能片段，并且尤其包括荧光素及其衍生物、荧光染料、罗丹明及其衍生物、GFP(GFP指“绿色荧光蛋白”)、丹磺酰基、伞形酮等。在这些偶联物中，本领域技术人员可以通过已知方法制备本发明的抗体或其功能片段。它们可以被直接偶联到酶或荧光标记物，或者通过间隔基团或连接基团介导，例如聚醛如戊二醛、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，或存在偶联剂如上面提及用于治疗性偶联物的偶联剂。含荧光素类型标记的偶联物可以通过与异硫氰酸酯反应制备。

其他偶联物也可以包括化学发光标记如鲁米诺、二氧杂环丁烷类(dioxetanes)，生物发光标记如萤光素酶和萤光素，也或者放射性标记如碘¹²³、碘¹²⁵、碘¹²⁶、溴⁷⁷、锝^99m、铟¹¹¹、铟^113m、镓⁶⁷、镓⁶⁸、钌⁹⁵、钌⁹⁷、钌¹⁰³、钌¹⁰⁵、汞¹⁰⁷、汞²⁰³、铼^99m、铼¹⁰¹、铼¹⁰⁵、钪⁴⁷、碲^121m、碲^122m、碲^125m、铥¹⁶⁵、铥¹⁶⁷、铥¹⁶⁸、氟¹⁸、钇¹⁹⁹、碘¹³¹。通过直接或者通过螯合剂如上面提及的EDTA、DTPA，本领域技术人员已知的将治疗性放射性同位素偶联至抗体上的现有方法可用于在诊断中可用的放射性元素。还可以提及的是通过氯胺T方法用Na[I¹²⁵]标记[Hunter W.M.andGreenwood F.C.，1962，Nature 194：495]，也或者通过Crockford et al.的技术用锝^99m标记(US patent 4,424,200)，或者如Hnatowich所述通过DTPA附着(US patent 4,479,930)。

因此，根据本发明的抗体或其功能片段可以用于检测和/或定量生物样品中IGF-I受体的过表达或表达不足、优选过表达的方法，其特征在于其包含以下步骤：

a)将根据本发明的抗体或其功能片段与生物样品接触；和

b)证明可能形成的IGF-IR/抗体复合物。

在一个具体实施方案中，根据本发明的抗体或其功能片段可以用于检测和/或定量生物样品中的IGF-I受体的方法，用于监测IGF依赖性癌症或者牛皮癣或粥样硬化的预防和/或治疗性处理的功效。

更通常地，根据本发明的抗体或其功能片段可以有利地用于必须以定性和/或定量方式观察IGF-I受体表达的任何情况中。

优选地，生物样品由生物流体形成，例如人来源的血清、全血、细胞、组织样品或者活组织检查样品。

为了实施这种检测和/或给药，可以使用任何方法或者常规测试。所述测试可以是竞争或者三明治测试，或者是本领域技术人员已知的依赖于抗体-抗原型免疫复合物形成的任何测试。根据本发明施用以后，抗体或其功能片段之一可以被固定或者标记。可以在本领域技术人员已知的很多支持物上实施固定。这些支持物尤其可以包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、或者天然或修饰细胞。这些支持物可以是可溶或者不可溶的。

作为实例，一种优选方法使用根据ELISA技术免疫酶方法、通过免疫荧光或放射免疫测定(RIA)技术或者等同技术。

因此，本发明也包含试剂盒或套装，其是实施由IGF-I受体过表达或低表达所诱导疾病的诊断方法所必要的、或者实施检测和/或定量生物样品中IGF-I受体过表达或低表达的方法所必要的，其特征在于所述试剂盒或者套装包含以下要素：

a)根据本发明的抗体或其功能片段之一；

b)任选地用于形成适于免疫反应的介质的试剂；

c)任选地允许证明由免疫反应所产生IGF-IR/抗体复合物的试剂。

本发明还涉及组合物作为根据本发明的组合产品用于制备药物的用途，所述药物旨在预防或者治疗癌症，尤其是一般处方所述细胞毒性剂或所述抗-HER2/neu抗体的癌症，对该癌症所述肿瘤细胞表达或者过表达IGF-I受体。

本发明的另一个主题是根据本发明的抗体用于制备药物的用途，所述药物旨在将生物活性化合物特异性靶向至表达或过表达IGF-I受体的细胞。

本文中生物活性化合物意思是指能够调节尤其是抑制细胞活性尤其是其生长、增殖、转录或者基因翻译的任何化合物。

本发明的另一个主题是包含根据本发明的抗体或其功能片段之一的体内诊断试剂，所述抗体优选被标记尤其是放射标记，及其在医学影像中的用途，尤其是用于检测与细胞表达或过表达IGF-I受体相关的癌症。

本发明也涉及作为组合产品的根据本发明的组合物，或者涉及作为药物的根据本发明的抗-IGF-IR/毒素偶联物或放射性元素。

优选作为组合产品的根据本发明所述组合物或者所述偶联物，将与赋形剂和/或药用可接受的载体混合。

在本说明书中，药用可接受的载体意思是指进入药物组合物中而不激发次级反应的化合物或者化合物组合，并且其允许例如促进活性化合物的施用、增加其使用期限和/或体内功效、增加其在溶液中的溶解度或者改善其保存性能。这些药用可接受的载体是公知的并且将被本领域技术人员作为所选活性化合物的本性和施用模式的函数进行适应性修改。

优选地，通过系统途径施用这些化合物，尤其通过静脉途径、肌肉、皮内、腹膜内或者皮下途径、或者通过口服途径。在一种更优选方式中，包含根据本发明抗体的组合物将以依次方式几次施用。

可以根据确定适用于患者的治疗一般所考虑的标准来确定其施用模式、剂量和最优药物形式，这些标准例如患者年龄或者体重、其一般健康状况的严重性、对治疗以及所提及次级作用的耐受性。

本发明的其他特征和优点随着实施例和附图出现在本说明书的连续部分中，其中：

-图1表示在MCF-7模型中抗IGF-IR抗体的体外评估，

-图2和3表示在DU145上抗IGF-IR抗体的体内评估，

-图4表示在表达IGF-IR的完整细胞上[¹²⁵I]-IGF-1的替换，

-图5表示在免疫捕获的HR-A上[¹²⁵I]-IGF-1的替换，

-图6表示在免疫捕获的HR-B上[¹²⁵I]-IGF-1的替换，

-图7表示在表达IR-A的完整细胞上[¹²⁵I]-INS的替换，

-图8表示在表达IR-B的完整细胞上[¹²⁵I]-INS的替换。

实施例1：产生抗IGF-1R单克隆抗体

通过融合来自用可溶α2-β2异四聚体重组人IGF-1R(R&D System，Minneapolis，USA)免疫的BALB/c小鼠的脾细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞系来产生杂交瘤。首先通过ELISA和在MCF-7细胞上FACS分析筛选所得鼠抗体。然后，在Sf9-IGF-1r对Sf9-IR细胞上实施最终筛选以消除识别IGF-1和IR的抗体。所选MAb(在ELISA中阳性并且识别MCF-7细胞上野生型受体)作为腹水而产生，并且在体外和/或体内测试前经蛋白A色谱柱纯化，如表1中总结。

表1：抗-IGF-IR单克隆抗体的选择

实施例2：抗-IGF-1R抗体的体外活性

方法

来自ATCC的MCF-7细胞常规培养在无酚红RPMI培养基(Invitrogen Corporation，Scotland，UK)、10％FCS(InvitrogenCorporation)、1％L-谷氨酰胺(Invitrogen Corporation)中。在无血清培养基中以5x10⁴个细胞/孔的密度将MCF-7细胞铺板于96孔组织培养板中。24小时后，将1-50ng/ml剂量范围的IGF1加入到缺乏或存在最终浓度5μg/ml每种待测抗体的培养基中。3天后，用0.5μCi的[³H]胸苷(Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden)脉冲处理细胞16小时。通过液体闪烁计数来定量掺入三氯乙酸不溶性DNA的[³H]胸苷的幅度。结果表示为增殖指数(细胞加IGF1加抗体的cpm/仅加抗体的细胞的cpm)。

结果

体外评价是根据促有丝分裂活性对Mab(单克隆抗体)的第一次筛选。对于这些试验，将作为腹水制备的所生成抗体与IGF1同时加至MCF-7细胞，并且与商品αIR3Mab比较以选择至少有该后者抗体功效的抗体。当用最高剂量的IGF1(50ng/ml)刺激细胞时，在先前答复的表2＊中描述为(+)的阳性Mab(5个Mab)的增殖指数＜5。图1显示在6种强效体外抑制剂(2D10、12D5、12B1、13F5)中4种的体外活性。2F2和21E3Mab已被认为是(±)＊Mab(对于最高浓度的IGF1，5＜增殖指数＜15)，以及7G3和2B10被认为是非中和抗体(增殖指数＞15)。有兴趣地注意到21E3是IgG2同种型唯一的Mab。

实施例3：抗IGF-IR-1R抗体的体内活性

方法

来自ATCC的DU145细胞常规培养在DMEM培养基(InvitrogenCorporation，Scotland，UK)、10％FCS(Invitrogen Corporation)、1％L-谷氨酰胺(Invitrogen Corporation)中。在移入前两天细胞被分瓶，使得它们处于指数生长期。在PBS中的两百万DU145被植入瑞士裸鼠。植入后一天，将动物分成6只小鼠每组。用200μg每种待测抗体在肿瘤对侧皮下注射处理小鼠，一周3次。在第一次筛选中用鼠同种型对照(EC2)处理对照组或者对于随后的筛选使用PBS，因为在第一次试验中已经显示在这两组小鼠之间没有观察到肿瘤生长的差异。一周测量一次肿瘤体积并且通过公式：π/6×长度×宽度×高度来计算。

结果

进行三次体内试验以测试一组Mab。图2和3显示13F5、2D10和6E5显著抑制DU145细胞的体内生长。统计学分析(Mann and Whitney检验)显示于表2。

第二次筛选	D12	D20	D26	D30
					Mann-WhitnevPBS/2D10(Wilcoxon)	p＝0,0041	p＝0,0017	p＝0,0027	p＝0,0027
PBS/6E5Mann-Whitnev(Wilconon	p＝0,027	p＝0,013	p＝0,0092	p＝0,019
					PBS/12B1Mann-Whitney(Wilcoxon	p＝0,11	p＝0,11	p＝0,067	p＝0,11
PBS/2F2Mann-Whitney(Wilcoxon	p＝0,18	p＝0,067	p＝0,050	p＝0,14

第三次筛选	D12	D20	D26	D33
					PBS/16A12Mann-Whitnev(Wilcoxon	p＝0,063	p＝0,087	p＝0,19	p＝0,11

表2：体内数据的统计学分析

实施例4：评价2D10、12D5、13F5结合至IGF-IR和杂合体-R的能力

这项研究所用细胞列于其后：

-R+：用IGF-I受体(IGF-IR)cDNA稳定转染的R-成纤维细胞

-R-/IR-A：用胰岛素受体同种型A(IR-A)cDNA稳定转染的R-成纤维细胞

-R-/IR-B：用胰岛素受体同种型B(IR-B)cDNA稳定转染的R-成纤维细胞

-R+/IR-A：用IGF-I和胰岛素受体同种型AcDNA稳定共转染的R-成纤维细胞，并且因此表达杂合体受体A(杂合体-RsA)

-R+/IR-B：用IGF-I和胰岛素受体同种型BcDNA稳定共转染的R-成纤维细胞，并且因此表达杂合体受体A(杂合体-RsB)

实施例4-1：通过2D10、12D5、13F5和αIR-3在IGF-IR上替换分析 [ ¹²⁵ I]IGF1

在缺乏或者存在浓度逐渐增加的非标记配体(IGF1、IGF2或胰岛素)或者抗体(2D10、12D5、13F5)下，允许[¹²⁵I]IGF1(20,000cpm)在4℃结合R+完整细胞16小时。结果作为最大特异性结合的百分数作图并表示于图4。

2D10和13F5都以亚纳摩尔亲和力有效和完全地替换IGF，并且与参考抗体αIR-3(IC₅₀：0.05nM)比较，在此实施例中分别具有0.15和0.20nM的IC₅₀。所述亲和力高于天然IGF-IR配体IGF1(在本实施例中2.2nM)和IGF2(在本实施例中15nM)的亲和力。

实施例4-2：通过2D10、12D5、13F5和47-9在杂合体-RsA上替换分析 [ ¹²⁵ I]IGF1

将来自R+/IR-A细胞裂解物的杂合体-RsA免疫捕获在包被抗IR抗体83-7的Maxisorb板上。

然后在缺乏或者存在浓度逐渐增加的非标记抗体(IGF1、IGF2或胰岛素)或者抗体(2D10、12D5、13F5、47-9、9G4)下，允许[¹²⁵I]IGF1(图5)结合至免疫捕获的受体。结果作为最大特异性结合的百分数作图并表示于图5。

2D10和13F5以非常相似的亚纳摩亲和力有效和完全替换标记IGF1，在本实施例中分别为0.2和0.35nM。通过比较，47-9产生0.18nM的IC₅₀值(图5)。

这些亲和力高于天然杂合体-RsA配体IGF1(在本实施例中2.0nM)和IGF2(在本实施例中12nM)的亲和力。

实施例4-3：通过2D10、12D5、13F5和47-9在杂合体-RsB上替换分析 [ ¹²⁵ I]IGF1

将来自R+/IR-B细胞裂解物的杂合体-RsB免疫捕获在包被83-7抗体的Maxisorb板上。

然后在缺乏或者存在浓度逐渐增加的非标记抗体的IGF1、IGF2、胰岛素或者抗体(2D10、12D5、13F5、47-9、9G4)下，允许[¹²⁵I]IGF1(图6)结合至免疫捕获的受体。结果作为最大结合的百分数进行作图。

2D10和13F5以非常相似的亚纳摩亲和力有效和完全替换标记IGF1，在本实施例中分别为0.04和0.15。通过比较，47-9效力较低，具有0.40nM的IC₅₀值(图6)。

实施例4-4：通过2D10、12D5、13F5和MA-10在胰岛素受体A(IR-A) 和B(IR-B)同种型上替换分析[ ¹²⁵ I]胰岛素

在缺乏或者存在浓度逐渐增加的非标记配体(IGF1、IGF2或胰岛素)或者抗体(2D10、12D5、13F5)下，允许[¹²⁵I]胰岛素(40,000cpm)在4℃结合至R-/IR-A或R-/IR-B完整细胞16小时。结果作为最大特异性结合的百分数作图并且对于IR-A和IR-B分别表示在图7和8中。

与参考抗体MA-10比较，2D10、12D5或者13F5都不替换胰岛素(IC₅₀：0.90和1.5nM分别对应IR-A(图7)and IR-B(图8))。

Claims

1.一种分离抗体或其功能片段，所述抗体或其所述片段能够结合至人胰岛素样生长因子I受体IGF-IR，其特征在于所述抗体及其功能片段包含一种轻链，所述轻链至少包含序列SEQ ID No.1、2和3的所述三种互补决定区CDR，并且其特征在于其包含一种重链，所述重链至少包含序列SEQ IDNo.4、5和6的所述三种CDR。

2.权利要求1的抗体，被称为13F5并且其特征在于其包含序列含氨基酸序列SEQ ID No.20的重链并且其还包含序列含氨基酸序列SEQ ID No.19的轻链。

3.一种鼠杂交瘤，其能够分泌权利要求1或2之一的抗体，并已在2004年3月25日以编号I-3193存放在CNCM，Institut Pasteur，Paris。

4.一种抗体，其特征在于所述抗体由权利要求3的杂交瘤分泌。

5.权利要求1或2的抗体或其功能片段，其特征在于所述抗体是嵌合抗体并且还包含来自于对小鼠为异源物种的抗体的轻链和重链恒定区。

6.权利要求5的抗体或其功能片段，其特征在于所述异源物种是人。

7.一种组合物，其包含由权利要求1、2、4、5和6之一所要求保护的抗体或其功能片段组成的化合物作为活性成分。

8.权利要求7的组合物，其特征在于，作为用于同时或者分开使用的组合产品，其还包含抗体、细胞毒性剂或细胞静止剂、和/或IGF-I和/或EGF受体各自酪氨酸激酶活性的抑制剂。

9.权利要求7的组合物，其特征在于，作为用于依次使用的组合产品，其还包含抗体、细胞毒性剂或细胞静止剂、和/或IGF-I和/或EGF受体各自酪氨酸激酶活性的抑制剂。

10.权利要求7、8和9之一的组合物，作为药物。

11.权利要求1、2、4、5和6之一所要求保护的抗体或其功能片段和/或权利要求7-10中任一项的组合物用于制备药物的用途，所述药物旨在预防或治疗与IGF-I受体过表达和/或异常活化相关的疾病、和/或与由IGF1或IGF2同IGF-IR的相互作用所介导的信号转导途径的过度活化相关的疾病。

12.权利要求11的用于制备药物的用途，所述药物旨在抑制正常细胞向具有肿瘤特征的IGF依赖性细胞的转化。

13.权利要求12的用于制备药物的用途，其中所述具有肿瘤特征的细胞是IGF1和/或IGF2依赖性细胞。

14.权利要求12的用于制备药物的用途，所述药物旨在抑制肿瘤细胞的生长和/或增殖，其中所述肿瘤细胞是IGF依赖性细胞。

15.权利要求14的用于制备药物的用途，其中所述肿瘤细胞是IGF1和/或IGF2依赖性细胞。

16.权利要求12或14的用途，其特征在于所述肿瘤细胞是肿瘤IGF依赖性细胞。

17.权利要求12或14的用途，其特征在于所述肿瘤细胞是肿瘤IGF1和/或IGF2依赖性细胞。

18.权利要求11-15之一的用于制备药物的用途，所述药物旨在预防或者治疗癌症，其中所述癌症过表达IGF-IR。

19.权利要求18的用途，其特征在于所述癌症选自前列腺癌、骨肉瘤、肺癌、乳癌、子宫内膜癌或结肠癌。

20.权利要求1、2、4、5和6之一所要求保护的抗体在制备用于从怀疑其中有IGF-I受体异常存在的生物样品中体外诊断由IGF-I受体过表达或低表达所诱导的疾病的药物中的用途。

21.权利要求20的用途，其特征在于所述抗体是被标记的。