JP2012153692A - 新規な抗igf−ir抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ヒトインスリン様成長因子I受容体IGF−IR特異的結合性マウスのモノクローナル抗体、並びにこれらの抗体をコードするアミノ酸配列及び核酸配列に関する。また、IGF−IRを過剰発現する癌又はその受容体の過剰発現に関連した病状の予防的処置及び/又は治療的処置を目的とした薬剤としての、並びにIGF−IRの過剰発現に関連した疾患の診断のための方法又はキットにおけるこれら抗体の使用を含む。
【選択図】なし
Description
g14)との細胞融合を生じさせるマウスハイブリドーマである。
a)本発明による抗体又はその機能的断片の一つをコードする核酸、DNA又はRNA、及び
b)a)で定義されたような核酸に相補的な核酸
から選択されることを特徴とする、単離された核酸に関する。
a)本発明による宿主細胞を培地内で適切な培養条件で培養する工程、及び
b)このようにして生成された上記抗体又はその機能的断片の一つを、培養培地又は上記培養した細胞から回収する段階。
a)生体試料を、本発明による抗体又はその機能的断片の一つと接触させる工程、及び
b)形成された可能性のあるIGF−IR/抗体複合体を明らかにする工程
を含むことを特徴とする。
(a)本発明による抗体又はその機能的断片の一つ、
(b)所望により、免疫学的反応に適した培地を形成するための試薬、
(c)所望により、免疫学的反応によって生成したIGF−IR/抗体複合体を明らかにすることが可能な試薬
を含むことを特徴とする。
−図1は、MCF−7モデルにおける抗IGF−1R抗体のin vitroでの評価を示す図である。
−図2及び3は、DU145での抗IGF−1R抗体のin vivoでの評価を示す図である。
−図4は、IGF−IRを発現する無傷細胞での[125I]−IGF−1の排除を示す図である。
−図5は、イムノキャプチャーしたHR−Aでの[125I]−IGF−1の排除を示す図である。
−図6は、イムノキャプチャーしたHR−Bでの[125I]−IGF−1の排除を示す図である。
−図7は、IR−Aを発現する無傷細胞での[125I]−INSの排除を示す図である。
−図8は、IR−Bを発現する無傷細胞での[125I]−INSの排除を示す図である。
可溶性のα2−β2ヘテロ四量体組換えヒトIGF−1R(R&Dシステム、米国ミネアポリス)で免疫されたBALB/cマウス由来の脾細胞とSP2/0−Ag14骨髄腫細胞株との融合によってハイブリドーマを作製した。得られたマウス抗体は、まずMCF−7細胞でのELISA及びFACS分析によってスクリーニングした。その後、Sf9−IGF−1R細胞とSf9−IR細胞で最後のスクリーニングを行い、IGF−1及びIRの両方を認識する抗体を除外した。選択されたMAb(ELISAで陽性であり、MCF−7細胞の野生型受容体を認識する)を、腹水として産生し、プロテインAクロマトグラフィで精製した後、in vitro及び/又はin vivoで試験し、結果を表1にまとめた。
方法
ATCCから入手したMCF−7細胞を、フェノールレッドフリーRPMI培地(インビトロジェン社、英国、スコットランド)、10%FCS(インビトロジェン社)、1%L−グルタミン(インビトロジェン社)中で常法により培養した。MCF−7細胞を、96ウェル組織培養プレートの無血清培地中に5×104細胞/ウェルの密度で播種した。24時間後、最終濃度が5μg/mlの各試験抗体の非存在下又は存在下で、IGF1を1〜50ng/mlの範囲の投与量で培地に添加した。3日後、0.5μCiの[3H]チミジン(アマシャムバイオサイエンス AB、スウェーデン国、ウプサラ)を細胞に16時間パルスした。トリクロロ酢酸に不溶性のDNAに組み込まれた[3H]チミジンの量を、液体シンチレーション計数によって定量した。結果を増殖指数(細胞+IGF1+抗体のcpm/細胞+抗体のみのcpm)として表す。
in vitroでの評価は、細胞分裂促進活性に関するMabの第一のスクリーニングであった。これらの分析は、腹水として産生された、作製された抗体を、IGF1と同時にMCF−7細胞に添加し、市販のαIR3Mabと比較して、その抗体と少なくとも同等に有効である抗体を選択することによって行った。先の結果の表2*中で(+)と記載されている陽性のMab(5つのMab)は、最も高い投与量のIGF1(50ng/ml)で細胞を刺激したときに増殖指数<5を示すものである。図1は、6つの強いin vitro阻害剤のうちの4つ(2D10、12D5、12B1、13F5)のin vitro活性を示す。2F2及び21E3のMabは、(±)*Mab(最も高いIGF1濃度の場合に5<増殖指数<15)であると考えられ、7G3及び2B10は、非中和抗体(増殖指数>15)であると考えられた。21E3がIgG2アイソタイプのMabにすぎないことは興味深い。
方法
ATCCから入手したDU145細胞を、DMEM培地(インビトロジェン社、英国、スコットランド)、10%FCS(インビトロジェン社)、1%L−グルタミン(インビトロジェン社)中で常法により培養した。細胞を移植の二日前に分割して、対数増殖期となるようにした。PBS中の200万個のDU145細胞をSwissヌードマウスに移植した。移植の一日後、マウスを6頭の群に分割した。1週間に3回、200μgの各試験抗体で、腫瘍と反対の位置においてマウスを皮下注射処理した。コントロール群は、最初のスクリーニングにおいてマウスのアイソタイプのコントロール(EC2)で処理するか、又は続くスクリーニングにおいてPBSで処理するとしたが、これは、最初の実験においてマウスのこれら2つの群の間で腫瘍成長の差異が観察されなかったことが示されたためである。腫瘍の体積を一週間に一度測定し、次の式によって算出した:π/6×長さ×幅×高さ。
三つのin vivoでの実験を、Mabパネルを試験するために行った。図2及び図3は、13F5、2D10及び6E5が、DU145細胞のin vivoでの成長を有意に阻害することを示す。統計分析(マンホイットニー検定)の結果を表2に示す。
この研究に用いた細胞を以下に列挙する。
・R+:IGF−I受容体(IGF−IR)のcDNAを安定的にトランスフェクトしたR−繊維芽細胞、
・R−/IR−A:インスリン受容体アイソフォームA(IR−A)のcDNAを安定的にトランスフェクトしたR−繊維芽細胞、
・R−/IR−B:インスリン受容体アイソフォームB(IR−B)のcDNAを安定的にトランスフェクトしたR−繊維芽細胞、
・R+/IR−A:IGF−I及びインスリン受容体アイソフォームAのcDNAを安定的にコトランスフェクトし、それによりハイブリッド受容体A(ハイブリッド−RsA)を発現するR−繊維芽細胞、
・R+/IR−B:IGF−I及びインスリン受容体アイソフォームBのcDNAを安定的にコトランスフェクトし、それによりハイブリッド受容体A(ハイブリッド−RsB)を発現するR−繊維芽細胞。
Claims (27)
- ヒトインスリン様成長因子I受容体IGF−IRに結合することができる、単離された抗体又はその機能的断片の一つであって、配列番号1、2及び3の配列を有する3つの相補性決定領域CDRを含む軽鎖を含み、かつ、配列番号4、5及び6の配列を有する3つのCDRを含む重鎖を含み、さらにインスリン/IGF−Iハイブリッド受容体(ハイブリッド−R)に結合し得ることを特徴とする、単離された抗体又はその機能的断片の一つ。
- 配列番号20のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含むこと、及び配列番号19のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖をさらに含むことを特徴とする、13F5と呼ばれる請求項1に記載の抗体。
- 請求項1又は2に記載の抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ。
- 2004年3月25日にCNCM(パリ、パスツール研究所)に番号I−3193で寄託された、請求項3に記載のマウスハイブリドーマ。
- ヒトインスリン様成長因子I受容体IGF−IRに結合することができる、単離された抗体又はその機能的断片の一つであって、配列番号7、8及び9の配列を有する3つの相補性決定領域CDRを含む軽鎖を含み、かつ、配列番号10、11及び12の配列を有する3つのCDRを含む重鎖を含み、さらにインスリン/IGF−Iハイブリッド受容体(ハイブリッド−R)に結合し得ることを特徴とする、単離された抗体又はその機能的断片の一つ。
- 配列番号22又は23のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含むこと、及び配列番号21のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖をさらに含むことを特徴とする、12D5と呼ばれる請求項5に記載の抗体。
- 請求項5又は6に記載の抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ。
- 2004年4月8日にCNCM(パリ、パスツール研究所)に番号I−3195で寄託された、請求項7に記載のマウスハイブリドーマ。
- ヒトインスリン様成長因子I受容体IGF−IRに結合することができる、単離された抗体又はその機能的断片の一つであって、配列番号13、14及び15の配列を有する3つの相補性決定領域CDRを含む軽鎖を含み、かつ、配列番号16、17及び18の配列を有する3つのCDRを含む重鎖を含み、さらにインスリン/IGF−Iハイブリッド受容体(ハイブリッド−R)に結合し得ることを特徴とする、単離された抗体又はその機能的断片の一つ。
- 配列番号25のアミノ酸配列を含む配列の重鎖を含むこと、及び配列番号24のアミノ酸配列を含む配列の軽鎖をさらに含むことを特徴とする、2D10と呼ばれる請求項9に記載の抗体。
- 請求項9又は10に記載の抗体を分泌することができるマウスハイブリドーマ。
- 2004年5月13日にCNCM(パリ、パスツール研究所)に番号I−3214で寄託された、請求項11に記載のマウスハイブリドーマ。
- 請求項4、8又は12に記載のハイブリドーマによって分泌されることを特徴とする抗体、又はその機能的断片の一つ。
- 前記抗体がキメラ抗体であり、マウスとは異なる種の抗体に由来する軽鎖及び重鎖の定常領域をさらに含むことを特徴とする、請求項13に記載の抗体又はその機能的断片の一つ。
- 前記異なる種がヒトであることを特徴とする、請求項14に記載のキメラ抗体又はその機能的断片の一つ。
- 2004年7月1日にCNCM(パリ、パスツール研究所)に番号I−3249で寄託されたマウスハイブリドーマであって、ヒトインスリン様成長因子I受容体IGF−IRおよびインスリン/IGF−Iハイブリッド受容体(ハイブリッド−R)に結合し得る抗体を生産するマウスハイブリドーマ。
- 請求項1、2、5、6、9、10、13〜15のいずれか一つに記載の抗体もしくはその機能的断片の一つ、又は請求項3、4、7、8、11、12もしくは16に記載のハイブリドーマによって産生される抗体もしくはその機能的断片の一つから成る化合物を有効成分として含む組成物。
- 同時の使用、別個の使用又は連続した使用を目的とした組合せ製品として、抗体、細胞傷害性/細胞増殖抑制性物質、並びに/又はIGF−I及び/もしくはEGFに対する受容体のそれぞれのチロシンキナーゼ活性の阻害剤をさらに含むことを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
- 薬剤としての請求項17又は18に記載の組成物。
- IGF−I受容体の過剰発現及び/もしくは異常な活性化に関連する疾患、並びに/又はIGF1もしくはIGF2とIGF−IRとの相互作用が介在するシグナル伝達経路の過剰な活性化に関連する疾患の予防又は治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項1、2、5、6、9、10、13〜15のいずれか一つに記載の抗体もしくはその機能的断片の一つ、又は請求項3、4、7、8、11、12もしくは16に記載のハイブリドーマにより産生される抗体もしくはその機能的断片の一つ、及び/又は請求項17〜19のいずれか一つに記載の組成物の使用方法。
- 腫瘍特性を有する細胞への正常細胞の形質転換を阻害することを目的とする薬剤の調製のための、請求項20に記載の使用方法。
- 腫瘍細胞の成長及び/又は増殖を阻害することを目的とする薬剤の調製のための、請求項20に記載の使用方法。
- 癌の予防又は治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項20〜22のいずれか一つに記載の使用方法。
- 前記癌が、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌又は結腸癌から選択される癌であることを特徴とする、請求項23に記載の使用方法。
- 乾癬又はアテローム性動脈硬化症の予防又は治療を目的とする薬剤の調製のための、請求項20〜22のいずれか一つに記載の使用方法。
- IGF−I受容体の異常な存在が疑われる生体試料から、IGF−I受容体の過剰発現又は低発現をin vitroで分析する方法であって、前記生体試料を、請求項1、2、5、6、9、10、13〜15のいずれか一つに記載の抗体又は請求項3、4、7、8、11、12もしくは16に記載のハイブリドーマにより産生される抗体と接触させることを特徴とする方法。
- ハイブリッド−RのアイソフォームA及び/もしくはアイソフォームBと結合することができ、且つ/又はその天然リガンドの結合を阻害することができることを特徴とする、請求項1、2、5、6、9、10、13〜15のいずれか一つに記載の抗体。
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