CN101993488B - 莱克多巴胺免疫原、包被原及其在胶体金试纸中的应用 - Google Patents
莱克多巴胺免疫原、包被原及其在胶体金试纸中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及莱克多巴胺免疫原、包被原及其在胶体金试纸中的应用，属于免疫学技术领域。该免疫原、包被原为莱克多巴胺远离氮原子的羟基端连接手臂的半抗原偶联载体蛋白的产物。此半抗原在分子结构，立体化学和电子分布上与莱克多巴胺对应体相似。半抗原分子具有便于与蛋白载体偶联的活性基团，且活性基团的存在对待测物分子的电子分布没有影响。此半抗原偶连学蓝蛋白后能使机体产生效价高，特异性好的针对莱克多巴胺的抗体，吸附于玻璃纤维素膜上；偶连人血清蛋白后构建的包被原可被吸附于硝酸纤维素膜上，用于构建莱克多巴胺胶体金试纸。
Description
技术领域
本发明涉及一种莱克多巴胺免疫原、包被原，属于免疫学技术领域。
背景技术
盐酸莱克多巴胺是一种医药原料，一种可用于治疗冲血性心力衰竭症的强心药。还可以用于治疗肌肉萎缩症，增长肌肉，减少脂肪蓄积。可以同时提高动物的日增重，提高饲料利用率，提高动物的蛋白质含量。莱克多巴胺属于beta兴奋剂，加在猪饲料中能提高瘦肉组织生长速度和效率，且皮光肉滑，看相很好。人在食用莱克多巴胺中毒现象与“瘦肉精”中毒现象类似，可能出现心跳加快、震颤、心悸等症状，更严重的会导致人体致畸致癌。因此农业部197号文件明令禁止其用于肉源性食品的生产。
莱克多巴胺是小分子化合物，常用的检测方法有高效液相色谱分析法(HPLC)，气相色谱/质谱联用分析法(GC/MS)或液相色谱/质谱联用分析法(LC/MS)。这些方法普遍存在着仪器昂贵，方法复杂，操作烦琐，试剂消耗量大的局限性。20世纪80年代兴起的胶体金免疫层析检测，基于免疫学检测原理，操作简单快捷、结果清晰易于判断、无需复杂的实验技能和设备，特别适于现场检测。能够在第一时间检测水产品中莱克多巴胺残留，对遏制莱克多巴胺的非法使用具有重要意义。但是目前市面上的莱克多巴胺胶体金速测产品存在检测限无法满足国家限量要求的现状。解决此问题在于以下两个途径：(一)改善抗体质量和竞争物。而抗体质量的改善还在于优化免疫原结构；(二)改善包被原结构，从而从竞争物的角度优化抗原抗体识别。
发明内容
针对上诉问题，本发明提供了一种莱克多巴胺免疫原、包被原，该免疫原、包被原能极大提高莱克多巴胺胶体金速测的灵敏度。
本发明的另一个目的是提供该免疫原、包被原在胶体金试纸生产中的应用。
上述莱克多巴胺免疫原的制备包括以下步骤：
(1)莱克多巴胺半抗原的合成；
(2)莱克多巴胺半抗原活泼酯的合成；
(3)莱克多巴胺半抗原活泼酯于血蓝蛋白进行偶联；
(4)免疫原的纯化；
(5)免疫原蛋白浓度的确定，分装。
所述的半抗原具有式(I)所示结构：
所述的免疫原具有式(II)所示结构：
上述莱克多巴胺包被原的制备包括以下步骤：
(1)莱克多巴胺半抗原的合成；
(2)莱克多巴胺半抗原活泼酯的合成；
(3)莱克多巴胺半抗原活泼酯于人血清蛋白进行偶联；
(4)包被原的纯化；
(5)包被原蛋白浓度的确定，分装。
所述的包被抗原具有式(III)所示结构：
发明通过以下途径应用于莱克多巴胺胶体金试纸的生产：
(1)将莱克多巴胺免疫原免疫试验动物生产莱克多巴胺抗体；
(2)胶体金颗粒的制备；
(3)胶体金标记莱克多巴胺抗体；
(4)样品垫的制备，该垫附置一段胶体金标记莱克多巴胺抗体的膜；
(5)莱克多巴胺固相硝酸纤维素膜的制备，该膜包被一条含莱克多巴胺包被原的检测带和一条包被羊抗鼠IgG的质控带；
(6)样品垫的处理：选择适当的封闭试剂、表面活性剂和(或)非离子型去污剂单独或以适当比例组合后均匀浸于玻璃纤维素膜，室温干燥备用；
(7)组装莱克多巴胺胶体金检测卡，该检测卡用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)保留有莱克多巴胺的骨架结构，从而提高特异性；
(2)使用了一定长度的手臂，降低了大分子蛋白对小分子半抗原在空间位阻及电子分布上的影响，易于机体产生针对莱克多巴胺特征结构的抗体；
(3)采用大分子蛋白作为免疫原偶联物，提高了免疫原的免疫原性；
(4)采用人血清蛋白作为包被原的偶联蛋白，降低了抗体对包被原载体蛋白的非特异性识别。
具体实施方式
实施例1 莱克多巴胺半抗原的合成
4-碘丁酸10mmol，10mL浓硫酸，于100mL乙醇中回流48h，蒸发至剩余10mL液体，加入50mL蒸馏水，使用碳酸钠中和过量的酸，并调节至pH＝10。100mL乙酸乙酯分3次萃取，旋转减压蒸发溶剂得4-碘丁酸乙酯。
称取莱克多巴胺5mmol，，氢氧化钠10mmol，于20mL无水甲醇中回流，缓慢滴加5mmol 4-碘丁酸乙酯，反应48h。冷却反应体系至室温，调节pH至中性，旋转蒸干组分，使用硅胶柱分离在远离莱克多巴胺氮原子的羟基端连接4-碘丁酸乙酯的组分。
上述中间体于含50mmol三氟乙酸的50mL蒸馏水中回流2h，蒸发部分溶剂，调节pH＝6，有沉淀析出，沉淀为目标半抗原。
制备的半抗原结构为：
实施例2 莱克多巴胺免疫原的合成
取莱克多巴胺半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入27.5mg DCC和14.4mg NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取血蓝蛋白(KLH)140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中。
制备的免疫抗原结构为：
实施例3 实验动物免疫
用半抗原莱克多巴胺免疫抗原分别免疫6周雌性balb/c鼠，每组3只。首次免疫注射时，分别100μg/mL的免疫抗原100μL，与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间隔两周后，取用样的抗原，与100μL不完全佐剂乳化，同样方法注射。
实施例4 细胞融合
在细胞融合前1d或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70％酒精中，体表消毒。用大头针固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小镊子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640完全培养液，用手轻轻揉动腹腔，将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液(75mL RPMI-1640完全培养液中加入0.75mL100×HAT液)中，反复2～3次。用吸管混匀，铺24孔板，每孔加0.5mL，置于37℃CO2培养箱中。
小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70％酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入RPMI-1640基础培养液中，并小心剔除筋膜及脂肪，剪碎，置于不锈钢筛(100目)内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于50mL无菌离心管中，离心。
将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞以个数5∶1的比例加入同一50mL的离心管中，加入37℃温浴的RPMI-1640不完全培养液20mL，混合均匀，离心(1500r/min，6min)。除上清，用手指轻击离心管底部，使沉淀混匀如糊状。用移液管取37℃预热的PEG 1mL，滴入离心管，静置1min后，于37℃水浴中在2min内滴加RPMI-1640完全培养液10mL。1000r/min离心6min，弃去上清，加75mL HAT培养液，轻轻混匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0.5mL，于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中孵育。
实施例5 杂交瘤细胞的培养和筛选
融合后6～9d，用HT培养液半量换液1次，在12～14d后根据增殖情况改用完全培养液。待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总数。取上清液，间接ELISA选择效价高和间接竞争ELISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细胞。
采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现竞争抑制反应的孔为产莱克多巴胺抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆。
无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先以饲养细胞铺板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2～1/3孔底后，取上清液，间接ELISA检测。取呈阳性强的亚克隆，如此反复2～5次，待所克隆的8个孔上清液中抗体阳性率为100％时，挑取单细胞克隆，检测为全阳性者转移至24孔细胞培养板或25mL细胞培养瓶扩大培养，建株并以分装、冻存。提前一周注射0.5mL降植烷至Balb/c小鼠腹腔。取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗涤二次后，再用10mL不完全培养基悬浮，计数。将细胞(每只小鼠1mL，含3.1×107个细胞)腹腔注射小鼠腹部，10～15d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水。2000r/min离心10min，去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，取部分ELISA法测定其效价，其余分装-70℃冻存备用。
实施例6 莱克多巴胺单克隆抗体的制备和纯化
取腹水约3mL，加入2倍体积的0.06mol/L、pH 4.5醋酸钠缓冲液。将正辛酸(33μg/mL腹水)逐滴慢慢加入样品中，边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，去沉淀(白蛋白和其它非IgG蛋白)。取上清经0.45μm微孔膜过滤，与1/10体积10×PBS混合(10×PBS：80gNaCl、2g KCl、11.5g Na2HPO4、2g KH2PO4、0.5845g EDTA、1000mL蒸馏水，pH 7.4)，用1mol/LNaOH溶液调pH值到7.4。上清冷却到4℃，加硫酸铵(0.277g/mL，使最终饱和度为45％)。搅拌30min，4℃下10000r/min离心30min，弃上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50～100倍体积的PBS透析过夜，换液3次。透析后的溶液用PEG-6000适当浓缩，4℃下贮藏备用。
实施例7 莱克多巴胺包被原的制备
取莱克多巴胺半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入27.5mg DCC和14.4mg NHS。4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液，称取人血清蛋白(HSA)140mg溶于10mL浓度为0.1mol/L的PBS(pH8.0)中。加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液，磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h。离心后，取上清夜，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换3次透析液。得到的全抗原以1mg/mL的浓度分装于0.5mL离心管中。冻存于-20℃冰箱中。
制备的包被抗原结构为：
实施例8 胶体金颗粒的制备
取1％氯金酸溶液1ml，加99ml超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积。
实施例9 胶体金标记莱克多巴胺单克隆抗体复合物的制备
当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记。具体步骤如下：按最低稳定量的120％计算出所需待标记蛋白质的总量。在磁力搅拌下，将蛋白质溶液加入胶体金溶液中(pH已调至5.9～6.2)，加入蛋白质时应逐滴加入，1mg的蛋白质大约5min加完。分别取1ml胶体金-葡萄球菌A蛋白结合物液(实验组)和1ml胶体金原液(对照组)于试管中加10％氯化钠溶液0.1ml，室温静置1h，观察结果：如果对照组试管溶液由红色转为蓝色，甚至可以看到聚合物沉淀，而实验组溶液仍保持红色，无沉淀，方可继续下一步实验，否则需补加标记用蛋白葡萄球菌A蛋白。最后加入终浓度为0.2％的聚乙二醇(PEG MW20000)，继续搅拌30min。
实施例10 样品垫的制备
保存液稀释胶体金标记单克隆莱克多巴胺抗体复合物原液至工作浓度，按比例均匀浸于玻璃纤维素膜，-20℃冻存，冷冻真空干燥后，密封保存。
实施例11 莱克多巴胺包被抗原固相硝酸纤维素膜的制备：
取莱克多巴胺包被抗原2mg/ml用0.01mol/L的PB缓冲液(pH 7.2)以250μg/ml间隔，经BIO-DOT型XYZ3000点样仪dispenser线形包被于硝酸纤维素膜的观察结果的测试反应区，定义为检测带，距离检测带5mm远的质控带用dispenser线形包被正常鼠IgG(2mg/ml)。37℃干燥2h，4℃密封保存。
实施例12 试纸条组装
用PVB作为背衬，在PVC衬板的中部叠置硝酸纤维素膜，两端分别叠置吸水垫和样品垫，硝酸纤维素膜和吸水垫、样品垫相搭连。组装好的试纸条置于刻画有检测带和质控带标识的塑料外壳内。
Claims (1)
1.一种莱克多巴胺免疫原、包被原的制备方法，其特征在于其制备方法为莱克多巴胺半抗原和蛋白进行交联制备所述的莱克多巴胺免疫原、包被原，
所述免疫原的制备方法包括以下步骤：
(1)莱克多巴胺半抗原的合成；
(2)莱克多巴胺半抗原活泼酯的合成；
(3)莱克多半抗原巴胺活泼酯与血蓝蛋白进行偶联；
(4)免疫原的纯化；
(5)免疫原蛋白浓度的确定，分装；
所述包被原的制备方法包括以下步骤：
(6)莱克多巴胺半抗原的合成；
(7)莱克多巴胺半抗原活泼酯的合成；
(8)莱克多半抗原巴胺活泼酯与人血清蛋白进行偶联；
(9)包被原的纯化；
(10)包被原蛋白浓度的确定，分装；
所述莱克多巴胺半抗原的合成方法包含以下步骤：
4-碘丁酸10mmol，10mL浓硫酸，于100mL乙醇中回流48h，蒸发至剩余10mL液体，加入50mL蒸馏水，使用碳酸钠中和过量的酸，并调节至pH=10；100mL乙酸乙酯分3次萃取，旋转减压蒸发溶剂得4-碘丁酸乙酯；
称取莱克多巴胺5mmol，氢氧化钠10mmol，于20mL无水甲醇中回流，缓慢滴加5mmol4-碘丁酸乙酯，反应48h；冷却反应体系至室温，调节pH至中性，旋转蒸干组分，使用硅胶柱分离在远离莱克多巴胺氮原子的羟基端连接4-碘丁酸乙酯的组分获得中间体；
上述中间体于含50mmol三氟乙酸的50mL蒸馏水中回流2h，蒸发部分溶剂，调节pH=6，有沉淀析出，沉淀为目标半抗原。
2．根据权利要求1所述的莱克多巴胺免疫原、包被原制备方法，其特征在于，所述的免疫原和包被原方法还包括：
(1)取莱克多巴胺半抗原0.1mmol溶于2mLDMF中，搅拌加入27.5mg DCC和14.4mgNHS：
(2)4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清液为A液；
(3)称取血蓝蛋白(KLH)／人血清蛋白(HSA)140mg溶于10mL浓度为0.1mol／L pH8.0的PBS中，加入DMF1mL，搅拌溶解制备B液；
(4)磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4℃下反应12h；离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3d，每天更换3次透析液，得到的全抗原以1mg／mL的浓度分装于0.5mL离心管中，冻存于-20℃冰箱中。
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