CN105200119B - 一种基于石墨烯氧化物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，公开了一种基于石墨烯氧化物传感器及其制备方法和应用，具体涉及一种基于Tween 80修饰的石墨烯氧化物—核酸适配体传感器及其检测凝血酶的方法本发明的技术方案主要包括：1）制备石墨烯氧化物；2）把石墨烯氧化物加入到Tween 80通过自组装修饰后的Au NP标记的核酸适配体上；3）加入不同浓度的凝血酶，通过石墨烯氧化物表面吸附的核酸适配体标记AuNP的紫外吸收强度的变化，进行检测。本发明充分利用石墨烯氧化物的特性，采用AuNP标记的核酸适配体序列与凝血酶特异性结合，通过AuNP紫外吸收值的变化，能高灵敏度、无标记、低成本地实现凝血酶的微量检测，通过加入Tween 80，将石墨烯氧化物‑核酸适配体传感器对凝血酶检测限提高至0.005 nM。

Description

一种基于石墨烯氧化物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学领域中的蛋白质检测领域，涉及一种基于石墨烯氧化物传感器对凝血酶（thrombin）的检测方法，具体涉及一种基于失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚（Tween 80）修饰的石墨烯氧化物（GO）—核酸适配体（aptamer）传感器及其检测凝血酶的方法，属于生物医学领域中的蛋白质检测方法。

背景技术

人的thrombin是凝血连锁反应的主要效应蛋白酶，thrombin能使纤维蛋白原转化成纤维蛋白。局部应用后作用于病灶表面的血液很快形成稳定的凝血块，用于控制毛细血管、静脉出血，或作为皮肤、组织移植物的黏合、固定剂。thrombin在凝血系统的许多疾病中发挥着关键性作用。过量表达thrombin能够导致血栓形成，但是它若表达不足则可能导致血友病。因此，准确地监控thrombin对于确定给定病人的合适治疗方法是至关重要的(Patthara K., Sunil K., Arya, Chee C.W., Lee J. O., Mi K. P. Coiled-coilpeptide based sensor for ultra-sensitive thrombin detection, Biosens.Bioelectron. 2014, 55, 26-31；Du F., Alam M. N., Pawliszyn J. Aptamer-functionalized solid phase microextraction-liquid chromatography/tandem massspectrometry for selective enrichment and determination of thrombin, Anal.Chim. Acta 2014, 845:45-52.)。GO是单一的原子层，可以随时在横向尺寸上扩展到数十微米，长久以来被视为亲水性物质，从石墨烯薄片边缘到中央呈现亲水至疏水的性质分布，制备简单，成本比较低，从而在生物检测中得到广泛的应用，而且GO在与DNA相互作用时，有一个重要的特点，单链DNA通过π－π效应，能吸附到GO表面(Qian, Z. S., Shan, X. Y.,Chai, L. J., Ma, J. J., Chen, J. R., Feng, H., Nanoscale, 2014, 6: 5671–5674)，aptamer 是一种单链DNA，能特异性地结合thrombin，当thrombin与aptamer特异结合后，aptamer会脱离GO表面，被检测的thrombin能非特异性地吸附到GO表面，从而阻止检测灵敏性的提高。为发展高灵敏、快速地、低成本地检测thrombin的方法，我们利用Tween80改善金纳米在缓冲液中的稳定性，缩短金纳米与核酸的链接时间，提高了反应效率并阻止GO表面非特异性吸附的thrombin，提高检测的灵敏度，发展一种灵敏度较高的thrombin的检测方法。 发明内容

本发明目的是提供一种基于Tween 80修饰的GO传感器及其对thrombin的检测方法，Tween 80能缩短金纳米与核酸的链接时间，提高了反应效率并阻止GO表面对thrombin的非特异性吸附，从而高灵敏、快速、低成本对thrombin进行检测。

一种基于石墨烯氧化物传感器，所述传感器为石墨烯氧化物-核酸适配体传感器，是金纳米粒子Au NP表面经Tween 80修饰后，连接核酸适配体，再与石墨烯氧化物结合而成的。

一种基于石墨烯氧化物传感器的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备石墨烯氧化物：通过改良的Hummers法制备石墨烯氧化物GO，将石墨烯氧化物GO真空干燥备用，使用前，在水溶液中超声分散，得石墨烯氧化物分散液备用；

（2）Tween 80修饰Au NP表面：按照1mL金溶胶中加10μl Tween 80的比例，配制分散液A，反应30min备用；Tween 80通过自组装与Au NP表面相结合，形成一层保护膜，防止AuNP聚集；

（3）将凝血酶thrombin的核酸适配体aptamer连接到金纳米粒子Au NP上：在步骤（2）所得的分散液A中，加入核算适配体aptamer，5’- GG TTG GTG TGG TTG G -3’，5’末端标记巯基（-SH）；加热反应2.5 h后，核算适配体aptamer连接到Au NP上，得分散液B；

（4）传感器的构建：将步骤（1）制得的石墨烯氧化物GO分散液加入到步骤（3）所得的分散液B中，即制备成基于核算适配体aptamer的GO传感器；GO能够使Au NP的紫外吸收值降低。

步骤（1）中，石墨烯氧化物分散液的浓度为2 mg/ml。

步骤（2）中，所述金溶胶的浓度为8-10 nM，所述的Tween 80的浓度为10%；所述分散液A中的Tween 80的最终体积百分浓度为0.1%。

步骤（3）中，所述分散液B中，核算适配体的最终浓度为120 nM。

步骤（4）中，所述GO传感器中，核酸适配体的终浓度为120 nM；GO的终浓度为40 µg/mL。

所述的一种基于石墨烯氧化物传感器应用于检测凝血酶，具体步骤为：在所述传感器中，加入0.005-30 nM的凝血酶，结合凝血酶后，Au NP的紫外吸收值较加入凝血酶前提高了30%-237.07%；根据Au NP的紫外吸收值的变化，对其进行检测。

所述传感器用于检测凝血酶的检测限可以达到0.005 nM。

本发明的有益效果为：

1. 本发明中GO易于获得，方法简单、成本低，充分利用GO能使结合有AuNP的aptamer的紫外吸收值降低，当蛋白质结合单链DNA后，紫外吸收值增加的特点，能无标记、特异性、高灵敏性对thrombin进行检测。

2.本发明采用Tween 80稳定金纳米在缓冲液中的分散性，大大缩短了金纳米与核酸的链接时间，提高了反应效率，阻止GO对thrombin的非特异性吸附，解决基于GO传感器检测thrombin中的非特异吸附的问题，从而增加检测的特异性，进一步提高检测的灵敏性。

附图说明

图1：本发明的流程示意图。

图2：基于GO传感器对凝血酶thrombin灵敏性检测图。

图3：基于GO传感器对凝血酶thrombin选择性检测图。

图4：Tween 80修饰GO传感器对凝血酶thrombin检测的影响图。

图5：Tween 80修饰GO传感器对0.005 nM thrombin检测图，图中曲线由上至下依次为aptamer-AuNP-Tween 80、aptamer--AuNP-GO- Tween 80-0.005 nM thrombin、aptamer-AuNP-GO- Tween 80检测结果曲线。

图6：Tween 80修饰GO传感器对0.01nM thrombin检测图，图中曲线由上至下依次为aptamer-AuNP-Tween 80、aptamer--AuNP-GO- Tween 80-0.01 nM thrombin、aptamer-AuNP-GO- Tween 80检测结果曲线。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。

图1为本发明的流程示意图，结合有Au NP的aptamer与GO吸附后，Au NP的紫外吸收值降低，当aptamer结合thrombin后，Au NP的紫外吸收值得到一定程度的恢复，根据AuNP的紫外吸收值的变化，从而对其进行检测。

实施例1：

(1) 制备GO：通过改良的Hummers法大批量制备GO，在三口烧瓶中，加入3g鳞片石墨粉、1.5 g NaNO₃与 69 mL浓硫酸后放入恒温水浴锅中搅拌。反应1h后加入1g KMnO₄，35℃下反应5个小时后加入150 mL去离子水。在温度98℃下反应30 min后，再加入50 mL的去离子水、5 mL H₂O₂以及 250 mL的10%稀盐酸，将溶液倒入1000 mL的大烧杯中，洗涤至PH值为5-6。将氧化产物真空干燥备用，使用前，在水溶液中1000W超声30 min。；加入10% Tween80，Tween 80通过自组装与GO表面相结合，阻止thrombin非特异吸附。

（2）合成特异的aptamer序列：5’- GG TTG GTG TGG TTG G -3’，5’末端标记巯基（-SH）；aptamer在10% Tween 80下连接到Au NP，该序列在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（3）传感器的构建：将GO加入到连接有Au NP的aptamer水溶液中，即制备成基于aptamer的GO传感器；GO能够使Au NP的紫外吸收值降低；其中aptamer的浓度为120 nM；GO的浓度为40 µg/mL；

（4）基于GO传感器对thrombin进行检测：含40 μg/mL GO及120 nM aptamer混合物在室温下放置30 min后，（本实验中所用比色皿规格为200µL，混合物总体积不小于500µL，即可，下面实施例相同）。加入不同浓度(0.01，0.1，1，5,10，60 nM) thrombin后，Au NP紫外值强度增加，30 min后对aptamer上Au NP紫外值进行扫描，如图2，图中Au NP上aptamer的浓度为120 nM，GO 浓度为40 μg/mL。检测发现，灵敏度可达到0.01 nM。图2插图中F/F₀是加入目标检测物前与加入目标检测物后的比，表明吸光度值与凝血酶浓度之间的线性关系R²=0.96819。（5）选取其他与aptamer非特异作用的几个蛋白质lysozyme、BSA、IgG 进行选择性检测，在同一实验条件下，发现GO-aptamer能特异结合thrombin，并能明显区分出与其他几个蛋白的差别，如图3，实验证明该检测方法对thrombin具有良好地选择性。

（6）基于Tween 80修饰的GO传感器对thrombin进行检测：对40 μg/mL GO、 120 nMaptamer与不同浓度(2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%) 的Tween 80混合后，室温下放置30 min后，发现在10% Tween 80下效果最好如图4，图中灰色是没有加入thrombin，深灰色为加入thrombin的。从图4说明了Tween 80的浓度对实验的结果有很大影响。当加入的Tween 80的终浓度为0.1%时反应体系中的物质比例最好，凝血酶与其对应的核酸适配体的结合率最高，从而加入凝血酶前后的紫外吸收值也最明显 。

在此基础上对0.005 nM 的thrombin进行检测，通过Origin 8.0分析aptamer上标记的FAM强度发生变化，如图5所示，发现检测的灵敏度达到0.005 nM （5 pM）。

实施例2：

步骤（1）、（2）和（3）同实施例1中。

（4）基于Tween 80修饰的GO传感器对thrombin进行检测：含40 μg/mL GO、120 nMaptamer与不同浓度(2%， 4%，6%，8%，10%，12%) 的Tween 80混合后，室温下放置30 min，发现在10% Tween 80下效果最好，在此基础上对0.01 nM的thrombin进行检测，如图6所示，通过Origin 8.0分析aptamer上标记的AuNP紫外吸收强度发生变化，发现检测的灵敏度达到0.01 nM （10pM）。

所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种基于石墨烯氧化物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备石墨烯氧化物：通过改良的Hummers法制备石墨烯氧化物，将石墨烯氧化物真空干燥备用，使用前，在水溶液中超声分散，得石墨烯氧化物分散液备用；石墨烯氧化物分散液的浓度为2mg/ml；

(2)Tween 80修饰Au NP表面：按照1mL金溶胶中加10μl Tween 80的比例，配制分散液A，反应30min备用；所述金溶胶的浓度为8-10nM，所述的Tween 80的浓度为10％；所述分散液A中的Tween 80的最终体积百分浓度为0.1％；

(3)将凝血酶的核酸适配体连接到金纳米粒子Au NP上：在步骤(2)所得的分散液A中，加入核酸适配体，5’-GG TTG GTG TGG TTG G-3’，5’末端标记巯基(-SH)；加热反应2.5h后，核酸适配体连接到Au NP上，得分散液B；所述分散液B中，核酸适配体的最终浓度为120nM；

(4)传感器的构建：将步骤(1)制得的石墨烯氧化物分散液加入到步骤(3)所得的分散液B中，即制备成基于核酸适配体的GO传感器，所述GO传感器中，核酸适配体的终浓度为120nM；GO的终浓度为40μg/mL。

2.根据权利要求1所述制备方法制得的一种基于石墨烯氧化物传感器的应用，其特征在于其应用于检测凝血酶。

3.根据权利要求2所述的一种基于石墨烯氧化物传感器的应用，其特征在于，具体步骤为：在所述传感器中，加入0.005-30nM的凝血酶，结合凝血酶后，Au NP的紫外吸收值较加入凝血酶前提高了30％-237.07％；根据Au NP的紫外吸收值的变化，对其进行检测。