FR2873699A1 - Nouveaux anticorps anti igf ir rt leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouveaux anticorps capables de se lier spécifiquement au récepteur humain du facteur de croissance I apparenté à l'insuline IGF-IR et/ou capables d'inhiber spécifiquement l'activité tyrosine kinase dudit récepteur IGF-IR, notamment monoclonaux d'origine murine, chimériques et humanisés, ainsi que les séquences d'acide aminé et nucléique codant pour ces anticorps. L'invention comprend également l'utilisation de ces anticorps à titre de médicament pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de cancers surexprimant l'IGF-IR ou de toute pathologie liée à la surexpression dudit récepteur ainsi que dans des procédés ou nécessaires de diagnostic de maladies liées à la surexpression de l'IGF-IR. L'invention comprend enfin des produits et/ou des compositions comprenant de tels anticorps en association avec des anticorps anti-EGFR et/ou des anticorps anti-VEGF et/ou des anticorps dirigés contre d'autres facteurs de croissance impliqués dans la progression tumorale ou la métastase et/ou des composés et/ou des agents anticancéreux ou conjugués avec des toxines et leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement de certains cancers.

Description

La présente invention concerne de nouveaux anticorps capables de se lier

spécifiquement au récepteur humain du facteur de croissance I apparenté à l'insuline IGF-IR et/ou capables d'inhiber spécifiquement l'activité tyrosine kinase dudit récepteur IGF-IR, notamment monoclonaux d'origine murine,

chimériques et humanisés, ainsi que les séquences d'acide aminé et nucléique codant pour ces anticorps. L'invention comprend également l'utilisation de ces anticorps à titre de médicament pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de cancers surexprimant l'IGF-IR ou de toute pathologie liée à la surexpression dudit récepteur ainsi que dans des procédés ou nécessaires de diagnostic de maladies liées à la surexpression de l'IGF-IR. L'invention comprend enfin des produits et/ou des compositions comprenant de tels anticorps en association avec des anticorps anti-EGFR et/ou des anticorps anti-VEGF et/ou des anticorps dirigés contre d'autres facteurs de croissance impliqués dans la progression tumorale ou la métastase et/ou des composés et/ou des agents anticancéreux ou conjugués avec des toxines et leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement de certains cancers.

Le récepteur du facteur de croissance I apparenté à l'insuline dénommé IGF-IR ("IGF-IR" pour "Insuline-like Growth Factor-I Receptor") est un récepteur bien décrit à activité tyrosine kinase comportant 70 % d'homologie avec le 2 0 récepteur à l'insuline IR ("IR" pour "Insuline Receptor"). L'IGF-IR est une glycoprotéine de poids moléculaire d'environ 350 000.

C'est un récepteur hétérotétramérique dont chaque moitié reliée par des ponts disulfures est composée d'une sous unité a extracellulaire et d'une sous unité (3 transmembranaire. L'IGF-IR fixe l'IGF I et l'IGF II avec une très forte affinité (Kd # 1 nM) mais est également capable de se lier à l'insuline avec une affinité 100 à 1 000 fois moindre. Inversement, l'IR fixe l'insuline avec une très forte affinité alors que les IGFs ne se fixent au récepteur à l'insuline qu'avec une affinité 100 fois inférieure. Le domaine tyrosine kinase de l'IGF-IR et de l'IR présentent une très forte homologie de séquence alors que les zones de plus faible homologie concernent respectivement la région riche en cystéine située sur la sous unité a et la partie C-terminale de la sous unité 3. Les différences de séquences observées dans la sous unité a sont situées dans la zone de fixation des ligands et sont donc à l'origine des affinités relatives de l'IGF-IR et de l'IR pour les IGFs et l'insuline respectivement. Les différences dans la partie C-terminale de la sous unité 3 résultent en une divergence dans les voies de signalisation des deux récepteurs; l'IGF-IR médiant des effets mitogéniques, de différenciation et d'anti-apoptose, alors que l'activation de l'IR entraîne principalement des effets au niveau des voies métaboliques (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332:F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253:1-6, 1999).

Les protéines tyrosine-kinases cytoplasmiques sont activées par la fixation du ligand au domaine extracellulaire du récepteur. L'activation des kinases entraîne à son tour la stimulation de différents substrats intracellulaires, incluant l'IRS-1, l'IRS-2, Shc et Grb 10 (Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999). Les deux substrats majeurs de l'IGF-IR sont IRS et Shc qui médient, par l'activation de nombreux effecteurs en aval, la plupart des effets de croissance et de différenciation liés à la fixation des IGFs à ce récepteur. La disponibilité de substrats peut par conséquent dicter l'effet biologique final lié à l'activation de l'IGF-IR. Lorsque l'IRS-1 prédomine, les cellules tendent à proliférer et à se transformer. Lorsque Shc domine, les cellules tendent à se différencier (Valentinis B. et al., J. Biol. Chem., 274:12423-12430, 1999). Il semble que la voie principalement en cause pour les effets de protection contre l'apoptose soit la voie des phosphatidylinositol 3-kinases (PI 3-kinases) (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31:80-89, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125:166-173, 1999).

Le rôle du système IGF dans la cancérogenèse est devenu le sujet de recherches intensives dans les dix dernières années. Cet intérêt a suivi la découverte du fait qu'en plus de ses propriétés mitogéniques et antiapoptotiques, l'IGF-IR semble être requis pour l'établissement et la maintenance d'un phénotype transformé. En fait, il a été bien établi qu'une surexpression ou une activation constitutive de l'IGF-IR conduit, dans une grande variété de cellules, à une croissance des cellules indépendante du support dans des milieux dépourvus de sérum de veau foetal, et à la formation de tumeurs chez la souris nude. Ceci n'est pas en soi une propriété unique puisqu'une grande variété de produits de gènes surexprimés peuvent transformer des cellules, incluant un bon nombre de récepteurs de facteurs de croissance. Mais la découverte cruciale qui a clairement mis en évidence le rôle majeur joué par l'IGF- IR dans la transformation a été la démonstration que les cellules R-, dans lesquelles le gène codant pour l'IGF-IR a été inactivé, sont totalement réfractaires à la transformation par différents agents qui sont habituellement capables de transformer les cellules comme la protéine E5 du papilloma virus bovin, une surexpression de l'EGFR ou du PDGFR, l'antigène T de SV40, ras activé ou la combinaison de ces deux derniers facteurs (Sell C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 90:11217- 11221, 1993; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14:3604-3612, 1994; Morrione A. J., Virol., 69:5300-5303, 1995; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14:4588-4595, 1994; DeAngelis T et al., J. Cell. Physiol., 164:214- 221, 1995).

L'IGF-IR est exprimé dans une grande variété de tumeurs et de lignées tumorales et les IGFs amplifient la croissance tumorale via leur fixation à l'IGFIR. D'autres arguments en faveur du rôle de IGF-IR dans la cancérogenèse proviennent d'études utilisant des anticorps monoclonaux murins dirigés contre le récepteur ou des dominants négatifs de l'IGF-IR. En effet, des anticorps monoclonaux murins dirigés contre l'IGF-IR inhibent la prolifération de nombreuses lignées cellulaires en culture et la croissance de cellules tumorales in vivo (Arteaga C. et al., Cancer Res., 49:6237-6241, 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196:9298, 1993; Zia F et al., J. Cell. Biol., 24:269-275, 1996; Scotlandi K et al., Cancer Res., 58:4127-4131, 1998). Il a également été montré dans les travaux de Jiang et al. (Oncogene, 18:6071-6077, 1999) qu'un dominant négatif de l'IGF-IR est capable d'inhiber la prolifération tumorale.

En ce qui concerne l'intérêt croissant relatif à l'IGF-IR et, plus particulièrement, les anticorps monoclonaux capables de se lier à, ou d'inhiber l'activité tyrosine kinase de l'IGF-IR, les demandeurs ont déjà développé et caractérisé un anticorps monoclonal humanisé dénommée 7C10 ou h7C10 (codé F50035). Une demande de brevet international PCT/FR03/00178 relative à cet anticorps et ses utilisations a été déposée et publiée le 24 juillet 2003 sous le numéro de publication WO 03/059951. Le contenu de cette demande de brevet figure ci-après pour référence.

La présente invention a pour objet de pouvoir disposer d'un anticorps monoclonal murin, de préférence un anticorps chimérisé ou humanisé, qui reconnaîtra spécifiquement et avec une forte affinité l'IGF-IR. Cet anticorps n'interagira pas ou peu avec le récepteur IR à l'insuline. Sa fixation devra inhiber in vitro la croissance des tumeurs exprimant l'IGFIR en interagissant principalement avec les voies de transduction du signal activées lors des interactions IGFI/IGF-IR et IGF2/IGF-IR. Cet anticorps devra être actif in vivo sur tous les types de tumeurs exprimant l'IGF-IR y compris les tumeurs du sein estrogène dépendantes et les tumeurs de la prostate.

Plus particulièrement, la présente invention concerne quatre anticorps monoclonaux anti-IGF-IR différents.

Sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un anticorps isolé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ledit anticorps ou l'un de sesdits fragments étant capable de se lier spécifiquement au récepteur humain du facteur de croissance I apparenté à l'insuline et, le cas échéant, de préférence capable en outre d'inhiber la fixation naturelle des ligands IGFI et/ou IGF2 de IGF-IR et/ou capable d'inhiber spécifiquement l'activité tyrosine kinase dudit récepteur IGF-IR, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne légère comprenant au moins une région CDR déterminant la complémentarité choisie parmi les CDRs de séquence d'acide aminé SEQ ID Nos. 1, 2 et 3, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID Nos. 1, 2 et 3; et/ou - une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs de séquence d'acide aminé SEQ ID Nos. 4, 5 et 6, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 4, 5 et 6.

Dans la présente spécification et les exemples correspondants, cet anticorps sera dénommé 13F5.

Dans la présente description, les termes se lier et se fixer ont la même signification et sont interchangeables.

Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences polypeptidiques, peptides et protéines attachés aux composés anticorps ou à leur séquence sont interchangeables.

Il doit être compris ici que l'invention ne concerne pas les anticorps sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être isolés ou obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou par synthèse chimique, et qu'ils peuvent alors comporter des acides aminés non naturels comme cela sera décrit plus loin.

Par régions CDR ou CDRs, on entend désigner les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères des immunoglobulines comme définies par Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5t" Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, and later editions). Il existe 3 CDRs de chaîne lourde et 3 CDRs de chaîne légère. Le terme CDR ou CDRs est utilisé ici pour désigner suivant les cas, l'une de ces régions ou 2 0 plusieurs, voire l'ensemble, de ces régions qui contiennent la majorité des résidus d'acide aminés responsables de la liaison par affinité de l'anticorps pour l'antigène ou l'épitope qu'il reconnaît.

Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminé au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminé sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison pouvant être réalisée par segment ou par fenêtre de comparaison . L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J.

Mol. Biol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminé est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acide nucléique ou d'acide aminé à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, BLAST 2 sequences (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres open gap penaltie : 5, et extension gap penaltie : 2; la matrice choisie étant par exemple la matrice BLOSUM 62 proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.

Par séquence d'acide aminé présentant au moins 80 %, de préférence85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité avec une séquence d'acide aminé de référence, on préfère celles présentant par rapport à la séquence de référence, certaines modifications, en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncation ou un allongement. Dans le cas d'une substitution, d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) consécutif(s) ou non consécutif(s), on préfère les substitutions dans lesquelles les acides aminés substitués sont remplacés par des acides aminés équivalents . L'expression acides aminés équivalents vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les activités biologiques des anticorps correspondants et telles qu'elles seront définies par la suite, notamment dans les exemples. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique entre les différents anticorps susceptibles d'être effectués.

A titre d'exemple, on mentionne les possibilités de substitution susceptibles d'être effectuées sans qu'il résulte en une modification approfondie de l'activité biologique de l'anticorps modifié correspondant. On peut remplacer ainsi la leucine par la valine ou l'isoleucine, l'acide aspartique par l'acide glutamine, la glutamine par l'asparagine, l'arginine par la lysine, etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions.

Sous un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un anticorps isolé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ledit anticorps ou l'un de sesdits fragments étant capable de se lier spécifiquement au récepteur humain du facteur de croissance I apparenté à l'insuline et, le cas échéant, de préférence capable en outre d'inhiber la fixation naturelle des ligands IGF1 et/ou IGF2 de IGF-IR et/ou capable d'inhiber spécifiquement l'activité tyrosine kinase dudit récepteur IGFIR, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne légère comprenant au moins une région CDR déterminant la complémentarité choisie parmi les CDRs de séquence d'acide aminé SEQ ID Nos. 7, 8 et 9, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID Nos. 7, 8 et 9; et/ou - une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs de séquence d'acide aminé SEQ ID Nos. 10, 11 et 12, dans laquelle le CDR de séquence SEQ ID No. 11 peut être remplacé par le CDR de séquence SEQ ID No. 26, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 10, 11 (ou 26) et 12.

Dans la spécification suivante, cet anticorps sera dénommé 12D5.

Sous un troisième aspect, la présente invention a pour objet un anticorps isolé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ledit anticorps ou l'un de sesdits fragments étant capable de se lier spécifiquement au récepteur humain du facteur de croissance I apparenté à l'insuline et, le cas échéant, de préférence capable en outre d'inhiber la fixation naturelle des ligands IGF1 et/ou IGF2 de IGF-IR et/ou capable d'inhiber spécifiquement l'activité tyrosine kinase dudit récepteur IGFIR, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne légère comprenant au moins une région CDR déterminant la complémentarité choisie parmi les CDRs de séquence d'acide aminé SEQ ID Nos. 13, 14 et 15, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID Nos. 13, 14 et 15; et/ou - une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs de séquence d'acide aminé SEQ ID Nos.16, 17 et 18, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 16, 17 et 18.

Dans la spécification suivante, cet anticorps sera dénommé 2D10.

Enfin, sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un anticorps isolé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, capable de se lier spécifiquement au récepteur humain du facteur de croissance I apparenté à l'insuline et, le cas échéant, de préférence capable en outre d'inhiber la fixation naturelle des ligands IGFI et/ou IGF2 de IGF-IR et/ou capable d'inhiber spécifiquement l'activité tyrosine kinase dudit récepteur IGF-IR, caractérisé en ce qu'il consiste en l'anticorps dénommé 21E3 et enregistré à la CNCM (COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES, Institut Pasteur, Paris, France) selon le traité de Budapest comme indiqué ci-après.

Les anticorps selon la présente invention, c'est-à-dire 13F5, 12D5, 2D10 et 21 E3, sont de préférence des anticorps monoclonaux spécifiques, notamment d'origine murine, chimériques ou humanisés qui pourront être obtenus selon les méthodes standards bien connues de l'homme de l'art.

En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux ou leurs fragments fonctionnels, notamment d'origine murine, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel Antibodies (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent être obtenus par exemple à partir de cellule d'un animal immunisé contre le récepteur IGFIR, ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon l'invention. Ledit récepteur IGF- IR, ou un de sesdits 2 0 fragments, pourra notamment être produit selon les modes opératoires usuels, par recombinaison génétique à partir d'une séquence d'acide nucléique contenue dans la séquence de l'ADNc codant pour le récepteur IGF-IR ou par synthèse peptidique à partir d'une séquence d'acides aminés comprise dans la séquence peptidique du récepteur IGF-IR.

Les anticorps monoclonaux selon l'invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisé le récepteur IGF-IR ou un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux selon l'invention. Plus particulièrement, lesdits anticorps monoclonaux pourront être purifiés par chromatographie sur protéine A et/ou G, suivie ou non par une chromatographie par échange d'ions visant à éliminer les contaminants protéiques résiduels ainsi que l'ADN et les LPS, elle-même suivie ou non par une chromatographie d'exclusion sur gel de sépharose afin d'éliminer les agrégats potentiels dus à la présence de dimères ou d'autres multimères. De manière encore plus préférée, l'ensemble de ces techniques peut être utilisé simultanément ou successivement.

Sont également compris par anticorps selon la présente invention, les anticorps chimériques ou humanisés.

Par anticorps chimérique, on entend désigner un anticorps qui contient une région variable (chaîne légère et chaîne lourde) naturelle dérivée d'un anticorps d'une espèce donnée en association avec les régions constantes de chaîne légère et chaîne lourde d'un anticorps d'une espèce hétérologue à ladite espèce donnée.

Les anticorps ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être préparés en utilisant les techniques de recombinaison génétique. Par exemple, l'anticorps chimérique pourra être réalisé en clonant un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable d'un anticorps monoclonal non humain, notamment murin, selon l'invention et une séquence codant pour la région constante d'anticorps humain. Un anticorps chimérique de l'invention codé par un tel gène recombinant sera par exemple une chimère souris-homme, la spécificité de cet anticorps étant déterminée par la région variable dérivée de l'ADN murin et son isotype 2 0 déterminé par la région constante dérivée de l'ADN humain. Pour les méthodes de préparation d'anticorps chimériques, on pourra par exemple se référer au document Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988).

Par anticorps humanisés, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. En outre, certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être modifiés pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988) .

Les anticorps humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (comme par exemple celles décrites dans les documents Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10:1142, 1992; ou Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992). De tels anticorps humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, ou de traitement prophylactique et/ou thérapeutique in vivo.

Par fragment fonctionnel d'un anticorps selon l'invention, on entend désigner en particulier un fragment d'anticorps, tel que des fragments Fv, scFv (sc pour simple chaîne), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diabodies, ou tout fragment dont la durée de demie-vie aurait été augmentée par modification chimique, comme l'ajout de poly(alkylène) glycol tel que le poly(éthylène)glycol ("PEGylation") (fragments pégylés dénommés Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, (Fab')2-PEG ou Fab'-PEG) ( PEG pour Poly(Ethylène) Glycol), ou par incorporation dans un liposome, lesdits fragments présentant au moins un des CDRs de séquence SEQ ID No. 1 à 6, 7 à 12 ou 26, ou 13 à 18 caractéristiques selon l'invention, et, notamment, en ce qu'il est capable d'exercer de manière générale une activité même partielle de l'anticorps dont il est issu, telle qu'en particulier la capacité à reconnaître et à se lier au récepteur IGF-IR, et, le cas échéant, à inhiber l'activité du récepteur IGF-IR.

De préférence, lesdits fragments fonctionnels seront constitués ou comprendront une séquence partielle de la chaîne variable lourde ou légère de l'anticorps dont ils sont dérivés, ladite séquence partielle étant suffisante pour retenir la même spécificité de liaison que l'anticorps dont elle est issue et une affinité suffisante, de préférence au moins égale à 1/100, de manière plus préférée à au moins 1/10 de celle de l'anticorps dont elle est issue, vis-à-vis du récepteur IGF-IR. Un tel fragment fonctionnel comportera au minimum 5 acides aminés, de préférence 10, 15, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence de l'anticorps dont il est issu.

De préférence, ces fragments fonctionnels seront des fragments de type Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ou diabodies, qui possèdent généralement la même spécificité de fixation que l'anticorps dont ils sont issus. Selon la présente invention, des fragments d'anticorps de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière, les fragments d'anticorps compris dans la présente invention peuvent être obtenus par des techniques de recombinaisons génétiques bien connues également de l'homme de l'art ou encore par synthèse peptidique au moyen par exemple de synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc. Plus particulièrement, l'invention comprend les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, selon la présente invention, notamment chimériques ou humanisés, obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.

Selon une première approche ou une seconde approche, l'anticorps sera défini par sa séquence de chaîne lourde et/ou légère.

D'une première manière préférée, la présente invention concerne un 15 anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne lourde comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 4 à 6, ou au moins deux des trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ D No. 4 à 6; et/ou - une chaîne légère comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 1 à 3, ou au moins deux des trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 1 à 3.

D'une seconde manière préférée, la présente invention concerne un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne lourde comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 10 à 12, dans laquelle le CDR de séquence SEQ ID No. 11 peut être remplacé par le CDR de séquence SEQ ID No. 26, ou au moins deux des trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 10, 11 (ou 26) ; et/ou une chaîne légère comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 7 à 9, ou au moins deux des trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 7 à 9.

D'une troisième manière préférée, la présente invention concerne un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention,caractérisé en ce qu'il comprend: - une chaîne lourde comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 16 à 18, ou au moins deux des trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 16 àl8; et/ou - une chaîne légère comprenant au moins deux des trois CDRs ou les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 13 à 15, ou au moins deux des trois CDRs ou trois CDRs de séquence présentant respectivement au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 13 à 15.

Selon une troisième approche, l'anticorps sera défini à la fois par sa séquence de chaîne lourde et sa séquence de chaîne légère.

D'une première manière préférée, l'anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il comprend: une chaîne lourde comprenant les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 4 à 6, ou trois CDRs de séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 4 à 6; et en en outre -une chaîne légère comprenant les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 1 à 3, ou trois CDRs de séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 1 à 3.

D'une deuxième manière préférée, l'anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il comprend; une chaîne lourde comprenant les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 10 à 12, ou trois CDRs de séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 10 à 12; et en outre - une chaîne légère comprenant les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 7 à 9, ou trois CDRs de séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 7 à 9.

D'une troisième manière préférée, l'anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il comprend; une chaîne lourde comprenant les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 16 à 18, ou trois CDRs de séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 16 à 18; et en outre - une chaîne légère comprenant les trois CDRs de séquence SEQ ID No. 13 à 15, ou trois CDRs de séquence présentant au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 13 à 15.

Dans encore un autre mode de réalisation préféré, l'anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, dénommé 13F5, est caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 20, et en ce qu'il comprend en outre une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 19.

Dans encore un autre mode de réalisation préféré, l'anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, dénommé 12D5, est caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 22 ou 23, et en ce qu'il comprend en outre une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 21.

Dans encore un autre mode de réalisation préféré, l'anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, dénommé 2D10, est caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 25, et en ce qu'il comprend en outre une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 24.

Une autre possibilité, faisant partie de la présente invention, consiste en un anticorps dans lequel les trois CDRs de la chaîne lourde sont choisis au hasard dans le groupe comprenant les CDRs de chaque 13F5, 12D5 et 2D10, et dans lequel les trois CDRs de la chaîne légère sont également choisis au hasard dans le groupe comprenant les CDRs de chaque 13F5, 12D5 et 2D10.

Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un anticorps, ou 5 l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce qu'il ne se fixe pas ou qu'il ne se fixe pas de manière significative au récepteur humain IR de l'insuline.

De manière préférée, lesdits fragments fonctionnels selon la présente invention seront choisis parmi les fragments Fv, scFv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv-Fc ou diabodies, ou tout fragment fonctionnel dont la demie vie aurait été augmentée par une modification chimique, notamment par PEGylation, ou par l'incorporation dans un liposome.

Sous un autre aspect, l'invention concerne un hybridome murin capable de sécréter un anticorps monoclonal selon la présente invention, notamment l'hybridome d'origine murine tel que déposé au Centre National de Culture de Microorganisme (CNCM) (Institut Pasteur, Paris, France).

L'anticorps monoclonal dénommé ici 13F5, ou l'un de ses fragments fonctionnels, caractérisé en ce que ledit anticorps est sécrété par l'hybridome déposé à la CNCM le 25 mars 2004 sous le numéro CNCM I-3193, fait bien entendu partie de la présente invention. Cet hybridome consiste en un hybridome murin résultant de la fusion cellulaire de splénocytes d'une souris immunisée avec une lignée de cellules du myélome (Sp20 Agl4).

L'anticorps monoclonal dénommé ici 12D5, ou l'un de ses fragments fonctionnels, caractérisé en ce que ledit anticorps est sécrété par l'hybridome déposé à la CNCM le 8 avril 2004 sous le numéro CNCM I-3195, fait bien entendu partie de la présente invention. Cet hybridome consiste en un hybridome murin résultant de la fusion cellulaire de splénocytes d'une souris immunisée avec une lignée de cellules du myélome (Sp20 Ag14).

L'anticorps monoclonal dénommé ici 2D10, ou l'un de ses fragments 30 fonctionnels, caractérisé en ce que ledit anticorps est sécrété par l'hybridome déposé à la CNCM le 13 mars 2004 sous le numéro I-3214, fait bien entendu partie de la présente invention. Cet hybridome consiste en un hybridome murin résultant de la fusion cellulaire de splénocytes d'une souris immunisée avec une lignée de cellules du myélome (Sp20 Agl4).

L'anticorps monoclonal dénommé ici 21E3, ou l'un de ses fragments fonctionnels, caractérisé en ce que ledit anticorps est sécrété par l'hybridome déposé à la CNCM le juillet 2004 sous le numéro I-3249, fait bien entendu partie de la présente invention. Cet hybridome consiste en un hybridome murin résultant de la fusion cellulaire de splénocytes d'une souris immunisée avec une lignée de cellules du myélome (Sp20 Agl4).

Sous un aspect également particulier, la présente invention concerne un anticorps chimérique, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, caractérisé en ce que ledit anticorps comprend en outre les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps d'une espèce hétérologue à la souris, notamment de l'Homme, et de manière préférée, en ce que les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps humain sont respectivement la région kappa et, gamma-1, gamma-2 ou gamma-4.

Sous un nouvel aspect, la présente invention concerne un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les acides nucléiques suivants: a) un acide nucléique, ADN ou ARN, codant pour un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention; b) un acide nucléique complémentaire d'un acide nucléique tel que défini en a).

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs.

Il doit être aussi compris ici que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner ici les acides nucléiques isolés obtenus par recombinaison génétique au moyen par exemple de cellules hôtes ou obtenus par synthèse chimique.

Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles peiniettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.

L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes: (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon; (2) 2 0 hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (c'est-à-dire: 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).

L'invention est également relative à un vecteur comprenant un acide nucléique selon la présente invention.

L'invention vise notamment les vecteurs de clonage et/ou d'expression qui contiennent une séquence nucléotidique selon l'invention.

Les vecteurs selon l'invention comportent de préférence des éléments qui permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques dans une cellule hôte déterminée. Le vecteur doit alors comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.

De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques.

Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques selon l'invention.

L'invention comprend également les cellules hôtes transfoiniées par ou comprenant un vecteur selon l'invention.

L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes.

L'invention concerne également les animaux, excepté l'Homme, qui comprennent au moins une cellule transformée selon l'invention.

Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de production 30 d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) la culture dans un milieu et conditions de culture appropriés d'une cellule hôte selon l'invention; et b) la récupération desdits anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ainsi produits à partir du milieu de culture ou desdites cellules cultivées.

Les cellules transformées selon l'invention sont utilisables dans des procédés de préparation de polypeptides recombinants selon l'invention. Les procédés de préparation d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre un vecteur et/ou une cellule transformée par un vecteur selon l'invention sont eux- mêmes compris dans la présente invention. De préférence, on cultive une cellule transformée par un vecteur selon l'invention dans des conditions qui pellnettent l'expression dudit polypeptide et on récupère ledit peptide recombinant.

Ainsi qu'il a été dit, l'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes. En particulier, il est possible d'identifier des séquences nucléotidiques selon l'invention, facilitant la sécrétion dans un tel système procaryote ou eucaryote. Un vecteur selon l'invention portant une telle séquence peut donc être avantageusement utilisé pour la production de protéines recombinantes, destinées à être sécrétées. En effet, la purification de ces protéines recombinantes d'intérêt sera facilitée par le fait qu'elles sont présentes dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu'à l'intérieur des cellules hôtes.

On peut également préparer les polypeptides selon l'invention par synthèse chimique. Un tel procédé de préparation est également un objet de l'invention. L'homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en oeuvre des phases solides (voir notamment Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2ème éd., (1984)) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention.

Les anticorps, ou l'un de leurs fragments fonctionnels, susceptibles d'être obtenus par un procédé selon l'invention sont également compris dans la présente invention.

Selon une deuxième forme d'exécution, la présente invention concerne un anticorps selon l'invention tel que décrit plus haut, caractérisé en ce qu'il est, en outre, capable de se lier spécifiquement sur le récepteur humain du facteur de croissance de l'épideinie EGFR et/ou capable d'inhiber spécifiquement l'activité tyrosine kinase dudit récepteur EGFR.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant à titre de principe actif un composé consistant en un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, de préférence additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Une autre fonne d'exécution complémentaire de l'invention consiste en une composition telle que décrite plus haut qui comprend, en outre, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, un agent cytotoxique/cytostatique et/ou un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase respectivement des récepteurs à l'IGF-I et/ou à l'EGF.

On entend par utilisation simultanée , l'administration des deux composés de la composition selon l'invention compris dans une seule et même 2 0 forme pharmaceutique.

On entend par utilisation séparée , l'administration, en même temps, des deux composés de la composition selon l'invention, compris dans des fbrnes phannaceutiques distinctes.

On entend par utilisation étalée dans le temps , l'administration successive des deux composés de la composition selon l'invention, compris chacun dans une forme pharmaceutique distincte.

D'une façon générale, la composition selon l'invention augmente considérablement l'efficacité du traitement du cancer. En d'autres termes, l'effet thérapeutique de l'anticorps anti-IGF-IR selon l'invention est potentialisé de manière inattendue par l'administration d'un agent cytotoxique. Un autre avantage subséquent majeur produit par une composition selon l'invention, concerne la possibilité d'utiliser des doses efficaces en principe actif plus faibles, ce qui permet d'éviter ou de réduire les risques d'apparition des effets secondaires, en particulier l'effet de l'agent cytotoxique.

De plus, cette composition selon l'invention permettrait d'atteindre l'effet 5 thérapeutique escompté plus rapidement.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition comme produit de combinaison selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique/cytostatique est choisi parmi les agents interagissant avec l'ADN, les antimétabolites, les inhibiteurs de topoisomérases I ou II, ou encore les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau ou encore tout agent susceptible d'être utilisé en chimiothérapie. De tels agents cytotoxiques/cytostatiques, pour chacune des classes d'agents cytotoxiques précitées, sont par exemple cités dans l'édition 2001 du VIDAL, à la page consacrée aux composés attachés à la cancérologie et l'hématologie colonne Cytotoxiques , ces composés cytotoxiques cités par référence à ce document sont cités ici comme agents cytotoxiques préférés.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition comme produit de combinaison selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique est couplé chimiquement audit anticorps pour une utilisation simultanée.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, ladite composition selon l'invention est caractérisée en ce que ledit agent cytotoxique/cytostatique est choisi parmi les agents inhibiteurs ou stabilisateurs du fuseau, de préférence la vinorelbine et/ou la vinflunine et/ou la vincristine.

Afin de faciliter le couplage entre ledit agent cytotoxique et ledit anticorps selon l'invention, on pourra notamment introduire des molécules espaceurs entre les deux composés à coupler, telles que des poly(alkylènes)glycols comme le polyéthylèneglycol, ou encore des acides aminés, ou, dans un autre mode de réalisation, utiliser des dérivés actifs desdits agents cytotoxiques dans lesquels auront été introduites des fonctions capables de réagir avec ledit anticorps selon l'invention. Ces techniques de couplage sont bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description.

Dans un autre mode de réalisation préféré, ledit inhibiteur de l'activité tyrosine kinase des récepteurs à l'IGF-I est sélectionné dans le groupe consistant en des agents naturels dérivés, des dianilinophtalimides, des pyrazolo- ou pyrrolopyridopyrimidines ou encore des quinazilines. De tels agents inhibiteurs sont bien connus de l'homme de l'art et décrit dans la littérature (Ciardiello F., Drugs 2000, Suppl. 1, 25-32).

Selon encore une autre forme d'exécution de l'invention, la composition telle que décrite plus haut, peut également comprendre un autre composé anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire du récepteur HER2/neu, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destinée à la prévention et au traitement de cancer, notamment les cancers surexprimant ledit récepteur HER2/neu et le récepteur IGF-IR, comme notamment le cancer du sein.

On pourra notamment se référer aux publications de Albanell et al. (J. of the National Cancer Institute, 93(24):1830-1831, 2001) et de Lu et al. (J. of the National Cancer Institute, 93(24):1852-1857, 2001) justifiant l'intérêt inattendu d'associer un anticorps anti-HER2/neu avec un anticorps anti-IGF-IR selon la 2 0 présente invention.

De manière particulière, ledit anticorps anti-HER2/neu de la composition selon l'invention est l'anticorps dénommé Trastuzumab (dénommé encore Herceptin).

L'invention est, sous un autre aspect, relative à une composition caractérisée en ce que l'un, au moins, desdits anticorps, ou l'un de leur fragment fonctionnel, est conjugué avec une toxine cellulaire et/ou un radioélément.

De préférence, ladite toxine ou ledit radioélément est capable d'inhiber au moins une activité cellulaire de cellules exprimant le récepteur IGFIR, de manière plus préférée capable d'empêcher la croissance ou la prolifération de ladite cellule, notamment d'inactiver totalement ladite cellule.

De préférence encore, ladite toxine est une toxine d'entérobactéries, notamment l'exotoxine A de Pseudomonas.

Les radioéléments (ou radioisotopes) préférés conjugués aux anticorps employés pour la thérapie sont des radioisotopes émetteurs de rayons gamma et de préférence l'Iode131, l'Yttrium90, l'Or199, le Palladium100, le Cuivre67, le Bismuth217 et l'Antimoine211. Les radioisotopes émetteurs de rayons béta et alpha peuvent également être utilisés pour la thérapie.

Par toxine ou radioélément conjugué à au moins un anticorps, ou l'un de leur fragment fonctionnel, selon l'invention, on entend désigner tout moyen permettant de lier ladite toxine ou ledit radioélément audit au moins un anticorps, notamment par couplage covalent entre les deux composés, avec ou sans introduction de molécule de liaison.

Parmi les agents peiinettant de lier de manière chimique (covalente), électrostatique, non covalente tout ou partie des composants du conjugué, on peut citer notamment la benzoquinone, la carbodiimide et plus particulièrement l'EDC (1 -Ethyl-3 [3-D iméthyl aminopropyl] carbo diimi de hydrochlori de) , la dimaléimide, l'acide dithio-bis-nitrobenzoïque (DTNB), le N- succinimidyl-S-acétyl-thioacétate (SATA), les agents pontants possédant un ou plusieurs groupements phénylazide réagissant avec les ultraviolets (U.V.) et de préférence le N-[-4- 2 0 (azidosalicylamino)butyl]-3'-(2'-pyridyldithio)propionamide (APDP), le N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP), le 6hydrazinonicotimide (HYNIC).

Une autre forme de couplage, notamment pour les radioéléments, peut consister en l'utilisation d'un chélateur d'ions bi-fonctionnel.

Parmi ces chélates, on peut citer les chélates dérivés de 1'EDTA (acide éthylènediamine-tetraacétique) ou du DTPA (acide diéthylènetriaminepentaacétique) qui ont été développés pour lier les métaux, notamment les métaux radioactifs, et les immunoglobulines. Ainsi, le DTPA et ses dérivés peuvent être substitués par différents groupes sur la chaîne carbonée afin d'augmenter la stabilité et la rigidité du complexe ligand-métal (Krejcarek et al. (1977) ; Brechbiel et al. (1991) ; Gansow (1991) ; brevet US 4 831 175).

Par exemple, l'acide diéthylènetriamine-pentaacétique (DTPA) et ses dérivés, qui sont depuis longtemps largement utilisés en médecine et en biologie soit sous leur forme libre, soit sous la forme de complexe avec un ion métallique, présentent la caractéristique remarquable de former des chélates stables avec les ions métalliques et être couplés avec des protéines d'intérêt thérapeutique ou diagnostique telles que des anticorps pour le développement de radioimmunoconjugués en thérapie du cancer (Meases et al., (1984) ; Gansow et al. (1990)).

De préférence également, ledit au moins un anticorps formant ledit conjugué selon l'invention est choisi paiini ses fragments fonctionnels, notamment les fragments amputés de leur composante Fe tels que les fragments scFv.

La présente invention comprend en outre l'utilisation de la composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament.

Plus particulièrement, selon une autre forme d'exécution, l'invention concerne l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, et/ou d'une composition pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie induite par une surexpression et/ou une activation anoimale du récepteur IGF-IR, et/ou liée à une hyperactivation de la voie de transduction du signal médié par l'interaction de IGF1 ou IGF2 avec IGF-IR.

De préférence, ladite utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que l'administration dudit médicament n'induit pas ou peu d'effets secondaires liés à une inhibition du récepteur IR de l'insuline, c'est-àdire à une inhibition de l'interaction du récepteur IR avec ses ligands naturels due à la présence dudit 2 5 médicament, notamment par une inhibition compétitive liée à la fixation dudit médicament sur l'IR.

La présente invention comprend en outre l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, et/ou d'une composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la transformation de cellules normales en cellules à caractère tumoral, de préférence IGF, notamment IGF1 et/ou IGF2 dépendante.

La présente invention est relative également à l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, et/ou d'une composition selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, de préférence IGF, notamment IGF 1 et/ou IGF2 dépendante.

De manière générale, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, et/ou d'une composition selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer de préférence exprimant l'IGF-IR et/ou de cancer présentant de préférence une hyperactivation de la voie de transduction du signal médié par l'interaction de l'IGF1 ou IGF2 avec IGF-IR, comme par exemple la surexpression de IRS 1.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence humanisé, et/ou d'une composition selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du psoriasis, psoriasis dont l'hyperprolifération épidermique peut être liée à l'expression ou la surexpression de l'IGF-IR, et/ou à l'hyperactivation de la voie de transduction du signal médié par l'interaction d'IGF-IR avec ses ligands naturels (Wraight C.J. et al. Nat. Biotechnol., 2000, 18(5):521-526. Reversai of epidermal hyperproliferation in psoriasis by insulinlike growth factor I receptor antisense oligonucleotides).

Parmi les cancers qui peuvent être prévenus et/ou traiter, on préfère le cancer de la prostate, les ostéosarcomes, le cancer du poumon, le cancer du sein, le cancer de l'endomètre ou le cancer du côlon ou tout autre cancer surexprimant IGF-IR.

Sous encore un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode de diagnostic, de préférence in vitro, de maladies liées à une surexpression ou une sousexpression, de préférence une surexpression du récepteur IGF-I à partir d'un échantillon biologique dont on suspecte laprésence anormale en récepteur IGF-I, caractérisée en ce qu'on met en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention, ledit anticorps pouvant être, le cas échéant, marqué.

De préférence, lesdites maladies liées par la surexpression du récepteur IGF-I dans ladite méthode de diagnostic seront des cancers.

Ledit anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, peut se présenter sous forme d'immunoconjugué ou d'anticorps marqué afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.

Les anticorps marqués selon l'invention ou leurs fragments fonctionnels incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, l'a-D-galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, l'anhydrase carbonique, l'acétyl-cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo-désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps ou leurs fragments fonctionnels selon l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour Green Fluorescent Protein ), le dansyl, l'umbelliférone etc. Dans de tels conjugués, les anticorps de l'invention ou leurs fragments fonctionnels peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhyde, l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que ceux cités ci-avant pour les conjugués thérapeutiques. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.

D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes, des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine, ou encore des marqueurs radioactifs tels que Iodel23, Iode125, Iode126, lode133, Brome77, Technetium99m, Indium", Indiuml 13m, Gallium67, Gallium68, Ruthénium95, Ruthénium97, Ruthénium' 03 Ruthénium 105 Mercure' 7 Mercure203 Rhénium99m Rhénium' Rhénium105 Scandium47, Tellurium'2'm Tellurium122in Teilurium12sm Thulium165 Thulium' 67, Thulium' 68, Fluors 8, yttrium'''. l'Iode' 31. Les méthodes connues de l'homme de l'art existant pour coupler les radioisotopes thérapeutiques aux anticorps soit directement soit via un agent chélatant tel l'EDTA, le DTPA citées ciavant peuvent être utilisées pour les radioéléments utilisables en diagnostic. On peut également citer ici le marquage avec du Na[I'25] par la méthode à la chloramine T. [Hunter W.M. et Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] ou encore avec le Technetium99m par la technique de Crockford et coll. (brevet US 4 424 200) ou attaché via du DTPA comme décrit par Hnatowich (brevet US 4 479 930).

Ainsi, les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, selon l'invention peuvent être employés dans un procédé pour la détection et/ou la quantification d'une surexpression ou d'une sousexpression, de préférence une surexpression du récepteur IGF-I dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) la mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention; et b) la mise en évidence du complexe IGF-I/anticorps éventuellement foliné.

Dans un mode de réalisation particulier, les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, selon l'invention, pourront être employés dans un procédé pour la détection et/ou la quantification du récepteur IGF-I dans un échantillon biologique, pour le suivi de l'efficacité d'un traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'un cancer IGF dépendant ou encore d'un psoriasis.

Plus généralement, les anticorps, ou leurs fragments fonctionnels, selon l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression du récepteur IGF-I doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative.

De. préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide biologique, tel que le sérum, le sang total, des cellules, un échantillon de tissu ou des biopsies d'origine humaine.

Toute procédure ou test classique peut être mis en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun de type anticorps-antigène. Suivant les applications selon l'invention, l'anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels peut être immobilisé ou marqué. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art. Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles.

A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus 15 immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radio-immunologique (RIA) ou équivalent.

Ainsi, la présente invention comprend également les kits ou nécessaires pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic de maladies induites par une surexpression ou une sousexpression du récepteur IGF-I ou pour la mise en oeuvre d'un procédé pour la détection et/ou la quantification d'une surexpression ou d'une sousexpression du récepteur IGF-I dans un échantillon biologique, de préférence une surexpression dudit récepteur, caractérisé en ce que ledit kit ou nécessaire comprend les éléments suivants: a) un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'invention; 25 b) éventuellement, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique; c) éventuellement, les réactifs permettant la mise en évidence des complexes IGF-IR/anticorps produits par la réaction immunologique.

L'invention est en outre relative à l'utilisation d'une composition comme 30 produit de combinaison selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer, notamment des cancers pour lesquels ledit agent cytotoxique ou ledit anticorps antiHER2/neu est généralement prescrit et, notamment, pour lesquels cancers, les cellules tumorales expriment ou surexpriment le récepteur IGF-I.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné au ciblage spécifique d'un composé biologiquement actif vers des cellules exprimant ou surexprimant le récepteur IGF-I.

On entend désigner ici par composé biologiquement actif tout composé capable de moduler, notamment d'inhiber, l'activité cellulaire, en particulier leur croissance, leur prolifération, la transcription ou la traduction de gène.

L'invention a aussi pour objet un réactif de diagnostic in vivo comprenant un anticorps selon l'invention, ou l'un de ses fragments fonctionnels, de préférence marqué, notamment radiomarqué, et son utilisation en imagerie médicale, en particulier pour la détection de cancer lié à l'expression ou à la surexpression par une cellule du récepteur IGF-I.

L'invention est également relative à une composition comme produit de combinaison ou à un conjugué anti-IGF-IR/toxine ou radioélément, selon l'invention, à titre de médicament.

De préférence, ladite composition comme produit de combinaison ou ledit conjugué selon l'invention sera additionné d'un excipient et/ou d'un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Dans la présente description, on entend désigner par véhicule pharmaceutiquement acceptable, un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des composés actifs, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode d'administration du ou des composés actifs choisis.

De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie orale. De manière plus préférée, la composition comprenant les anticorps selon l'invention, sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps.

Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description à travers les exemples et les figures dont les légendes sont ci-après: Figure 1: représente l'évaluation in vitro des anticorps anti-IGF-1R dans le modèle MCF-7 De gauche à droite en abscisse, chaque barre d'histogramme représente: - cellules seules, + IGF-1 à 1 ng/ml, + IGF-1 à 10 ng/ml, + IGF-1 à 50 ng/ml; - alphaIR3, alphaIR3 + IGF-1 à 1 ng/ml, alphaIR3 + IGF-1 à 10 ng/ml, alphaIR3 2 0 + IGF-1 à 50 ng/ml; - 2D10, 2D10 + IGF-1 à 1 ng/ml, 2D10 + IGF-1 à 10 ng/ml, 2D10 + IGF-1 à 50 ng/ml; - 2F2, 2F2 + IGF-1 à 1 ng/ml, 2F2 + IGF-1 à 10 ng/ml, 2F2 + IGF-1 à 50 ng/ml; - 7G3, 7G3 + IGF-1 à 1 ng/ml, 7G3 + IGF-1 à 10 ng/ml, 7G3 + IGF-1 à 50 ng/ml; - 21E3, 21E3 + IGF-1 à 1 ng/ml, 21E3 + IGF-1 à 10 ng/ml, 21E3 + IGF-1 à 50 ng/ml; - 12D5, 12D5 + IGF-1 à 1 ng/ml, 12D5 + IGF-1 à 10 ng/ml, 12D5 + IGF-1 à 50 ng/ml; - 12B1, 12B1 + IGF-1 à 1 ng/ml, 12B1 + IGF-1 à 10 ng/ml, 12B1 + IGF-1 à 50 ng/ml; - 13F5, 13F5 + IGF-1 à 1 ng/ml, 13F5 + IGF-1 à 10 ng/ml, 13F5 + IGF-1 à 50 ng/ml.; Figures 2 à 4: représentent l'évaluation in vivo des anticorps anti-IGF-1R sur les cellules DU145.

Exemple 1: Génération d'anticorps monoclonaux dirigés contre IGF-lR Les hybridomes ont été générés par fusion des splénocytes d'une souris BALB/c immunisée avec un IGF-IR humain recombinant hétérotétramérique soluble a2132 (R&D System, Minneapolis, USA) et la lignée de cellules du myélome SP2/0-Ag14. Les anticorps murins obtenus (AcM) ont d'abord été criblés par ELISA et analysés par FACS sur les cellules MCF-7. Puis, un criblage final sur les cellules Sf9-IGF-lr contre les MD-IR a été réalisé pour éliminer les anticorps reconnaissant à la fois IGF-1 et IR. Les AcM sélectionnés (positifs par ELISA et reconnaissant le récepteur de type sauvage sur les cellules MCF-7) ont été produits sous forme de fluides ascitiques et purifiés par chromatographie avec la protéine A avant d'être testés in vitro et/ou in vivo comme l'indique le tableau 1.

TABLEAU 1: Sélection d'anticorps monoclonaux anti-IGF-IR Analyses FACSCAN Isotype Activité In Activité vitro In vivo MCF-7 Sf9 IGF- Sf9 IR+ MCF-7 DU145 1R+ 2D10 IgG1 x + 2F2 + - - IgG 1 x +/- +/- 6E5 + + - IgG 1 x +/- + 7A4 + + - IgG 1 x - - 7G3 + - - IgG1 ?,, - - 9E5 + + - IgG 1 x +/- - 9F5 + + + Nd Nd Nd 10B7 + - - Nd Nd Nd 11H6 + + - IgE Nd - 12B1 + + - IgGI K + 12D5 + + IgGl Nd 12D8 + Nd Nd Nd Nd 13F5 + + Nd IgG 1 x + L 13G10 + +/- IgG 1 X. +/- Nd 15B9 + + - IgGI K +/- - 16Al2 + - + IgGI K +/- - 9D5 + Nd - IgG 1 K Nd Nd 13G5 + + Nd IgGI K Nd + 14H1 - Nd + IgGI K Nd Nd 15H1 - Nd Nd IgGI K Nd Nd 18B5 Nd Nd Nd Nd Nd Nd 20D1 nd Nd Nd IgGI K Nd - 21B3 - - Nd Nd Nd 13F10 Nd Nd Nd Nd Nd Nd 14A1 - Nd Nd Nd Nd Nd 2B10 + - - IgGI K - - 3A9 + +/- - IgG 1 K Nd Nd 3C9 + + - IgGI K - - 4G4 + + - IgG 1 K + Nd 6F4 + - - IgGI K +/- - 9E10 + +/- - IgGI. +/- Nd 14D7 + + - IgGI K Nd Nd 21E3 + - IgG2a I +1 nd Exemple 2: Activité in vitro d'anticorps anti-IGF1R.

Procédé: Des cellules MCF-7 de l'ATCC ont été mises en culture dans un milieu RPMI sans rouge de phénol (Invitrogen Corporation, Scotland, UK), à 10 % de sérum de veau foetal (FCS) (Invitrogen Corporation) et 1 % de LGlutamine (Invitrogen Corporation). Les cellules MCF-7 ont été placées sur des plaques de culture tissulaire de 96 puits à une densité de 5 x 104 cellules/puits dans un milieu sans sérum. Vingt-quatre heures après, une dose d'IGF1 de 1 à 50 ng/ml a été ajoutée au milieu en absence ou en présence à une concentration finale de 5 g/ml de chaque anticorps à tester. Trois jours plus tard, les cellules ont été stimulées avec 0,5 Ci de [3H]thymidine (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) pendant 16 heures. La valeur de [3H]thymidine incorporée à l'ADN insoluble dans l'acide trichloracétique a été quantifiée par comptage à scintillation liquide. Les résultats sont exprimés sous forme d'indice de prolifération (cpm des cellules plus IGF1 plus anticorps / cpm des cellules plus anticorps seulement).

Résultats: L'évaluation in vitro correspond au premier criblage des AcM en terme d'activité mitogénique. Pour ces tests de vérification, les anticorps générés, produits sous forme de fluides ascitiques, ont été ajoutés aux cellules MCF-7 en même temps que l'IGF1 et comparés à l'AcM aIR3 commercialement disponible pour sélectionner des anticorps au moins aussi efficaces que ce dernier. Les AcM positifs (5 AcM) décrits comme (+) dans le tableau 2* de la réponse précédente sont ceux qui donnent des indices de prolifération <5 lorsque les cellules ont été stimulées avec la dose la plus élevée d'IGF1 (50 ng/ml). La figure 2 montre l'activité in vitro de quatre inhibiteurs forts in vitro sur six (2D10, 12D5, 12B1, 13F5). Les AcM 2F2 et 21E3 ont été considérés comme a ( )* Mab (5< indice de prolifération <15 pour la plus forte concentration d'IGF1) ; 7G3 et 2B10 ont été considérés comme des anticorps non-neutralisant (indice de prolifération >15). Il est intéressant de noter que 21E3 est le seul AcM d'isotype IgG2.

Exemple 3: Activité in vivo d'anticorps anti-IGF-1R Procédé : Des cellules DU145 de l'ATCC ont été mises en culture dans un milieu RPMI (Invitrogen Corporation, Scotland, UK), à 10 % de sérum de veau foetal (FCS) (Invitrogen Corporation) et 1 % de L-Glutamine (Invitrogen Corporation). Les cellules ont été divisées deux jours avant la prise de greffe pour être en phase de croissance exponentielle. Deux millions de cellules DU145 ont été greffées en PBS sur des souris nudes suisses. Vingt-quatre heures après implantation, les animaux ont été répartis en groupes de 6 souris. Les souris ont été traitées en s.c. à l'opposé de la tumeur avec 200 g de chaque anticorps à tester, 3 fois par semaine. Dans le groupe contrôle, les souris ont été traitées soit avec un isotype contrôle murin (EC2) lors du premier criblage, soit du PBS lors des criblages suivants, la première expérience ayant démontré qu'aucune différence de croissance tumorale n'avait été observée entre ces 2 groupes de souris. Le volume de la tumeur a été mesuré une fois par semaine et calculé selon la formule: t/6 X longueur X largeur X hauteur.

Résultats: Trois expériences in vivo ont été réalisées pour tester un panel d'AcM. La figure 3 montre que 13F5, 2D10, 6E5 et 13G5 inhibent de façon significative la croissance in vivo des cellules DU 145. Les analyses statistiques (test de Mann et Whitney) sont retranscrites dans le tableau 2. L'AcM 13G5 a reconnu IGF-1R et IR et a été rejeté.

Tableau 2: Analyse statistique des données in vivo Premier criblage D16 D23 D29 D36 D43 PBS/13F5 Mann-Whitney p=0,47 p=0,086 p=0, 046 p=0,015 p=0,023 (Wilcoxon) Deuxième D12 D20 D26 D30 criblage PBS/2D10 Mann-Whitney p=0,0041 p=0,0017 p=0,0027 p=0,0027 (Wilcoxon) PBS/6E5 Mann-Whitney p=0,027 p=0,013 p=0,0092 p=0,019 (Wilcoxon) PBS/12B1 Mann-Whitney p=0,11 p=0,11 p=0,067 p=0,11 (Wilcoxon) PBS/2F2 Mann-Whitney p=0,18 p=0,067 p=0,050 p=0,14 (Wilcoxon) Troisième D12 D20 D26 D33 criblage PBS/13G5 Mann-Whitney p=0,012 p=0, 028 p=0,032 p=0,032 (Wilcoxon) PBS/16Al2 Mann-Whitney p=0,063 p=0,087 p=0, 19 p=0,11 (Wilcoxon)

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Anticorps isolé, ou l'un de ses fragments fonctionnels, ledit anticorps ou l'un de sesdits fragments étant capable de se lier au récepteur humain du facteur de croissance I apparenté à l'insuline IGF-IR et, le cas échéant, d'inhiber la fixation naturelle de ses ligands IGF1 et/ou IGF2 et/ou capable d'inhiber spécifiquement l'activité tyrosine kinase dudit récepteur IGF-IR, caractérisé en ce qu'il comprend: - à une chaîne légère comprenant au moins une région CDR déterminant la complémentarité choisie parmi les CDRs de séquence SEQ ID No. 1, 2 ou 3, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 1, 2 ou 3; et/ou - une chaîne lourde comprenant au moins un CDR choisi parmi les CDRs de séquence SEQ ID Nos. 4, 5 et 6, ou au moins un CDR dont la séquence présente au moins 80 % d'identité après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 4, 5 et 6.

2. Anticorps selon la revendication 1, dénommé 13F5 et caractérisé en ce qu'il comprend une chaîne lourde de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 20 et en ce qu'il comprend en outre une chaîne légère de séquence comprenant la séquence d'acide aminé SEQ ID No. 19.

3. Hybridome murin capable de sécréter un anticorps selon l'une des

2 0 revendications 1 ou 2.

4. Hybridome murin selon la revendication 3 déposé à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur, Paris (France) le 25 mars 2004 sous le numéro I-3193.

5. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, caractérisé en ce que 2 5 ledit anticorps est sécrété par l'hybridome selon la revendication 4.

6. Anticorps ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit anticorps est un anticorps chimérique et comprend en outre les régions constantes de chaîne légère et de chaîne lourde dérivées d'un anticorps d'une espèce hétérologue à la souris.

7. Anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite espèce hétérologue est l'Homme.

8. Composition comprenant à titre de principe actif un composé consistant en un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1, 2 ou 5 à 7, ou produit par l'hybridome selon l'une des revendications 3 et 4.

9. Composition selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle comprend, en outre, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps un agent cytotoxique/cytostatique et/ou un inhibiteur de l'activité tyrosine kinase des récepteurs à l'IGF-I et/ou à l'EGF.

10. Composition selon l'une des revendications 8 ou 9, à titre de médicament.

11. Utilisation d'un anticorps, ou l'un de ses fragments fonctionnels, selon l'une des revendications 1, 2 ou 5 à 7, ou produit par l'hybridome selon l'une des revendications 3 et 4, ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie liée à une surexpression et/ou une activation anormale du récepteur IGF- I, et/ou liée à une hyperactivation de la voie de transduction du signal médié par l'interaction de l'IGF1 ou IGF2 avec IGF-IR.

12. Utilisation selon la revendication 11 pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la transformation de cellules normales en cellules à caractère tumoral, de préférence IGF, notamment IGF1 et/ou IGF2, dépendante.

2 0

13. Utilisation selon la revendication 11 pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber la croissance et/ou la prolifération de cellules tumorales, de préférence IGF, notamment IGF1 et/ou IGF2, dépendante.

14. Utilisation selon l'une des revendications 11 à 13, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de cancer.

15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit cancer est un cancer choisi parmi le cancer de la prostate, les ostéosarcomes, le cancer du poumon, le cancer du sein, le cancer de l'endomètre ou le cancer du côlon.

16. Utilisation selon l'une des revendications 11 à 12, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du psoriasis.

17. Méthode de diagnostic in vitro de maladies induites par une surexpression ou une sousexpression du récepteur IGF-I à partir d'un échantillon biologique dont on suspecte la présence anormale en récepteur IGF-I, caractérisée en ce qu'on met en contact ledit échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des revendications 1, 2 ou 5 à 7, ou produit par l'hybridome selon les revendications 3 et 4, ledit anticorps pouvant être, le cas échéant, marqué.