CN110907422B - 基于Ti3C2的凝血酶适体传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于Ti3C2的凝血酶适体传感器及其制备方法，属于生物分析检测技术领域。解决传统凝血酶检测方法使用的抗体难以制备和保存，而且相关反应复杂费时的技术问题。本发明提供的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器，是由单层Ti3C2及其结合到Ti3C2表面的荧光素标记的凝血酶适体组成；所述荧光素标记的凝血酶适体的序列为：5′‑FAM‑GGT TGG TGT GGT TGG‑3′。本发明采用Ti3C2材料构建凝血酶传感器，拓宽了Ti3C2在生物领域的应用，构建了一种优秀的纳米检测平台；采用凝血酶适体作为凝血酶的识别剂，与传统的抗体相比，价格便宜、合成简便、易于保存、反应快速。本发明提供制备方法制备的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器具有高特异性、高敏感性的特点，对凝血酶的检出限为2.5×10‑11mol/L。

Description

基于Ti3C2的凝血酶适体传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及一种用于凝血酶定量检测的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器及其制备方法。
背景技术
凝血酶是一种Na+激活的变构丝氨酸蛋白酶，在凝血级联过程中起着中心蛋白酶的作用。凝血酶和无活性的凝血酶原在生理和病理学中起着至关重要的作用。凝血酶与许多疾病有所关联，例如血栓，阿尔茨海默氏病，中枢神经系统损伤和癌症。因此，高灵敏度和高特异性的凝血酶检测方法对这些疾病的研究和临床诊断至关重要。
目前，已开发出多种用于检测凝血酶的方法，包括基于凝结的检测，基于酶活性的检测，和免疫检测。但是，这些方法的缺点是其使用的抗体难以制备和保存，而且相关反应复杂费时。
Ti3C2是一种二维碳化钛材料，因其良好的化学稳定性，优异的导电性等而受到高度关注。Ti3C2在能源方面的应用有超级电容器、燃料电池、电磁干扰屏蔽和钙钛矿型太阳能电池等。此外，由于其大表面积和近红外区域强吸收的特性，Ti3C2的应用已扩展到生物医学领域，例如污染物处理、抑菌剂、肿瘤治疗、生物成像和精确的生物传感。出色的理化特性使Ti3C2成为制造生物传感器的理想选择。
凝血酶检测用适体通常为单链DNA或RNA，具有高结合亲和力和特异性，已被广泛应用于分子识别、实验室诊断、疾病治疗和药物研究。作为抗体的替代品，适体显示出其独特的优势，包括易于合成和廉价合成、易于化学修饰、靶分子范围广和稳定性高。凝血酶适体由15个碱基构成，能够与凝血酶特异性结合达到识别凝血酶的目的。
综上由于二维Ti3C2出色的理化特性和适体的价格比抗体便宜很多，使用 Ti3C2和适体进行凝血酶检测前景广阔。
发明内容
本发明要解决现有技术中传统凝血酶检测方法的不足，利用Ti3C2和荧光标记的适体组成凝血酶适体传感器，Ti3C2和凝血酶适体成本较低，易于制备和保存，进而提供一种基于Ti3C2的凝血酶适体传感器及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案具体如下：
本发明提供一种基于Ti3C2的凝血酶适体传感器，是由单层Ti3C2及其结合到Ti3C2表面的荧光素标记的凝血酶适体组成；
所述荧光素(FAM)标记的凝血酶适体的序列为：5′-FAM-GGT TGG TGT GGT TGG-3′；
所述FAM的结构式如下：
Figure BDA0002319631820000021
本发明还提供一种基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)单层Ti3C2的制备：
通过在氩气下烧结钛粉、铝粉和石墨的混合物来制备Ti3AlC2，将Ti3AlC2粉末在连续搅拌下添加到LiF/HCl溶液中蚀刻，反应完成后，通过重复离心，用超纯水洗涤酸性混合物，直到混合物的pH值超过5，最后，将浆液超声处理，并离心得到单层Ti3C2溶液；
(2)将荧光素标记的凝血酶适体结合到Ti3C2表面：
将荧光素标记的凝血酶适体在室温下加入步骤(1)制备的Ti3C2溶液中，反应完成后，组成基于Ti3C2的凝血酶适体传感器。
在上述技术方案中，步骤(1)中钛粉：铝粉：石墨物质的量比为5：2：3。
在上述技术方案中，步骤(1)中烧结的温度为1650℃，时间为2小时。
在上述技术方案中，步骤(1)中Ti3AlC2粉末应用研钵研磨，通过400目筛后进行蚀刻。
在上述技术方案中，步骤(1)中Ti3AlC2粉末进行刻蚀的步骤如下：
将过筛后的1g Ti3AlC2加入到8-12M LiF/6-9M HCl溶液中进行蚀刻，反应在室温进行24小时。
在上述技术方案中，步骤(1)中蚀刻完成后重复离心，用超纯水洗涤混合物，每循环5分钟，转速8000rpm，直到混合物的pH值超过5，最后，将浆液超声处理10分钟以上，并以3500rpm离心1h。
在上述技术方案中，步骤(1)中Ti3C2溶液的浓度的确认步骤为：用孔径为0.22μm的纤维素膜过滤单层Ti3C2溶液，将Ti3C2干燥后，将Ti3C2膜剥离并称重，即可计算得到。
在上述技术方案中，步骤(2)的具体步骤为：
将20-40nM荧光素标记的凝血酶适体加入到步骤(1)制备的0.1-0.2mg/mL Ti3C2溶液中，反应进行5min，组成基于Ti3C2的凝血酶适体传感器。
本发明的有益效果是：
本发明提供的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器，采用Ti3C2材料构建凝血酶传感器，拓宽了Ti3C2在生物领域的应用，构建了一种优秀的纳米检测平台；采用凝血酶适体作为凝血酶的识别剂，与传统的抗体相比，价格便宜、合成简便、易于保存、反应快速。
本发明制备的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器具有高特异性、高敏感性的特点，对凝血酶的检出限为2.5×10-11mol/L。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
图1为本发明的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的原理示意图。
图2为本发明的Ti3C2的扫描电镜图。
图3为本发明的Ti3AlC2和Ti3C2的XRD图谱。
图4为本发明的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器加入凝血酶后的荧光光谱。
图5是凝血酶标准曲线，其线性方程为：y＝4.3+0.398x，R2＝0.986。
具体实施方式
本发明提供一种基于Ti3C2的凝血酶适体传感器，是由单层Ti3C2及其结合到Ti3C2表面的荧光素标记的凝血酶适体组成；所述荧光素(FAM)标记的凝血酶适体的序列为：5′-FAM-GGT TGG TGT GGT TGG-3′；
所述FAM的结构式如下：
Figure BDA0002319631820000051
本发明还提供一种基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)单层Ti3C2的制备：
通过在氩气下烧结钛粉、铝粉和石墨的混合物来制备Ti3AlC2，将Ti3AlC2粉末在连续搅拌下添加到LiF/HCl溶液中蚀刻，反应完成后，通过重复离心，用超纯水洗涤酸性混合物，直到混合物的pH值超过5，最后，将浆液超声处理，并离心得到单层Ti3C2溶液；
(2)将荧光素标记的凝血酶适体结合到Ti3C2表面：
将荧光素标记的凝血酶适体在室温下加入步骤(1)制备的Ti3C2溶液中，反应完成后，组成基于Ti3C2的凝血酶适体传感器。
优选的是，步骤(1)中钛粉：铝粉：石墨物质的量比为5：2：3。
优选的是，步骤(1)中烧结的温度为1650℃，时间为2小时。
优选的是，步骤(1)中Ti3AlC2粉末应用研钵研磨，通过400目筛后进行蚀刻。
优选的是，步骤(1)中Ti3AlC2粉末进行刻蚀的步骤如下：
将过筛后的1g Ti3AlC2加入到8-12M LiF/6-9M HCl溶液中进行蚀刻，反应在室温进行24小时。
优选的是，步骤(1)中蚀刻完成后重复离心，用超纯水洗涤混合物，每循环5分钟，转速8000rpm，直到混合物的pH值超过5，最后，将浆液超声处理 10分钟以上，并以3500rpm离心1h。
优选的是，步骤(1)中Ti3C2溶液的浓度的确认步骤为：用孔径为0.22μm 的纤维素膜过滤单层Ti3C2溶液，将Ti3C2干燥后，将Ti3C2膜剥离并称重，即可计算得到。
优选的是，步骤(2)的具体步骤为：将20-40nM荧光素标记的凝血酶适体加入到步骤(1)制备的0.1-0.2mg/mL Ti3C2溶液中，反应进行5min，组成基于Ti3C2的凝血酶适体传感器。
使用本发明提供的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器检测凝血酶的步骤如下：
(1)绘制凝血酶标准曲线：配制已知浓度梯度的凝血酶溶液，加入到上述步骤(2)制备的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器溶液中，反应20-30分钟，离心后取上清液，测量荧光光谱，取每个标准样品517nm波长处的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，凝血酶浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性方程。
(2)测量待测溶液的凝血酶浓度：取待测溶液，加入到上述步骤(2)制备的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器溶液中，反应20-30分钟，离心后取上清液，测量荧光光谱，得到517nm波长处的荧光强度，与标准曲线对比，得出待测溶液的凝血酶浓度。
优选的，凝血酶检测过程步骤(1)中，离心转速9000rpm，离心时间10 分钟，荧光光谱激发光波长470nm。
优选的，凝血酶检测过程步骤(2)中，离心转速9000rpm，离心时间10 分钟，荧光光谱激发光波长470nm。
结合图1说明本发明提供的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器检测凝血酶的原理为：凝血酶适体被荧光素标记，结合到Ti3C2表面，由于荧光能量共振转移其荧光被Ti3C2有效淬灭。在凝血酶存在的情况下，由于凝血酶和适体之间的亲和力较高，因此Ti3C2表面上的适体将与凝血酶结合形成四联体。此过程导致荧光素从Ti3C2表面脱离，荧光能量共振转移效率降低，观察到荧光恢复。并且，荧光光谱变化程度反映了溶液中凝血酶的量。
为了更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本文所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，本发明并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本发明的实施例中的原料均通过商业途径购买，其中荧光素标记的凝血酶适体购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
试剂均为分析纯。电阻为18.25MΩ·cm的超纯水是从Create Fun Summer-S-10净水系统(中国四川德立实科技有限公司)获得的，并用于所有溶液的制备。
实施例1：
1)单层Ti3C2的合成：通过在1650℃氩气下烧结7.368g钛粉、1.523g铝粉和1.109g石墨的混合物，烧结2小时制备Ti3AlC2。烧制的Ti3AlC2粉末用研钵研磨，通过400目筛。1gTi3AlC2在连续搅拌下加入到12M LiF/9M HCl溶液中进行蚀刻，在室温反应24小时。蚀刻完成后重复离心，用超纯水洗涤混合物，每循环5分钟，转速8000rpm，直到混合物的pH值超过5。最后，将浆液超声处理10分钟以上，并以3500rpm离心1h得到单层Ti3C2溶液。为了确认Ti3C2的浓度，用孔径为0.22μm的纤维素膜过滤10mL Ti3C2分散液。将Ti3C2干燥后，将Ti3C2膜剥离并称重，计算得到Ti3C2浓度。图2为Ti3C2的扫描电镜图。图3为Ti3AlC2和Ti3C2的XRD图谱。
2)凝血酶适体传感器的制备：40nM荧光素标记的凝血酶适体加入到0.2 mg/mLTi3C2溶液中，反应5分钟，组成凝血酶适体传感器。
3)凝血酶标准曲线的绘制：制备8种不同浓度的凝血酶标准溶液，浓度为 25pmol/L，50pmol/L，75pmol/L，100pmol/L，125pmol/L，150pmol/L，175pmol/L 和200pmol/L。凝血酶溶液加入到2)中的凝血酶传感器中，室温反应20分钟，离心转速9000rpm，离心10分钟后取上清液，用Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪检测荧光光谱，激发光波长470nm，取每个标准样品517nm波长处的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，凝血酶浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性方程。图4为不同浓度的凝血酶溶液加入到凝血酶传感器后的荧光光谱图像。图5为得到的凝血酶标准曲线。
4)检测样品中的凝血酶：取样品溶液加入到2)中的凝血酶传感器中，室温反应20分钟，离心转速9000rpm，离心10分钟后取上清液，用Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪检测荧光光谱，激发光波长470nm，取样品517nm波长处的荧光强度，根据凝血酶标准曲线计算出样品中的凝血酶浓度。
实施例2：
1)单层Ti3C2的合成：通过在1650℃氩气下烧结3.684g钛粉、0.762g铝粉和0.555g石墨的混合物，烧结2小时制备Ti3AlC2。烧制的Ti3AlC2粉末用研钵研磨，通过400目筛。1gTi3AlC2在连续搅拌下加入到8M LiF/6M HCl溶液中进行蚀刻，在室温反应24小时。蚀刻完成后重复离心，用超纯水洗涤混合物，每循环5分钟，转速8000rpm，直到混合物的pH值超过5。最后，将浆液超声处理10分钟以上，并以3500rpm离心1h得到单层Ti3C2溶液。为了确认Ti3C2的浓度，用孔径为0.22μm的纤维素膜过滤10mL Ti3C2分散液。将Ti3C2干燥后，将Ti3C2膜剥离并称重，计算得到Ti3C2浓度。
2)凝血酶适体传感器的制备：20nM荧光素标记的凝血酶适体加入到0.1 mg/mLTi3C2溶液中，反应5分钟，组成凝血酶适体传感器。
3)凝血酶标准曲线的绘制：制备8种不同浓度的凝血酶标准溶液，浓度为25pmol/L，50pmol/L，75pmol/L，100pmol/L，125pmol/L，150pmol/L，175pmol/L 和200pmol/L。凝血酶溶液加入到2)中的凝血酶传感器中，室温反应20分钟，离心转速9000rpm，离心10分钟后取上清液，用Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪检测荧光光谱，激发光波长470nm，取每个标准样品517nm波长处的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，凝血酶浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性方程。
4)检测样品中的凝血酶：取样品溶液加入到2)中的凝血酶传感器中，室温反应25分钟，离心转速9000rpm，离心10分钟后取上清液，用Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪检测荧光光谱，激发光波长470nm，取样品517nm波长处的荧光强度，根据凝血酶标准曲线计算出样品中的凝血酶浓度。
实施例3：
1)单层Ti3C2的合成：通过在1650℃氩气下烧结14.736g钛粉、3.048g铝粉和2.22g石墨的混合物来2小时制备Ti3AlC2。烧制的Ti3AlC2粉末用研钵研磨，通过400目筛。1gTi3AlC2在连续搅拌下加入到8M LiF/6M HCl溶液中进行蚀刻，在室温反应24小时。蚀刻完成后重复离心，用超纯水洗涤混合物，每循环5分钟，转速8000rpm，直到混合物的pH值超过5。最后，将浆液超声处理10分钟以上，并以3500rpm离心1h得到单层Ti3C2溶液。为了确认Ti3C2的浓度，用孔径为0.22μm的纤维素膜过滤10mL Ti3C2分散液。将Ti3C2干燥后，将Ti3C2膜剥离并称重，计算得到Ti3C2浓度。
2)凝血酶适体传感器的制备：30nM荧光素标记的凝血酶适体加入到0.15 mg/mLTi3C2溶液中，反应5分钟，组成凝血酶适体传感器。
3)凝血酶标准曲线的绘制：制备8种不同浓度的凝血酶标准溶液，浓度为 25pmol/L，50pmol/L，75pmol/L，100pmol/L，125pmol/L，150pmol/L，175pmol/L 和200pmol/L。凝血酶溶液加入到2)中的凝血酶传感器中，室温反应20分钟，离心转速9000rpm，离心10分钟后取上清液，用Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪检测荧光光谱，激发光波长470nm，取每个标准样品517nm波长处的荧光强度，以荧光强度为纵坐标，凝血酶浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性方程。
4)检测样品中的凝血酶：取样品溶液加入到2)中的凝血酶传感器中，室温反应30分钟，离心转速9000rpm，离心10分钟后取上清液，用Shimadzu RF-5301PC荧光光谱仪检测荧光光谱，激发光波长470nm，取样品517nm波长处的荧光强度，根据凝血酶标准曲线计算出样品中的凝血酶浓度。
以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明请求保护的范围内。

Claims (9)

1.一种基于Ti3C2的凝血酶适体传感器，其特征在于，是由单层Ti3C2及其结合到Ti3C2表面的荧光素标记的凝血酶适体组成；
所述荧光素FAM标记的凝血酶适体的序列为：5′-FAM-GGT TGG TGT GGT TGG-3′；
所述FAM的结构式如下：
Figure FDA0002319631810000011
2.一种权利要求1所述的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)单层Ti3C2的制备：
通过在氩气下烧结钛粉、铝粉和石墨的混合物来制备Ti3AlC2，将Ti3AlC2粉末在连续搅拌下添加到LiF/HCl溶液中蚀刻，反应完成后，通过重复离心，用超纯水洗涤酸性混合物，直到混合物的pH值超过5，最后，将浆液超声处理，并离心得到单层Ti3C2溶液；
(2)将荧光素标记的凝血酶适体结合到Ti3C2表面：
将荧光素标记的凝血酶适体在室温下加入步骤(1)制备的Ti3C2溶液中，反应完成后，组成基于Ti3C2的凝血酶适体传感器。
3.根据权利要求2所述的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中钛粉：铝粉：石墨物质的量比为5：2：3。
4.根据权利要求2所述的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中烧结的温度为1650℃，时间为2小时。
5.根据权利要求2所述的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中Ti3AlC2粉末应用研钵研磨，通过400目筛后进行蚀刻。
6.根据权利要求5所述的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中Ti3AlC2粉末进行刻蚀的步骤如下：
将过筛后的1g Ti3AlC2加入到8-12M LiF/6-9M HCl溶液中进行蚀刻，反应在室温进行24小时。
7.根据权利要求2所述的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中蚀刻完成后重复离心，用超纯水洗涤混合物，每循环5分钟，转速8000rpm，直到混合物的pH值超过5，最后，将浆液超声处理10分钟以上，并以3500rpm离心1h。
8.根据权利要求2所述的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中Ti3C2溶液的浓度的确认步骤为：用孔径为0.22μm的纤维素膜过滤单层Ti3C2溶液，将Ti3C2干燥后，将Ti3C2膜剥离并称重，即可计算得到。
9.根据权利要求2-8任意一项所述的基于Ti3C2的凝血酶适体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：将20-40nM荧光素标记的凝血酶适体加入到步骤(1)制备的0.1-0.2mg/mL Ti3C2溶液中，反应进行5min，组成基于Ti3C2的凝血酶适体传感器。
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