CN101424642B - 一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法，依次包括以下步骤：1)将能与靶分子特异性结合的特异性DNA与荧光标记的cDNA杂交形成双链捕获探针；2)加入待检溶液进行反应；3)加入纳米金溶液进行反应，记录反应溶液的荧光光谱。本发明的检测方法具有通用性，检测对象可以是任意靶分子，应用范围广。利用本发明可以很方便地实现对靶分子的快速、灵敏、选择性检测。

Description

一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法

技术领域

本发明特别涉及一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法。

背景技术

核酸适体(aptamer)是指利用上个世纪末建立而发展起来的SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)体外筛选技术，从随机寡核苷酸文库中筛选获得的短单链寡核苷酸配基，它能够与靶分子特异结合，从而本身发生构象变化。

通过体外筛选技术，理论上可筛选到任意物质的核酸适体，再加上高通量筛选的技术特点与核酸适体精确识别、易体外合成与修饰等特性，使得核酸适体在分析化学与生物医药研究方面具有广阔的应用前景。例如，核酸适体在生物传感器的设计中具有重要作用，被应用于生物学、环境、安全等领域的检测，包括蛋白质(凝血酶、生长因子、HIV相关多肽等)、有机小分子(cAMP、ATP、可卡因等)和金属离子(K+、Hg²⁺、Pb²⁺等)，其他新的令人兴奋的应用包括基于核酸适体的蛋白质芯片，和在蛋白质组学中用于高通量成像、基于DNA酶和RNA酶的分子尺度的逻辑DNA分子计算机等。

除此之外，还有一些其他的DNA序列也可以在某一特定环境下发生构象变化。核酸适体和这些DNA对各自的靶物质来说都有其特异性的核酸结构，可与靶物质发生特异性反应，从而本身发生构象的变化。

这种核酸结构在遇到相应的靶分子进行结合时通常会伴有明显的构象变化。这种结构的差异形成了基于核酸结构传感器的理论基础。一个典型的基于核酸结构的传感器包括一个双标记的寡核苷酸序列(电子传递或能量传递的受体和供体)，因此，靶分子结合导致的结构变化可以直接影响到受体和供体之间的距离，从而可以高灵敏度的检测到电信号或光信号的产生。在此基础上，核酸结构在分析化学方面的应用逐渐成为人们关注的焦点，例如，Tan等将核酸适体应用于分子信标研究，发展了一种高效、高灵敏检测生物分子的方法—分子aptamer信标(MAB)，并进一步用于凝血酶和血小板源生长因子(PDGF)的检测。另外，由于核酸适体与抗体具有类似的特异结合性质，因此在ELISA、免疫学分析、Western印迹法和生物传感器等许多应用中具有更大的发展潜力，并取得初步结果。

目前这种基于DNA构象变化的分子信标的方法，主要是应用双标记核酸序列，一端标记荧光基团，另一端标记猝灭基团，而猝灭基团又主要以Dabcyl(4-[4′-二甲基胺基苯基氮]安息香酸)为主。为了进一步提高荧光猝灭效率和检测的灵敏度，科学家们不断的研究开发新型的猝灭剂。近年来，科学家们通过研究发现与常规猝灭基团DABCYL相比，纳米金可以在可见到近红外的波长范围内，有效地猝灭各种荧光染料，猝灭率达到90％以上。

纳米金颗粒在生物学中的应用非常广泛，目前，核酸结构-纳米复合物在分析检测中的应用也受到了关注。1996年，Mirkin和Alivisatos所在工作组分别报道了纳米金-DNA复合物的重要应用，并将其发展为基于纳米结构的新型检测平台。通过深入了解金胶独特的光学和电学性质，Mirkin等人随后发展了一系列方法对DNA和蛋白质进行超微量检测。他们的方法依赖于巯基DNA探针在金胶表面的修饰，当加入靶时，可以引起金胶的团聚或解聚，从而引起宏观上颜色的红-蓝变化。Huang等用纳米金颗粒(GNPs)与核酸适体5’端的-SH直接作用形成的结合物(即Apt-AuNPs)来检测PDGF及其受体(PDGFR)，发现由于Apt-AuNPs具有简易性和专一性，所以非常适合于蛋白质分析和癌症诊断。Parlor等还将Apt-AuNPs用于光学检测凝血酶。Dwarakanath等将荧光性能优异的半导体纳米晶粒-量子点用于标记核酸适体，开辟了量子点技术与SELEX技术联合使用的先河。Korgd等通过生物素和抗生物素的作用将前列腺专一性膜抗原(PSMA)的核酸适体连接到具有近红外发光性能的CdTe量子点上来检测前列腺癌细胞，取得了较好的结果，这给核酸适体量子点标记在活细胞及生物体内的分析检测提供了新思路。但是这些方法主要是基于纳米金和HS-DNA的组装来进行的，由于DNA需要标记，而且组装的过程较为繁琐，耗时长、成本高，不利于推广应用。

最近，Rothberg等人报道了一种利用未经修饰的金胶检测靶DNA的比色法(H.Li，L Rothberg，PNAS101，14036，September 28，2004)。该法基本原理是纳米金颗粒可以和单链DNA，通过静电作用发生瞬时的吸附结合，从而可以在高离子强度条件下有效地稳定纳米金，而双链DNA则不具有这种作用。核酸结构在溶液中为无规卷曲状态，可以吸附在纳米金表面并提高其稳定性。而当有靶分子存在时，核酸分子会形成刚性的二级结构，不能吸附在纳米金表面。但是由于对靶分子进行特异性识别的DNA分子不同，形成的二级结构也有差异，例如可以形成四分体、茎环、三叶草、凸起、假结等结构。这些结构与纳米金的作用类似但是又有一定的差异，因此该方法在具体操作过程中需要一对一的进行设计，只能对特定的DNA进行检测，而不适用于任意靶物质的检测，并且比色法的灵敏度有限。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是克服现有的纳米金检测靶DNA的方法中对不同的靶分子，需要对检测方案进行不同设计的缺陷，提供一种快速、特异性高、灵敏度高、通用型的纳米金检测靶物质的方法，可以很方便地实现对任意靶物质的检测。

本发明人经过研究发现，核酸结构在溶液中为无规卷曲状态，可以吸附在纳米金表面，因此将DNA序列的一端用荧光素进行标记，当它吸附在纳米金表面时，其荧光基团离纳米金表面非常近(小于10nm)，荧光被猝灭。而当有靶分子存在时，核酸分子会形成刚性的二级结构，不能吸附在纳米金表面，荧光素与纳米金的距离足够远，纳米金不能够猝灭DNA上的荧光。因此本发明人提出了新的检测策略：利用纳米金高效猝灭荧光的性质将其发展成为检测核酸结构的探针，可以很方便地实现对任意靶物质的高灵敏检测，从而完成了本发明。

因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是，一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法，可依次包括以下步骤：

1)将能与靶分子特异性结合的特异性DNA与荧光标记的cDNA杂交形成双链捕获探针；

2)加入待检溶液进行反应；

3)加入纳米金溶液进行反应，记录反应溶液的荧光光谱。

本发明步骤1)为将能与靶分子特异性结合的特异性DNA与荧光标记的cDNA杂交形成双链捕获探针。本发明可实现对蛋白质(凝血酶、血小板衍生性生长因子、溶菌酶、HIV相关多肽等)、有机小分子(cAMP、ATP、可卡因等)、金属离子(K+、Hg²⁺、Pb²⁺等)、甚至整个病毒颗粒等靶分子的检测，所述靶分子不包括DNA分子。较佳的靶分子可为三磷酸腺苷(ATP)、可卡因(Cocaine)、凝血酶(thrombin)、血小板衍生性生长因子(PDGF)、溶菌酶(lysozyme)、钾离子、汞离子或氢离子(pH值)。本发明所述的特异性DNA为核酸适体和一些其他的DNA序列，这些DNA序列也可以在某一特定环境下发生构象变化，核酸适体和这些DNA对各自的靶物质来说都有其特异性的核酸结构，可与靶物质发生特异性反应，从而本身发生构象的变化。较佳的特异性DNA为核酸适体、MSO(mercury-specific Oligonuclide，特异性结合汞离子的寡核苷酸)、PSO(特异性结合钾离子的寡核苷酸)或具有i-motif结构的寡聚核苷酸。所述的荧光标记所用的荧光基团较佳的可选自荧光素(FAM)、花菁染料Cy3和花菁染料Cy5、罗丹明B(Rodamine B)、异硫氰酸荧光素(FITC)和6-羰基-罗丹明(ROX)等有机染料。较佳的，所述的特异性DNA与其cDNA溶液的反应浓度可各为0.1～10μM；更佳的，所述的特异性DNA与其cDNA溶液的摩尔量可以相等。同常规，步骤1)所述的杂交形成双链捕获探针时的反应体系中可加入杂交缓冲溶液。杂交缓冲溶液如PBS、胂酸盐或Tris-HCl等，反应浓度为10～25mM。为了保证检测不同靶分子所用的与纳米金的发生吸附作用的核酸分子都具有相同的二级结构，统一检测的具体操作过程；更佳的，可以对双链探针中互补序列进行适当的修饰，例如，由于G能够淬灭荧光，因此在距离G、C比较近的地方加入A或者T的序列来降低G的影响，本发明中优选加ATT。另外，对于富含GGG和富含CCC的序列作为互补链时，由于在不同pH和钾离子存在下会形成刚性的二级结构，导致不能吸附到纳米金表面，因此本发明优选对其进行适当修改，包括减少末端G或C的个数，序列中间的GGG或CCC的其中一个碱基换为其他碱基如A、T。这些修饰提高了不同双链探针中cDNA结构的一致性，使得它们与纳米金的相互作用也尽量保持一致，从而使得检测的准确度、重复性以及通用程度都有很大提高。

本发明步骤2)为向步骤1)的杂交溶液中加入待检溶液进行反应。其中，所述的待检溶液的反应浓度较佳的可为0.01～100μM待检溶液与特异性DNA的摩尔比较佳的为10：1～1：10。较佳的反应温度为4～37℃，反应时间为5～30分钟。

本发明步骤3)为将步骤2)的反应溶液加入纳米金溶液中进行反应，记录反应溶液的荧光光谱。其中，所述的纳米金的粒径较佳的为10～20nm，纳米金溶液的反应浓度较佳的为1～100nM，纳米金与特异性DNA的摩尔比较佳的为1:1～1:100。反应温度较佳的为4～37℃，反应时间较佳的为1～5分钟。所述的反应较佳的在加入缓冲溶液进行反应后再观察荧光光谱。同常规，所述的缓冲溶液较佳的可为Tris、PBS或胂酸盐缓冲溶液，反应浓度较佳的可为0.1～10mM。同时根据需要还可以加入其他盐以更好的满足靶分子与DNA的结合。所述观察荧光光谱的方法较佳的可为分光光度法。分光光度法可为仪器检测溶液的荧光光谱的变化：光谱保持不变的，待检溶液不含靶分子，呈阴性；对于FAM，光谱530nm处吸收降低的，待检溶液含靶分子，呈阳性。

同常规，本发明可以采用水或靶分子类似物替换步骤2)中所加的靶分子溶液作为对照组。所述的靶分子类似物可以是靶分子的结构类似物或性质类似物。

本发明整个反应的体系可控制在微升级别，较佳的反应体系的体积为10～1000微升，优化实施方案可表述如下：分别取2μL反应浓度为0.1～10μM的特异性DNA溶液与2μL同等浓度的FAM标记的cDNA(FAM-cDNA)溶液(可以使用的荧光基团包括：FAM、Cy3、Cy5、Rodamine B、FITC或ROX等有机染料)，加入14μL的杂交缓冲溶液(杂交缓冲溶液如Tris-HCl、PBS或胂酸盐等，反应浓度为10～25mM)混匀，加热到85℃后缓慢降到室温(对于本身无二级结构的序列室温条件下反应5～30分钟即可)，充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL反应浓度为0.01～100μM靶分子溶液，进行充分反应。同时以不加靶分子溶液一组、以及加入靶分子类似物的一组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入10～1000μL的纳米金(粒径10～20nm，反应浓度在1～100nM)溶液(Au:DNA的摩尔比例范围在1:1～1:100)，用缓冲溶液(Tris、PBS、胂酸盐等常规生化体系，反应浓度为0.1～10mM)补足总体积0.2～1mL后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

本发明的基本原理可总结为：利用纳米金对不同结构DNA的吸附作用不同，以及纳米金高效猝灭荧光的性质来实现对DNA结构的区分。首先设计任意靶的特异性DNA-荧光标记cDNA双链作为捕获探针，加入靶后释放出的荧光标记cDNA以单链形式存在，靶与特异性DNA形成二级结构。由于单链DNA可以通过表面氨基吸附到纳米金颗粒表面，因此cDNA的荧光被纳米金猝灭。而双链DNA和其它刚性的二级结构均不能吸附到纳米金表面，因此双链的荧光没有明显降低。本发明的检测原理图可参见图1。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

1)本发明改变了目前所使用的单链探针依赖于探针本身结构变化提供信号的检测模式，建立了一种通用的工作模式。也就是说本发明的检测方法具有通用性，检测对象可以是任意靶分子，包括蛋白质(如凝血酶、血小板衍生性生长因子、溶菌酶、HIV相关多肽等)、有机小分子(如cAMP、ATP、可卡因等)、金属离子(如K+、Hg²⁺、Pb²⁺等)、甚至整个病毒颗粒，所述靶分子不包括DNA分子，因此本发明应用范围广。因为在理论上任何靶物质都可以通过SELEX技术寻找到特异性的核酸适体，而且自然界中还存在大量可以发生构象变化的DNA片段是基于某一特定环境和特定物质的。

2)本发明的检测方法具有高度特异性。因为核酸结构通常都具有非常高的亲和力，而高亲和力使得可以很方便地检测到极微量的靶分子，并将反应信号直接传输到检测元件进行读取，同时又不受其他非靶物质的干扰，实现对靶分子的特异性检测。

3)本发明的检测方法灵敏度高，利用荧光素和纳米金，可以提高检测的灵敏度到10^-14mol数量级。

4)本发明检测快速。本发明建立了一种通用的工作模式，利用纳米金进行荧光检测，可以很方便地实现对靶分子的快速的检测。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和优点。

图1是本发明的检测原理示意图。

图2是本发明纳米金反应液的荧光光谱图。I：可卡因；II：空白；III：苯甲酰芽子碱(N1)；IV：芽子碱甲酯(N2)。

具体实施方式

下面用本发明对三磷酸腺苷(ATP)、可卡因、凝血酶、血小板衍生性生长因子(PDGF)、溶菌酶、汞离子、钾离子、pH(氢离子)检测的实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中的“室温”是指进行实施例操作的实验室温度，为22～25℃。

荧光光谱检测：Hitachi F4500 Fluorescene spectrophotometer，激发波长480nm，发射波长490～900nm，用200μL石英比色皿，取200μL样品进行测量。

本发明实施例中所用纳米金颗粒参考文献(S.Dwarakanath et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications 325，739，2004)制备。具体步骤如下，将100mL 0.01％(w/w)的氯金酸溶液加热到沸腾后，在剧烈搅拌下快速加入2～5mL的柠檬酸三钠溶液(10mg/mL)并继续加热15～30min，溶液变成酒红色。停止加热继续搅拌30min后，静置过夜。然后用0.22μm滤膜进行过滤，并放置在冰箱4℃保存。根据本方法得到粒径为10～20nm，浓度为8～1nM的纳米金溶液。在制备纳米金时，使用的是同一浓度的氯金酸溶液，生成的颗粒越大，对应的浓度就越低。此处，10nm金的浓度为8nM左右，而20nm的金的浓度为1nM左右。

本发明实施例中所用的各种DNA序列如表1所示。这些序列都带有荧光标记FAM。在本领域，其他的荧光标记也明显适用于实施例中的反应，因此不再赘述。表1所示的DAN均按照已公布的序列进行了修饰，修饰前的序列见括号中序列，修饰后不同的碱基用下划线标出。其中，检测ATP、PDGF、可卡因、凝血酶和溶菌酶所用的特异性DNA为核酸适体，检测钾离子、汞离子、pH值所用的特异性DNA分别为PSO、MSO和具有i-motif结构的DNA。这些序列均由上海生物工程技术有限公司合成。

表1.寡聚核苷酸序列

 

靶分子	DNA性质	碱基组成(5′-3′)	长度(mer)
				可卡因	核酸适体	GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC	30
		FAM-ATT GAC CCA CTT CAT TGA AGG ATT TTC CTT GTC(修饰前：FAM-GAC CCA CTT CAT TGA AGG ATT TTC CTTGTC)	33
				ATP	核酸适体	ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT	27
	cDNA	FAM-<u>ATT</u> ACC TTC CTC CGC AAT ACT CCC CCA GGT(修饰前：FAM-ACC TTC CTC CGC AAT ACT CCC CCA GGT)	30
				凝血酶	核酸适体	GG TT GG TGT GG TT GG	15
	cDNA	FAM-C AA CC ACA TC AA C(修饰前：FAM-<u>C</u>C AA CC ACA CC AA C<u>C</u>)	13

 

溶菌酶	核酸适体	ATC TAC GAA TTC ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTTACT TAG	42
					cDNA	FAM-AAC TCT GCA CTC TTT AGC CCT GAT GAA TTC(修饰前：FAM-<u>CTA AGT</u> AAC TCT GCA CTC TTT AGC CCTGAT GAA TTC <u>GTAGAT</u>)	30
PDGF	核酸适体	CAG GCTACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TG	35
						FAM-<u>ATT</u> CAG GAT CAT GGT GAT GCT CTA CGT GCC GTAGCC TG(修饰前：FAM-CAG GAT CAT GGT GAT GCT CTA CGT GCCGTA GCC TG)	38
Hg<sup>2+</sup>	MSO	TTC TTT CTT CCCC TTG TTT GTT	22
					cDNA	FAM-AAC AAA CAA GGGG AAG AAA GAA	22
K<sup>+</sup>	PSO	GGG TTA GGG TTA GGG TTA GGG	21
					cDNA	FAM-<u>ATT</u> C<u>G</u>C TAA CC<u>T</u> TAA C<u>A</u>C TAA C(修饰前：FAM-CCC TAA CCC TAA CCCTAA CCC)	22
pH	i-motif	CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC	21
					cDNA	FAM-<u>ATT</u> G TTA GTG TTA GGT TTA G(修饰前：FAM-<u>GG</u>G TTA G<u>G</u>G TTA GG<u>G</u> TTA G<u>GG</u>)	20

实施例1  可卡因的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的可卡因的核酸适体溶液与2μL浓度为100μM的cDNA溶液，加入14μL的缓冲溶液(25mMTris，pH8.2，0.3MNaCl)后，加热至85℃后缓慢冷却至室温，使其进行充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL浓度为0.01～1mM的可卡因盐酸盐的水溶液，室温条件下反应30min使其进行充分反应。同时以不加可卡因，加入2μL水的一组作为空白、以及加入2μL 1mM的苯甲酰芽子碱(N1)、芽子碱甲酯(N2)的两组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL的纳米金溶液(13nm，3.5nM)，反应5min后，用上述缓冲溶液(25mMTris，pH8.2，0.3M NaCl)补足总体积0.2mL后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，荧光光谱图见图2，可见在含有可卡因的一组溶液中，可卡因与双链探针中的核酸适体结合，释放出FAM-cDNA单链，吸附到纳米金表面从而荧光被猝灭70％以上。而没有加可卡因的一组，以及N1、N2组，双链探针的结构没有发生变化，因此加入纳米金后荧光降低幅度较小(小于30％，可能是由于杂交效率而导致溶液中部分FAM-cDNA以单链形式存在)。通过优化条件，最低可以检测出纳米金溶液中可卡因的浓度在10nM，按照检测时体积为0.2mL计算，可以检测到2pmol的可卡因，如果用nano-drop荧光光谱检测系统，检测时样品体积最小为1μL，此时可以最低检测到10fmol的可卡因。

实施例2  ATP的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的ATP的核酸适体溶液与2μL浓度为100μM的cDNA溶液，加入14μL的缓冲溶液(25mM Tris，pH8.2，0.15MNaCl)后，加热至85℃后缓慢冷却至室温，使其进行充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL浓度为0.01～1mM的ATP的水溶液，室温条件下反应30min使其进行充分反应。同时以不加ATP，加入2μL水的一组作为空白、以及加入2μL1mM的CTP、UTP、GTP的三组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL的纳米金溶液(20nm，1nM)，反应5min后，用上述缓冲溶液(25mM Tris，pH8.2，0.15M NaCl)补足总体积0.2mL后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，荧光光谱显示，加入ATP的一组荧光显著降低，而空白组和对照组荧光下降幅度较小。利用此法检测的灵敏度和检测限参考实施例1。

实施例3  二价汞离子的检测(一)

步骤：分别取1μL浓度为1μM的MSO溶液与1μL浓度为1μM的cDNA溶液，加入16μL的缓冲溶液(10mM胂酸-胂酸钠，pH6.8，0.3M NaCl)后，室温条件下反应10min使其进行充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL浓度为100nM～0.1mM的Hg²⁺的水溶液，室温条件下反应5min使其进行充分反应。同时以不加Hg²⁺，加入2μL水的一组作为空白实验。另外选择性分析通过两组实验来进行，一组加入2μL各25mM的Ca²⁺、Mg²⁺的，另外一组加入各0.5mM的混合离子(Fe²⁺，Cu²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺)。然后分别取5μL的上述反应溶液加入5μL的纳米金溶液(10nm，100nM)，反应1min后，用上述缓冲溶液(10mM胂酸-胂酸钠，pH6.8，0.3MNaCl)补足总体积0.2mL后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，荧光光谱显示，加入Hg²⁺的一组荧光显著降低，而空白组和对照组荧光下降幅度较小。利用此法检测的灵敏度和检测限参考实施例1。

实施例4  二价汞离子的检测(二)

步骤：分别取2μL浓度为100μM的MSO溶液与2μL浓度为100μM的cDNA溶液，加入14μL的缓冲溶液(10mM胂酸-胂酸钠，pH6.8，0.3M NaCl)后，室温条件下反应10min使其进行充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL浓度为0.01mM～1mM的Hg²⁺的水溶液，室温条件下反应5min使其进行充分反应。同时以不加Hg2⁺，加入2μL水的一组作为空白实验。另外选择性分析通过两组实验来进行，一组加入2μL各25mM的Ca²⁺、Mg²⁺的，另外一组加入各0.5mM的混合离子(Fe²⁺，Cu²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Ni²⁺，Zn²⁺，Cd²⁺)。然后分别取2μL的上述反应溶液加入1000μL的纳米金溶液(10nm，1nM)，反应5min后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，荧光光谱显示，加入Hg²⁺的一组荧光显著降低，而空白组和对照组荧光下降幅度较小。利用此法检测的灵敏度和检测限参考实施例1。

实施例5  钾离子的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的PSO溶液与2μL浓度为100μM的cDNA溶液，加入14μL的缓冲溶液(10mM PB，pH7.4，0.3M LiCl)后，室温条件下反应5min使其进行充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL浓度为0.01mM～1mM的K⁺的水溶液，4℃下反应5min使其进行充分反应。同时以不加K⁺，加入2μL水的一组作为空白实验，以及加入2μL300mM的Na⁺作为对照组。然后分别取2μL的上述反应溶液加入在4℃预冷的100μL的纳米金溶液(13nm，10nM)，反应5min后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，荧光光谱显示，加入K⁺的一组荧光显著降低，而空白组和对照组荧光下降幅度较小。利用此法检测的灵敏度和检测限参考实施例1。

实施例6  pH-DNA结构的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的pH-DNA溶液与2μL浓度为100μM的cDNA溶液，加入14μL的缓冲溶液(10mM PB，pH7.0，0.3M NaCl)后，室温条件下反应15min使其进行充分杂交形成双链探针。用HCl或NaOH调节如上制备而得的纳米金溶液(13nm，5nM)的pH分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0。然后分别取2μL的上述反应溶液加入不同pH值的100μL的纳米金溶液，室温反应1min后，用上述缓冲溶液补足总体积0.2mL后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

结果：在pH为5.5的一组溶液中，pH-DNA主要以四分体的刚性结构存在，释放出荧光标记的cDNA单链，吸附到纳米金表面，因此荧光显著降低。而在pH为8.5的一组溶液中，仍主要以双链形式存在，荧光降低较少。同时得到pH-DNA的结构半转换点在pH6.3附近，这与通过CD谱检测得到的pH6.2的结构半转换点非常吻合。

实施例7  pH的检测

1、获得标准工作曲线

(1)分别取2μL浓度为100μM的pH-DNA溶液与2μL浓度为100μM的cDNA溶液，加入14μL的缓冲溶液(10mM PB，pH7.0，0.3M NaCl)后，室温条件下反应30min使其进行充分杂交形成双链探针。

(2)用HCl或NaOH制备pH分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0的水溶液，然后分别取50μL该不同pH值的水溶液加入到50μL如上制备而得的纳米金溶液(13nm，3.5nM)中，混合均匀。

(3)分别取2μL的步骤(1)的反应溶液加入到步骤(2)的不同pH值的100μL的纳米金溶液中，室温反应5min，加入上述缓冲溶液补足0.2mL后记录实验组和对照组的荧光光谱。获得标准工作曲线。

2、样品的检测

取50μL待测pH值的样品加入到50μL如上制备而得的纳米金溶液中(13nm，3.5nM)。再加入2μL的步骤(1)的反应溶液，室温反应5min，然后加入上述缓冲溶液补足0.2mL后，记录实验组和对照组的荧光光谱，根据标准曲线，确定待测溶液的pH值。

结果：可检测的pH值的样品的pH范围是pH5～10。

实施例8  凝血酶的检测

步骤：分别取2μL浓度为1μM的凝血酶的核酸适体溶液与2μL浓度为1μM的cDNA溶液，加入14μL的缓冲溶液(20mM Tris-乙酸，pH7.4，140mMNaCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂)后，加热至85℃后缓慢冷却至室温，使其进行充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL浓度为10nM～0.1mM的凝血酶的水溶液，室温条件下反应30min使其进行充分反应。同时以不加凝血酶，加入2μL水的一组作为空白实验。以及加入2μL1mM的BSA的一组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL的纳米金溶液(10nm，5nM)，反应1min后，用上述缓冲溶液(20mM Tris-乙酸，pH7.4，140mM NaCl，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂)补足总体积0.2mL后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，荧光光谱显示，加入凝血酶的一组荧光显著降低，而空白组和对照组荧光下降幅度较小。利用此法检测的灵敏度和检测限参考实施例1。

实施例9  溶菌酶的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的溶菌酶的核酸适体溶液与2μL浓度为100μM的cDNA溶液，加入14μL的缓冲溶液(10mM PB，pH7.0，0.2MNaCl)后，加热至85℃后缓慢冷却至室温，使其进行充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL浓度为0.01～1mM的溶菌酶的水溶液，室温条件下反应30min使其进行充分反应。同时以不加溶菌酶，加入2μL水的一组作为空白实验。以及加入2μL 1mM的BSA的一组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入100μL的纳米金溶液(13nm，10nM)，反应5min后，用上述缓冲溶液(10mM PB，pH7.0，0.2M NaCl)补足总体积0.2mL后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，荧光光谱显示，加入溶菌酶的一组荧光显著降低，而空白组和对照组荧光下降幅度较小。利用此法检测的灵敏度和检测限参考实施例1。

实施例10  PDGF的检测

步骤：分别取2μL浓度为100μM的溶菌酶的核酸适体溶液与2μL浓度为100μM的cDNA溶液，加入14μL的缓冲溶液(10mM PB，pH7.0，0.2MNaCl)后，加热至85℃后缓慢冷却至室温，使其进行充分杂交形成双链探针。然后向杂交液中加入2μL浓度为0.01～1mM的PDGF的水溶液，37℃条件下反应30min使其进行充分反应。同时以不加PDGF，加入2μL水的一组作为空白实验。以及加入2μL 1mM的BSA的一组作为对照。然后分别取2μL的上述反应溶液加入37℃预热的100μL的纳米金溶液(13nm，10nM)，反应5min后，用上述缓冲溶液(10mM PB，pH7.0，0.2M NaCl)补足总体积0.2mL后，记录实验组和对照组的荧光光谱。

结果：根据如图1所示的原理和操作步骤，荧光光谱显示，加入PDGF的一组荧光显著降低，而空白组和对照组荧光下降幅度较小。利用此法检测的灵敏度和检测限参考实施例1。

Claims (11)

1.一种基于纳米金与核酸结构的靶分子检测方法，所述靶分子不包括DNA分子，其特征在于，依次包括以下步骤：

1)将能与靶分子特异性结合的特异性DNA与荧光标记的cDNA杂交形成双链捕获探针；

2)加入待检溶液进行反应；

3)加入纳米金溶液进行反应，记录反应溶液的荧光光谱。

2.根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤1)所述的靶分子为三磷酸腺苷、可卡因、凝血酶、溶菌酶、血小板衍生性生长因子、钾离子、汞离子或氢离子。

3.根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤1)所述的特异性DNA为核酸适体、特异性结合汞离子的寡核苷酸、特异性结合钾离子的寡核苷酸或具有i-motif结构的寡聚核苷酸。

4.根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤1)所述的荧光标记所用的荧光基团选自荧光素、Cy3、Cy5、罗丹明B、异硫氰酸荧光素和6-羰基-罗丹明。

5.根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤3)所述的纳米金的粒径为10～20nm。

6.根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤3)所述的纳米金的反应浓度为1～100nM。

7.根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤3)所述的纳米金与特异性DNA的摩尔数比为1∶1～1∶100。

8.根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤3)的反应温度为4～37℃，反应时间为1～5分钟。

9.根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤3)所述的反应还加入缓冲溶液进行反应。

10.根据权利要求9所述的靶分子检测方法，其特征在于，所述的缓冲溶液为常规的Tris、PBS或胂酸盐缓冲溶液，反应浓度为10～25mM。

11.根据权利要求1所述的靶分子检测方法，其特征在于，步骤3)所述观察荧光光谱的方法为分光光度法。

Images