CN104020294B - 用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒及其用途。本发明所述试剂盒中包含由保藏号CGMCC？NO.9106以及保藏号为CGMCC？NO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，其中任选一种单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。本发明发明人制备并筛选得到的两株杂交瘤细胞株能够识别马传染性贫血病毒p26蛋白不同抗原表位，且实验证明该两株杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体只与马传染性贫血病毒而不与其他马源病毒反应，使用本发明的方法检测马传染性贫血病毒p26蛋白抗原，其最低检测下限为98pg。本发明为马传染性贫血病毒的检测提供了一种有效的，准确性高的新的检测手段，同时为马传染性贫血病毒的防治提供了技术支撑。

Description

用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及一种病毒抗原检测试剂盒及其用途，特别涉及一种用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒及其用途，本发明属于病毒感染的诊断及检测技术领域。
背景技术
马传染性贫血病毒(EIAV)是反录病毒科(Retroviridae)慢病毒属的成员，可引起马、骡、驴的传染性贫血病，以发热、贫血、出血、黄疸、浮肿、心机能紊乱、血相变化和进行性消瘦为特征。根据临诊表现，常分为急性、亚急性、慢性和隐性4种病型,除有主要症状如发烧、贫血、黄疸、出血、心机能紊乱外，血液学的变化也很突出，如红细胞数减少、血红蛋白量降低、白细胞数常减少和静脉血中出现吞铁细胞等。该病呈世界分布，给养马业造成巨大经济损失。此外也曾有几例人感染此病毒的报道。发烧期的病马是最危险的传染源，其血液和脏器(肝、脾、骨髓、淋巴结等)含有大量病毒，常随同分泌物和排泄物排出体外而散播。慢性病马能长期甚至终身带毒。
EIAV是正链RNA病毒，其基因组结构与其它慢病毒相似。病毒RNA编码三个主要结构基因gag、pol和env，此外还有几个小开放阅读框架(ORFS1、S2、S3)，其中gag和pol基因部分重叠。病毒RNA基因组两端是完全相同的重复区(R区)，在5’R下游是5’独特区(US)；3’端R区上游是3’独特区(U3)。EIAvGag前体蛋白为分子量为55KD的Pr55，Pr55经病毒编码的蛋白酶裂解产生四种主要的结构蛋白。分别为基质蛋白MP15、衣壳蛋白CA/p26、核衣壳蛋白NC/P11及核心蛋白p9。基质蛋白MA、衣壳蛋白CA、核衣壳蛋白NC是构成病毒粒子的主要蛋白，尤其是p26，可以占病毒蛋白总量的40％，在病毒装配和出芽过程中发挥重要作用。由于P26蛋白非常保守，任何不同血清型的马传贫病毒感染马都能产生对P26抗原的抗体，因此P26蛋白是马传贫免疫琼脂扩散(AGID)和ELISA诊断法使用的主要抗原。
马传贫的流行病毒调查主要以血清学检测为主，然而血清抗体的产生往往滞后于病毒感染，因此，血清学检测抗体会有漏检的情况出现。目前，针对EIAV抗原检测的方法主要有RT-PCR方法、ELISA方法以及传统的病毒分离鉴定等，病毒分离耗时费力，荧光定量RT-PCR使用Taq探针法价格昂贵，相比之下，ELISA方法最为简便快捷、成本低又敏感性高、特异性好。然而利用ELISA方法检测EIAV病毒的报道并不多见，国际上也没有检测马传贫病毒的商品化试剂盒。目前多采用商品化的反转录酶试剂盒检测和定量EIAV病毒，但是该试剂盒中应用HIV的反转录酶作为标准品，因此在定量和检测EIAV时的准确性并不十分理想，而且该试剂盒价格昂贵，不适合于大批量临床样品的检测。因此，建立一种快速、敏感、可靠的方法检测EIAV病毒，形成可应用于实际临床样本检测的ELISA商品化试剂盒是十分必要和亟待解决的。
该检测方法的应用对及时控制疾病传播和蔓延，最大限度的减少马传贫对养马业造成的损失具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒及其用途。
为此，本发明发明人制备并筛选出了两株能够识别马传染性贫血病毒p26蛋白不同抗原表位的杂交瘤细胞株，特异性实验证明由该两株杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体只与马传染性贫血病毒而不与I型马疱疹病毒，IV型马疱疹病毒，马流感病毒以及马动脉炎病毒反应，说明本发明的方法特异性好。此外，灵敏度实验证明使用本发明的方法检测马传染性贫血病毒p26蛋白抗原，其敏感性为98pg。因此，本发明为马传染性贫血病毒的检测提供了一种有效的，准确性高的新的检测手段。
具体的，本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的一种用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含由保藏号CGMCCNO.9106以及保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，任选其中一种单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。
其中，保藏号为CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株，命名为EIAV-p26-1G11，分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年4月21日。
其中，保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株，命名为EIAV-p26-9H8，分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2014年4月21日。
在本发明中，优选的，保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。
更优选的，保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体是用辣根过氧化物酶标记的。
在本发明中，优选的，所述试剂盒还进一步包含阳性参考品、稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
在本发明中，优选的，所述的阳性参考品为纯化的马传染性贫血病毒p26蛋白，所述的稀释液为含有10％(v/v)小牛血清(CS)以及0.1％(v/v)TRITONX-100的磷酸盐缓冲液，所述的封闭液为含有5％(v/v)小牛血清的磷酸盐缓冲液，所述的洗涤液为PBST缓冲液，所述的显色液的TMBA+B双组分显色液，所述的终止液为2MH2SO4。
在本发明中，优选的，所述的试剂盒是通过以下步骤检测马传染性贫血病毒p26蛋白：
(1)用稀释液将保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体稀释至1μg/ml，加至96孔板，每孔100μl，4℃过夜，所述的稀释液为含有10％小牛血清以及0.1％TRITONX-100的磷酸盐缓冲液；
(2)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(3)用含有5％小牛血清的磷酸盐缓冲液封闭，每孔200μl，37℃封闭1h；
(4)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(5)加入稀释后的待检测抗原，每孔100μl，37℃孵育2h；
(6)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(7)用稀释液稀释HRP标记的保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，加入稀释后的酶标抗体，每孔100μl，37℃孵育2h；
(8)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(9)加入TMBA+B双组分显色液，每孔100μl，室温避光静止10min；
(10)加入2MH2SO4终止反应，立即于OD450nm测值。
进一步的，本发明还提出了以上任一项所述的试剂盒在制备检测马传染性贫血病毒p26蛋白以及在制备检测马传染性贫血病毒的试剂中的应用。
附图说明
图1为两株单克隆抗体进行间接免疫荧光实验的结果；
图2为p26基因的序列的分段表达；
图3为单抗1G11以及9H8与p26基因不同区段的Westernblotting结果；
图4为特异性实验结果图；
图5为AC-ELISA检测的线性范围确定；
图6为AC-ELISA检测2倍梯度稀释的EIAVcmv3-8p26蛋白的浓度与对应的OD450值绘制线性图；
图7为采用本发明的AC-ELISA方法与其他方法进行检测的比较结果。
具体实施方式
下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1单克隆抗体Mab的制备和纯化
1、仪器和试剂：
CO2培养箱(HealForce,HongKong)；水浴锅(一恒，China)；倒置显微镜(Nikon,Japan)；离心机(ThermoScientific,UnitedStates)；液体石蜡(国产)；
BALB/C小鼠(实验动物中心提供)；1640培养液(HyClone，UnitedStates)；FBS(Gibco，UnitedStates)；电泳仪(BioRad,UnitedStates)；浓度测定仪(ThermoScientific,UnitedStates)；BCA(Novagen,Germany)；10mL注射器(康寿,China)；50mL离心管(corning)；0.45μm滤膜(Millipore,UnitedStates)；HiTrapProteinG(10mL)(GE,UnitedStates)；BindingBuffer:20mMsodiumphosphate(恒兴,China)，pH7.0ElutionBuffer:0.1Mglycine-HCl(KH,0167)，pH9.0。
2、杂交瘤细胞的筛选
以纯化后的原核表达的重组天然p26蛋白免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，一免将重组p26蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化，二免和三免将重组p26蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，免疫剂量为50μg/只，免疫途径为腹腔免疫。分别在二免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清(4℃离心，3000g，10min)，用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射50μg免疫抗原(不加佐剂)。
融合前一天准备饲养层细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞4:1的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准好的饲养层细胞之上。
利用纯化后的原核表达p26蛋白建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆，克隆3轮，将克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。
最终获得两株可以稳定分泌抗p26蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为EIAV-p26-1G11以及EIAV-p26-9H8，其中，EIAV-p26-1G11保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.9106，保藏日期为2014年4月21日。EIAV-p26-9H8保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.9107，保藏日期为2014年4月21日。
3、单克隆抗体的大量制备
(1)将EIAV-p26-9H8杂交瘤细胞株于液氮罐取出，置于37℃水浴锅复苏。
(2)加入1640培养液(20％FBS+1％双抗)至细胞培养瓶，放入37℃，5％CO2培养箱进行培养。
(3)于细胞生长生长期收集细胞：先用移液器轻轻吹打使细胞脱落，1000rpm4℃离心10min，用1640(不含FBS和双抗)培养液重悬细胞。将重悬细胞置于倒置显微镜下进行计数，按照1×105/cm2分装细胞。
(4)对6-8周龄雌性BALB/C小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，7-10天后每只小鼠腹腔注射1×105个杂交瘤细胞，待一周后观察腹腔有明显膨大后抽取腹腔积液，分装至EP管中。
(5)分装后的腹腔积液4℃，5000rpm离心10min，离心后取上清分装，-80℃保存，得到的单抗命名为EIAV-p26-9H8单克隆抗体(简称9H8)，-80℃冻存。
同样方法制备EIAV-p26-1G11(简称1G11)单克隆抗体。
4、单克隆抗体的纯化(按照GE说明书进行)
(1)将单克隆抗体于-80℃取出，在纯化前先用0.45μm滤膜过滤；
(2)在每个收集管加入60μl1MTris-HCl(pH9.0)；
(3)将装有10mlBindingBuffer的注射器连接柱子顶端，打开柱子底部螺栓，推动注射器使BindingBuffer以1mL/min的速度流经柱子；
(4)注射器吸入样品，同样使样品流经柱子，流速为0.2-1mL/min；
(5)用5-10mLBindingBuffer洗脱未结合的样品；
(6)用2-5mLElutionBuffer洗脱在结合在柱子上的单克隆抗体；
(7)SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析目的条带；
(8)BCA法测定蛋白浓度；
(9)分装纯化样品，-80℃保存。
5、单抗亚型鉴定(按照说明书进行)(SouthernBiotechAssociations,UnitedStates)
主要的步骤为：用试剂盒提供的捕获抗体包被ELISA板，封闭后加入待检单克隆抗体，并通过孵育HRP标记的检测抗体，最终在酶标仪上读取ELISA板。
结果：
(1)单克隆抗体的验证
在293T细胞上，通过脂质体Lipo2000转染EIAV感染性克隆cmv3-8质粒，转染后48h，分别应用两株单克隆抗体进行间接免疫荧光实验，结果如图1所示，两株单抗均可以特异性的识别EIAV。
(2)亚型鉴定
两株单克隆抗体经亚型鉴定，结果如表1所示：阳性对照孔(screeningantibody)和阴性对照孔(NTC)的检测结果均与预期结果一致，经检测两株单抗均为κ链，其中9H8单抗为IgG2a，1G11单抗为IgG1。
表1
实施例2两株单克隆抗体表位的初步鉴定
1、方法
对p26基因的序列进行分段表达，将p26基因的序列分成首位重叠的4段序列，每段序列大小约为240bp(如图2)，分别设计引物，利用限制性内切酶BamHI和SalI，将目的基因克隆到pET30a载体上，通过大肠杆菌原核表达系统进行目的蛋白的表达。
将获得的含有目的蛋白的原核表达菌菌液进行Westernblotting分析，分别用两株单抗作为一抗进行孵育，用抗鼠二抗进行检测。从而筛选出特定单克隆抗体所识别的线性表位。
2、结果
将p26基因序列分4段进行扩增，将获得的扩增子克隆到pET30a载体上，经过PCR、酶切和测序鉴定正确的克隆，转化到DH5α感受态中，在OD值为0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，室温条件下诱导表达4h。收集菌液进行Westernblotting检测，结果如图3所示。从该结果可以看出单抗1G11识别的表位位于d4区，而9H8识别的表位位于d1和d2交叉区，由此说明，两株单抗分别识别p26蛋白的不同表位。
实施例3马传染性贫血病毒p26抗原的检测
1、实验仪器和试剂
仪器：ELISA板(COSTA)；微孔震荡仪；37℃恒温箱；酶标仪
试剂：小牛血清(CS)，PBS(工程中心提供)，Tween-20(SIGMA)；TRITONX-100(SIGMA)；裂解液(homemade)、PBST(0.1MPBS+0.2％(v/v)Tween-20)，封闭液(0.1MPBS+5％(v/v)CS)，抗原抗体稀释液(0.1MPBS+10％(v/v)CS+0.1％(v/v)TRITONX-100)。
2、方法
2.1CutOff值的确定：
选取30份阴性样品采用本发明的捕获ELISA检测方法(AC-ELISA)进行检测，具体方法为：
(1)用稀释液将保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-9H8稀释至1μg/ml，加至96孔板，每孔100μl，4℃过夜；
(2)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(3)用含5％(v/v)CS的0.1MPBS缓冲液封闭，每孔200μl，37℃封闭1h；
(4)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(5)分别加入稀释后的30份阴性样品，每孔100μl，37℃孵育2h；
(6)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(7)用稀释液按照1：5000稀释HRP标记的保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-1G11，加入稀释后的酶标抗体，每孔100μl，37℃孵育2h；
(8)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(9)加入TMBA+B双组分显色液，每孔100μl，室温避光静止10min；
(10)加入2MH2SO4终止反应，立即于OD450nm测值。
将获得的OD450检测结果进行平均值(X)和标准偏差(SD)的计算，以X+2SD值作为阴性结果的上限，以X+3SD值作为阳性结果的下限，二者之间判定为疑似，并重复检测。
2.2特异性实验:
(1)用稀释液将保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-9H8稀释至1μg/ml，加至96孔板，每孔100μl，4℃过夜；
(2)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(3)用含5％(v/v)CS的0.1MPBS缓冲液封闭，每孔200μl，37℃封闭1h；
(4)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(5)加入稀释后的待检测抗原，每孔100μl，37℃孵育2h；所述待检抗原包括EIAV病毒的感染性克隆毒，EIAV病毒的假病毒粒子，EIAV病毒，I型马疱疹病毒(EHV-1)，IV型马疱疹病毒(EHV-4)，马流感病毒(EIV)，马动脉炎病毒(EAV)的病毒液；
(6)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(7)用稀释液按照1：5000稀释HRP标记的保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-1G11，加入稀释后的酶标抗体，每孔100μl，37℃孵育2h；
(8)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(9)加入TMBA+B双组分显色液，每孔100μl，室温避光静止10min；
(10)加入2MH2SO4终止反应，立即于OD450nm测值。
2.3敏感性试验
2.3.1检测纯化的p26蛋白的敏感性
(1)用稀释液将保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-9H8稀释至1μg/ml，加至96孔板，每孔100μl，4℃过夜；
(2)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(3)用含5％(v/v)CS的0.1MPBS缓冲液封闭，每孔200μl，37℃封闭1h；
(4)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(5)用稀释液将纯化的p26蛋白分别由2μg/ml经2倍梯度稀释至0.00098μg/ml，分别将每一梯度稀释后的p26蛋白抗原加入96孔板中，每孔100μl，37℃孵育2h；
(6)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(7)用稀释液按照1：5000稀释HRP标记的保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-1G11，加入稀释后的酶标抗体，每孔100μl，37℃孵育2h；
(8)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(9)加入TMBA+B双组分显色液，每孔100μl，室温避光静止10min；
(10)加入2MH2SO4终止反应，立即于OD450nm测值。
2.3.2检测浓缩的cmv3-8(EIAV的感染性克隆)的敏感性
(1)用稀释液将保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-9H8稀释至1μg/ml，加至96孔板，每孔100μl，4℃过夜；
(2)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(3)用含5％(v/v)CS的0.1MPBS缓冲液封闭，每孔200μl，37℃封闭1h；
(4)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(5)用稀释液将将浓缩的cmv3-8病毒从50倍稀释开始做2倍梯度稀释，分别将每一梯度稀释后的病毒液加入96孔板中，每孔100μl，37℃孵育2h；
(6)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(7)用稀释液按照1：5000稀释HRP标记的保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-1G11，加入稀释后的酶标抗体，每孔100μl，37℃孵育2h；
(8)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(9)加入TMBA+B双组分显色液，每孔100μl，室温避光静止10min；
(10)加入2MH2SO4终止反应，立即于OD450nm测值。
3、结果
3.1CutOff值的确定
30份阴性样品的检测结果(OD450)如表2所示，平均值为0.050，SD值为0.004，所以阴性结果的上限值为0.057，阳性结果的下限为0.061，0.057～0.061判定为疑似。
表230份阴性样品的检测结果
0.056 0.055 0.049 0.051 0.047
0.048 0.059 0.045 0.047 0.045
0.049 0.05 0.045 0.049 0.046
0.055 0.046 0.051 0.047 0.056
0.056 0.051 0.049 0.049 0.048
0.048 0.048 0.046 0.046 0.049
3.2特异性实验结果
实验结果的判定：阴性对照结果必须满足OD450小于0.057；OD450大于0.061判定为阳性结果，小于0.057的判定为阴性。特异性实验结果如图4所示，EIAV病毒的感染性克隆毒(cmv3-8)、EIAV病毒的假病毒粒子(gp2)、EIAV病毒(FDDV11)检测结果均为阳性，说明该方法可以特异性的检测EIAV病毒，而对于其他马病病毒，如I型马疱疹病毒(EHV-1)、IV型马疱疹病毒(EHV-4)、马流感病毒(EIV)和马动脉炎病毒(EAV)均不产生特异性反应，由此说明该方法具有较好的特异性。
3.3敏感性实验结果
3.3.1该方法检测纯化的p26蛋白的敏感性
使用本发明方法检测纯化的p26蛋白的敏感性试验结果如下表3所示：
表3纯化的p26蛋白的敏感性试验结果
将2ug/ml的P26蛋白进行2倍梯度稀释，表3结果表明，当p26浓度为0.00098ug/ml时，OD450为0.0765，大于0.061，仍为阳性结果，因此，则该方法的敏感性为0.00098ug/ml，即0.98ng/ml，因96孔板每孔的检测体积为100ul，因此本方法的敏感性为98pg。
依据表3中的结果，以p26蛋白浓度为横坐标，为OD450值纵坐标作图，如图4所示，结果显示p26浓度在4ng/ml～62.5ng/ml范围内呈现良好的线性关系，线性方程如图5所示，斜率为18.729，R2值大于0.99。
3.3.2该方法检测浓缩的cmv3-8(EIAV的感染性克隆)的敏感性
将浓缩的cmv3-8病毒液从50倍稀释开始做2倍梯度稀释，进行AC-ELISA检测，同时以滴度稀释的p26蛋白作为标准品，绘制标准曲线，利用该标准曲线对在线性范围内的EIAVcmv3-8最小稀释度进行定量计算，确定EIAVcmv3-8与OD450之间的线性关系。结果如表4所示，从表4结果可以看出AC-ELISA最低可以检测到12800倍稀释的EIAVcmv3-8病毒，将OD450为1.222(在p26标准曲线的线性范围内的最高OD450值)时，即800倍稀释的cmv3-8病毒，代入p26线性方程(y＝18.729x+0.0875)，得出含有p26蛋白的浓度为0.06ug/ml，以此浓度计算2倍梯度稀释的病毒浓度，由表中可以看出，AC-ELISA最低可以检测到12800倍稀释的EIAVcmv3-8病毒，经推算，对应的p26蛋白的浓度为0.94ng/ml，相当于94pg/孔，与对纯化的p26蛋白检测的敏感性(0.98ng/ml，98pg/孔)一致；
此外利用推算得出的p26蛋白的浓度与对应的OD450值绘制线性图，结果如图6所示，R2值大于0.99，EIAVcmv3-8与OD450之间呈现良好的线性关系，其斜率(19.385)与标准品斜率(18.729)相当，由此说明，该方法对病毒中p26蛋白检测的敏感性和纯化的p26蛋白的敏感性一致。
表4检测浓缩的cmv3-8的敏感性结果
实施例4重复性试验结果
1、组内重复试验(interassay)
每组试验中，每个稀释度做2个重复，选择高、中、低浓度的p26蛋白进行试验，三组试验结果显示，每组组内重复实验表明，变异系数(CV)小于6.5％，说明组内具有良好的重复性，如表5所示。
2、组间重复试验(intraassay)
p26蛋白检测三组重复试验表明，组间变异系数(CV)小于8.3％，说明组间具有良好的重复性，如表5所示。
表5组内和组间重复试验结果(p26蛋白)
实施例5试剂盒的制备
1、稀释液：含有10％(v/v)CS以及0.1％(v/v)TRITONX-100的0.1M磷酸盐缓冲液；
2、洗涤液：含有0.2％(v/v)Tween-20的0.1MPBS；
3、封闭液：含有5％(v/v)小牛血清的0.1MPBS缓冲液
4、显色液：TMBA+B双组分显色液；
5、终止液：2MH2SO4；
6、捕获抗体：保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-9H8；
7、酶标二抗：HRP标记的保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-1G11。
实施例6试剂盒的制备
1、稀释液：含有10％(v/v)CS以及0.1％(v/v)TRITONX-100的0.1M磷酸盐缓冲液；
2、洗涤液：含有0.2％(v/v)Tween-20的0.1MPBS；
3、封闭液：含有5％(v/v)小牛血清的0.1MPBS缓冲液
4、显色液：TMBA+B双组分显色液；
5、终止液：2MH2SO4；
6、捕获抗体：保藏号为CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-1G11；
7、酶标二抗：HRP标记的保藏号CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体EIAV-p26-9H8。
实验例1本发明的方法(EIAV捕获ELISA)与其他方法的比较实验
方法：
将2倍梯度稀释的cmv3-8假病毒，分别通过本发明所建立方法(EIAV捕获ELISA，AC-ELISA)、Westernblotting分析(WB)和反转录酶(RT)的测定(按照德国罗氏公司Reversetranscriptaseassay试剂盒说明书操作)进行检测。由于WB的上样体积较小(20ul)，而ELISA和RT试验的检测体积均为100ul，为了使3个平行实验检测的目的蛋白总量一致，将20ul的cmv3-8假病毒稀释到100ul用于ELISA和RT试验。对于WB试验，用EIAV马阳性血清(1:1000倍稀释)作为一抗，用Dligh800标记的抗马多抗(KPL公司)作为二抗，在Odyssey仪器上进行目的蛋白的检测。
结果：
1.与Westernblotting方法的比较：
结果如图7A和图7B所示，AC-ELISA和WB结果均可以检测到12800倍稀释的cmv3-8，WB检测试验采用Dlight800的标记的二抗，该标记物的检测敏感性是化学发光检测法的100倍以上，已经相当敏感，由此说明，AC-ELISA的检测敏感性可与Dlight800作为标记二抗的WB检测相媲美。
2.与RT试剂盒检测结果的比较：
反转录酶(RT)试剂盒是通检测EIAV病毒中反转录酶活性对EIAV进行定量分析，每次试验均采用试剂盒中提供的标准品作标准曲线，对检测病毒进行定量，RT试剂盒仅能检测到6400倍稀释的cmv3-8，由此说明，AC-ELISA的检测敏感性与RT试剂盒相当，甚至略敏感于该试剂盒；此外将获得的反转录酶含量值与AC-ELISA获得的p26蛋白含量值(800倍-6400倍稀释的病毒)绘制相关性分析曲线，结果如图7C所示，两种方法呈现良好的线性关系，二者的相关系数大于0.99，具有良好的相关性。
以上所述仅为本发明的优选实例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种用于检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含由保藏号为CGMCCNO.9106以及保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，任选其中一种单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体是用辣根过氧化物酶或异硫氰酸荧光素或生物素标记的。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体是用辣根过氧化物酶标记的。
4.如权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于还进一步包含阳性参考品、稀释液、封闭液、洗涤液、显色液和终止液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的阳性参考品为纯化的马传染性贫血病毒p26蛋白，所述的稀释液为含有10％小牛血清以及0.1％TRITONX-100的磷酸盐缓冲液，所述的封闭液为含有5％小牛血清的磷酸盐缓冲液，所述的洗涤液为PBST缓冲液，所述的显色液的TMBA+B双组分显色液，所述的终止液为2MH2SO4。
6.如权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于是通过以下步骤检测马传染性贫血病毒p26蛋白：
(1)用稀释液将保藏号为CGMCCNO.9107的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体稀释至1μg/ml，加至96孔板，每孔100μl，4℃过夜，所述的稀释液为含有10％小牛血清以及0.1％TRITONX-100的磷酸盐缓冲液；
(2)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(3)用含5％小牛血清的磷酸盐缓冲液封闭，每孔200μl，37℃封闭1h；
(4)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(5)加入稀释后的待检测抗原，每孔100μl，37℃孵育2h；
(6)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(7)用稀释液稀释HRP标记的保藏号CGMCCNO.9106的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体，加入稀释后的酶标抗体，每孔100μl，37℃孵育2h；
(8)PBST缓冲液洗4次，前3次1min，第4次5min；
(9)加入TMBA+B双组分显色液，每孔100μl，室温避光静止10min；
(10)加入2MH2SO4终止反应，立即于OD450nm测值。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在制备检测马传染性贫血病毒p26蛋白的试剂中的应用。
8.权利要求1-6任一项所述的试剂盒在制备检测马传染性贫血病毒的试剂中的应用。
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