PT2257624E - Métodos e composições - Google Patents

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Gregory Winter
Christian Heinis
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Medical Res Council
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Description

ΡΕ2257624 1
DESCRIÇÃO "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES"
CAMPO DO INVENTO 0 invento está relacionado com a modificação e constrangimento de polipéptidos, em particular com poli-péptidos geneticamente modificados em complexos com o ácido nucleico que os codifica, como seja no contexto de apresentação fágica.
FUNDAMENTO DO INVENTO A geração de moléculas com elevada afinidade e especificidade para alvos biológicos é um problema central na química, biologia e ciências farmacêuticas. Em particular, os ligandos para ligação são importantes na criação de fármacos que possam intervir com processos biológicos. A criação de ligandos que se ligam a um ligando alvo escolhido, geralmente, implica a geração de uma pluralidade de moléculas de ligação putativas e testar as referidas moléculas relativamente às suas propriedades de ligação.
Ainda que técnicas biológicas de selecção in vitro tenham sido usadas eficientemente para o isolamento 2 ΡΕ2257624 de grandes estruturas biopoliméricas tais como anticorpos, até agora têm sido menos praticáveis para o isolamento de fármacos consistindo em pequenas moléculas. As técnicas biológicas de selecção in vitro estão geralmente ligadas a polímeros biológicos tais como polipéptidos, RNA ou DNA. Pequenos biopolímeros, como por exemplo péptidos, podem também ligar-se a alvos biológicos mas podem apresentar flexibilidade conformacional e podem ser susceptíveis à degradação proteolítica em fluidos do corpo. Ainda, as afinidades de ligação de péptidos lineares pequenos são frequentemente fracas. São conhecidas várias estratégias de circularização que exercem constrangimento espacial em bibliotecas de pequenos péptidos geneticamente codificados. É conhecido, por exemplo, que reportórios de péptidos apresentados em fagos são circularizados pela oxidação de dois resíduos de cisterna flanqueantes. Sabe-se que as bibliotecas de péptidos cíclicos codificados por mRNA são geradas através da ligação da amina N-terminal e de um resíduo de lisina do péptido com um reagente químico para ligação cruzada. Esta estratégia foi usada para o isolamento de macrocíclicos insensíveis a redox que se ligam à proteína de sinalização Gail (Millward, S.W. et al., ACS Chem. Biol., 2007). São também conhecidas várias estratégias para usar na incorporação de blocos de construção não naturais em bibliotecas de polipéptidos codificados geneticamente, para expandir a diversidades das bibliotecas ou para inserir propriedades que não podem ser proporcionadas pelos aminoácidos naturais. No entanto, as estratégias permitiram apenas a adição de um número 3 ΡΕ2257624 limitado e pequenos apêndices orgânicos a polipéptidos lineares codificados geneticamente. Frankel, A. et al., por exemplo, incorporaram aminoácidos não naturais em polipéptidos naturais que eram codificados por apresentação de mRNA (Frankel, A. et al., Chem. Biol., 2003) . Jespers L. et al., ligaram quimicamente uma molécula repórter fluorescente a uma ansa hipervariável de um reportório de anticorpos apresentado em fagos e seleccionaram este reportório relativamente à ligação a antigénio (Jespers, L. et al. Prot. Eng., 2004). Dwyer, M.A. et al. Uniram péptidos sintéticos a um reportório de péptidos apresentados em fagos através da ligação quimica nativa para a geração de uma biblioteca de inibidores de proteases contendo um aminoácido não natural (Dwyer, M.A. et al., Chemistry & Biology, 2000). Pequenas moléculas orgânicas foram também ligadas a reportórios combinatórios de péptidos codificados por mRNA. A equipa de pesquisa de Roberts, R.W. tinham ligado um grupo de penicilina a uma posição fixa de uma biblioteca de péptidos de apresentação de mRNA para selec-cionar inibidores da proteína 2a de ligação à penicilina de Staphylococcus aureus (Li, S. and Roberts, W.R., Chem. & Biol., 2003).
De forma a aplicar a selecção in vitro a bibliotecas combinatórias de compostos tendo arquitecturas moleculares mais diversas (e.g. moléculas ramificadas) e sendo formados por blocos de construção não naturais, foram propostas várias metodologias. Ao contrário dos métodos de selecção biológica in vitro, estas metodologias usam 4 ΡΕ2257624 estratégias químicas para ligar segmentos de DNA a pequenas moléculas orgânicas. Brenner S. e Lerner R.A. propuseram um processo de síntese combinatória paralela para codificar membros individuais de uma grande biblioteca de compostos químicos com sequências nucleotídicas únicas nas esferas (Brenner, S. e Lerner, R.A., PNAS, 1992). Após a entidade química ser ligada ao alvo, o código genético é descodificado por sequenciação do segmento nucleotídico. Liu D.R. e colaboradores conjugaram uma pequena colecção de moléculas orgânicas a oligonucleótidos de DNA e realizaram selecções de afinidade com diferentes antigénios (Doyon, J.B. et al., JACS, 2003) . Neri D. e colaboradores geraram grandes reportórios de pares de moléculas por auto-montagem de sub-bibliotecas químicas mais pequenas codificadas por DNA através de hibridação de duas cadeias de DNA (Melkko, S. et al., Nature Biotechnol., 2004). A metodologia foi usada com êxito para a maturação de afinidade de ligandos moleculares pequenos. Halpin D.R. e Harris P.B. desenvolveram uma estratégia para a evolução in vitro de bibliotecas combinatórias químicas que envolve a amplificação de compostos seleccionados para realizarem múltiplos ciclos de selecção (Halpin, D.R. e Harbury, P.S., PLOS Biology, 2004). Woiwode T.F. et al., ligaram bibliotecas de compostos sintéticos às proteínas da cápside de partículas de bacteriófagos, de forma que a identidade da estrutura química fosse especificada no genoma do fago (Woiwode, T. F., Chem. % Biol., 2003). Todas estas estratégias que empregam compostos químicos especificados por DNA demonstram ser eficientes em experiências modelo e alguns deram 5 ΡΕ2257624 mesmo novos elementos de ligação de pequenas dimensões. No entanto, tornou-se aparente que a codificação de grandes bibliotecas de compostos e a amplificação de compostos seleccionados é muito mais exigente que os procedimentos equivalentes em sistemas biológicos de selecção.
Jespers et ai. (2004 Protein engineering design and selection, volume 17, n° 10, páginas 709-713) descrevem a selecção de bio-sensores ópticos a partir de bibliotecas de anticorpos obtidos por sintese química. Este documento está relacionado com a ligação de uma molécula repórter fluorescente à ansa hipervariável de um reportório de anticorpos apresentados no fago. Em particular, este documento descreve a ligação de uma molécula repórter fluorescente a uma ansa hipervariável (região determinante de complementaridade ou CDR) de um reportório de anticorpos sintéticos. A molécula repórter fluorescente está ligada através de uma única ligação covalente a um resíduo de cisteína introduzido artificialmente na ansa hipervariável. É efectuada uma ligação de um para um. Os resíduos de cisteína nas partículas fágicas foram reduzidos com DTT e o excesso de agente redutor foi removido por precipitação convencional com polietilenoglicol (PEG) largamente conhecido na área.
Dwyer et al., descrevem a apresentação biossin-tética por fagos, descrevendo uma nova ferramenta de engenharia de proteínas que combina diversidade química e genética. Dwyer et al. (Chem Biol 2000, volume 7, n°4, áginas 263-274) descrevem a ligação química de um péptido 6 ΡΕ2257624 sintético tendo um aminoácido não estrutural a uma biblioteca de péptidos sintéticos compreendendo os principais resíduos estruturais de uma proteína com interesse. A motivação para esta realização foi gerar uma gama diversa de sequências de proteases, cada uma tendo um segmento constante incorporando um aminoácido não natural. 0 péptido sintético compreendendo o aminoácido não natural foi simplesmente ligado por uma ligação química nativa, resultando na acoplagem dos dois fragmentos peptídicos. Não foi descrito qualquer composto de conjugação. Não foi descrita qualquer ligação com moléculas pequenas. Não foi conseguida qualquer constrangimento conformacional do polipéptido resultante. Não foi descrita ligação covalente de grupos particulares à cadeia polipeptídica.
Diferentes equipas de investigação anteriormente ligaram polipéptidos com resíduos de cisteína a uma estrutura molecular sintética (Kemp, D.S. e McNamara, P.E., J. Org. Chem. 1985: Timmerman, P. et al., ChemBioChem, 2005). Meloen e colaboradores usaram tris(bromometil)ben-zeno e moléculas relacionadas para a ciclização rápida e quantitativa de múltiplas ansas de polipéptidos em suportes sintéticos para a simulação estrutural de superfícies proteicas (Timmerman, P. et al., ChemBioChem, 2005). Os métodos para a geração de compostos candidatos promissores a fármacos em que os referidos compostos são gerados através da ligação de polipéptidos contendo cisteína a um suporte molecular, como por exemplo tris(bromometil)ben-zeno, estão descritos em WO 2004/077062 e WO 2006/078161. 7 ΡΕ2257624
Os métodos proporcionados em WO 2004/077062 e WO 2006/078161 baseiam-se na amostragem de compostos individuais, por exemplo num procedimento de rastreio. O rastreio de compostos individuais ou de pequenas séries de compostos é entediante e pode ser dispendiosa se forem analisados grandes números de compostos. O número de compostos que podem ser testados com os ensaios de rastreio, geralmente, não excede vários milhares. Ainda, as condições de reacção descritas em WO 2004/077062 para ligar um péptido contendo cisteina a um suporte contendo halometilo, como por exemplo tris(bromometil)benzeno, não são adequadas para modificar um péptido contendo cisteina codificado geneticamente. W02004/077062 descreve um método de selecção de um composto candidato promissor a fármaco. Em particular, este documento descreve várias moléculas de suporte compreendendo primeiro e segundo grupos reactivos e contacto do referido suporte com outras moléculas para formar duas ligações entre o suporte e a outra molécula numa reacção de acoplagem. Este método ainda apresenta muitas restrições. Em primeiro lugar, baseia-se na utilização de péptidos sintéticos e em reacções químicas in vitro em vasos separados. Por este motivo é exigente em termos de trabalho. Não existe oportunidade para automatizar ou para aplicar o método ao rastreio de muitas variantes de péptidos sem a produção manual das variantes individuais através da realização de numerosas reacções independentes em paralelo. Não existe menção à diversidade codificada geneticamente neste documento e certamente nem menção da ΡΕ2257624 aplicação a bibliotecas de fagos codificadas geneticamente. De facto, as condições de reacção descritas neste documento significam que será dificil ou impossível de realizar as reacções descritas nas partículas fágicas. W02006/078161 descreve compostos de conjugação, compostos imunogénicos e simulações de péptidos. Este documento descreve a síntese artificial de várias colecções de péptidos retirados das proteínas existentes. Estes péptidos são então combinados com um péptido sintético constante tendo algumas alterações de aminoácidos introduzidas para produzir bibliotecas combinatórias. Através da introdução desta diversidade através da ligação química a péptidos separados com várias alterações de aminoácidos, é proporcionada uma maior oportunidade de encontrar a actividade de ligação pretendida. A Figura 7 deste documento mostra uma representação esquemática da síntese de várias construções de ansas peptídicas. Não existe descrição de bibliotecas de péptidos codificados geneticamente neste documento. Não existe descrição da utilização de técnicas de apresentação fágica neste documento. Este documento descreve um processo que é considerado como incompatível com a apresentação fágica. Por exemplo, a química descrita neste documento provavelmente resulta na reacção da molécula de ligação com a cápside do fago. Existe o risco que possa ligar de forma cruzada partículas fágicas. É provável que as partículas fágicas sejam inactivadas (e.g. percam a sua infecciosidade) se sujeitas à química descrita. Este documento focou-se na manipulação 9 ΡΕ2257624 de vários péptidos sintéticos em reacções de conjugação química independentes.
Millward et al. (2007 Chemical Biology, volume 2, n°9, páginas 625-634) descreve o desenho de péptidos cíclicos que se ligam a superfícies proteicas com afinidade do tipo anticorpo. Este documento descreve a ciclização de vários péptidos produzidos a partir de uma biblioteca codificada geneticamente. Os polipéptidos são tornados cíclicos através da reacção de um elemento químico para ligação cruzada com a amina N-terminal e uma amina de uma lisina no polipéptido. Neste documento, a biblioteca codificada geneticamente é uma biblioteca de apresentação de mRNA. Este documento não descreve a ligação de qualquer composto de conjugação aos polipéptidos resultantes. Este documento está relacionado com a produção de péptidos tornados cíclicos insensíveis a redox. A química descrita neste documento é a ciclização através da reacção de um elemento de ligação química cruzada com a amina N-terminal e uma amina de uma lisina proporcionada pelo polipéptido. A reacção de ciclização é realizada num tampão de fosfatos 50 milimolar a pH 8 pela adição de DSG (1 mg por ml em DMF) . No máximo este documento descreve a ligação de duas partes de uma cadeia polipeptídica através de um grupo de ligação cruzada de forma a proporcionar um péptido cíclico. US2003/0235852 descreve bibliotecas de apresentação de ácidos nucleicos-péptidos contendo péptidos com resíduos de aminoácidos não naturais e métodos de prepa- 10 ΡΕ2257624 ração destes agentes modificadores de péptidos. Por outras palavras, este documento descreve bibliotecas de poli-péptidos codificados geneticamente que possuem um amino-ácido não natural ou um aminoácido em que um bloco de construção não natural (e.g. penicilina) é ligado após tradução numa reacção quimica. Este documento foca-se em métodos conhecidos para a associação de um péptido com o ácido nucleico que o codifica. O outro problema abordado por este documento é como incorporar aminoácidos não naturais naquele péptido. Isto é conseguido principalmente através do uso de tRNAs supressores de forma a incorporar aminoácidos não naturais em resposta a codões âmbar/ocre/opala como conhecido na área. Noutras pequenas realizações, aminoácidos não naturais são criados após tradução por tratamento do péptido traduzido com um "agente modificador de péptidos". Este reagente destina-se, tipicamente, a alterar um resíduo de aminoácido existente de forma a convertê-lo num resíduo de aminoácido não natural, ou de outra forma torná-lo funcionalmente reactivo ou receptivo à ligação a um outro grupo químico. Especificamente, este documento ensina a conjugação pós-tradução de um resíduo cisteína no polipéptido de interesse ao antibiótico beta lactama ácido 6-bromoacetil penicilâmico. Isto resulta na conjugação deste análogo da penicilina ao polipéptido de interesse através de uma única ligação à cadeia lateral com um resíduo de cisteína. Não é descrita ligação múltipla da molécula a ser ligada ao polipéptido. Não é descrita constrangimento conformacional do polipéptido. Não são formadas ansas peptídicas ou quaisquer outras estruturas 11 ΡΕ2257624 terciárias complexas pelos métodos descritos neste documento - é puramente uma forma de ligação de mais um grupo molecular a um polipéptido através de uma única ligação. A quimica de conjugação convencional é usada de forma a efectuar modificações aos polipéptidos neste documento.
SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento permite, vantajosamente, a combinação de diversidade geneticamente codificada, em particular bibliotecas de polipéptidos codificados geneticamente, com a modificação quimica e o constrangimento conformacional.
Ainda, as técnicas aqui descritas proporcionam a ligação de um composto de conjugação a uma molécula de polipéptido através de pelo menos três ligações covalentes. Isto oferece a vantagem de constrangimento conformacional do polipéptido, em particular constrangimento conforma-cional de pelo menos dois segmentos do polipéptido um relativamente ao outro. Pelo contrário, a utilização de um composto de conjugação que faz apenas duas ligações covalentes constrangirá apenas um único segmento do polipéptido.
As vantagens do invento provêm destas caracterís-ticas técnicas, por exemplo devido à sua construção com triplas ligações, as moléculas conjugadas do invento possuem duas ou mais ansas peptidicas que podem interagir 12 ΡΕ2257624 com um alvo. Com múltiplas ansas de ligação, podem ser obtidas afinidades de ligação mais elevadas do que com moléculas que possuem apenas uma única ansa peptídica.
Ainda, a superfície de interacção de uma molécula do invento com duas ou mais ansas de ligação para interacção com um alvo é maior do que a de uma molécula com uma única ansa peptídica com um alvo. A superfície de ligação maior pode proporcionar maior afinidade de ligação e/ou pode igualmente proporcionar melhor especificidade.
Assim num aspecto, o invento proporciona um complexo compreendendo uma partícula fágica, a referida partícula fágica compreendendo (i) um polipéptido; (ii) um ácido nucleico codificador do polipéptido (i) e apresentado na superfície do fago; (iii) um composto de conjugação ligado ao referido polipéptido em que o referido composto de conjugação está ligado ao polipéptido através de pelo menos três ligações covalentes discretas.
As ligações covalentes são adequadamente ligações covalentes discretas, no sentido de cada uma ser uma ligação separada entre o composto de conjugação e uma parte do polipéptido. Por exemplo, uma única ponte entre o 13 ΡΕ2257624 polipéptido e o composto de conjugação, ponte única essa que é constituída por até três ligações covalentes (e.g. composto de conjugação -x-y-polipéptido em que representa uma ligação covalente) não são considerados como compreendendo pelo menos três ligações covalentes discretas devido a três ligações não serem três pontes ou conexões separadas do composto de conjugação ao polipéptido alvo. 0 princípio subjacente é que o composto de conjugação/núcleo molecular e o polipéptido sejam ligados por pelo menos três ligações de pontes covalentes separadas.
Adequadamente cada uma das três ligações covalentes é formada com um resíduo de aminoácido separado do polipéptido. Por outras palavras, um resíduo de aminoácido separado é adequadamente um resíduo de aminoácido individual ou distinto - mais de uma ligação pode ser efectuada com uma única espécie ou tipo de resíduo de aminoácido e.g. duas das ligações podem ser formadas com resíduos de cisterna mas de preferência os dois resíduos de cisteína serão resíduos de cisteína separados. A parte composto de conjugação-polipéptido do complexo descrito atrás é, por vezes, referida como o "conjugado". Nalgumas realizações o conjugado (i.e. a parte de polipéptido-composto de conjugação correspondendo à compreendida pelo complexo do invento) pode ser sintetizada separadamente. Nesta realização o conjugado pode não estar complexado com um ácido nucleico. Isto está discutido mais detalhadamente abaixo. 14 ΡΕ2257624
De preferência, "codificador" tem o seu significado natural usado na área, i.e. codificador no sentido do código de tripletos universal para converter a sequência nucleotidica em sequência polipeptidica. Nos trabalhos anteriores "codificador" poderá ter sido usado no sentido de "marcação" ou "deconvolução" e.g. quando uma sequência nucleotidica única é usada para marcar um grupo e esse conhecimento da sequência nucleotidica pode "descodificar" i.e. dizer ao utilizador qual o grupo marcado que estava presente, ainda que sem ter qualquer relação biológica com a sua estrutura. No entanto, no presente invento, "codificar" e "descodificar" são usados na forma natural tradicional para referir codificação no sentido de tradução da sequência nucleotidica em sequência de aminoácidos.
De preferência, o composto de conjugação compreende uma molécula orgânica. Adequadamente o composto de conjugação compreende uma molécula orgânica pequena.
De preferência, as ligações covalentes são formadas entre o composto de conjugação e os residuos de aminoácidos do polipéptido.
De preferência, o referido polipéptido compreende um residuo de cisterna e, adequadamente, pelo menos uma das referidas três ligações covalentes discretas para ligação do referido composto de conjugação ao polipéptido compreende uma ligação ao referido residuo de cisterna. 15 ΡΕ2257624
Adequadamente o composto de conjugação possui uma simetria molecular correspondendo ao número de ligações covalentes através das quais está ligado ao polipéptido.
Adequadamente o composto de conjugação possui três eixos de simetria molecular e o composto de conjugação é ligado ao polipéptido através de três ligações covalentes.
Adequadamente o composto de conjugação compreende um grupo quimico estruturalmente rigido.
Adequadamente o composto de conjugação compreende tris-(bromometil)benzeno (TBMB). Ácido nucleico possui o significado habitualmente atribuído na área e pode compreender DNA, RNA ou qualquer ácido nucleico adequado. 0 ácido nucleico pode compreender um ou mais oligonucleótidos ou genomas fágicos ou qualquer outro exemplo adequado de ácidos nucleicos conhecidos dos familiarizados com a área. 0 referido ácido nucleico está contido na referida partícula fágica.
Num outro aspecto, o invento está relacionado com uma biblioteca de polipéptidos geneticamente codificados compreendendo pelo menos dois complexos diferentes como atrás descrito. 16 ΡΕ2257624
Num outro aspecto, o invento está relacionado com um método para a preparação de um complexo, o referido método compreendendo (i) obtenção de uma partícula fágica compreendendo um ácido nucleico e um polipéptido expresso pelo ácido nucleico e apresentado na partícula fágica, (ii) obtenção de um composto de conjugação e (iii) ligação do referido composto de conjugação ao referido polipéptido através da formação de pelo menos três ligações covalentes entre o referido composto de conjugação e o polipéptido.
Adequadamente os grupos reactivos do polipéptido apresentados na partícula fágica são reduzidos e, de preferência, a partícula fágica que apresentan o polipéptido compreendendo grupos reactivos reduzidos é purificada por filtração antes do passo (iii) . Adequadamente, quando os grupos reactivos compreendem cisteína eles são reduzidos: nesta realização a purificação é purificação relativamente ao agente redutor, por exemplo por filtração.
Adequadamente, após o passo de purificação por filtração, o polipéptido é mantido no estado reduzido para ligação do composto de conjugação através da incubação em tampão desgaseado e na presença de um agente quelante. 17 ΡΕ2257624
Adequadamente, o passo (iii) compreende a incubação do polipéptido e do composto de conjugação em conjunto a 30°C, a pH 8, em tampão aquoso compreendendo acetoni-trilo.
Adequadamente, o composto de conjugação compreende tris-(bromometil)benzeno (TBMB).
Adequadamente o tris-(brmometil)benzeno está presente a 10 ym.
Adequadamente, o tris-(brmometil)benzeno está presente a 10 ym, o agente quelante é o ácido etileno-diaminatetracético (EDTA), o acetonitrilo está presente a 20% e o passo de incubação (iii) é conduzido durante 1 hora.
Adequadamente, o referido método compreende ainda o passo (iv) de clivagem de uma ou mais ligações da cadeia polipeptidica. Isto tem a vantagem de modificar a cadeia polipeptidica. Por exemplo, isto pode ter o beneficio de produzir múltiplos polipéptidos ligados a um único composto de conjugação, e.g. quando a clivagem ocorre na cadeia polipeptidica entre as ligações do polipéptido e do composto de conjugação. De preferência, o passo de clivagem compreende o contacto do referido polipéptido com uma protease. 18 ΡΕ2257624
Num outro aspecto, o invento está relacionado com um complexo obtido por um método como atrás descrito.
Num outro aspecto, o invento está relacionado com um método para a identificação de um complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que é capaz de se ligar a um ligando, o método compreendendo (i) obtenção de um complexo como atrás descrito, (ii) contacto do referido complexo com o ligando e (iii) Selecção dos complexos que se liqam ao referido ligando.
Tal método de selecção pode ser conduzido em qualquer formato adequado. Adequadamente o ligando é imobilizado. 0 complexo é então colocado em contacto com o ligando imobilizado. Os complexos que não se ligam são então removidos por lavagem. Desta forma, os complexos que se ligam ao ligando imobilizado são enriquecidos ou seleccionados. Numa realização é possível que os complexos possam ser recuperados por libertação do ligando, i.e. libertando ou eluindo a parte complexo-ligando. No entanto, adequadamente os complexos são recuperados por eluição (separação) do ligando imobilizado. Nesta realização os complexos eluídos deixam de estar ligados ao ligando no passo de eluição. 19 ΡΕ2257624
Os complexos ou os polipéptidos dos referidos complexos ou os conjugados de polipéptido-composto de conjugação dos referidos complexos, podem ser úteis noutras situações. Por exemplo, podem ser úteis como base para o desenho de fármacos tais como pequenos fármacos, ou podem ser úteis como CDRs ou como grupos de ligação (e.g. para a marcação ou detecção dos seus parceiros de ligação ou outras aplicações em que o conhecimento intimo da interac-ção pode ser explorado.
Num outro aspecto, o invento está relacionado com um método como descrito atrás ainda compreendendo determinação da sequência do ácido nucleico do referido complexo.
Num outro aspecto, o invento está relacionado com um método como descrito atrás, ainda compreendendo o passo de produção de uma quantidade do complexo isolado como capaz de se ligar ao referido ligando.
Num outro aspecto, o invento está relacionado com um método como descrito atrás compreendendo ainda o passo de produção de uma quantidade do polipéptido-composto de conjugação contido no complexo isolado como capaz de se ligar ao referido ligando. Nesta realização, o polipéptido-composto de conjugação pode ser vantajosamente sintetizado na ausência de ácido nucleico.
Num outro aspecto, o invento está relacionado com um método como atrás descrito compreendendo ainda o passo 20 ΡΕ2257624 de produção de uma quantidade de um polipéptido isolado ou identificado por um método do invento, a referida produção compreendendo a ligação do composto de conjugação ao polipéptido, em que o referido polipéptido é expresso por via recombinante ou obtido por síntese química. Numa outra realização, o invento está relacionado com um método como atrás descrito compreendendo ainda o passo de produção de uma quantidade de um polipéptido isolado ou identificado por um método do invento, a referida produção compreendendo a ligação de um composto de conjugação ao polipéptido, em que o composto de conjugação pode ser diferente do composto de conjugação ligado durante o isolamento ou identificação do polipéptido, desde que o referido composto de conjugação seja ligado ao referido polipéptido através de pelo menos três ligações covalentes e em que o referido polipéptido é expresso por via recombinante ou sintetizado quimicamente.
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O invento traz novas características e vantagens associadas que podem ser explicadas mais detalhadamente em relação à geração de moléculas codificadas geneticamente como uma estrutura nuclear. Em particular, o invento proporciona restrição conformacional que não é conseguida pelas técnicas conhecidas de ciclização de péptidos. Ainda, o elemento de ligação cruzada em sistemas conhecidos tais como os de Roberts (ibid) não possui o carácter de um núcleo central/composto de conjugação do presente invento. Nos sistemas conhecidos, o elemento de ligação cruzada foi 21 ΡΕ2257624 usado puramente para substituir uma ligação dissulfureto para gerar um péptido ciclico insensível ao redox. Não existe menção ou sugestão do conceito de um núcleo central com múltiplos apêndices, tais como um complexo de composto de conjugação ligado covalentemente três vezes ao polipéptido como aqui ensinado. De facto, deve-se notar que no presente invento o polipéptido está ligado à estrutura nuclear através de pelo menos três ligações covalentes, proporcionando uma diferença estrutural chave relativamente aos sistemas conhecidos. A ligação de uma estrutura nuclear (composto de conjugação) a um polipéptido codificado geneticamente através de três ou mais ligações é uma reacção complexa que não foi até agora descrita.
Ainda, a ligação de um polipéptido a um composto de conjugação, através de pelo menos três ligações covalentes, poderá dar vários produtos diferentes. Isto poderá causar dificuldades no processo de selecção e no procedimento de descodificação. No entanto, de acordo com presente invento, é proporcionada uma solução usando um composto de conjugação com três grupos reactivos e, de preferência, com três eixos de simetria, combinação essa que tem a vantagem de dar um único produto. Certamente o leitor familiarizado com a área saberá que em determinadas circunstâncias obscuras um composto de conjugação com três eixos de simetria pode dar múltiplos produtos, mais óbvio no exemplo de uma molécula tetraédrica com três grupos reactivos idênticos; esta também possui 3 eixos de simetria 22 ΡΕ2257624 mas dará dois estereoisómeros. No entanto, para facilitar a compreensão, tais excepções teóricas à formação de um único produto são consideradas como possíveis, adequadamente os compostos de conjugação com 3 eixos de simetria dão um único produto de acordo com o presente invento; nas circunstâncias raras atrás referidas então, de preferência, o polipéptido é escolhido de forma a evitar a formação de uma molécula tetraédrica e assim manter a formação de apenas um único produto. 0 composto de conjugação usado nos métodos e composições aqui descritos é diferente dos elementos de ligação cruzada bivalentes conhecidos (e.g., como usado por Millward et al. ibid) relativamente à necessidade de o composto de conjugação do invento ter pelo menos três grupos reactivos, os quais podem formar pelo menos três ligações covalentes com o polipéptido alvo. Esta caracte-rística traz numerosos benefícios técnicos ao invento. Em primeiro lugar, ao ligar-se o composto de conjugação ao polipéptido através de pelo menos três ligações covalentes, são criadas pelo menos duas ansas polipeptídicas. Estas ansas são formadas entre a primeira e a segunda ligações e entre a segunda e a terceira ligações do composto de conjugação ao polipéptido. 0 elemento de ligação conhecido descrito por Millward et al. pode apenas ligar dois grupos funcionais de um péptido e não pode formar duas ou mais ansas peptídicas constrangidas. 23 ΡΕ2257624
Vantagens da ligação do composto de conjugação-polipéptido
Existe uma série de propriedades que distingue moléculas do invento tendo 3 ou mais ligações a um composto de conjugação das outras moléculas, tais como aquelas que possuem apenas 2 ligações. Algumas destas são explicadas abaixo.
Em primeiro lugar, será apreciado que as moléculas com duas ligações ao composto de conjugação estão constrangidas através da ligação de extremos flexíveis de um péptido linear em conjunto. Este é também o caso para as moléculas de acordo com o presente invento com 3 ou mais ligações covalentes a um composto de conjugação. No entanto, a conformação das moléculas de acordo com o presente invento, com 3 ou mais ligações covalentes a um composto de conjugação, está constrangida pelos dois efeitos adicionais que não se aplicam a uma molécula com apenas duas ligações: i) 0 polipéptido ligado ao composto de conjugação através de pelo menos três ligações covalentes compreenderá pelo menos duas ansas polipeptídicas constrangidas, ii) as ansas polipeptídicas podem interagir uns com os outros através de interacções não covalentes para gerar constrangimento adicional e 24 ΡΕ2257624 iii) cada uma das ansas ocupa espaço que não pode ser ocupado pelas ansas que adicionalmente restringem a sua flexibilidade conformacional.
Para ilustrar estes pontos, podem ser imaginadas as vias possíveis que podem ser tomadas por um polipéptido ancorado nos pontos A e C a um composto de conjugação. A introdução de um ponto B âncora, entre os pontos A e C e o mesmo composto de conjugação, ainda limitará mais as vias possíveis tomadas pelo polipéptido e assim a sua entropia conf ormacional. Uma vez que a ligação do péptido a um ligando requere a perda de entropia conformacional (e desde que o péptido possa adoptar uma conformação que seja complementar de um ligando), a afinidade de ligação entre o péptido ABC constrangido no ponto B intermédio e o ligando espera-se que seja superior ao péptido AC. Assim, são conseguidas afinidades de ligação mais elevadas usando as moléculas constrangidas do presente invento relativamente ao que até agora foi possível.
Para além destes pontos chaves, outras vantagens das três ou mais ligações covalentes entre o plipéptido e o composto de conjugação estão descritas abaixo.
As moléculas do invento podem ligar-se a um alvo através da interacção de duas ou mais ansas peptídicas constrangidas. Quanto mais ansas de ligação, maiores as afinidades e especificidades que podem ser obtidas. Um efeito paralelo ocorre com anticorpos - eles ligam-se 25 ΡΕ2257624 melhor quando múltiplas CDRs interagem com o alvo. As moléculas de acordo com o presente invento proporcionam assim, vantajosamente, este beneficio técnico de múltiplas ansas para interacção, caracteristica que está ausente nas moléculas com menos de três ligações.
Para além da condição de uma segunda (ou subsequente) ansa peptidica, é importante notar que tal ansa também traz a vantagem da constrição conformacional das outras ansas. Isto pode acontecer através da ocupação de algum do espaço tridimensional limitado, o qual pode então não ser ocupado pelas outras ansas. Como alternativa, isto pode ocorrer através de interacções não covalentes entre as múltiplas ansas.
Destas vantagens pode igualmente observar-se que ligandos mais estruturados, geralmente, se ligam com afinidades (perde-se menos entropia quando da ligação) e especificidades mais elevadas.
Como aqui discutido, o invento proporciona igualmente a produção de estruturas peptidicas com ansas em que cada uma das duas ou mais ansas possui uma propriedade diferente. Tais estruturas são referidas como "duplamente especificas" para reflectir o facto de uma entidade molecular única possuir dupla especificidade atribuiveis a duas partes diferentes da mesma estrutura global. A vantagem de tais realizações é que cada ansa pode ser seleccionada ou construída para se ligar a um alvo 26 ΡΕ2257624 diferente (como seja um "antigénio"). Isto representa uma outra característica distintiva de um sistema de ligações de acordo com o presente invento.
Para além destes efeitos, as moléculas do invento também proporcionam a possibilidade de ensanduichar um único antigénio (ou outra entidade) entre dois segmentos da cadeia polipeptidica. Esta possibilidade não existe certamente nas construções polipeptídicas com menos de duas ansas. Certamente o arranjo particular adoptado pode depender da geometria da construção particular a ser usada. Mas o invento torna isto possível, o que contrasta com técnicas anteriormente descritas.
Certamente, a discussão atrás fez menção às ansas geradas de acordo com o presente invento. Nalgumas realizações, aquelas ansas são então clivadas. É importante notar que mesmo em tais realizações, as ansas são formadas, sendo simplesmente que a molécula com ansas é tratada como um intermediário que é então processado por clivagem das ansas para produzir uma estrutura de múltiplos péptidos lineares ligados uns aos outros. Nestas realizações, devido ao péptido estar inicialmente ligado ao composto de conjugação através de três ou mais ligações covalentes, após clivagem peptídica das moléculas serão decoradas com três ou mais grupos peptídicos. Tais moléculas podem formar mais interacções com os alvos e espera-se maiores afinidades/especificidades de ligação, o que é uma vantagem adicional do sistema de três ligações do invento. 27 ΡΕ2257624 É uma vantagem que moléculas do invento, tendo duas ou mais ansas polipeptídicas, possam formar mais interacções com um ligando alvo e assim possam ter maiores afinidades e/ou especificidades que as moléculas polipepti-dicas com apenas uma única ansa. Por exemplo, pode ser desejável alterar a segunda ansa para melhor afinidade, o que é claramente impossível para as moléculas de ansa simples. É uma vantagem que nos complexos do invento, o composto de conjugação suporte pelo menos duas ansas polipeptídicas em estreita proximidade espacial. Estas duas ou mais ansas podem interagir simultaneamente com diferentes epitopos no mesmo ligando alvo.
Ainda, o benefício de ter duas ou mais ansas pode ser explorado na produção de moléculas "duplamente específicas", onde uma ansa pode ser ou é seleccionada relativamente a uma propriedade particular ou afinidade de ligação e a outra ansa relativamente a uma propriedade ou afinidade diferente. Estas moléculas são referidas como "bispecíficas" ou "duplamente específicas". Existem vários tipos possíveis. Por exemplo, (a) bispecíficas produzidas através de selecção na ansa 1 e depois na ansa 2 (ou mais), (b) dois macrocíclicos bicíclicos ligados e 28 ΡΕ2257624 (c) uma macrocíclico bicíclico mais péptido ou fármaco.
Para (a), isto deve tipicamente ser feito através de produção/selecção de uma aliquota de uma biblioteca contra um primeiro antigénio e de uma outra aliquota contra um segundo antigénio. As ansas seleccionadas poderão então ser combinadas aos pares, por exemplo por técnicas convencionais tais como recombinação dos segmentos de ácido nucleico codificadores das duas ansas para proporcionar uma nova biblioteca de diferentes combinações da primeira e segunda ansa. As moléculas combinadas aos pares (e.g. fagos) podem então ser testadas e/ou seleccionadas relativamente à ligação a ambos os antigénios sequenciadamente. Desta forma, podem ser preparados bispecíficos capazes de se ligarem a dois antigénios separados. Naturalmente este método pode ser aumentado com outros passos adicionais tais como as afinidades de ligação para cada antigénio poderem ser melhoradas por mutação de cada uma das ansas, a qual pode ser mutação dirigida ou mesmo ao acaso.
Numa variação desta técnica, uma aliquota da biblioteca poderá ser seleccionada pela ligação a um primeiro antigénio. A ansa mais importante para a ligação poderá ser identificada, por exemplo através da inspecção das "sequências de consenso" entre as seleccionadas como ligandos e a outra ansa poderá ser alterada aleatoriamente e seleccionada relativamente ao segundo antigénio. 29 ΡΕ2257624
Os bispecíficos mais adequados deste tipo tais como em (a) serão preparados em fagos.
As moléculas variantes referidas em (b) e (c) atrás poderão ser igualmente preparadas como fago (de forma semelhante ao descrito atrás). Como alternativa, mais provavelmente as duas entidades ligadas poderão ser selecci-onadas separadamente, depois fundidas num passo de sintese quimica, o que deverá simplificar a sua selecção/cons-trução. É ainda uma caracteristica vantajosa importante dos aspectos do invento que, para além do composto de conjugação do invento que serve para ligar os segmentos polipeptidicos através de ligações covalentes via residuos de aminoácidos na base de cada ansa peptidica, o composto de conjugação também esteja envolvido noutras interacções não covalentes (tais como ligações iónicas, interacções hidrofóbicas ligações de hidrogénio, interacções de Van der Waals) com elementos adicionais da cadeia polipeptidica tais como outros residuos de aminoácidos. Pelo contrário, o elemento de ligação bivalente de Millward et al., é linear e altamente flexivel (propilo) e o seu único papel é ligar dois extremos de um polipéptido para criar um péptido ciclico insensível a redox. 0 elemento de ligação de Millward et al., não é espectável que faça interacções não covalentes significativas com a ansa polipeptidica, uma vez que é pequeno e altamente flexível e, de facto, não existe evidência que o faça. Esta vantagem do invento é ainda 30 ΡΕ2257624 ilustrada na secção de exemplos, juntamente com evidência das interacções não covalentes vantajosas. Assim, adequadamente o polipéptido é ligado com composto de conjugação através de uma ou mais interacções não covalentes, para além das ligações covalentes aqui descritas. Isto tem ainda a vantagem de proporcionar nivel adicional de constrangimento estrutural ao complexo/conjugado do invento. É uma vantagem do invento que uma molécula com múltiplas ansas peptidicas seja geralmente mais estruturada que um polipéptido com uma única ansa peptidica. Moléculas altamente estruturadas tendem a ser mais especificas. Igualmente, moléculas bem estruturadas possuem geralmente melhores afinidades de ligação. Ainda, uma molécula com múltiplas ansas peptidicas pode formar mais interacções com um ligando alvo do que um polipéptido com uma única ansa peptidica. É ainda um beneficio dos aspectos do invento que um composto de conjugação do invento também imponha constrangimentos conformacionais inerentes à sua estrutura quimica. Por exemplo, alguns grupos quimicos são conhecidos como sendo inflexíveis, para evitar rotação, proporcionar impedimento ou constrangimento espacial, apresentar uma estrutura rígida ou de outra forma proporcionar suporte ou restrição ao complexo. Assim, adequadamente, o composto de conjugação compreende um grupo de suporte como seja um grupo de suporte rígido. A função deste grupo de suporte é proporcionar estrutura molecular ou constrangimento ao 31 ΡΕ2257624 complexo do invento. Relativamente a um composto de conjugação preferido do invento, tri-(bromometil)benzeno (TBMB), esta caracteristica pode ser ilustrada com referência à estrutura planar do grupo benzeno do TBMB. Este grupo benzeno é rigido devido ao seu carácter planar e assim é capaz de servir de grupo de suporte ao composto de conjugação, em particular um grupo de suporte rigido.
Assim, numa realização preferida do invento, o composto de conjugação proporciona restrições conformacio-nais impostas por pelo menos três ligações covalentes ao polipéptido, proporciona mais estrutura via ligações não covalentes entre o composto de conjugação e o polipéptido, e ainda o composto de conjugação do invento também impõe constrangimentos conformacionais pela natureza da sua própria estrutura quimica que serve de suporte rigido. Por exemplo, a estrutura planar do grupo benzeno quando o composto de conjugação compreende o mesmo, como seja quando o composto de conjugação é tris-(bromometil)benzeno (TBMB).
Composto de conjugação 0 composto de conjugação é por vezes referido como o "centro molecular". Adequadamente, o composto de conjugação possui simetria molecular. Adequadamente, o composto de conjugação possui três grupos reactivos e possui três eixos de simetria. Isto tem a vantagem de produzir apenas um único produto de reacção. Se o composto de conjugação não for uma molécula simétrica, então podem 32 ΡΕ2257624 ser produzidos múltiplos produtos de reacção. Isto pode levar a complicações, ou requerer que o isómero pretendido seja separado dos outros produtos de reacção. Ao usar-se um composto de conjuqação tendo a simetria adequada, tais problemas são vantajosamente ultrapassados.
Constitui uma vantagem do invento que os poli-péptidos produzidos possuam uma maior complexidade que os péptidos ciclicos anteriormente descritos. Por exemplo, os polipéptidos produzidos de acordo com o presente invento podem possuir mais de duas ansas para interacção com outras entidades químicas. Ainda, os polipéptidos produzidos de acordo com o presente invento usufruem de um maior nivel de constrangimento que os polipéptidos baseados nos conhecimentos anteriores. Estes dois efeitos em conjunto criam uma outra vantagem pelo facto das ansas múltiplas (ou "ciclos") do polipéptido serem retidos na proximidade física uns dos outros através das suas ligações ao composto de conjugação comum. Isto proporciona um outro nível de restrição à conformação daqueles polipéptidos.
Tipicamente, os polipéptidos cíclicos dos trabalhos anteriores são ligados usando múltiplos resíduos de cisteína, tais como dois resíduos de cisteína para formar uma ponte entre duas parte do péptido e assim formar um polipéptido cíclico. No entanto, tais moléculas são sensíveis ao redox. 0 método de Millward et al. está direc-tamente focado na produção de péptidos cíclicos que são insensíveis a redox. Neste contexto, o método de Millward 33 ΡΕ2257624 et al. parte dos trabalhos anteriores e desaconselha o uso de cisternas como grupos reactivos para as modificações de polipéptidos. Pelo contrário, de acordo com o presente invento, as cisteinas são preferidas como grupos reactivos.
Quando existem três ou mais grupos reactivos para pelo menos três ligações covalentes discretas ao composto de conjugação, os referidos grupos reactivos não necessitam de ser cada um deles cisteina. Por exemplo, os três grupos reactivos podem compreender uma cisteina e mais dois grupos reactivos adequados, os quais devem, por exemplo, compreender lisina, selenocisteina ou outros. Mais de preferência a totalidade dos três grupos reactivos é cisteina.
As técnicas anteriormente descritas apenas conduziram à produção de polipéptidos com uma ansa simples. De acordo com o presente invento, pelo menos duas ansas ou mesmo mais podem ser produzidas pela ligação do polipéptido em diferentes pontos ao composto de conjugação. 0 método do presente invento envolve um minimo de três ligações com o polipéptido. Isto tem a vantagem de oferecer maior restrição molecular. Têm ainda a vantagem da apresentação de múltiplas ansas polipeptídicas para interacção com outros grupos.
Em técnicas conhecidas, no máximo um agente de ligação cruzada foi introduzido ou ligado ao polipéptido, como seja um polipéptido geneticamente codificado. Pelo 34 ΡΕ2257624 contrário, o presente invento proporciona um composto de conjugação para a coordenação de diferentes partes do mesmo polipéptido.
Adequadamente o composto de conjugação pode ser uma molécula pequena. Adequadamente o composto de conjugação é uma molécula orgânica pequena.
Adequadamente o composto de conjugação pode ser ou pode ser baseado em monómeros naturais tais como nucleósidos, açúcares ou esteróides. Adequadamente o composto de conjugação pode compreender um pequeno polímero de tais entidades, tais como um dímero ou um trímero.
Adequadamente o composto de conjugação é um composto de toxicidade conhecida, de preferência de toxicidade baixa. Exemplos de compostos adequados incluem colesteróis, nucleótidos, esteróides ou fármacos já existentes tais como o tamazapan.
Adequadamente o composto de conjugação pode ser uma macromolécula. De preferência, o composto de conjugação é uma macromolécula composta por aminoácidos, nucleótidos ou açúcares.
Adequadamente o composto de conjugação compreende grupos reactivos que são capazes de reagir com grupos funcionais do polipéptido alvo para formar ligações covalentes. 35 ΡΕ2257624 0 composto de conjugação pode compreender grupos químicos tais como aminas, tióis, álcoois, cetonas, aldeídos, nitrilos, ácidos carboxílicos, ésteres, alcenos, alcinos, azidas, anidridos, succinimidas, maleimidas, haletos de alquilo e haletos de acilo.
Adequadamente o composto de conjugação pode compreender ou pode consistir em tris(bromometil)benzeno ou um derivado do mesmo.
Adequadamente o composto de conjugação possui três eixos de simetria, de forma que a reacção dos três grupos funcionais do polipéptido alvo com o composto de conjugação gera um único isómero.
Nalgumas realizações, o composto de conjugação pode ter uma geometria tetraédrica, de forma que a reacção de quatro grupos funcionais do polipéptido codificado com o composto de conjugação gera não mais de dois isómeros.
Um composto de conjugação adequado é 1,3,5-Tris(bromometil)benzeno ('TBMB').
Um composto de conjugação adequado é 2,4,6-Tris(bromometil)mesitileno. É semelhante a 1,3,5-Tris (bromometil) benzeno mas contem mais três grupos metilo ligados ao anel de benzeno. Isto tem a vantagem de os grupos metilo adicionais poderem formar outros contactos com o polipéptido e assim adicionar restrição estrutural adicional. 36 ΡΕ2257624 0 composto de conjugação do presente invento é seleccionado de entre uma molécula pequena ou de entre uma estrutura macromolecular. 0 referido composto de conjugação é composto por componentes inorgânicos ou orgânicos e inorgânicos.
Numa realização preferida, o composto de conjugação é uma pequena molécula orgânica, como por exemplo um alcano linear. Mais adequadamente o composto de conjugação é uma pequena molécula orgânica, como por exemplo um alcano linear. Mais adequadamente, o composto de conjugação é um alcano ramificado, um alcano ciclico, um alcano policí-clico, um aromático, um alcano heterocíclico ou um aromático heterocíclico, o qual oferece a vantagem de ser menos flexível (i.e. mais rígido).
Numa outra realização, o composto de conjugação é seleccionado de uma estrutura macromolecular como por exemplo um polipéptido, um polinucleótido ou um polis- sacárido. 0 composto de conjugação do invento possui grupos químicos que permitem que grupos funcionais do polipéptido da biblioteca codificada do invento formem ligações covalentes com o composto de conjugação. Tais grupos químicos são seleccionados de entre uma larga gama de funcionalidades incluindo aminas, tióis, álcoois, cetonas, aldeídos, ácidos carboxílicos, ésteres, alcenos, alcinos, 37 ΡΕ2257624 anidridos, succinimidas, maleimidas, azidas, haletos de alquilo e haletos de acilo.
Numa realização, o composto de conjugação do invento é tris(bromometil)benzeno ou um seu derivado.
POLIPÉPTIDO
Os grupos funcionais dos polipéptidos codificados são adequadamente proporcionados pelas cadeias laterais de aminoácidos naturais ou não naturais. Os grupos funcionais dos polipéptidos codificados são adequadamente seleccio-nados entre grupos tiol, grupos amina, grupos carboxilo, grupos guanidina, grupos fenólicos ou grupos hidroxilo. Os grupos funcionais dos polipéptidos codificados podem adequadamente ser seleccionados entre grupos azida, ceto-carbonilo, alcino, vinilo ou haleto de arilo. Os grupos funcionais dos polipéptidos codificados para ligação a um composto de conjugação podem adequadamente ser o extremo amina ou carboxilo do polipéptido.
Nalgumas realizações, cada um dos grupos funcionais do polipéptido para a ligação a um composto de conjugação são do mesmo tipo. Por exemplo, cada um dos grupos funcionais pode ser um resíduo cisteína.
Nalgumas realizações, os grupos funcionais para ligação a um composto de conjugação pode compreender dois ou mais tipos diferentes ou pode compreender três ou mais 38 ΡΕ2257624 tipos diferentes. Por exemplo, os grupos funcionais podem compreender dois residuos de cisteina e um residuo de lisina ou podem compreender um residuo de cisteina, um resíduo de lisina e uma amina N-terminal.
Nalgumas realizações, aminoácidos alternativos tais como aminoácidos naturais podem ser adequados para modificar quimicamente polipéptidos tais como os péptidos apresentados por fagos do invento. A cisteina é o aminoácido mais adequado devido a ter a vantagem da sua reactividade ser mais diferente de todos os outros aminoácidos. Os grupos reactivos que podem ser usados no composto de conjugação para reagirem com grupos tiol das cisternas são haletos de alquilo (ou também designados halogeno-alcanos ou halo-alcanos). São exemplos o bromonetilbenzeno (o grupo reactivo exemplificado por TBMB) ou a iodoacetamida. Outros grupos reactivos que são usados para acoplar selectivamente compostos a cisternas nas proteínas são as maleimidas. Exemplos de maleimidas que podem ser usadas como compostos de conjugação no invento incluem: tris-(2-maleimidoetil)amina, tris-(2-maleimido-etil)benzeno, tris-(maleimido)benzeno. A selenocisteína é também um aminoácido natural que possui reactividade semelhante à cisteina e pode ser usado nas mesmas reacções. Assim, sempre que seja mencionada cisteina, é tipicamente aceitável substituir por selenocisteína, a menos que o contexto de outra forma o sugira. Mais adequadamente usa-se cisteina. 39 ΡΕ2257624
As lisinas (e aminas primárias do extremo N de péptidos) são também adequadas como grupos funcionais para modificar péptidos nos fagos através da ligação a um composto de conjugação. No entanto, são mais abundantes nas proteínas fágicas do que as cisteínas e existe uma maior risco de as partículas fágicas ficarem ligadas de forma cruzada ou de poderem perder a sua infecciosidade. No entanto, encontrámos que as lisinas são especialmente úteis nas reacções intramoleculares (e.g., quando um composto de conjugação já está ligado ao péptido fágico) para formar uma segunda ligação ou ligação consecutiva com o composto de conjugação. Neste caso, o composto de conjugação reage preferencialmente com lisinas do péptido apresentado (em particular lisinas que estão em estreita proximidade). Os grupos funcionais que reagem selectivamente com aminas primárias são succinimidas, aldeídos ou haletos de alquilo. Relativamente aos haletos de alquilo, o leitor saberá que existem haletos de alquilo com diferentes reactividades. No grupo bromometilo que usámos numa série de exemplos dos exemplos juntos, os electrões do anel benzeno podem estabilizar o estado de transição catiónico. Este haleto de alquilo particular é assim 100-1000 vezes mais reactivo do que os haletos de alquilo que não estão ligados a um grupo benzeno. Exemplos de succinimidas para usar como composto de conjugação incluem tris-(succinimidil aminotriacetato) , ácido 1,3,5-benzenotetracético. Exemplos de aldeídos para usar como composto de conjugação incluem triformilmetano. Exemplos de haletos de alquilo para usar como composto de 40 ΡΕ2257624 conjugação incluem 1,3,5-Tris(bromometil)-2,4,6-trimetil-benzeno, 1,3,5-Tris(bromometil)benzeno, 1,3,5-Tris(bromometil ) -2,4,6-trietilbenzeno.
Nalgumas realizações, os elementos de ligação moleculares ou modificações podem ser adicionados a grupos funcionais (ou para os criar) dos polipéptidos codificados antes da ligação do composto de conjugação, em que os referidos elementos de ligação ou modificações são capazes de reagir com o composto de conjugação.
Os aminoácidos com grupos funcionais para ligação a um composto de conjugação podem estar situados em quaisquer posições adequadas dentro do polipéptido codificado. De forma a influenciar as estruturas particulares ou ansas criadas, as posições dos aminoácidos que possuem grupos funcionais podem ser alteradas por um operador especializado, e.g. através da manipulação do ácido nucleico codificador do polipéptido, de forma a mutar o polipéptido produzido.
Cada um dos aminoácidos do polipéptido codificado pode ser um alvo de mutagénese (e.g., mutagénese de variância restringida) de acordo com as necessidades do operador ou finalidade a que o invento está a ser aplicado. Claramente, pelo menos três grupos funcionais para ligação ao composto de conjugação são necessários no polipéptido de interesse. Outros aminoácidos que não os necessários para a ligação ao composto de conjugação podem variar livremente 41 ΡΕ2257624 de acordo com as necessidades do operador e são designados "aminoácidos variáveis". Os referidos aminoácidos variáveis do polipéptido codificado (e.g., membros da biblioteca de polipéptidos) podem ser aleatórios, parcialmente aleatórios ou constantes. 0 polipéptido alvo compreende um segmento de ligação ao composto de conjugação. Esta é a região a que o composto de conjugação se liga. Adequadamente, o comentário relativo aos grupos funcionais no polipéptido aplica-se a este segmento de ligação. Adequadamente, o segmento de ligação ao composto de conjugação do polipéptido alvo compreende 1 a 20 residuos de aminoácidos. Adequadamente, o segmento de ligação ao composto de conjugação do polipéptido alvo compreende menos de 10 aminoácidos. Isto tem a vantagem de impor mais constrangimento conformacional no segmento polipeptídico quando está ligado ao composto de conjugação. O polipéptido alvo adequadamente compreende a sequência AC (X) 6C (X) 6CG, em que X é um aminoácido estrutural ao acaso, A é alanina, C é cisteina e G é glicina. O polipéptido alvo adequadamente compreende a sequência (X) ιΥ (X) mY (X) nY (X) o, em que Y representa um aminoácido com um grupo funcional, X representa um aminoácido ao acaso, m e n são números, entre 0 e 20, definindo o comprimento dos segmentos polipeptídicos flanqueantes. 42 ΡΕ2257624
Nalgumas realizações, o complexo do invento pode compreender um polipéptido com a sequência AC (X) 6C (X) 6CG. Numa realização, um membro da biblioteca ou complexo do invento pode compreender um composto de conjugação mesi-tileno e um polipéptido com a sequência AC (X) eC (X) 6CG, em que o polipéptido é ligado aos grupos metilo exo-ciclicos do composto de conjugação através de resíduos de cisteína do polipéptido formador de três ligações tioéter entre eles, e em que X consiste em qualquer aminoácido, (adequadamente um aminoácido natural), A é alanina, C é cisteína e G é glicina. Adequadamente o polipéptido alvo compreende um inibidor da calicreína do plasma humano e o polipéptido compreende uma ou mais das sequências de aminoácidos GCSDRFRNCPADEALCG, ACSDRFRNCPLWSGTCG, ACSTERRYCPIEIFPCG, ACAPWRTACYEDLMWCG, ACGTGEGRCRVNWTPCG ou uma sequência relacionada .
Por sequência relacionada pretende-se significar uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50% de identidade, adequadamente pelo menos 60% de identidade, adequadamente pelo menos 70% de identidade, adequadamente pelo menos 80% de identidade, adequadamente pelo menos 90% de identidade, adequadamente pelo menos 95% de identidades, adequadamente pelo menos 98% de identidade, adequadamente pelo menos 99% de identidade. A identidade é adequadamente avaliada ao longo de um segmento contíguo de pelo menos 10 aminoácidos, adequadamente pelo menos 12 aminoácidos, adequadamente pelo menos 14 aminoácidos, adequadamente pelo menos 16 aminoácidos, adequadamente pelo menos 17 aminoácidos ou a sequência de referência de tamanho completo. 43 ΡΕ2257624
Adequadamente o polipéptido alvo compreende um inibidor de catepsina G humana e o polipéptido compreende uma ou mais sequências de aminoácidos ACEYGDLWCGWDPPVCG, ACIFDLGFCHNDWWNCG, ACLRAQEDCVYDRGFCG ou uma sequência relacionada.
Adequadamente, o polipéptido alvo compreende um inibidor do activador do plasminogénio tipo urocinase humana e o polipéptido compreende uma ou mais das sequências de aminoácidos ACNSRFSGCQIDLLMCG, ACSRYEVDCRGRGSACG ou uma sequência relacionada.
Adequadamente o polipéptido alvo faz parte de uma biblioteca de polipéptidos contendo pelo menos 105 membros, mais adequadamente 109 membros. 0 invento também está relacionado com tais bibliotecas.
GRUPOS REACTIVOS DO POLIPÉPTIDO 0 composto de conjugação do invento pode ser ligado ao polipéptido através de grupos funcionais ou reactivos no polipéptido. Estes são tipicamente formados a partir das cadeias laterais de aminoácidos particulares encontrados no polímero polipeptídico. Tais grupos reactivos podem ser uma cadeia lateral da cisteína, uma cadeia lateral da lisina ou um grupo amina N-terminal ou qualquer outro grupo reactivo adequado. 44 ΡΕ2257624
Adequadamente, pelo menos um grupo funcional é um grupo de cisteína. Grupos tais como lisina ou as aminas N-terminais são tipicamente não suficientemente reactivos para se ligarem ao composto de conjugação por si só dentro de uma janela de tempo conveniente. No entanto, uma vez que o composto de conjugação tenha sido atraido ou ligado a pelo menos uma cisteina, então as cinéticas de reacção normais significam que as ligações lisina ou amina podem depois formar-se rapidamente e estavelmente. Por este motivo, adequadamente, pelo menos um dos grupos funcionais é um grupo cisteina.
Caso se pretendam grupos reactivos no polipéptido que não sejam cisteina/lisina/amina, então um composto de conjugação diferente pode ser escolhido de forma a emparelhar com os grupos reactivos funcionais particulares escolhidos no polipéptido alvo.
Adequadamente são usados cisteina, lisina ou amina como grupos funcionais ou reactivos no polipéptido de interesse.
Adequadamente pelo menos três ligações covalentes são formadas entre o composto de conjugação e o polipéptido de interesse.
Nalgumas realizações, quatro ligações ou mesmo mais podem ser formadas ente o composto de conjugação e o polipéptido de interesse. No entanto, se forem usadas mais 45 ΡΕ2257624 de quatro ligações então, tipicamente, as misturas de produtos formadas tornam-se cada vez mais complexas e podem impedir subsequentes usos ou aplicações. Por este motivo, são preferidas três ligações ou quatro ligações entre o composto de conjugação e o polipéptido de interesse. Em qualquer realização, prefere-se que haja simetria molecular do composto de conjugação. Mais preferidos são os compostos de conjugação tendo três grupos funcionais ou reactivos. São mais preferidos os compostos de conjugação tendo três eixos de simetria molecular.
Os grupos funcionais dos polipéptidos geneticamente codificados do invento são capazes de formar ligações covalentes com o composto de conjugação/núcleo molecular. Os grupos funcionais são grupos especificos de átomos dentro de aminoácidos naturais ou não naturais. De preferência, os grupos funcionais com uma reactividade quimica distinta são usados para ligar o polipéptido ao composto de conjugação para formar o complexo do invento. A utilização dos referidos grupos funcionais distintivos permite a ligação do composto de conjugação/núcleo molecular exclusivamente aos grupos funcionais designados do polipéptido mas não a outros grupos químicos de outros elementos do polipéptido, do ácido nucleico ou outros componentes do complexo.
Grupos funcionais adequados de aminoácidos naturais são o grupo tiol de cisteína, o grupo amina da lisina, o grupo carboxilo de aspartato ou glutamato, o grupo guani- 46 ΡΕ2257624 dina da arginina, o grupo fenólico da tirosina ou o grupo hidroxilo da serina. Os aminoácidos não naturais podem proporcionar uma larga gama de grupos funcionais incluindo um grupo azida, cetocarbonilo, alcino, vinilo ou haleto de arilo. 0 grupo amino e carboxilo do extremo do polipéptido podem também servir como grupos funcionais para formar ligações covalentes a um composto de conjugação/núcleo molecular .
Os polipéptidos codificados do invento adequadamente possuem pelo menos três grupos funcionais. Os referidos polipéptidos também possuem quatro ou mais grupos funcionais. Quantos mais grupos funcionais forem usados, maior a diversidade de segmentos que pode ser ligada ao composto de conjugação/núcleo molecular. No entanto, a ligação de números excessivos de grupos funcionais a um composto de conjugação/núcleo molecular não é recomendado uma vez que pode conduzir a um número não manipulável de isómeros do produto. Adequadamente, são usadas três, quatro ou cinco ligações covalentes a um composto de conjugação; mais adequadamente três ou quatro ligações covalentes; mais adequadamente três ligações covalentes.
Numa realização preferida, podem ser gerados os polipéptidos codificados com três grupos funcionais. A reacção dos referidos polipéptidos com um composto de conjugação/núcleo molecular tendo três eixos de simetria gera um único isómero do produto. A geração de um único isómero do produto é favorável por vários motivos. Os 47 ΡΕ2257624 ácidos nucleicos (por vezes referidos como "códigos genéticos") das bibliotecas de compostos codificam apenas as sequências primárias do polipéptido mas não o estado isomérico das moléculas que são formadas quando da reacção do polipéptido codificado com o núcleo molecular. Se puder ser formado apenas um isómero do produto, a correspondência do ácido nucleico ao isómero do produto fica claramente definida. Se se formarem múltiplos isómeros do produto, o ácido nucleico não pode dar informação acerca da natureza do isómero do produto que foi isolado num processo de rastreio ou selecção. A formação de um único isómero do produto é igualmente vantajoso se um membro especifico de uma biblioteca do invento for sintetizado. Neste caso, a reacção química do polipéptido com o composto de conjugação dá um único isómero do produto em vez de uma mistura de isómeros.
Numa outra realização do invento, são gerados polipéptidos codificados com quatro grupos funcionais. A reacção dos referidos polipéptidos com um composto de conjugação/núcleo molecular tendo uma simetria tetraédrica gera dois isómeros do produto. Apesar dos dois isómeros diferentes do produto serem codificados pelo mesmo ácido nucleico ("código genético"), a natureza isomérica do isómero isolado pode ser determinada por síntese química de ambos os isómeros, separação dos dois isómeros e testando ambos os isómeros relativamente à ligação a um ligando alvo. 48 ΡΕ2257624
Numa realização do invento, pelo menos um dos grupos funcionais dos polipéptidos é ortogonal relativamente aos restantes grupos funcionais. A utilização dos grupos funcionais ortogonais permite dirigir os referidos grupos funcionais ortogonais para locais especificos do núcleo molecular. As estratégias de ligação envolvendo grupos funcionais ortogonais podem ser usadas para limitar o número de isómeros do produto formados. Por outras palavras, ao escolher-se grupos funcionais distintos ou diferentes para uma ou mais de pelo menos três ligações relativamente às escolhidas para as restantes das três ligações, pode ser conseguida uma ordem particular de ligação ou direcção de grupos funcionais especificos do polipéptido a posições especificas no composto de conjugação.
Numa ouutra realização, os grupos funcionais do polipéptido codificado do invento reagem com elementos de ligação moleculares em que os referidos elementos de ligação são capazes de reagir com um composto de conjuga-ção/suporte molecular de forma que o elemento de ligação fique entre o composto de conjugação e o polipéptido no estado ligado final.
Os aminoácidos adequados dos membros das bibliotecas combinatórias quimicas codificadas geneticamente podem ser substituídos por qualquer aminoácido natural ou não natural. Estão excluidos destes aminoácidos permutáveis os que são portadores dos grupos funcionais para a ligação cruzada dos polipéptidos a um núcleo molecular. Um grupo de 49 ΡΕ2257624 aminoácidos adjacentes que pode variar é definido como um segmento polipeptidico. 0 tamanho de um único segmento polipeptidico geralmente varia entre 1 e 20 aminoácidos. Os segmentos polipeptídicos que possuem sequências aleatórias, sequências constantes ou sequências com aminoácidos constantes e aleatórios. Os aminoácidos com grupos funcionais estão localizados em posições definidas ou ao acaso dentro do polipéptido codificado do invento.
Numa realização, os segmentos polipeptidicos que são ligados pelos dois aminoácidos portadores de grupos funcionais para ligação com um composto de conjugação/nú-cleo molecular são pequenas sequências de aminoácidos de 10 ou menos aminoácidos. A reacção das referidas sequências de aminoácidos codificadas com um núcleo molecular gera membros da biblioteca com elevado constrangimento conforma-cional. Os ligandos para constrangimento conformacional são geralmente mais específicos e possuem maiores afinidades de ligação. O constrangimento conformacional pode também proteger os ligandos da degradação proteolítica, por exemplo em fluidos do corpo.
Numa realização, um polipéptido codificado com três grupos funcionais tem a sequência (X) ιΥ (X) mY (X) nY (X) o, em que Y representa um aminoácido com um grupo funcional, X representa um aminoácido ao acaso, m e n são números entre 1 e 20 definindo o comprimento dos segmentos polipeptídicos intercalados e i e o são números entre 0 e 20 definindo o comprimento dos segmentos polipeptídicos flanqueantes. 50 ΡΕ2257624
Numa realização preferida, uma biblioteca de polipéptidos codificados do invento tem a sequência AC(X) eC (X) õCG, em que A representa alanina, C é cisterna, X representa um aminoácido natural ao acaso e G é glicina.
Alternativas às conjugações mediadas por tiol podem ser usadas para ligar o composto de conjugação ao péptido via interacções covalentes. Como alternativa, estas técnicas podem ser usadas na modificação ou ligação de outros grupos (tais como pequenas moléculas de interesse que são distintas do composto de conjugação) ao polipéptido após terem sido seleccionados ou isolados de acordo com o presente invento - nesta realização então, claramente, a ligação não necessita de ser covalente e pode incluir ligações não covalentes. Estes métodos podem ser usados em vez de (ou em combinação com) métodos mediados por tiol através da produção de fagos que apresentam proteínas e péptidos portadores de aminoácidos não naturais com os grupos funcionais químicos necessários, em combinação com pequenas moléculas portadoras do grupo funcional complementar, ou através da incorporação dos aminoácidos não naturais num polipéptido produzido por síntese química ou por via recombinante quando a molécula está a ser produzida após a fase de selecção/isolamento.
Os aminoácidos não naturais incorporados em péptidos e proteínas no fago podem incluir 1) um grupo cetona funcional (como encontrado em para- ou meta- 51 ΡΕ2257624 acetilfenilalanina) que pode ser especificamente reagido com hidrazinas, hidroxilaminas e seus derivados (Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli. Wang L, Zhang Z. Brock A, Schultz PG. Proc Natl Acad Sei USA. 2003 Jan 7; 100 (1) :56-61: Bioorg Med Chem Lett. 2006 Oct 15; 16(20) :5356-9. Genetic introduction of a diketone-containing amino acid into proteins. Zeng H, Xie J. Schultz PG) , 2) azidas (como encontrado em p-azida-fenilalanina) que pode reagir com alcinos via "quimica de click" catalisada por cobre ou ciclo-adições (3+2) promovidas por estirpes para formar os correspondentes triazóis (Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Chin JW. Santoro SW, Martin AB, King DS, Wang L, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2002 Aug 7;124(31):9026-7; Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Deiters A, Cropp TA, Mukherji M, Chin JW, Anderson JC, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Oct 1; 125 (39) :11782-3),) ou azidas que podem reagir com aril fosfinos, através de uma ligação Staudinger (Selective Staudinger modification of proteins containing p-azidophenylalanine. Tsao ML, Tian F, Schultz PG. Chembiochem. 2005 Dec;6(12):2147-9), para formar as correspondentes amidas, 4) alcinos que podem reagir com azidas para formar o correspondente triazole (In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli. Deiters A. Schultz PG. Bioorg Med Chem Lett. 2005 Mar 1;15(5):1521-4), 5) ácidos borónicos (boronatos) que podem reagir especificamente com compostos contendo mais de um 52 ΡΕ2257624 grupo hidroxilo adequadamente espaçado ou sofrer acoplagem mediada por paládio com compostos halogenados (Angew Chem Int Ed Engl. 2008; 47 (43) : 8220-3. A genetically encoded boronate-containing amino acid., Brustad E, Bushey ML, Lee JW, Groff D, Liu W, Schultz PG),), 6) aminoácidos quelatores de metais, incluindo os portadores de bipiridilos, que podem especificamente coordenar um ião metálico (Angew Chem Int Ed Engl. 2007;4β(48):9239-42. A genetically encoded bidentate, metal-binding amino acid. Xie J, Liu W, Schultz PG).
Aminoácidos não naturais podem ser incorporados em proteínas e péptidos apresentados por fagos através da transformação de E. coli com plasmídeos ou combinações de plasmídeos portadores de: 1) a sintetase ortogonal de aminoacil-tRNA e tRNA que dirige a incorporação do aminoácido não natural em resposta a um codão, 2) o DNA fágico ou plasmídeo fagemídeo alterado para conter o codão seleccionado no local de incorporação do aminoácido não natural ((Proc Natl Acad Sei U S A. 2008 Nov 18,-105 (46) :17688- 93. Protein evolution with an expanded genetic code. Liu CC, Mack AV, Tsao ML, Mills JH, Lee 40 HS, Choe H, Farzan M, Schultz PG, Smider W; A phage display system with unnatural amino acids. Tian F, Tsao ML, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2004 Dec 15;126(49):15962-3). A sintetase ortogonal de aminoacil-tRNA e o tRNA podem derivar do par tirosilo de Methanococcus janaschii ou de um sintetase (Addition of a photocrosslinking aminoacid to the genetic code of Escherichiacoli. Chin JW, Martin AB, King 53 ΡΕ2257624 DS, Wang L, Schultz PG. Proc Natl Acad Sei US A. 2002 Aug 20; 99 (17):11020-4) ) e tRNA que naturalmente incorpora pirrolisina (Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase to genetically encode N (epsilon)-(o-azidoben-zyloxycarbonyl) lysine for site-specific protein modifica-tion. Yanagisawa T, Ishii R, Fukunaga R, Kobayashi T, Sakamoto K, Yokoyama S. Chem Biol. 2008 Nov 24; 15(11): 1187-97; Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Neumann H, Peak-Chew SY, Chin JW. Nat Chem Biol. 2008 Apr:4(4):232-4. Epub 2008 Feb 17). O codão para a incorporação pode ser o codão âmbar (UAG) ou um outro codão de paragem (UGA ou UAA), como alternativa pode ser um codão de quatro bases. A sintetase de aminoacil-tRNA e o tRNA podem ser produzidos a partir de vectores existentes, incluindo a série de vectores pBK, vectores pSUP (Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins in Escherichia coli. Ryu Y, Schultz PG.Nat Methods. 2006 Apr;3(4):263-5)) e vectores pDULE (Not Methods. 2005 May;2(5):377-84. Photo-cross-linking inter-acting proteins with a genetically encoded benzophenone. Farrell IS, Toroney R, Hazen JL, Mehl RA, Chin JW) .) . A estirpe de E. coli usada expressará o pelo F' (geralmente através do operão tra). Quando a supressão âmbar é usada a estirpe de E. coli não poderá ter um gene supressor de tNRA âmbar activo. O aminoácido será adicionado ao meio de crescimento, de preferência numa concentração final de 1 mM ou mais. A eficiência da incorporação de aminoácido pode ser aumentada usando uma construção de expressão com um local de ligação ao ribossoma ortogonal e traduzindo o gene 54 ΡΕ2257624 com ribo-X (Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic code expansion. Wang K, Neumann H, Peak-Chew SY, Chin JW. Nat Biotechnol. 2007 Jul; 25(7):770-7). Isto poderá permitir a incorporação em múltiplos locais do aminoácido não natural proporcionando múltiplos locais para a ligação do ligando.
PURIFICAÇÃO DE FAGOS
Quaisquer meios adequados para a purificação dos fagos podem ser usados. Técnicas convencionais podem ser aplicadas no presente invento. Por exemplo, os fagos podem ser purificados por filtração ou por precipitação, como seja precipitação com PEG; as partículas fágicas podem ser produzidas e purificadas por purificação com polietileno-glicol (PEG) como anteriormente descrito.
No caso de ser necessária mais informação, é feita referência a Jespers et al. (al (Protein Engineering Design and Selection 10 2004 17(10):709-713. Selection of optical biosensors from chemisynthetic antibody libraries.) Adequadamente os fagos podem ser preparados como ali descrito. O texto desta publicação é aqui especificamente incorporado por referência para o método de purificação de fagos; em particular é feita referência à secção de materiais e métodos que se inicia na coluna do lado direito da página 709 de Jespers et al.
Ainda, os fagos podem ser purificados como 55 ΡΕ2257624 publicado por Marks et al. J.Mol.Biol vol 222 pp581-597, o qual é aqui especificamente incorporado como referência para a descrição particular de como a produção/purificação de fagos é realizada.
No caso de ser necessário qualquer orientação adicional, os fagos podem ser reduzidos e purificados como se segue. Aproximadamente 5 x 1012 partículas fágicas reagem com ditiotreitol (DTT) 1 mM durante 30 min à temperatura ambiente, depois são precipitados com PEG. Após lavagem com água, o sedimento é ressuspenso em 1 ml de tampão de reacção (tampão de fosfatos 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,8) . Os fagos reagem então facultativamente com 50 μΐ de N-[(2-iodoacetoxi)etil]-N-metilamino-7-nitrobenz-2-oxo-l,3-diazole (NBDIA) (Molecular Probes) durante 2 h à temperatura ambiente ou, mais adequadamente, reagem com o composto de conjugação como atrás descrito. A reacção é terminada por precipitação com PEG das partículas fágicas.
Ainda uma outra forma de como os fagos podem ser produzidos/purifiçados está descrita em Schreier e Cortese (A fast and simple method for sequencing DNA cloned in the single-stranded bacteriophage M13. Journal of molecular biology 129(1): 169-72, 1979). Esta publicação está relacionada com o procedimento de sequenciação de DNA por terminação de cadeias de Sanger et al. (1977), o qual requere DNA de cadeia simples como matriz. O DNA do fago M13 existe como cadeia simples e assim qualquer sequência de DNA clonada em M13 pode ser facilmente obtida nesta 56 ΡΕ2257624 forma. Schreier e Cortese mostram que DNA de M13 de cadeia simples, suficientemente puro para ser usado como matriz para determinação da sequência, pode ser preparado por simples centrifugação da partícula fágica e extracção com fenol. A publicação de Schreier e Cortese é aqui especialmente incluída por referência para o método de purificação de fagos. Para evitar dúvidas, a extracção com fenol não é realizada para a preparação dos complexos de acordo com o presente invento, uma vez que esse é o propósito da purificação de ácidos nucleicos. Assim o passo do fenol de Schreier e Cortese é adequadamente omitido. 0 método de Schreier e Cortese é seguido apenas até ao ponto das partículas fágicas purificadas.
Assim, existe uma miríade de técnicas conhecidas na área para purificação de fagos. No contexto do presente invento tal purificação é usada para remover o agente redutor usado para reduzir os grupos funcionais no polipéptido de interesse para ligação ao composto de conjugação, particularmente quando tal ligação é através dos resíduos de cisteína.
Facultativamente, técnicas especialmente vantajosas para a purificação de fagos podem ser adoptadas como discutido na secção de química das reacções abaixo. Deve ser expressamente referido que estas técnicas não são consideradas como essenciais para o invento, mas devem representar métodos especialmente úteis ou mesmo o melhor modo de preparação de partículas fágicas do invento. No 57 ΡΕ2257624 entanto, é dada atenção para evitar a reoxidação dos grupos funcionais/reactivos reduzidos no fago na fase de remoção do agente redutor antes da ligação seguinte ao composto de conjugação, em principio qualquer técnica pode ser usada para conseguir isto. As técnicas de filtração descritas são particularmente eficazes mas também mais complicadas do que as técnicas convencionais, assim o operador escolherá a técnica mais adequada para o seu trabalho particular no invento. Mais adequadamente é empregue a técnica de filtração.
QUÍMICA DAS REACÇÕES
Para além da percepção conceptual relacionada com os conjugados do composto de conjugação-polipéptido ligados triplamente e das partículas fágicas do invento, os inventores também deduziram uma série bem definida de condições químicas que podem ser empregues de forma a conseguir a ligação química e mantendo ao mesmo tempo a integridade da porção geneticamente codificada do produto. Tecnologias anteriores para modificação dos polipéptidos envolveram química dura e reacções independentes de modificação de polipéptidos. Pelo contrário, o presente invento proporciona novas condições químicas para a modificação de polipéptidos mantendo ao mesmo tempo a função e integridade do elemento geneticamente codificado do produto. Especifi-camente, quando o elemento geneticamente codificado é um polipéptido apresentado na superfície de um fago que o codifica, a química vantajosamente não compromete a 58 ΡΕ2257624 integridade biológica do fago. É aqui descrito que existe uma janela estreita de condições para as quais estas reacções químicas podem ser estimuladas ou facilitadas. Em particular, como será explicado mais detalhadamente abaixo, os solventes e as temperaturas usadas são importantes para uma reacção eficiente. Ainda, a concentração dos reagentes usados é igualmente importante na promoção da ligação correcta, enquanto melhora ou elimina a ligação cruzada ou a danificação dos polipéptidos que estão a ser modificados.
Em particular, é descrito que a redução das cisternas no polipéptido alvo é necessária para uma reacção mais eficiente. Claramente, o agente redutor usado para reduzir quimicamente as cisteínas deve ser removido de forma a efectuar-se a ligação pretendida. Uma técnica conhecida é usar ditiotreitol (DTT) para a redução das cisteínas e para a remoção do agente redutor precipitar as partículas, tais como as partículas fágicas, numa reacção de precipitação. Tais reacções de precipitação tipicamente envolvem 20% de polietilenoglicol (PEG) juntamente com NaCl 2,5 molar que conduz à precipitação das partículas fágicas. No entanto, os inventores descrevem que nalgumas experiências estas condições padrão específicas não levam a uma reacção eficiente dos resíduos de cisteína no polipéptido com o composto de conjugação, muito provavelmente devido à reoxidação de uma proporção dos resíduos de cisteína que tinham sido reduzidos. Isto poderá não ter sido previsto a partir do entendimento de trabalhos anteriores. Deve-se salientar que esta técnica convencional pode ainda ter 59 ΡΕ2257624 aplicação no invento, em particular quando o especialista na área está alerta para a necessidade de se estar vigilante na avaliação/inibição da reoxidação. No entanto, os inventores abordaram este problema criptico de como remover o agente redutor mantendo ao mesmo tempo as cisteinas no seu estado reduzido. Como será descrito mais detalhadamente abaixo, as soluções são encontradas numa gama de estratégias incluindo o uso de tris-carboxietil-fosfino, tampão desgaseado, a utilização de quelatores na mistura de reacção e a filtração de forma a extrair as partículas em condições quimicas favoráveis.
As condições de reacção, e.g. para a ligação do composto de conjugação ao polipéptido alvo deverão ser escolhidas cuidadosamente. A escolha das condições pode variar dependendo da aplicação em que se está a usar o invento. É necessário particular cuidado quando o polipéptido alvo está numa particula fágica. São dadas orientações ao longo da especificação e secção dos exemplos.
As condições de reacção como sejam a temperatura da reacção, a concentração do composto de conjugação, o solvente e/ou pH deverão ser escolhidas para permitir uma reacção eficiente dos grupos funcionais do polipéptido alvo com o composto de conjugação, mas deixa o ácido nucleico codificador do polipéptido numa condição que permite descodificar (e.g. em sequência) e/ou propagar as moléculas isoladas (e.g. por PCR ou através da propagação de fagos ou por qualquer outra técnica adequada). Ainda, as condições 60 ΡΕ2257624 de reacção deverão deixar a proteína da cápside do fago numa condição que permita propagar o fago.
Os grupos tiol de um polipéptido codificado por fago podem ser reduzidos com um agente redutor antes da ligação ao composto de conjugação. Em tais realizações, em particular nas realizações de apresentação fágica ou em particular quando o agente redutor é TCEP, o excesso de agente redutor é adequadamente removido por filtração e.g. filtração do fago. Isto é especialmente vantajoso uma vez que os presentes inventores descrevem pela primeira vez que técnicas convencionais para a remoção de agentes redutores tais como precipitação com PEG/NaCl pode por vezes levar à reacção sub-óptima com o composto de conjugação, igualmente devido à reoxidação dos grupos laterais funcionais reduzidos do polipéptido alvo. Assim, é uma vantagem das realizações em que o polipéptido alvo é preparado por redução seguido de purificação (remoção do agente redutor) através de filtração que seja conseguida a preservação dos grupos funcionais reduzidos (e portanto reactivos) do polipéptido.
No presente invento, são aplicadas condições de reacção que por um lado permitem ligar eficientemente o polipéptido codificado a um composto de conjugação e por outro lado deixam o ácido nucleico apenso (e as proteínas da cápside do fago) numa condição que permite a sua propagação ou descodificação. As referidas condições de reacção são, por exemplo, a temperatura de reacção, a concentração 61 ΡΕ2257624 do composto de conjugação, a composição do solvente ou o PH.
Numa realização do presente invento, os grupos tióis dos residuos de cisteina são usados como grupos funcionais para ligar polipéptidos a um núcleo molecular. Para algumas reacções químicas, os grupos tiol dos polipéptidos necessitam de ser reduzidos. Os grupos tiol nos polipéptidos apresentados em fagos são eficientemente reduzidos pela adição de um agente redutor como por exemplos tris(carboxietil)fosfino (TCEP). Uma vez que o excesso de agente redutor pode interferir com a reacção de ligação é eficazmente removido por filtração do fago. A re-oxidação dos grupos tiol após remoção de TCEP é adequadamente evitada através do desgaseamento do tampão de reacção. A re-oxidação dos grupos tiol é também igualmente evitada através da formação de complexos de iões metálicos por quelatação, por exemplo quelatação com ácido etilenodi-aminatetracético (EDTA).
Adequadamente a inibição da re-oxidação dos grupos tiol é evitada ou inibida por quelatação e utilização de tampões desgaseados.
Numa realização do presente invento, a ligação do polipéptido ao composto de conjugação é conseguida por 62 ΡΕ2257624 reacção dos grupos reactivos do polipéptido, tais como grupos tiol do polipéptido codificado pelos fagos, com o composto de conjugação durante uma hora. Adeguadamente reagem a 30°C. Adequadamente, reagem com o composto de conjugação (como seja tris(bromometil)benzeno) numa concentração de 10 μΜ. Adequadamente, a reacção é em tampão aquoso. Adequadamente, a reacção é a pH 8. Adequadamente, o tampão de reacção contem acetonitrilo. Adequadamente, o tampão de reacção contém 20% de acetonitrilo.
Mais adequadamente, a reacção engloba duas ou mais das condições atrás referidas. De preferência, a reacção inclui três ou mais das condições atrás. Adequadamente a reacção inclui quatro ou mais das condições atrás referidas. Adequadamente a reacção inclui cinco ou mais das condições atrás descritas. Adequadamente a reacção inclui seis ou mais das condições descritas. Adequadamente a reacção inclui cada uma das reacções atrás descritas.
Estas condições de reacção estão optimizadas para reagir quantitativamente os grupos tiol de um polipéptido com os grupos reactivos de tris(bromometil)benzeno. Nas mesmas condições de reacção, cerca de 20% das partículas fágicas permanecem infecciosas para introduzirem o código genético nas células bacterianas para propagação e descodificação.
Numa realização, o composto de conjugação, como seja TBMB, pode ser ligado ao polipéptido alvo, como seja 63 ΡΕ2257624 um polipéptido codificado por fago, através da reacção (incubação) dos grupos tiol do polipéptido durante uma hora a 30°C com TBMB (i.e. Tris(bromometil)benzeno) numa concentração de 10 μΜ em tampão aquoso pH 8 contendo 20% de acetonitrilo.
Os inventores também descrevem o efeito da concentração do composto de conjugação na reacção da infec-ciosidade fágica. Em particular, o invento adequadamente minimiza a concentração de composto de conjugação usado na reacção. Por outras palavras, quanto menor a concentração do composto de conjugação usado na reacção com o polipéptido do fago tanto melhor, desde que seja suficiente o composto de conjugação ligado ao polipéptido fágico. A vantagem de minimizar o composto de conjugação presente desta forma é uma maior preservação da infecciosidade do fago após acoplagem do composto de conjugação. Por exemplo, quando o composto de conjugação é TBMB, concentrações do composto de conjugação superiores a 100 μΜ podem comprometer a infecciosidade. Assim, adequadamente, quando o composto de conjugação é TBMB então adequadamente a concentração de TBMB presente na altura da ligação ao polipéptido é inferior a 100 μΜ. Mais adequadamente, a concentração é como descrita na secção dos exemplos.
MODIFICAÇÃO APÓS LIGAÇÃO
Nalgumas realizações o complexo polipéptido-composto de conjugação pode ser modificado após ligação. 64 ΡΕ2257624
Nalgumas realizações, os elementos polipeptídicos do invento são clivados proteoliticamente depois de estarem ligados ao composto de conjugação/núcleo molecular. A clivagem gera ligandos com fragmentos peptidicos discretos ligados a um composto de conjugação/núcleo molecular.
Por exemplo, uma ou mais ligações amida do polipeptideo podem ser clivadas proteoliticamente após ligação do polipéptido ao núcleo molecular. Isto tem a vantagem de criar polipéptidos mais pequenos, cada um deles ligado ao composto de conjugação através de pelo menos uma ligação covalente, mas que apresentam diferentes estruturas moleculares que são retidas num complexo compreendendo o ácido nucleico codificador do polipéptido parental. A clivagem do polipéptido é adequadamente catalisada por quaisquer meios conhecidos na área, como sejam hidrólise controlada ou, mais adequadamente, clivagem enzimática por uma protease adequada. A protease pode ser qualquer protease adequada mas é preferencialmente uma protease com uma sequência ou motivo polipeptidico de reconhecimento especifico. Isto, vantajosamente, leva à produção de produtos de clivagem polipeptidicos mais previsiveis. De facto, nesta realização, as sequências de reconhecimento por proteases podem ser sistematicamente adicionadas ou removidas do polipéptido alvo, por exemplo através de manipulação dos ácidos nucleicos codificadores do mesmo. É vantajoso proporcionar um maior grau de controlo e permitir que maior diversidade seja produzida nas moléculas 65 ΡΕ2257624 apresentadas de acordo com o presente invento. Mais adequadamente, o polipéptido compreende pelo menos um local de reconhecimento por proteases. Adequadamente cada um dos referidos locais de clivagem está contido na sequência de aminoácidos intercalados entre grupos funcionais no polipéptido usado na ligação covalente ao composto de conjugação. Adequadamente, cada local de reconhecimento referido estará contido dentro da sequência de aminoácidos entre os grupos funcionais no polipéptido usado para a ligação covalente ao composto de conjugação.
As ansas peptidicas são adequadamente clivadas com uma protease que reconhece e processa polipéptidos em posições de aminoácidos especificas, tais como a tripsina (arginina ou lisina na posição Pl) ou termolisina (cadeias laterais alifáticas na posição Pl) . A enzima é usada numa concentração que permite o processamento eficiente das ansas peptidicas da molécula apresentada mas poupa a partícula fágica. As condições óptimas podem variar dependendo do comprimento das ansas polipeptidicas e da protease usada. A tripsina, por exemplo, é tipicamente usada a 200 nM em tampão TBS-Ca (Tris HCl 25 mM/NaCl 137 mM/ CaCl2 1 mM, pH 7,4) durante 10 min a 10°C.
Uma gama completa de proteases que são adequadas para modificar polipéptidos apresentados mas que poupam o fago estão descritas em Kristensen, P. e Winter, G. (Proteolytic selection for protein folding using filamentous bacteriophages Fold Des. 1998:3(5):321-8). O 66 ΡΕ2257624 processamento enzimático do péptido no fago pode ser uma proteólise parcial, uma vez que não se pode excluir que um número limitado de proteínas da cápside do fago seja clivado. Assim na optimização das condições, o melhor equilíbrio entre a clivagem máxima do alvo e a poupança máxima das partículas fágica é escolhida de forma adequada.
Adequadamente, o polipéptido alvo compreende pelo menos um desses locais de clivagem proteolítica. Adequadamente, o polipéptido alvo compreende pelo menos dois desses locais de clivagem proteolítica. Adequadamente, o polipéptido alvo compreende pelo menos três desses locais de clivagem proteolítica.
Em cada uma dessas realizações de proteólise, adequadamente o primeiro desses locais da protease ocorre distai relativamente à primeira ligação covalente entre o polipéptido alvo e o composto de conjugação. Isto tem a vantagem do composto de conjugação ser mantido no complexo, uma vez que se o polipéptido alvo for clivado antes da primeira dessas ligações covalentes, então o complexo polipéptido-composto de conjugação será separado do ácido nucleico codificador do polipéptido alvo, o que é indesejável para a maioria das aplicações do invento. A utilização de pequenas ansas (pequeno sendo, e.g., 6 resíduos de aminoácidos ou menos) pode comprometer a capacidade de algumas proteases para clivar dentro das ansas. Neste caso, pode ser desejável seleccionar ansas 67 ΡΕ2257624 mais longas que são provavelmente mais acessíveis à proteólise. Ainda, após clivagem das ansas por endopro-teases, pode ser desejável cortar novamente as ansas com outras endoproteases ou mesmo com exoproteases, tais como carboxipeptidases ou aminopeptidases.
Quando o polipéptido alvo compreende mais de um desses locais de protease, adequadamente cada um dos locais ocorre entre duas ligações covalentes feitas entre o polipéptido alvo e o composto de conjugação. Podem ocorrer múltiplos locais de clivagem entre ligações se necessário.
Nas realizações de clivagem, adequadamente o polipéptido parental será considerado como um todo para a avaliação se está ligado ou não ao composto de conjugação através de pelo menos três ligações covalentes. Mais adequadamente, o polipéptido alvo será considerado como sendo o polipéptido intacto (não clivado) quando da avaliação se está ou não ligado ao composto de conjugação através de pelo menos três ligações covalentes. Tais polipéptidos não clivados serão tipicamente bicíclicos.
SÍNTESE
Deve ser considerado que uma vez isolado ou identificado o polipéptido com interesse de acordo com o presente invento, então a sua síntese subsequente pode ser simplificada sempre que possível. Por exemplo, a sequência do polipéptido de interesse pode ser determinada e pode ser 68 ΡΕ2257624 produzido sinteticamente através de técnicas convencionais, seguido de reacção com um composto de conjugação in vitro. Quando isto é efectuado, pode ser usada química convencional uma vez que já não existe a necessidade de preservar a funcionalidade ou a integridade da partícula veículo geneticamente codificada. Isto permite a rápida preparação, em larga escala, de material solúvel para outras experiências a jusante ou para validação. Neste contexto, a preparação em larga escala dos candidatos identificados pelos métodos do presente invento poderá ser conseguida usando química convencional como descrito em Meloen e Timberman.
Assim, o invento também está relacionado com a produção de polipéptidos ou conjugados seleccionados como aqui descrito, em que a produção compreende outros passos facultativos como explicado abaixo. Mais adequadamente estes passos são realizados no produto final polipé-ptido/conjugado por síntese química, em vez de ser no fago.
Facultativamente, os resíduos de aminoácidos no polipéptido de interesse podem ser substituídos quando da produção de um conjugado ou complexo, e.g. após o passo inicial de isolamento/identificação.
Para ilustrar as modificações/adições a serem descritas, é útil considerar o exemplo de selecção de um polipéptido que reage com um receptor. Pode ser desejável estender o péptido no seu extremo N ou C. Isto pode ser útil por exemplo na preparação de um péptido macrocíclico 69 ΡΕ2257624 que se liga a um alvo, com uma cauda como seja uma cauda linear que se liga a um segundo alvo, por exemplo um pépti-do de penetração celular como sejam os derivados de VP22, HIV-Tat, uma proteína homeobox de Drosophila {Antennapedia) ou proteínas desenhadas quimicamente, tais como poliargi-nina ou outro desses péptidos, e.g. como descrito em (Chen and Harrison Biochemical Society Transactions (2007) Volume 35, part 4, p821 "Cell-penetrating peptides in drug development: enabling intracellular targets")· Isto teria a vantagem de auxiliar ou permitir que um macrocíclico que tenha sido seleccionado contra um alvo particular, como seja um alvo intracelular entre numa célula.
Para prolongar o péptido, este pode simplesmente ser prolongado quimicamente no seu extremo N ou C usando química convencional de fase sólida ou em solução. A química convencional de proteínas pode ser usada para introduzir um extremo N ou C activável. Como alternativa, podem ser feitas adições através de condensação de fragmentos ou de ligação química nativa e.g. como descrito em (Dawson PE, Muir TW, Clark-Lewis I, Kent, SBH. 1994.
Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779) ou por enzimas, por exemplo usando subtiligase como descrito em Subtiligase: a tool for semisynthesis of proteins Chang TK, Jackson DY, Bumier JP, Wells JA Proc Natl Acad Sei USA. 1994 Dec 20;91 (26):12544-8 ou em Bioorganic & Medicinal Chemistry letters Tags for labeling protein N-termini with subtiligase for proteomies Volume 18, Issue 22. 15 November 2008. Pages 6000-6003 Tags for 70 ΡΕ2257624 labeling protein N-termini with subtiligase for proteomics Hikari A.I. Yoshihara, Sami Mahrus and James A. Wells).
Como alternativa, os péptidos podem ser prolongados ou modificados por conjugação adicional através de ligações dissulfito. Isto tem a vantagem adicional de permitir que o primeiro e segundo péptidos se dissociem um do outro dentro do ambiente redutor da célula. Nestes casos, o composto de conjugação (e.g. TBMB) poderá ser adicionado durante a sintese quimica do primeiro péptido de forma a reagir com os três grupos de cisterna; uma outra cisteina poderá então ser apensa ao extremo N do primeiro péptido, de forma que esta cisteina apenas reage com uma cisteina livre do segundo péptido. Técnicas semelhantes podem ser aplicadas igualmente à sintese/acoplagem de dois macrociclicos biciclicos.
Ainda, a adição de outros grupos pode ser conseguida da mesma forma, usando quimica adequada, acoplagem nos extremos N ou C ou via cadeias laterais. Adequadamente, a acoplagem é conduzida de forma que não bloqueie a actividade de qualquer uma das entidades.
Assim o invento ainda está relacionado com um método como descrito atrás, ainda compreendendo o passo de extensão do polipéptido num ou mais dos extremos N ou dos extremos C do polipéptido. 71 ΡΕ2257624
Assim o invento ainda está relacionado com um método como descrito atrás compreendendo ainda o passo de conjugação do referido complexo ou do referido conjugado de polipéptido-composto de conjugação a um outro polipéptido.
Assim o invento ainda está relacionado com um método como descrito atrás em que a referida conjugação é realizada através de (i) adição de uma outra cisteina ao polipéptido após ligação do composto de conjugação e (ii) conjugação do referido polipéptido ao referido polipéptido adicional através de ligação dissul-fureto à referida cisteina adicional.
DIVERSIDADE CODIFICADA GENETICAMENTE
Os polipéptidos de interesse são adequadamente codificados geneticamente. Isto oferece a vantagem de potenciar a diversidade juntamente com o facto de facilitar a manipulação. Adequadamente, os polipéptidos com interesse são codificados geneticamente como uma biblioteca de apresentação fágica.
Assim, o complexo do invento compreende uma partícula fágica, o ácido nucleico estando inserido no genoma do fago. Nestas realizações, o polipéptido está incluído na cápside do fago. 72 ΡΕ2257624
Nalgumas realizações, o invento pode ser usado para produzir uma biblioteca combinatória codificada geneticamente de polipéptidos que são gerados por tradução de uma série de ácidos nucleicos nos polipéptidos correspondentes e ligação das moléculas do referido composto de conjugação aos referidos polipéptidos. A biblioteca combinatória geneticamente codificada dos polipéptidos pode ser gerada pela apresentação fágica.
Os polipéptidos são apresentados nos fagos de acordo com técnicas estabelecidas tal como descrito abaixo. Mais adequadamente tal apresentação é conseguida através da fusão do polipéptido alvo de interesse com um gene manipulado que permite a apresentação externa do polipéptido de interesse; adequadamente o referido gene manipulado compreende o gene 9 (p9 ou gene IX) , o gene 8 (gene VIII), o gene 7 (p7 ou gene VII), o gene 6 (p6 ou gene VI) ou o gene 3 (p3 ou gene III) manipulado do fago. Estas proteínas oferecem a vantagem de conterem poucas ou nenhumas cisteínas que possam reagir com os compostos de conjugação tais como TBMB e produzir produtos secundários. Para p6, é vantajoso mutar a cisteína 84 para serina. As cisteínas em p7 e em p9 estão muito provavelmente enterradas e portanto não necessitam obrigatoriamente de serem mutadas para serem removidas. P8 oferece a vantagem de não conter um resíduo de cisteína. Assim, mais adequadamente o referido gene 73 ΡΕ2257624 manipulado compreende o gene 8 (gene VIII), o gene 6 (p6 ou gene VI) ou o gene 3 (p3 ou gene III) manipulado do fago.
Mais adequadamente, tal apresentação é conseguida através da fusão do polipéptido alvo de interesse com uma proteína do gene 3 manipulado sem resíduos de cisteína no domínio 1 e 2. Esta fusão pode ser conseguida através de qualquer técnica adequada conhecida na área, como seja através da manipulação do ácido nucleico codificador da proteína do gene III do fago para mudar os codões codificadores de cisteína para codões codificadores de outros aminoácidos e através da inserção de uma sequência de ácido nucleico codificadora do polipéptido alvo na sequência codificadora do gene II, em grelha, de forma a ser apresentada como uma proteína de fusão com a proteína do gene III na parte externa da partícula fágica. É um benefício do invento que os genes manipulados resultantes deixem o fago infeccioso, i.e. capaz de infectar células e de se propagar. Mesmo quando o gene manipulado é um gene diferente do gene 3, (como seja o gene 6 ou o gene 8), pode ainda ser desejável manipular o gene 3 para remover um ou mais resíduos de cisteína (como sejam todos os resíduos de cisteína).
Reportórios de polipéptidos codificados compreendendo até 1013 membros individuais têm sido gerados por apresentação fágica. 0 número de ligandos individuais que pode ser gerado de acordo com o invento excede claramente o 74 ΡΕ2257624 número de moléculas individuais que são, de uma maneira geral, testadas em rastreios convencionais.
Quando os fagos são produzidos numa célula bacteriana, o polipéptido é expresso como uma fusão da proteina da cápside. Quando da montagem de uma particula fágica, o polipéptido é apresentado na superfície do fago. Ao contactar o reportório de um fago com um antigénio imobilizado, alguns fagos permanecem ligados ao antigénio enquanto outros são removidos por lavagem. 0 fago pode ser eluído e propagado. 0 DNA codificador do polipéptido do fago seleccionado pode ser sequenciado. A apresentação fágica pode ser usada para codificar mais de IO10 poli-péptidos individuais. Um aspecto favorável da apresentação fágica é que o código genético, um DNA de cadeia simples é introduzido numa cápside. A cápside pode proteger o DNA da reacção com o núcleo molecular.
Numa outra realização preferida, a biblioteca de polipéptidos do invento é apresentada no fago como uma proteína de fusão do gene 3. Cada partícula fágica possui cerca de 3 a 5 cópias da referida proteína na cápside do fago. Como resultado da apresentação de múltiplas cópias do polipéptido modificado, os ligandos com afinidades micro-molares (ligandos fracos) podem também ser isolados nas selecções com fagos. Como alternativa, os fagemídeos são usados para reduzir o número de polipéptidos por fago para evitar os efeitos de avidez e seleccionar ligandos com afinidades mais elevadas. 75 ΡΕ2257624
Numa realização preferida, os fagos com proteínas da cápside modificadas são usados para codificar as bibliotecas de polipéptidos do invento. Em particular, são usados fagos sem ou com um número reduzido de um tipo específico de aminoácidos nas proteínas da cápside. A utilização das referidas proteínas da cápside pode ser vantajosa quando o núcleo molecular é reactivo relativamente ao referido tipo específico de aminoácido. Este é explicitamente o caso quando os grupos funcionais do polipéptido apresentados para ligação cruzada de um núcleo molecular são aminoácidos naturais e o mesmo tipo de aminoácido natural está presente numa região exposta da superfície na cápside do fago. A utilização do referido fago com proteínas da cápside modificadas pode evitar a ligação cruzada de partículas fágicas através da reacção dos aminoácidos de múltiplos fagos com o mesmo núcleo molecular. Ainda, usando o referido fago pode-se reduzir a ligação cruzada das cadeias laterais dos aminoácidos dos grupos funcionais no polipéptido e da proteína da cápside do fago ao mesmo núcleo molecular.
Ainda numa outra realização preferida, o fago com uma proteína do gene 3 sem os resíduos de cisteína das pontes dissulfureto C7-C36, C46-C53, C188-C201 no domínio 1 e 2 foram usados para apresentação das bibliotecas de polipéptidos do invento. Um fago com mutações nas referidas posições (C7C, C36I, C46I, C53V, C188V, C201A) e 14 mutações adicionais na proteína do gene 3 para compensar a 76 ΡΕ2257624 estabilidade térmica reduzida (T13I, N15G, R29W, N39K, G55A, T56I 160V, T101I, Q129H, N138G, L198P, F199L, S207L D209Y) foi gerado por Schmidt F.X. e colaboradores (Kather, I. et al., J. Mol. Biol.,2005). Os fagos sem grupos tiol na referida proteina minoritária da cápside são adequados se um ou mais dos aminoácidos funcionais para ligação cruzada do polipéptido a um núcleo molecular forem os resíduos de cisteína. A remoção dos resíduos de cisteína na proteína da cápside evita a sua interferência com a referida reacção de ligação entre o polipéptido e o composto de conjugação.
Este exemplo de fago para aplicação no invento é agora descrito mais detalhadamente. 0 fago sem dissulfuretos de FX Schmid (domínios D1-D2) compreende fagos fd derivados do vector fCKCBS (Krebber, C., 1997, J. Mol. Biol.). 0 vector fCKCBS baseia-se num vector fágico fd disponível na American Type Culture Collection (ATCC: 15669-B2). A sequência de aminoácidos dos domínios 1 e 2 de p3 do fago fd selvagem está disponível ao público, por exemplo na base de dados PubMed. Por facilidade de referência, um exemplo de sequência é:
AETVESCLAKPHTENSFTNVWKDDKTIDRYANYEGCLWNATGVWCTGDETQCYGTWVPIGLA ipenegggsegggsegggsegggticppeygdtpipgytyinpldgtyppgieqnpanpnpslees
QPLNTFMFQNNRFRNRQGALTVYTGTVTQGTDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNGKFRDCAF
HSGFNEDPFVCEYQGQSSDIPQPPVNAPSG 77 ΡΕ2257624 FX Schmid e colaboradores estabilizaram evolutivamente a p3 deste fago ((Martin, A. and Schmid, FX., 2003, J. Mol. Biol.) através da mutação de 4 aminoácidos. Num trabalho subsequente FX Schmid e colaboradores mutaram 6 cisteínas para eliminar as 3 pontes dissulfureto e inseriram mutações adicionais para compensar a perda de estabilidade (Kather. I. and Schmid FX., 2005, J. Mol. Biol.). Em múltiplos ciclos evolutivos geraram os clones 19, 20, 21 e 23 que possuem todos uma p3 sem pontes dissulfureto com diferentes estabilidades térmicas.
Como explicado mais detalhadamente na secção dos exemplos, o mutante 21 ("clone 21") pode ser preparado como descrito ou simplesmente obtido de FX Schmid e colaboradores. De acordo com a publicação de FX Schmid este clone possui as seguintes mutações nos dominios 1 e 2: C7S. T13I, N15G, R29W, C36I, N39K, C46I, C53V, G55A, T101I, Q129H, C188V, F199L, C201A. D209Y. Para além de encontrarmos as mutações que se seguem nos domínios 1 e 2 quando sequen-ciámos o clone e o comparámos com o fago fd selvagem: P11S e P198L. Sem pretender estar limitado pela teoria assume-se que estas mutações já estavam presentes no fago do vector fCKCBS.
Os domínios Dl e D2 do clone 21 possuem a seguinte sequência de aminoácidos:
AETV^UitSHie^PTftVWmDmDWYANYiEOlWíMTGVVVÍTGSÊíQVVAtWVMILA 78 ΡΕ2257624
Pode ser gerada uma biblioteca pelos métodos de acordo com o invento. 0 invento pode ser aplicado ao rastreio de moléculas ou entidades que se ligam a (ou influenciam a ligação a) um complexo do invento. Um exemplo de um complexo do invento é um polipéptido alvo com um composto de conjugação que lhe está ligado. Qualquer formato de rastreio convencional pode ser adoptado pelos familiarizados com a área. 0 formato particular usado dependerá dos objectivos do operador. Por exemplo, se se pretender um rastreio de um grande número de amostras então será fundamental a densidade elevada, a rapidez e a simplicidade de operação. Tipicamente, técnicas tais como como selecção de fagos por adsorção, apresentação de mRNA e similares podem ser igualmente aplicadas ao presente invento como aplicadas na área. Os benefícios chave do invento são a ligação covalente tripla do composto de conjugação ao polipéptido de interesse e o formato particular em que os complexos resultantes são testados, (ou a utilização daqueles complexos como moduladores candidatos de outras interacções ou noutros rastreios), é uma questão de escolha para quem trabalha no invento.
Numa realização, o rastreio pode ser realizado através do contacto de uma biblioteca gerada pelos métodos de acordo com o invento com um ligando alvo e isolamento de um mais membros da biblioteca que se ligam ao referido ligando. 79 ΡΕ2257624
Numa outra realização, membros individuais da referida biblioteca são colocados em contacto com um ligando alvo num rastreio e identificados os membros da referida biblioteca que se ligam ao referido ligando alvo.
Numa outra realização, membros da referida biblioteca são simultaneamente colocados em contacto com um ligando alvo e os membros da referida biblioteca que se ligam ao referido ligando alvo são seleccionados.
Os ligandos alvo podem ser um péptido, uma proteina, um polissacárido, um lipido, um DNA ou um RNA.
Um ligando alvo pode ser um receptor, um ligando de receptor, um enzima, uma hormona ou uma citocina. 0 ligando alvo pode ser uma proteina procarió-tica, uma proteina eucariótica ou uma proteina arquea. Mais especificamente, o ligando alvo pode ser uma proteina de mamífero ou uma proteína de insecto ou uma proteína bacteriana ou uma proteína fúngica ou uma proteína virai. 0 ligando alvo pode ser uma enzima, como seja uma protease. Mais especificamente, o ligando alvo pode ser uma elastase, calicreína do plasma, catepsina G ou activador do plasminogénio tipo urocinase.
Deve-se notar que o invento também abrange 80 ΡΕ2257624 membros da biblioteca isolados a partir de um rastreio de acordo com o invento. Adequadamente, os métodos de rastreio do invento ainda compreendem o passo de: produção de uma quantidade do ligando isolado como capaz de se ligar ao complexo do invento. Quando o rastreio é conduzido no formato oposto (i. e. quando os complexos do invento são identificados devido à sua capacidade para se ligarem a um ligando proporcionado). Adequadamente, os métodos de rastreio do invento ainda compreendem o passo de: produção de uma quantidade do complexo do invento isolado como capaz de se ligar ao referido ligando. 0 invento também está relacionado com membros da biblioteca que são ou podem ser isolados através de um rastreio de acordo com o presente invento, em que o referido membro é subsequentemente gerado/produzido sem uso posterior do ácido nucleico que codificou o referido poli-péptido quando parte do complexo do invento. Por exemplo, os métodos do invento adequados ainda compreendem o passo adicional de produção de uma quantidade de um polipéptido isolado ou identificado por um método do invento através da ligação do composto de conjugação ao polipéptido, em que o referido polipéptido é sintetizado por via recombinante nesta realização, o ácido nucleico originalmente que o codifica como parte de um complexo do invento pode deixar de estar presente num passo intermédio, e.g. amplificação por PCR ou clonagem do ácido nucleico original do complexo, conduzindo à produção de um ácido nucleico matriz a partir do qual o polipéptido pode ser sintetizado neste passo adicional. 81 ΡΕ2257624
OUTRAS VANTAGENS É uma vantagem do invento que os próprios complexos tenham capacidade de propagação. Assim, os complexos ou bibliotecas do invento podem ser multiplicados-selec-cionados-(iterativamente caso se pretenda)-enriquecidos. Isto contrasta com técnicas anteriores que requerem a deconvolução após um único ciclo de selecção. 0 presente invento permite vantajosamente a construção e rastreio de bibliotecas muito grandes.
Adequadamente o composto de conjugação pode ser flexível ou rígido, mais adequadamente o composto de conjugação é rígido. Isto tem a vantagem de conferir maior constrangimento molecular à molécula produto.
Nalgumas realizações, o composto de conjugação não só constrange a molécula retendo-a em três ou mais ligações, como também actua como um suporte. Os aminoácidos do péptido podem interagir com o suporte e formar uma estrutura compacta. Este fenómeno pode também ser encontrado em anticorpos em que os aminoácidos das CDRs interagem com os aminoácidos do suporte. Assim o invento proporciona esta característica vantajosa pela primeira vez em polipéptidos conjugados, como sejam os contidos em partículas fágicas. 82 ΡΕ2257624
Nalgumas realizações, são usados os compostos de ligação com uma simetria geométrica. Isto tem a vantagem de se obter um único produto em vez de misturas de produtos (e.g. isómeros).
As reacções de sintese foram estabelecidas para ligarem um composto de conjugação a um péptido através de pelo menos três ligações covalentes. As condições de reacção anteriormente usadas não podem ser facilmente aplicadas a péptidos codificados geneticamente. Descrevemos uma série de condições especificas gue têm aplicação na conjugação mas mantendo ao mesmo tempo e vantajosamente a infecciosidade. É uma vantagem do invento ser obtida leitura directa, em particular para uma combinação de péptido + composto químico (i.e. péptido + composto de conjugação). É uma vantagem do invento que uma biblioteca química sintética seja criada, a qual é susceptível a propagação. Por outras palavras, as técnicas anteriores criaram bibliotecas químicas de modo que não era possível amplifi-car/ler a molécula pequena de interesse desta forma, i.e. mesmo quando os ácidos nucleicos estavam presentes nas bibliotecas químicas anteriores não se podiam multipli-car/propagar, mas apenas era permitida hibridação ou outras técnicas desse tipo.
Vantagens semelhantes advêm das técnicas aqui 83 ΡΕ2257624 descritas tais como condições químicas usadas para ligar o composto de conjugação ao polipéptido com a vantagem preservarem a infecciosidade do complexo quando o complexo compreende uma partícula fágica.
OUTRAS APLICAÇÕES 0 invento proporciona igualmente um método para a geração de uma biblioteca química combinatória codificada geneticamente compreendendo os polipéptidos ligados a um núcleo molecular, o método compreendendo: (a) geração de uma biblioteca de polipéptidos compreendendo grupos funcionais capazes de formar ligações covalentes com um núcleo molecular; (b) ligação química da referida biblioteca ao referido núcleo através de pelo menos três ligações covalentes .
Num aspecto lato, o invento está relacionado com um polipéptido, compreendendo um composto de conjugação ligado ao referido polipéptido, em que o composto de conjugação é ligado ao polipéptido através de pelo menos três ligações covalentes discretas. Em particular, o invento está relacionado com tais polipéptidos que são susceptíveis de serem obtidos ou são obtidos por métodos do presente invento. 0 invento pode também ser aplicado ao desenho e/ou selecção de simulações de péptidos ou simulações de pequenas moléculas para usar como fármacos ou alvos de fármacos. 84 ΡΕ2257624 0 invento proporciona igualmente métodos para a geração de bibliotecas quimicas combinatórias geneticamente codificadas e para o isolamento de ligandos das mesmas. 0 invento pode ser aplicado à identificação de alvos candidatos a partir da sequenciação de DNA e identificação de sequências de consenso nos péptidos daqueles alvos e depois síntese dos péptidos. Por exemplo, pode-se desenhar um péptido de consenso através desta análise, péptido de consenso esse que pode ter uma sequência de aminoácidos não necessariamente idêntica a qualquer um dos candidatos recuperados da fase de rastreio e este péptido de consenso pode então ser sintetizado de acordo com o presente invento. 0 complexo compreende uma partícula fágica.
Assim, é proporcionado um método para a geração de bibliotecas químicas combinatórias geneticamente codificadas em que as referidas bibliotecas compreendem poli-péptidos ligados a um núcleo molecular através de pelo menos três ligações covalentes. As bibliotecas geradas com o referido método são igualmente proporcionadas. Ainda, é proporcionado um método de contacto das referidas bibliotecas com um ligando alvo e de isolamento dos membros que se ligam ao referido ligando, tal como membros de bibliotecas geradas com o referido método. 85 ΡΕ2257624
Contrariamente aos métodos conhecidos de WO 2004/077062 e WO 2006/078161, o presente invento proporciona métodos para a geração e ensaio de grandes bibliotecas de complexos. De acordo com WO 2004/077062 e WO 2004/ 077062 são proporcionados métodos conhecidos para produzir e testar centenas ou milhares de compostos. O presente invento proporciona métodos de codificar geneticamente as bibliotecas de compostos. Isto permite gerar e testar milhões, biliões ou mais compostos individuais.
Contrariamente aos métodos conhecidos de WO 2004/077062 e de WO 2006/078161, o presente invento proporciona métodos para testar grandes bibliotecas de compostos num único compartimento de reacção usando princípios de selecção in vitro. Ao contrário dos compostos gerados de acordo com WO 2004/077062 e WO 2006/078161, os complexos do presente invento compreendem um ácido nucleico que permite a identificação dos complexos isolados; adequadamente o referido ácido nucleico codifica o polipéptido do complexo. O presente invento proporciona condições de reacção tais como concentração do composto de conjugação, tempo de reacção, temperatura de reacção e similares que poupam o ácido nucleico do complexo, como por exemplo uma partícula fágica, e em particular poupam a infecciosidade da partícula fágica. Por outras palavras, a química aqui apresentada preserva a condição do ácido nucleico do complexo e preserva a função biológica do complexo. No exemplo do complexo compreendendo uma partícula fágica, a 86 ΡΕ2257624 química aqui apresentada vantajosamente estimula a funcionalidade preservada da partícula fágica e torna possível ou mais possível que seja usada na propagação do ácido nucleico após formação do complexo. 0 presente invento compreende também bibliotecas combinatórias de compostos geradas com os métodos descritos . São igualmente considerados os polipéptidos tricíclicos ligados a um composto de conjugação. Estes podem ser criados por exemplo através da ligação dos extremos N e C de um polipéptido bicíclico ligado a um composto de conjugação de acordo com o presente invento. Desta forma, os extremos N e C ligados criam uma terceira ansa, tornando um polipéptido tricíclico. Esta realização adequadamente não é realizada no fago, mas antes realizada num conjugado de polipéptido-composto de conjugação do invento. A ligação dos extremos N e C é uma questão de química de péptidos de rotina. No caso de ser necessária alguma orientação, o extremo C pode ser activado e/ou os extremos N e C podem ser prolongados por exemplo para adicionar uma cisteína a cada um dos extremos e depois ligá-los por ligações dissulfureto. Como alternativa, a ligação pode ser conseguida usando uma região de ligação incorporado nos extremos N/C. Como alternativa, os extremos N e C podem ser ligados por uma ligação peptídica convencional. Como alternativa, quaisquer outros meios adequados para a ligação dos extremos N e C podem ser empregues, por exemplo pode ser feita N-C-ciclização por 87 ΡΕ2257624 técnicas convencionais, por exemplo como descrito em Linde et al. Peptide Science 90, 671-682 /2008) "Structure-activity relationship and metabolic stability studies of backbone cyclization and N-methylation of melanocortin peptides", ou como em Hess et al. J. Med. Chem. 51, 1026- 1034 (2008) "backbone cyclic peptidomimetic melanocortin-4 receptor agonist as a novel orally administered drug lead for treating obesity". Uma vantagem de tais moléculas triciclicas é evitar a degradação proteolitica dos extremos livres, em particular através da acção de exoproteases. Uma outra vantagem de um polipéptido triciclico desta natureza é que a terceira ansa pode ser utilizada para funções de aplicação genérica, tais como ligação a BSA, entrada na célula ou para efeitos de transporte, marcação ou qualquer outra utilidade do tipo. Será sublinhado que esta terceira ansa não estará tipicamente disponível para selecção (devido a não ser produzida no fago mas apenas no conjugado de polipéptido-composto de conjugação) e assim o seu uso para outras funções biológicas ainda deixa livres as ansas 1 e 2 para selecção/criação de especificidade. Assim, o invento também está relacionado com tais polipéptidos tricíclicos e com a sua produção e utilizações. O presente invento proporciona outros métodos para o contacto de bibliotecas de compostos geneticamente codificadas com um ligando alvo e para a identificação de ligandos que se ligam ao referido ligando alvo. As bibliotecas de compostos geneticamente codificados foram testadas por procedimentos de rastreio ou selecção. ΡΕ2257624
Num procedimento de rastreio, foram testados membros individuais da biblioteca. Múltiplas cópias de um membro individual da biblioteca são por exemplo incubadas com um ligando alvo. 0 ligando alvo é imobilizado antes ou após contacto com os membros da biblioteca e os membros não ligados são removidos por lavagem. Os ligandos ligados são, por exemplo, detectados num ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA). As sequências de aminoácidos dos membros da biblioteca que se ligam a um ligando alvo foram determinadas por sequenciação do código genético.
Num processo de selecção, múltiplos membros da biblioteca de compostos codificados são colocados em contacto com um ligando alvo. 0 ligando alvo é imobilizado antes ou após contacto com os membros da biblioteca e os membros não ligados são removidos por lavagem. 0 código genético dos ligandos ligados é sequenciado. Como alternativa, os ligandos seleccionados são propagados para serem realizados mais ciclos de selecção.
Numa realização do invento, as bibliotecas de compostos são codificadas por apresentação fágica e as selecções são realizadas por adsorção e eluição dos fagos. 0 ligando alvo do presente invento pode ser uma proteína, um DNA, um RNA ou um polissacárido. A proteína pode ser um receptor, uma enzima, uma hormona, uma citocina ou uma proteína virai. Um ligando proteico alvo possível será uma protease em que a referida protease poderá ser 89 ΡΕ2257624 elastase, calicreína do plasma, catepsina G ou activador do plasminogénio tipo urocinase. 0 presente invento compreende também membros das bibliotecas quimicas combinatórias codificadas isoladas com métodos do invento. Os referidos membros podem ser produzidos com ou sem o código genético ligado. Numa realização preferida, os referidos membros, sem o ácido nucleico, são usados como fármaco ou candidato a fármaco. Vários membros das bibliotecas combinatórias codificadas que são capazes de se ligarem a um ligando alvo foram isolados com um método do presente invento. Os referidos membros são compostos por um núcleo de mesitileno e um polipéptido com a sequência AC (X) eC (X) ôCG, em que o polipéptido está ligado aos grupos metilicos exociclicos do núcleo através dos residuos de cisteina, formando três ligações tioéter e em que X é um aminoácido natural, A é alanina, C é cisteina e G é glicina. A porção do péptido dos referidos membros pode ser expressa por via recombi-nante ou ser sintetizada quimicamente.
Os inibidores de calicreína do plasma humano podem ser isolados com métodos do invento a partir de bibliotecas químicas combinatórias codificadas do invento. Os referidos inibidores possuem as sequências polipeptídicas GCSDRFRNCPADEALCG, ACSDRFRNCPLWSGTCG, ACSTERRYCPIEIFPCG, ACAPWRTACYEDLMWCG, ACGTGEGRCRVNWTPCG ou sequências relacionadas em que os grupos tiol das cisteínas estão ligados a núcleos de mesitileno. 90 ΡΕ2257624
Os inibidores de catepsina humana G podem ser isolados com métodos do invento a partir de bibliotecas quimicas combinatórias codificadas do invento. Os referidos inibidores possuem as sequências polipeptidicas ACEYGDLWCG-WDPPVCG, ACIFDLGFCHNDWWNCG, ACLRAQEDCVYDRGFCG ou sequências relacionadas em que os grupos tiol das cisternas estão ligados a núcleos de mesitileno.
Os inibidores do activador do plasminogénio tipo urocinase humano podem ser isolados com métodos do invento a partir de bibliotecas quimicas combinatórias codificadas do invento. Os referidos inibidores possuem as sequências polipeptidicas ACNSRFSGCQIDLLMC, ACSRYEVDCRGRGSACG ou sequências relacionadas em que os grupos tiol das cisternas estão ligados a núcleos de mesitileno.
ALVOS BIOLÓGICOS É importante criar e testar o maior número de moléculas possivel, uma vez que a probabilidade de identificar um ligando com as propriedades pretendidas aumenta quando mais moléculas são testadas. Igualmente, em geral, os ligando com maiores afinidades são obtidos quando são testados maiores reportórios de moléculas.
Os investigadores tipicamente avaliam moléculas usando metodologias de rastreio ou selecção. O rastreio é um processo através do qual os compostos são individual- 91 ΡΕ2257624 mente testados relativamente à sua capacidade para modificar um alvo. Os processos de rastreio são versáteis e permitem que sejam testados reportórios de moléculas tendo estruturas muito diversas. 0 rastreio através de ensaios individuais, no entanto, pode ser demorado e o número de moléculas únicas que pode ser testado relativamente à ligação a um alvo especifico, geralmente, não excede 106 entidades químicas. Pelo contrário, os métodos de selecção, de um modo geral, permitem a amostragem de um número muito maior de moléculas diferentes. Assim, os métodos de selecção são mais adequadamente usados na aplicação do invento. Nos procedimentos de selecção, as moléculas são testadas num único recipiente de reacção e os possuidores de propriedades favoráveis (i.e. ligação) são fisicamente separados das moléculas inactivas. Estão disponíveis estratégias de selecção que permitem gerar e testar simultaneamente mais de 1013 compostos individuais. São exemplos de técnicas de selecção por afinidade potentes a apresentação fágica, a apresentação ribossomal, a apresentação de mRNA, a apresentação em leveduras, a apresentação bacteriana ou os métodos de aptâmeros de RNA/DNA. Estes métodos biológicos de selecção in vitro possuem em comum o facto dos reportórios de ligandos serem codificados por DNA ou RNA. Eles permitem a propagação e a identificação de ligandos seleccionados através de sequenciação. A tecnologia de apresentação fágica tem sido, por exemplo, usada para o isolamento de anticorpos com afinidades muito elevadas contra virtualmente qualquer alvo. 92 ΡΕ2257624
APLICAÇÃO INDUSTRIAL 0 presente invento é aplicável à descoberta de moléculas que são úteis nos campos da biologia, da biotecnologia e das ciências farmacêuticas. Em particular, o presente invento está relacionado com métodos para a geração de fármacos ou candidatos a fármacos. 0 presente invento compreende métodos para a geração de bibliotecas quimicas combinatórias geneticamente codificadas e métodos para o isolamento de membros das referidas bibliotecas. Ainda, o invento engloba bibliotecas geradas com os referidos métodos e membros das bibliotecas isoladas com os referidos métodos. 0 presente invento proporciona um método para a geração de bibliotecas quimicas combinatórias, geneticamente codificadas, em que os membros das referidas bibliotecas compreendem um núcleo molecular central e elementos de diversidade múltipla que são apensos ao referido núcleo. As referidas bibliotecas geneticamente codificadas são geradas em dois passos: num primeiro passo, são geradas bibliotecas de polipéptidos geneticamente codificados compreendendo grupos capazes de formar ligações covalentes com um núcleo molecular. No segundo passo, as bibliotecas de polipéptido geneticamente codificados são ligadas quimicamente, de forma cruzada, ao referido núcleo molecular através de pelo menos três ligações covalentes. 93 ΡΕ2257624
As moléculas das bibliotecas químicas combinatórias geneticamente codificadas do presente invento possuem uma estrutura nuclear que é expandida por vários apêndices. Ao contrário do estabelecido na área, as bibliotecas químicas combinatórias geneticamente codificadas geradas com métodos biológicos, as bibliotecas do presente invento proporcionam moléculas com arquitecturas ramificadas não lineares. As moléculas com tais estruturas ramificadas são adequadas para ligação a ligandos alvo uma vez que podem ligar-se ao alvo através da interacção de múltiplos apêndices que saem do núcleo central.
Contrariamente às estruturas poliméricas lineares, os complexos do presente invento possuem menos flexibilidade conformacional. Em solução elas adoptam apenas uma série limitada de conformações. Como consequência, a ligação dos referidos complexos ou polipéptidos a um ligando alvo não está associada a uma perda dramática de entropia e pode resultar em afinidades de ligação elevadas.
Os polipéptidos dos complexos/bibliotecas do invento são codificados geneticamente. Isto permite que possam ser aplicados métodos biológicos potentes de codificação, como por exemplo a apresentação fágica, apresentação ribossomal, a apresentação em leveduras, a apresentação bacteriana ou a apresentação de mRNA, para a sua produção, os quais permitem gerar bibliotecas de ligandos contendo milhões, biliões ou mais de membros individuais. 94 ΡΕ2257624 A sequência dos apêndices polipeptídicos dos membros das bibliotecas quimicas combinatórias geneticamente codificadas pode variar. São excepções os aminoácidos portadores de grupos funcionais para a ligação cruzada do polipéptido a um núcleo molecular, o que é explicado mais detalhadamente abaixo. Os apêndices polipeptídicos podem compreender diversidades combinatórias muito grandes. A representação de grandes reportórios combinatórios é importante, uma vez que a probabilidade de isolar elementos de ligação de elevada afinidade para os ligandos alvo aumenta com o tamanho da biblioteca.
Ao contrário dos biopolimeros lineares como polipéptidos, aptâmeros de DNA ou de RNA, os complexos e membros de bibliotecas quimicas combinatórias geneticamente codificadas do invento não formam estruturas terciárias complexas. Os complexos e membros das bibliotecas quimicas combinatórias geneticamente codificadas do invento apresentam um risco muito reduzido de inactivação através de desnaturação irreversível. A formação de agregados devido ao desenrolamento é assim, vantajosamente, improvável.
As bibliotecas geneticamente codificadas do invento adequadamente compreendem pelo menos 105 membros individuais. De preferência, as referidas bibliotecas compreendem milhões ou biliões ou mais de membros individuais. 0 tamanho das referidas bibliotecas é determinado por métodos que são usados para ligar o ácido nucleico codificador de um polipéptido a esse polipéptido. Numa 95 ΡΕ2257624 realização preferida do invento, métodos biológicos foram usados para gerar reportórios de polipéptidos geneticamente codificados. 0 número de membros individuais de polipéptidos que estão ligados ao polinucleótido codificador pode exceder 1013 dependendo dos métodos usados. 0 invento é agora descrito como exemplo em que é feita referência às seguintes figuras:
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a geração de pequenas bibliotecas quimicas combinatórias codificadas por fagos. Um péptido codificado por fagos com três resíduos de cisternas é ligado ao composto trifuncional tri-(bromometil)benzeno numa reacção de substituição nucleofílica. As entidades químicas resultantes podem ainda ser modificadas através de reacções enzimáticas. A Figura 2 mostra a avaliação das condições de reacção para a ligação dos péptidos apresentados por fagos a tris-(bromometil)benzeno (TBMB). (A) Massa molecular da proteína de fusão GCGSGCGSGCG-D1-D2 antes e após reacção com TBMB ΙΟμΜ em NH4HCO3 20 mM, EDTA 5 mM, pH 8, 20% ACN, a 30°C, durante 1 hora, determinada por espectrometria de massa. A diferença entre as massas da proteína de fusão com péptidos que reagiram ou não, corresponde à massa do pequeno núcleo molecular de mesitileno. (C) Títulos (unidades de transdução) de fagos reduzidos e tratados com várias 96 ΡΕ2257624 concentrações de TBMB em NH4HCO3 2 0 mM, EDTA 5 mM, pH 8, 20% ACN, a 30°C, durante 1 hora. Estão apresentados os títulos dos fagos de fdg3pOss21 (preto) e da biblioteca 1 (branco). A Figura 3 mostra o desenho da biblioteca de fagos e sequências de clones seleccionados. (A) Sequência de aminoácidos das proteínas de fusão com péptidos expressos pelos clones da biblioteca 1. A sequência líder é removida, quando da secreção da proteína, por uma protease de E. coli deixando um péptido com uma alanina N-terminal, duas sequências de 6 aminoácidos ao acaso flanqueadas por três cisteínas e um elemento de ligação Gly-Gly-Ser-Gly que liga o péptido à proteína do gene 3. (B e C) Sequências de aminoácidos de clones seleccionados com calicreína de plasma humano (B) e catepsina G (C). Estão indicadas as actividades inibidoras das proteínas de fusão com os péptidos D1-D2 modificados com TBMB. As semelhanças de sequências estão evidenciadas com cores. A Figura 4 mostra a maturação de afinidade de inibidores de calicreína do plasma humano. (A) Desenho das bibliotecas 2, 3 e 4. Em cada uma das bibliotecas, uma das ansas peptídicas tem a sequência de um motivo de consenso identificado nas primeiras selecções e o outro contém seis aminoácidos ao acaso. (B) Sequências de aminoácidos de clones seleccionados com calicreína do plasma humana. Todos os clones derivaram da biblioteca 2. Estão indicadas as actividades inibidoras das proteínas de fusão com os 97 ΡΕ2257624 péptidos D1-D2 modificados com TBMB. As semelhanças de sequências estão evidenciadas a cores na segunda ansa de ligação. A Figura 5 mostra a inibição de calicreina de plasma humano por péptidos sintéticos modificados com TBMB. A actividade inibidora está expressa como a actividade fraccionária (taxa de inibição/taxa de não inibição) a diferentes concentrações de inibidor. A Figura 6 mostra a estrutura em solução, por NMR, representativa do péptido PK15 modificado com TBMB mostrada como uma estrutura em "salsicha". As ansas peptí-dicas estão apresentadas a azul (ansa 1) e a verde (ansa 2) . Os átomos de carbono alfa dos aminoácidos nas ansas peptidicas e nos extremos estão representados com esferas. A Figura 7 mostra a reacção quimica do composto trifuncional TBMB com péptidos contendo uma ou duas cisteinas. (A) Mecanismo de reacção plausível do TBMB com uma proteína de fusão com péptidos contendo dois resíduos de cisteína. (B) Espectro de massa de uma proteína de fusão com péptidos com duas cisternas antes e após reacção com TBMB. (C) Mecanismo de reacção plausível do TBMB com uma proteína de fusão com péptidos contendo um resíduo de cisteína. (D) Espectro de massa de uma proteína de fusão com péptidos com uma cisteína, antes e após reacção com TBMB. 98 ΡΕ2257624 A Figura 8 mostra a inibição da activação de contacto em plasma humano pela aprotinina e pelo péptido PK15 modificado com TBMB. Efeito da aprotinina (A) e do péptido PK15 modificado com TBMB (B) na geração de trombina induzida por actina. Ambos os inibidores causam prolongamento dependente de dose do tempo de espera comparativamente com a amostra controlo. (C) A soma das actividades do factor Xlla e da calicreina do plasma foi medida com o substrato colorimétrico H-D-Pro-Phe-Arg-pNA em plasma humano de três dadores diferentes tratados com concentrações variáveis de inibidor. A activação por contacto foi iniciada pela adição de caulino. Estão indicados os valores médios e os desvios padrão. A Figura 9 mostra (a) Geração de pequenas bibliotecas químicas combinatórias codificadas por fagos. Um péptido codificado por fago com três resíduos de cisteína foi ligado ao composto trifuncional tris-(bromometil)ben-zeno numa reacção de substituição nucleofílica. As entidades químicas resultantes poderão ser, facultativamente, ainda mais modificadas através de reacções enzimáticas. (b) Estrutura química de um inibidor macrocíclico da calicreina do plasma isolado por apresentação fágica (PK15). A Figura 10 mostra a avaliação das condições de reacção para a ligação a tris-(bromometil)benzeno (TBMB)dos péptidos apresentados por fagos. (a) Massa molecular da proteína de fusão GCGSGCGSGCG-D1-D2 antes e após reacção com TBMB ΙΟμΜ em NH4HCO3 2 0 mM, EDTA 5 mM, pH 8, 20% ACN a 99 ΡΕ2257624 30 °C, durante 1 hora, determinada por espectrometria de massa. A diferença entre as massas da proteína de fusão com péptidos que reagiram ou não corresponde à massa do pequeno núcleo molecular de mesitileno. (b) Títulos (unidades de transdução) de fagos reduzidos e tratados com várias concentrações de TBMB em NH4HCO3 20 mM, EDTA 5 mM, pH 8, 20% ACN a 30°C durante 1 hora. Estão apresentados os títulos dos fagos de fdg3pOss21 (preto) e da biblioteca 1 (branco). A Figura 11 mostra o desenho da biblioteca de fagos e sequências de clones seleccionados. (a) Sequência de aminoácidos das proteínas de fusão com péptidos expressas pelos clones da biblioteca 1. A sequência líder foi removida quando da secreção da proteína por uma protease de E. coli deixando um péptido com uma alanina N-terminal, duas sequências de 6 aminoácidos ao acaso flanqueadas por três cisteínas e um elemento de ligação Gly-Gly-Ser-Gly que liga o péptido à proteína do gene 3. (b e c) Sequências de aminoácidos de clones seleccionados com calicreína de plasma humano (b) e catepsina G (c) . Estão indicadas as actividades inibidoras das proteínas de fusão Dl-D2-péptido modificado com TBMB. As semelhanças de sequências estão evidenciadas com cores. A Figura 12 mostra a maturação por afinidade de inibidores de calicreína do plasma humana, (a) Desenho das bibliotecas 2, 3 e 4. Em cada uma das bibliotecas, uma das ansas peptídicas tem a sequência de um motivo de consenso modificado na primeira selecção e o outro possui seis 100 ΡΕ2257624 aminoácidos ao acaso. (b) Sequências de aminoácidos de clones seleccionados com calicreína do plasma humana- Todos os clones derivam da biblioteca 2. Estão indicadas as acti-vidades inibidoras das proteínas de fusão D1-D2- péptido modificado com TBMB. As cores evidenciam as semelhanças de sequências na segunda ansa de ligação. A Figura 13 mostra a inibição da calicreína do plasma humano por péptidos sintéticos modificados com TBMB. A actividade inibidora está expressa como a actividade fraccionária (taxa de inibição/taxa de não inibição) a diferentes concentrações de inibidor. Os clones PK2, PK4, PK6 e PK13 foram isolados em selecções de fagos usando a biblioteca 1. PK15 deriva da biblioteca 2 e é um inibidor maturado por afinidade. A Figura 14 mostra a estrutura em solução, por NMR, do péptido PK15 modificado com TBMB. As ansas peptídicas estão apresentadas a amarelo (ansa 1) e a laranja (ansa 2). O núcleo de mesitileno, os três resíduos de cisterna e a alanina terminal (extremo N) e a glicina (extremo C) estão apresentados a cinzento. Os átomos do suporte do péptido estão representados como uma salsicha e as cadeias laterais dos aminoácidos estão mostradas como estiletes. A Figura 15 mostra a reacção química do composto trifuncional TBNB com péptidos contendo um ou dois resíduos de cisterna. (a) Mecanismo de reacção plausível do TBMB com 101 ΡΕ2257624 uma proteína de fusão com péptidos contendo dois resíduos de cisteína. (b) Espectro de massa de uma proteína de fusão com péptidos com duas cisteínas antes e após reacção com TBMB. (c) Mecanismo de reacção plausível do TBMB com uma proteína de fusão com péptidos contendo um resíduo de cisteína e um resíduo de lisina. (d) Espectro de massa de uma proteína de fusão com péptidos com um resíduo de cisteína e um resíduo de lisina, antes e após reacção com TBMB. A Figura 16 mostra a supressão da activação do factor XII de plasma humano através da inibição da calicreína do plasma com aprotinina ou com o péptido PK15 modificado com TBMB. A via de coagulação intrínseca em plasma humano de três dadores diferentes foi iniciada pela adição de caulino. A superfície carregada negativamente do caulino activa pequenas quantidades do factor XII. Pré-calicreína foi convertida em calicreína pelo factor XII activado (Xlla) e a calicreína exerce uma retroacção positiva para activar mais factor XII. A actividade do factor Xlla foi medida com o substrato colorimétrico H-D-Pro-Phe-Arg-pNA. Estão indicados os valores médios e desvios padrões da actividade do factor Xlla.
Os exemplos que se seguem destinam-se a serem de natureza ilustrativa e não se destinam a limitar o âmbito das reivindicações apensas. 102 ΡΕ2257624 EXEMPLOS Visão global
Nestes exemplos demonstrámos a produção de bibliotecas químicas combinatórias codificadas por fagos. A descoberta de moléculas sintéticas com elevada afinidade e especificidade para alvos biológicos é um problema central na descoberta de fármacos. Ainda que recentemente se tenha tornado possível isolar grandes estruturas moleculares, como anticorpos ou aptâmeros, contra virtualmente qualquer alvo usando técnicas de selecção in vitro, a geração de pequenos elementos de ligação orgânicos com elevada afinidade mantém-se como um grande desafio. Neste invento, descrevemos uma estratégia para o isolamento de pequenas estruturas moleculares que são construídas a partir de um núcleo molecular orgânico (composto de conjugação) que é decorado com grupos peptídicos (e.g. polipéptido(s)). Por conveniência, nestes exemplos foi usada a tecnologia de apresentação fágica para codificar a fracção peptídica das pequenas moléculas, permitindo a geração e selecção de reportórios químicos combinatórios muito grandes. As condições de reacção foram escolhidas para selectivamente ligarem um péptido de 17 aminoácidos através de três ligações tioéter a uma molécula de benzeno no sentido de poupar as proteínas da cápside das partículas fágicas. Elementos de ligação altamente específicos com afinidades submicromolares foram obtidos 103 ΡΕ2257624 contra as duas proteases humanas do plasma calicreína e catepsina G. Um inibidor maturado por afinidade da calicreina do plasma com um Ki aparente de 1,5 nM suprimiu eficazmente a activação por contacto em plasma humano.
Fundamento dos Exemplos
As moléculas com elevada afinidade e especificidade para alvos biológicos são necessárias para desenvolver terapias eficientes e selectivas contra uma larga gama de doenças. O processo de encontrar um novo fármaco que seja uma molécula orgânica pequena contra um alvo determinado, geralmente, envolve rastreio de um elevado número de amostras, em que grandes bibliotecas de químicos são testadas pela sua capacidade para modificar o alvo. O processo, no entanto, é demorado e dispendioso e o número de moléculas únicas que podem ser testadas contra um alvo específico geralmente não excede um milhão de entidades químicas. Os rastreios frequentemente proporcionam apenas candidatos que depois requerem optimização por métodos empíricos ou por projecção química. Métodos mais potentes para a geração de moléculas de ligação são técnicas biológicas de selecção in vitro como é a apresentação fágica, apresentação ribossomal, apresentação de mRNA ou técnicas de aptâmeros RNA/DNA. Eles permitem a geração rápida de grandes reportórios combinatórios (ΙΟ9—1013) de polipéptidos, RNA ou DNA e o subsequente isolamento de elementos de ligação com elevadas afinidades. No entanto, a restrição de tais métodos a 104 ΡΕ2257624 grandes estruturas de biopolímeros, como anticorpos ou aptâmeros, faz pressupor a sua utilização para a descoberta de moléculas pequenas. Para se aplicar a selecção in vitro às bibliotecas combinatórias, foram propostas várias metodologias para associar moléculas orgânicas a uma marca que especifica a sua estrutura. A maior parte das abordagens propõe o uso de marcas de DNA para identificar as pequenas moléculas orgânicas após selecção por afinidade. Foi proposto um processo de síntese combinatória paralela para codificar membros individuais de uma grande biblioteca de químicos com sequências nucleotídicas únicas em esferas (Brenner, S. and Lerner, R. A., PNAS, 1992). Após a entidade química ser ligada ao alvo, o código genético foi descodificado por sequenciação da marca nucleotídica. Uma pequena colecção de moléculas orgânicas foi conjugada a oligonucleótidos de DNA e realizadas selecções por afinidade com diferentes antigénio (Doyon, J. B. et al., JACS, 2003) . Neri D. e colaboradores geraram grandes reportórios de pares de moléculas por auto-montagem de sub-bibliotecas mais pequenas de químicos codificados por DNA através de hibridação das duas cadeias de DNA (Melkko, S. et al., Nature Biotechnol., 2004). A metodologia foi usada com sucesso para maturação por afinidade de pequenas moléculas ligandos. Halpin D. R. e Harris P. B. desenvolveram uma estratégia para a evolução in vitro de bibliotecas químicas combinatórias que envolve a amplificação de compostos seleccionados para desempenharem múltiplos ciclos de selecção (Halpin, D. R. e Harbury, P. B., PLOS Biology. 2004) . Woiwode T. F. et al. ligaram 105 ΡΕ2257624 bibliotecas de compostos sintéticos a proteínas da cápside de partículas de bacteriófagos de forma que a identidade da estrutura química fosse codificada no genoma do fago (Woiwode, T. F., Chem. & Biol., 2003). Todas estas estratégias que empregam compostos químicos codificados por DNA provaram ser eficientes em experiências modelo e algumas deram mesmo novas moléculas de pequenas ligandos. No entanto tornou-se aparente que a codificação de grandes bibliotecas de compostos e a amplificação de compostos seleccionados é muito mais exigentes do que procedimentos equivalentes em sistemas de selecção biológicos.
Neste invento descrevemos uma estratégia para codificar estruturas de moléculas híbridas de péptido-molécula pequena, as quais são construídas com múltiplos fragmentos polipeptídicos ligados a uma molécula orgânica, central, pequena. A porção peptídica é codificada pelas partículas fágicas permitindo a geração e selecção de diversidades muito grandes e complexas. Propomos os processos de reacção que se seguem para ligar fragmentos peptídicos a uma pequena molécula (esquematicamente descrita na Figura 1). Uma estrutura química equipada com grupos reactivos é incubada com um péptido apresentado por fagos. Os aminoácidos específicos no péptido (e.g. cisteínas) reagem com os grupos funcionais da molécula pequena para formar ligações covalentes, em que uma primeira ligação acelera as ligações subsequentes. As moléculas resultantes são então sujeitas a selecção por afinidade. Como alternativa, ligações peptídicas 106 ΡΕ2257624 específicas da estrutura multicíclica são clivadas enzimaticamente para se obter pequenas estruturas químicas decoradas com entidades peptídicas discretas. A ligação de reportórios polipeptídicos apresentados por fagos a pequenas estruturas moleculares não é fácil, uma vez que a reacção tem de ser específica e selectiva para dar um único produto. Igualmente, os reagentes adequadamente não deverão inactivar a partícula fágica. Ainda, a ligação de uma molécula pequena através de múltiplos locais a um péptido acrescenta um nível adicional de complexidade, uma vez que podem ser facilmente geradas misturas de produtos ou as partículas fágicas podem ser ligadas de forma cruzada. De facto, não se conhece qualquer exemplo na área em que uma molécula pequena foi ligada a um polipéptido apresentado por fagos através de mais de uma ligação.
Materiais e métodos
Ligação química das proteínas de fusão péptido-D12 a um suporte químico
Os domínios D1-D2 de g3p (compreendendo os resíduos de aminoácidos 2 a 217 da fdg3p madura), com e sem o péptido nCGSGCGSGCGc fundido no extremo N, foram expressos em E. coli. 0 vector de expressão baseado em pUC119 com uma sequência líder e o gene Dl-02 com uma cauda de hexa-histidina C-terminal (aqui designado pUC119H6D12) foi gentilmente cedido por Phil Holliger do laboratório de biologia molecular (LMB) em Cambridge. Um plasmídeo para a 107 ΡΕ2257624 expressão de D1-D2 com o péptido N-terminal foi clonado por amplificação por PCR do gene D1-D2 com as sequências iniciadoras pepdl2ba (codificadora da sequência peptídica) e dl2fo e ligação a pUC119H6D12 digerido com Sfil/NotI. O gene para expressão de D1-D2 sem dissulfureto com um total de 20 mutações de aminoácidos foi gentilmente cedido por Insa Kather e Franz Xaver Schmid da University of Bayreth. O gene foi amplificado por PCR a partir do vector fdg3pOss21 com o par de sequências iniciadoras dl20ssba/dl20ssfo, pepdl20ssba/dl20ssfo, P2cdl20ssba/dl20ssfo ou Plcdl20ssba/ dl20ssfo e ligado em Sifl/Notl a pUC119H6D12 para expressão de D1-D2 sem ligações dissulfureto com e sem os péptidos nACGSGCGSGCGc, nAGSGCGSGCGc ou nAGSGKGSGCGc fundidos no extremo N. As 6 proteínas foram expressas em células E. coli TG1, a 30°C, durante 8 horas e a fracção periplásmica foi purificada em vários passos por cromatografia de afinidade com Ni e filtração em gel numa coluna Superdex 75 em NH4HCO3 20 mM, pH 7,4. Os grupos sulfidrilo oxidados foram reduzidos por incubação da proteína (1-10 μΜ) com TCEP 1 mM em NH4HCO3 20 mM, pH 8 a 42°C, durante 1 h. O agente redutor foi removido com um filtro Vivapsin 20 tendo um poro de exclusão de 10000 (Vivascience, Stonehouse, UK) usando tampão NH4HCO3 2 0 mM, EDTA 5 mM, pH 8. Os grupos tiol das proteínas reagiram por incubação com TBMB 10 μΜ em tampão de reacção (NH4HCO3 20 mM, EDTA 5 mM, pH 8, 20% ACN) , a 30°C, durante 1 h. Para remoção do TBMB que não reagiu e concentração, a proteína foi filtrada com um microcon YM-30 (Millipore, Bedford, MA) . As massas moleculares das proteínas (5-20 μΜ) foram determinadas por 108 ΡΕ2257624 desnaturação em 4 volumes de 50% MeOH, 1% de ácido fórmico e análise num espectrómetro de massa por tempo de voo com ionização por electrovaporização (Micromass, Millford, MA, USA) . As massas moleculares foram obtidas por deconvolução de espectros de massa de proteínas multiplamente carregadas usando MassLynx versão 4.1. o desempenho da reacção de modificação química na presença de fagos foi testado pela adição de fagos purificados com PEG para uma concentração final de IO10 t.u. à proteína antes da redução com TCEP. Os fagos foram removidos por filtração em gel com uma coluna PD-10 (Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden) após reacção com TBMB.
Criação de uma biblioteca de fagos com péptidos
Os genes codificadores de um péptido semi-aleatório com a sequência Ala-Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys, o elemento de ligação Gly-Gly-Ser-Gly e os dois domínios Dl e D2 sem ligações dissulfureto foram clonados na orientação correcta no vector fágico fd0D12 para se obter a biblioteca fágica 1. O vector fd0D12, sem os genes dos domínios Dl e D2 do gene 3 e tendo um segundo local de restrição Sfil foi previamente criado através da amplificação por PCR da totalidade do plasmídeo fdg3pOss21 (Kather, I. et al.al., J. Mol. Biol., 2005) usando as sequências iniciadoras ecoG3pNba e pelbsfiecofo. Os genes codificadores do reportório de péptidos e os dois domínios do gene 3 foram criados gradualmente em duas reacções de PCR consecutivas. Primeiro, os genes Dl e D2 foram amplificados por PCR com 109 ΡΕ2257624 as duas sequências iniciadoras prepcr e sfi2fo usando o vector fdg3pOss21 como matriz. Segundo, o DNA codificador dos péptidos ao acaso foram apensos numa reacção de PCR usando as sequências iniciadoras ecoG3pNba e pelbsfiecofo. A ligação de 33 e 9 yg do plasmideo fd0D12 digerido com Sfil e do produto de PCR deu 4,4 x 109 colónias em 12 placas de 20x20 cm de 2YT com cloranfenicol (30 yg/ml). As colónias foram raspadas das placas com meio 2YT, suplementado com 15% de glicerol e guardadas a -80°C. Os stocks de glicerol foram diluidos para uma ϋΟβοο = 0,1 em 1 litro de 2YT/cloranf enicol (30 yg/ml) e os fagos foram expressos a 30°C durante a noite (12 a 16 hrs).
Ligação química de um péptido apresentado por fagos a uma molécula pequena
Tipicamente 1011-1012 t.u. de fagos purificados com PEG foram reduzidos em 2 0 ml de NH4HCO3 2 0 mM, pH 8, com TCEP 1 mM, a 42°C, durante 1 h. Os fagos foram centrifugados a 4000 rpm num filtro Vivaspin-20 (MWCO de 10000) para reduzir o volume para 1 ml e lavados duas vezes com 10 ml de tampão de reacção arrefecido em gelo (NH4HCO3 20 mM, EDTA 5 mM, pH 8) . O volume dos fagos reduzidos foi ajustado a 32 ml com tampão de reacção e 8 ml de TBMB μΜ em ACN foram adicionados para se obter uma concentração final de 10 μΜ. A reacção foi incubada a 30°C durante 1 h antes do TBMB que não reagiu ser removido por precipitação do fago com 1/5 do volume de 20% PEG, NaCl 2,5M em gelo e centrifugação a 4000 rpm durante 30 minutos. 110 ΡΕ2257624
Selecçoes de fagos com calicreína e catepsina G de plasma humano A calicreína de plasma humano (activada com factor Xlla) foi adquirida à Innovative Research (Southfiled, MI. USA) e biotinilada numa concentração de 1,2 μΜ com um excesso molar de 5 vezes de Sul-NHS-LC-biotina (Pierce, Rockford, IL, USA) em PBS, pH 7,4/5% DMSO à TA durante 1 horas. A proteína biotinilada foi purificada numa coluna PD-10 usando um tampão de NaAc 50 mM, pH 5,5, NaCl 200 mM. Catepsina G humana já biotinilada foi adquirida à Lee Biosolutions (St. Louis, MI, USA). Os antigénios biotinilados (5 a 20 yg) foram incubados com 50 μΐ de esferas magnéticas com estreptavidina (Dynal, M-280 da Invitrogen, Paisley, UK) durante 20 minutos, a 4°C. As esferas revestidas com antigénio foram lavadas duas vezes com tampão de lavagem (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mm, MgCl2 10 mM, CaCl2 1 mM) e bloqueadas em 0,5 ml de tampão de lavagem contendo 1% BSA e 0,1% Tween 20, durante 30 minutos. Os fagos modificados quimicamente (tipicamente 101°-1011 t.u. dissolvidos em 2 ml de tampão de lavagem) foram bloqueados pela adição de 1 ml de tampão de lavagem contendo 3% BSA e 0,3% Tween 20. 3 ml de fagos bloqueados foram pipetados para 0,5 ml de esferas magnéticas bloqueadas e incubados numa roda giratória à TA. As esferas foram lavadas 8 vezes com tampão de lavagem contendo 0,1% Tween 20 e duas vezes com tampão de lavagem, antes da incubação com 100 μΐ de glicina 50 μΜ, pH 2,2 durante 5 111 ΡΕ2257624 minutos. Os fagos eluídos foram transferidos para 50 μΐ de Tris-HCl 1M, pH 8 para neutralização, incubados com 50 ml de células TG1 a ΌΟδοο = 0,4 durante 90 minutos, a 37°C e as células foram semeadas em grandes placas de 2YT/cloran-fenicol. Dois ciclos adicionais de selecção por adsorção foram realizados usando os mesmos procedimentos. No segundo ciclo de selecção, foram usadas esferas magnéticas revestidas com neutravidina para evitar o enriquecimento em pépti-dos específicos de estreptavidina. As esferas de neutravidina foram preparadas através da reacção de 0,8 mg de neutravidina (Pierce, Rockford, IL, USA) com 0,5 ml de esferas magnéticas activadas com tosilo (Dynal, M-280 da Invitro-gen, Paiseley, UK) de acordo com as instruções do fabricante .
Procedimento de rastreio para identificar inibi-dores de proteases 0 DNA de plasmídeo dos clones seleccionados após os segundo e terceiro ciclos de selecção por adsorção foi amplificado por PCR num único tubo com as sequências iniciadoras 21seqba e flagfo e clonados no vector pUC119H6D12 nos locais Sfil e Notl, para expressão no espaço periplásmico dos péptidos fundidos com os domínios Dl e D2 sem dissulfureto com uma marca FLAG C-terminal e uma cauda de hexa-histidinas. Os plasmídeos ligados foram electroporados para células TG1 e semeados em placas de 2YT/ampicilina (100 yg/ml). Os clones que expressam a proteína recombinante foram identificados como se segue: 1 112 ΡΕ2257624 ml de 2YT/ampicilina (100 yg/ml) em placas de 96 alvéolos fundas foram inoculados com células de colónias individuais e incubadas a 37°C. A expressão proteica foi induzida com IPTG 1 mM quando as culturas estavam turvas e as placas foram agitadas a 300 rpm, a 30°C durante a noite. As células foram semeadas por centrifugação a 3500 rpm durante 30 minutos, lisadas com tampão de lavagem contendo 1 mg/ml de lisozima e centrifugadas a 3500 rpm para sedimentar os detritos celulares. Os sobrenadantes foram transferidos para placas Polysorp de 96 alvéolos (Nunc, Roskilde, Denmark) para adsorção não especifica. Os alvéolos foram lavados duas vezes com tampão de lavagem contendo 0,1% Tween 20 e bloqueados com tampão de lavagem contendo 1% BSA e 0,1% Tween 20 durante 1 h. O conjugado anti-FLAG M2-peroxidase (Sigma-Aldrich. St Louis, MO, USA) foi diluido a 1:5000 e bloqueado em tampão de lavagem contendo 1% BSA e 0,1% Tween 20 e adicionado às placas durante 1 h. Os alvéolos foram lavados (5 vezes com tampão de lavagem contendo 0,1% Tween 20 e uma vez com detergente) e a peroxidase ligada foi detectada com solução do substrato TMB (eBiosciences, San Diego, USA) . O DNA de plasmideo dos clones que expressam proteina foi sequenciado (Geneservice, Cambridge, UK) . Os clones seleccionados foram expressos numa escala de 800 ml e purificados por cromatografia de afinidade com Ni e filtração em gel como descrito atrás. Os péptidos foram modificados quimicamente usando o procedimento descrito atrás e as concentrações dos produtos foram determinadas através da medição da adsorção óptica a 280 nm. O IC5o foi medido por incubação de várias concen- 113 ΡΕ2257624 trações das proteínas de fusão com péptidos modificados (diluições de 2 vezes) com calicreína de plasma humano (0,1 nM) ou com catepsina G (20 nM) e determinando a actividade residual em Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM, CaCl2 1 mM, 0,1% BSA, 0,01% Triton-X100. A actividade de calicreína de plasma humano foi medida com o substrato fluorogénico Z-Phe-Arg-AMC (Bachem. Bubendorf, Switzerland) numa concentração de 100 μΜ num leitor de fluorescência para placas Spectromax Gemini (excitação a 355 nm, registo de emissão a 460 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) . A actividade de catepsina G humana foi medida com o substrato colorimétrico N-Suc-Ala-Ala-Phe-Pro-pNA (Bachem, Bubendorf, Switzerland) numa concentração de 1 mM com um leitor de placas de absorção Spectromax (registando a 410 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
Procedimento de rastreio para identificar inibi-dores de proteases
Foram criadas três biblioteca fágicas para péptidos essencialmente como descrito para a biblioteca 1 (ver atrás) mas usando a sequência iniciadora degenerada sficxôabc (biblioteca 2), sficxôabb (biblioteca 3) e sficxôaba (biblioteca 4) em vez de sficxôba. A electroporação das reacções de ligação em células TG1 deu 9,5 x 108 (biblioteca 2), 1,1 x 109 (biblioteca 3) e 1,2 x 109 (biblioteca 4) transformantes. Os fagos de cada biblioteca foram produzidos em culturas de 1 litro, purificados, reunidos e reagidos com TBMB. Três ciclos de 114 ΡΕ2257624 selecção por adsorção foram realizados essencialmente como nas selecções descritas atrás, mas usando a calicreina de plasma humano biotinilada numa concentração mais baixa (1 nM nos Io e 2o ciclos, 200 pM no 3o ciclo). Síntese química de péptidos bicíclicos
Os péptidos com um grupo amina livre no extremo N e uma amida no extremo C foram obtidos por sintese química numa escala de 25 mg por química de fase sólida (JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany). Os péptidos brutos em 1 ml de 60% NH4HCO3, pH 8 e 30% ACN (1 mM) reagiram com TBMB (1,2 mM) durante 1 h à TA. O produto de reacção foi purificado por cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (HPLC) usando uma coluna C18 e eluição com gradiente com uma fase móvel composta por ACN e solução a 0,1% de ácido trifluoroacético aquoso (TFA), a um fluxo de 2ml/min. Os péptidos purificados foram liofilizados e dissolvidos em DMSO ou num tampão de Tris-HCl 50 mM pH 7,8, NaCl 150 mM para medições de actividade.
Medição da actividade e especificidade dos inibi-dores da calicreina de plasma humano
As actividades inibidoras (IC50) foram determinadas por medição das actividades residuais da enzima quando da incubação (30 min, TA) com diferentes concentrações de inibidor (tipicamente variando entre 10 μΜ e 0,5 pM) . As actividades da calicreina do plasma humano (0,1 nM) e do 115 ΡΕ2257624 factor Xla (0,8 nM; Innovative Research, Southfiled, MI, USA) foram medidas com Z-Phe-Arg-AMC (100 μΜ) e a actividade da trombina humana (2 nM; Innovative Research, Sothfiled, MI, USA) com Boc-Phe-Ser-Arg-AMC (100 μΜ) em Tris-Cl 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM CaCl2 1 mM, 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100 e 5% DMSO. A calicreina de plasma humano recombinante da R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) com um péptido sinal foi activada proteoliticamente com 0,5 mg/ml de termolisina a 37°C, durante 1 h. A actividade da calicreina do plasma humano (3 nM) foi medida com Z-Phe-Arg-AMC (100 μΜ) em Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, CaCl2 10 mM e NaCl 250 mM, 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100 e 5% DMSO. O inibidor hidrolisado numa ansa da ligação foi gerado por incubação do péptido PK15 modificado com TBMB com calicreina de plasma humano numa razão molar de 5:1 durante 24 horas a 37°C e subsequente inactivação da enzima pelo calor a 60°C (30 min). Os valores de Ki aparente foram calculados de acordo com a equação de Cheng e Prusoff (Cheng, Y. and Prusoff, W. H., Biochem. Pharmacol., 1973).
Medição da activação por contacto em plasma humano
Plasma humano normal de dadores isolados foi adquirido a 3H Biomedial (Uppsala, Sweden). O plasma foi centrifugado a 1500 xg, a 20°C, durante 15 minutos para se obter plasma empobrecido em plaquetas (PPP). Aliquuotas do PPP foram guardadas em tubos de polipropileno a -80°C. Foram preparadas amostras de 60 μΐ de PPP contendo 5, 50, 116 ΡΕ2257624 500 ou 5000 nM de aprotinina (Roche, Mannheim, Germany) ou péptido PK15 modificado com TBMB. O tempo de activação da trombina foi medido a 37°C pela adição de 20 μΐ de actina FS diluída a 1:10 (Dade Behring, Marburg, Germany) e 20 μΐ de tampão Hepes 20 mM pH 7,4, CaCl2 100 mM, 5 mg/ml de BSA e Z-Gly-Gly-Arg-AMC 1 mM à amostra de plasma e monitorização da intensidade de fluorescência com um leitor de fluorescência em placas (excitação a 355 nm, registo de emissão a 460 nm; PHERAStar, Labtech, Offenburg, Germany). A activação do factor Xlla e da calicreína de plasma humano foi medida como se segue. 2 pg de caulino foi adicionado às amostras de plasma, bem misturados e incubados durante 20 minutos a 37°C. As amostras foram diluídas 250 vezes em Tris-HCl 50 mM pH 7,8, NaCl 150 mM. A actividade tipo calicreína do plasma foi medida com o substrato cromogénico H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (100 μΜ; Bachem, Bubendorf, Switzer-land) usando um leitor de absorção de placas (absorção a 450 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
Determinação da estrutura do péptido PK15 modificado com TBMB 1 mg do péptido PK15 modificado com TBMB foi dissolvido em 550 μΐ de Tris-HCl deuterado 10 mM, pH 6, 6,
NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM CaCl2 1 mM para obter uma concentração de i nibidor de 1 mM. Os espectros do inibidor foram registados a 800 MHz (Bruker Avance com crio-sonda TCI) . A análise dos espectros foi baseada em espectros TOCSY e NOESY. As restrições de distâncias foram dos 117 ΡΕ2257624 espectros NOESY. Foram calculadas 50 estruturas de confórmeros, O programa PyMOL foi usado para análise da estrutura e visualização dos modelos moleculares. EXEMPLO 1: Preparação de um complexo
Neste exemplo demonstrámos a ligação dos péptidos apresentados em fagos a pequenas moléculas. O polipéptido neste exemplo é um péptido apresentado por fagos. O ácido nucleico está contido na partícula fágica. O composto de conjugação deste exemplo é uma molécula pequena (TBMB neste exemplo).
Usámos o pequeno composto orgânico tris-(bromome-tilbenzeno (TBMB) como suporte para ancorar péptidos contendo três resíduos de cisteína (Kemp, D.S. e McNamara, P.E. J. org. Chem. 1985; Figura 1B) . Alcanos de halogéneo conjugados com um suporte aromático reagem especificamente com grupos tiol de cisternas em solvente aquoso à temperatura ambiente (Stefanova, H.I., Biochemistry, 1993). Meloen e colaboradores usaram anteriormente suportes sintéticos substituídos com bromometilo para a imobilização de péptidos com múltiplas cisteínas (Timmerman. P. et al., ChemBioChem, 2005). As condições suaves necessárias para a reacção de substituição são convenientes para poupar a funcionalidade do fago (Olofsson, L., et al., J. of Molecular Recognition, 1998). Escolhemos cisteínas como pontos de ancoragem devido às suas cadeias laterais possuírem a reactividade mais distinta dentro dos 20 118 ΡΕ2257624 aminoácidos naturais. Igualmente, os resíduos de cisterna são raros em proteínas da cápside do fago (8 cisteínas em pIII, uma cisteína em pVI, pVII e pIX; Petrenko, V.A. e Smith, G.P., Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery, 2005) . Os três eixos de simetria da molécula TBMB assegura a formação de um isómero único em termos estruturais e espaciais quando da reacção com três cisteínas num péptido. As condições de reacção para a modificação de um péptido em fago foram a seguir estabelecidas. Como parece difícil detectar o péptido quimicamente modificado no fago com as técnicas disponíveis, expressámos o péptido nGÇGSGÇGSGÇGc como uma fusão N-terminal com os dois domínios solúveis Dl e D2 da proteína minor pIII da cápside do fago e analisámos a massa molecular da proteína antes e após reacção com TBMB por espectroscopia de massa. As tentativas para ligar selectivamente as três cisteínas no péptido ao suporte mas poupar as três pontes dissulfureto nos domínios Dl e D2 de pIII (C7-C36, C46-C53, C188-C201) falharam. Isto levou-nos a tirar partido de uma proteína do gene 3 sem dissulfureto, recentemente desenvolvida por Schmidt F.X. e colaboradores (Kather, I. et al., J. Mol. Biol., 2005). 0 péptido fundido ao domínio N-terminal da proteína glll sem cisteínas foi reduzido com tris(carboxietil)fosfino (TCEP). Uma vez que se encontrou que o agente redutor reage com os grupos bromometilo do suporte TBMB, foi removido antes da adição de TBMB à proteína. A re-oxidação dos grupos tióis após remoção de TCEP pôde ser evitada através do desgaseamento do tampão de reacção e complexação dos iões metálicos com EDTA 5 mM. A reacção dos grupos tióis com TBMB em várias concentrações e a análise espectrométrica de 119 ΡΕ2257624 massa do produto revelou que a concentração de TBMB 10 μΜ é suficiente para a modificação quantitativa do péptido a 30°C numa hora. Predominantemente formou-se um produto com a massa molecular esperada (Δ massa esperada = 114 Da;
Figura 2a) . Quando D1-D2 sem dissulfureto e sem péptido fundido foi incubado com TBMB, a nossa massa não foi alterada indicando que não ocorrem reacções inespecíficas com outros aminoácidos. A adição de partículas fágicas às reacções (IO10 t.u. por mililitro) revelou que a elevada densidade das proteínas de revestimento do fago no vaso não sobrecarrega a reacção do péptido com TBMB. Inesperadamente, encontrámos que a reacção de TBMB com péptidos contendo apenas dois resíduos de cisteína (NAGGSGCGSGCGc-D1-D2) dá um produto com uma massa molecular que é consistente com a reacção do restante grupo bromometilo com a amina primária do extremo N (Figura 7a e 7b) . De forma semelhante, a reacção de TBMB com um péptido tendo uma cisteína e uma lisina (nAGSGKGSGCGc-D1-D2 ) dá uma massa molecular que é esperada quando as aminas primárias de lisina e o extremo N reagem com os restantes dois grupos bromometilo (Figura 7C e 7D) .
Em seguida, testámos se os fagos modificados com TBMB eram ainda capazes de infectar bactérias. Encontrámos que quanto mais elevadas as concentrações de TBMB menos fagos permaneceram infecciosos (Figura 2B) . Nas condições de reacção que permitem a modificação quantitativa do péptido (TBMB 10 μΜ, 30°C, reacção durante 1 hora) o número de fagos infecciosos caiu por um factor de 5. 120 ΡΕ2257624
Exemplo 2: Rastreio
Este exemplo mostra a selecção por afinidade de inibidores da calicreína do plasma humano e da catepsina G.
Esta exequibilidade de seleccionar estruturas hibridas de péptidos codificados por fagos-pequenas moléculas foi testada usando dois antigénios humanos, a calicreina e a catepsina G do plasma. Foi criada uma biblioteca de apresentação fágica de péptidos na proteina minor pIII da cápside com uma complexidade de 4,4 x 109 variantes. Os péptidos foram projectados para terem duas sequências de seis aminoácidos ao acaso flanqueados por três cisteinas (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys; Figura 3A) . Uma alanina foi adicionada ao extremo N do péptido para assegurar um processamento correcto da sequência sinal. Um elemento de ligação Gly-Gly-Ser-Gly foi colocado entre a terceira cisteina e a proteina do gene 3. Como o fago com a proteina do gene 3 sem dissulfureto tinha cerca de 100 vezes menos infecciosidade comparativamente com o fago selvagem, foram produzidas grandes quantidades de partículas fágicas. Uma cultura de 1 litro, incubada durante a noite a 30°C, deu tipicamente 1010-1012 partículas infec-ciosas. Cerca de 1012 partículas de fagos infecciosos purificadas foram quimicamente modificadas com o suporte TBMB e incubadas com as duas proteases biotiniladas. Os fagos que se ligaram foram capturados em esferas magnéticas de estreptavidina e sujeitos a mais dois ciclos de selecção. Números crescentes de fagos capturados no segundo e 121 ΡΕ2257624 terceiro ciclo de selecção indicaram que elementos de ligação específicos foram enriquecidos. A sequenciação dos péptidos revelou várias sequências de consenso numa ou em ambas as ansas (Figura 3B e 3C) . 0 DNA dos péptidos seleccionados foi amplificado por PCR de populações e inserido num plasmídeo para expressão periplasmática dos péptidos como proteina de fusão D1-D2. As proteinas de fusão com péptidos que apresentaram semelhanças de sequências com outros clones sequenciados ou que foram encontrados em múltiplas cópias, foram expressas, purificadas, modificadas quimicamente e testadas relativamente à sua actividade inibidora. Os melhores inibidores da calicreina e da catepsina G do plasma tinham um IC50 de 400 nM (PK2 e PK4) e 100 nM (CG2 e CG4) respectivamente quando testado como uma fusão D1-D2.
Exemplo 3: Rastreio
Neste exemplo, é descrita a maturação por afinidade dos inibidores de calicreina do plasma. A comparação das sequências de aminoácidos dos clones seleccionados contra calicreina de plasma humano revelou que diferentes grupos de clones tinham elevada semelhança de sequências numa das potenciais ansas de ligação. Assumimos que as moléculas bicíclicas eram predominantemente interactuantes com a ansa de ligação conservada enquanto a ansa com composições de aminoácidos diversas não evoluiu para a interacção óptima com a protease. Assim, 122 ΡΕ2257624 foram criadas novas bibliotecas fágicas com péptidos tendo uma ansa com uma sequência de uma das três regiões de consenso encontradas na selecção com calicreina do plasma e uma ansa com seis aminoácidos ao acaso (Figura 4A) . A adsorção de fagos sob elevada pressão selectiva, usando concentrações mais baixas de antigénio (1 nM a 200 pM), deu clones tendo uma sequência de consenso na segunda ansa de interacção (Figura 4B) . Os ensaios de inibição revelaram que o IC50 do melhor inibidor (PK15) foi melhorado num factor de cerca de 20 (20 nM) quando testado como uma fusão D1-D2.
Exemplo 4: Caracterização dos complexos
Estudou-se a actividade e a especificidade dos inibidores obtidos por sintese química.
Os péptidos sintéticos dos quatro melhores inibidores da calicreina de plasma humano isolados na pri meira selecção (PK2, PK4, PK6, PK13) e do melhor inibidor da selecção de maturação por afinidade (PK15) foram produzidos por síntese em fase sólida. Os péptidos foram projectados para terem uma alanina com um grupo amina livre no extremo N e uma glicina amidada no extremo C, para representar exactamente a carga e o ambiente químico dos péptidos apresentados por fagos. Encontrou-se que os péptidos sintéticos que reagiram com TBMB possuíam IC50 10 vezes mais baixos que os correspondentes péptidos de fusão D1-D2 que reagiram com TBMB (Tabela A; Figura 5) . A afinidade 123 ΡΕ2257624 mais baixa dos péptidos como fusão D1-D2 pode derivar da ligação intramolecular do péptido aos domínios da proteína do gene 3 e portanto uma concentração aparente de inibidor mais baixa. 0 Ki aparente do péptido PK15 modificado com TBMB foi calculado com a equação de Cheng e Prusoff e encontrou-se ser 1,5 nM (Cheng, Y. e Prusoff, W.H., Biochem, Pharmacol., 1973). Os IC5oS dos péptidos lineares não constrangidos foram pelo menos 250 vezes mais elevados que os dos péptidos modificados com TBMB (Tabela A):
Tabela A
Clone Sequência de aminoácidos Massa (Da) IC50 (nM) Péptido linear Péptido bicíclico Péptido linear Péptido bicíclico PK2 h-acsdrfrncplwsgtcg-nh2 1871,2 1985,3 >10000 28,6 PK4 h-acsterrycpieifpco-nh2 1942,9 2055,9 7181 33 PK6 H-ACAPWRTACYEDUyiWCG-NH2 1974,8 2088,7 5707 21,2 PK13 h-acgtgegrcrvnwtpcg-nh2 1764,8 1879,1 >10000 39,1 PK15 h-acsdrfrncpadealcg-nh2 1825 1939,4 >100000 1,7 A análise por espectrometria de massa do inibidor incubado com calicreína de plasma humano mostrou uma quebra na massa de 18 Da, sugerindo que uma ligação peptídica numa das ansas do inibidor foi hidrolisada. A actividade inibidora (IC50) do inibidor tratado com calicreína, no entanto, foi tão boa quanto a do péptido PK15 bicíclico intacto modificado com TBMB.
As especificidades dos cinco inibidores foram 124 ΡΕ2257624 testadas através de medição da actividade inibidora contra a calicreína do plasma de murganho (79% de identidade de sequência) ou contra o factor Xla homólogo de proteases serinicas humanas (partilha a identidade de sequência mais elevada com a calicreina de plasma humano dentro das proteases serinicas humanas; 63%) e trombina (36% de identidade de sequência) . Nem a calicreina do plasma de murganho nem uma das proteases homólogas do soro humano foram inibidas na concentração mais elevada testada (10 μΜ).
Exemplo 5: Utilização de entidades identificadas em Métodos do Invento
Neste exemplo, foi demonstrada a inibição da activação por contacto em plasma humano por um inibidor de calicreina de plasma humano. A calicreina de plasma humano desempenha um papel chave nos primeiros eventos na activação por contacto. A capacidade do péptido PK15 modificado com TBMB para inibir a activação por contacto foi testada medindo o prolongamento do tempo de activação da trombina em plasma humano na presença de diferentes concentrações de inibidores. A trombina é a última enzima a ser activada na cascata de activação da via de coagulação do sangue. Numa concentração de 50 nM do inibidor, o péptido PK15 modificado com TBMB retardou a formação de trombina enquanto a aprotinina, um inibidor proteico de 6 kDa da calicreina do plasma humano não teve qualquer efeito (Figura 8A e 7B). Numa concentra- 125 ΡΕ2257624 ção de inibidor tão alta quanto 5 μΜ o intervalo de tempo até à activação da trombina foi mais prolongado pela aprotinina do que pelo pequena molécula de inibidor. A aprotinina é um inibidor de espectro largo e pode inibir outras proteases na via intrínseca quando usada numa concentração elevada. Num ensaio diferente, testámos se o péptido PK15 modificado com TBMB podia suprimir a activação do factor Xlla e a calicreína do plasma em plasma humano de três dadores diferentes. A activação das duas proteases pôde ser suprimida essencialmente a 5 μΜ do péptido PK15 modificado com TBMB. Estimámos que uma concentração cerca de 30 vezes superior de aprotinina é necessária para obter o mesmo efeito de inibição (Figura 8C).
Exemplo 6: Estrutura do péptido PK15 modificado
com TBMB A conformação do péptido PK15 modificado com TBMB foi determinada por espectroscopia de 2D NMR, em solução aquosa, a pH 6,6. Os sinais de desvios químicos foram conseguidos por métodos convencionais. A análise dos espectros NOESY forneceu evidência de uma conformação de suporte definida. De salientar os desvios químicos dos três protões do anel de benzeno central que puderam ser resolvidos como resultado dos seus diferentes ambientes espaciais. As estruturas médias em solução foram calculadas usando restrições de distâncias derivadas de NOESY (Figura 6). 126 ΡΕ2257624
Sumário dos Exemplos 1 a 6
Descrevemos o invento com referência a tecnologia de apresentação fágica para codificar a fracção peptídica de estruturas moleculares pequenas não naturais (i.e. complexos de acordo com o presente invento). A codificação genética permite a geração, selecção e amplificação fáceis de reportórios combinatórios muito grandes. Uma dificuldade importante desta abordagem foi ligar reportórios de pépti-dos codificados por fagos a um núcleo molecular pequeno. Desenvolvemos uma estratégia de síntese conveniente e estabelecemos condições de reacção óptimas numa série de experiências. As concentrações de reagentes, composição do solvente e temperatura de reacção tiveram de ser escolhidas cuidadosamente para ligar especificamente péptidos lineares no fago a pequenas moléculas poupando simultaneamente nas partículas fágicas. Um fago específico com proteínas do gene 3 sem dissfulfureto foi usado para ajudar a evitar a geração de misturas de produtos, através da reacção da moléula pequena com resíduos de cisteína da cápside fágica.
Escolhemos calicreína de plasma humano e cate-psina G como alvos para testar a eficiência das técnicas de selecção in vitro do invento. As moléculas com afinidades na gama de nanomolar foram isoladas contra ambos os alvos e confirmado que a estratégia de selecção proposta e o desenho da molécula podem dar elementos de ligação de afinidade elevada. Quando da avaliação da especificidade dos inibidores de calicreína do plasma humano, encontrámos 127 ΡΕ2257624 que nem a calicreína do plasma de murganho nem as proteases homólogas do plasma humano, como seja o factor Xla ou a trombina, foram inibidas. Este resultado foi agradável uma vez que a geração de inibidores específicos de baixo peso molecular contra calicreina de plasma humana (Young, W. B. et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2006) e contra outras proteases serinicas humanas não é frequente (revisto em Abbenante, G. and Fairlie. D. P., Medicinal Chemistry, 2005 and Turk, B., Nature Rev. Drug Discovery, 2006). O acesso das estruturas moleculares pequenas à sintese quimica permite a substituição de aminoácidos específicos com blocos de construção não naturais e portanto a melhoria da afinidade dos inibidores. A determinação da estrutura de um dos inibidores de calicreina do plasma por NMR em solução sugere que a molécula possui uma conformação de suporte definida. Conforme antecipado, o anel de benzeno hidrofóbico forma o núcleo da molécula. No entanto, nenhuma das cadeias laterais dos aminoácidos se empilhou densamente com o anel de benzeno para esta combinação particular de polipéptido simples-composto de conjugação. Suportes alternativos com estruturas quimicas que oferecem mais possibilidades de interagir com o suporte peptídico ou cadeias laterais de aminoácidos podem vantajosamente ser usados para obter um empilhamento mais denso da fracção peptídica caso se pretenda. Os átomos de hidrogénio do suporte de 1,3,5-tris-(bromometil)-benzeno nas posições 2, 4 e 6 do anel poderão, por exemplo, ser substituídos por três substituintes químicos idênticos. 128 ΡΕ2257624
Nas selecções aqui apresentadas, usámos um desenho de molécula em que um péptido é ligado através de três ligações a um suporte molecular pequeno para obter uma estrutura peptídica biciclica. Certamente, a criação de arquitecturas moleculares alternativas em que as ansas peptidicas são clivadas por protéases antes da selecção para obter pequenas moléculas com grupos peptidicos discretos pode também ser usado em realizações de selecção/ras-treio. De facto, as estruturas com dois grupos peptidicos discretos foram geradas neste trabalho quando o inibidor PK15 modificado com TBMB foi clivado por calicreína do plasma humano quando da incubação com a enzima. Encontrou-se que a molécula digerida num único local possuía uma actividade inibidora tão boa quanto a forma não hidro-lisada. A clivagem da ansa peptídica também oferece a possibilidade de ligar estruturas químicas adicionais aos extremos amina e carboxilo nascentes através de outras reacções químicas.
Avaliámos o potencial terapêutico do inibidor da calicreína de plasma humano desenvolvido testando a sua capacidade para inibir a activação por contacto em plasma humano. Em cirurgia cardíaca envolvendo "bypass" cardio-pulmonar (CPB), o contacto do sangue com a superfície artificial na máquina CPB e tubagem activa as múltiplas vias de proteases do plasma. Podem resultar graves complicações, incluindo o síndrome de resposta inflamatória sistémica (SIRS), todo um estado inflamatório de todo o 129 ΡΕ2257624 corpo que pode comprometer a função do coração e dos pulmões em doentes (Miller, B. E. et al., J. of Cardio-thoracic and Vascular Anesthesia, 1997) . A calicreína do plasma desempenha um papel chave nos primeiros eventos da activação por contacto e na amplificação de outras vias de proteases, tais como os sistemas fibrinolíticos e do complemento. Uma estratégia comum para suprimir a activação por contacto durante a cirurgia cardíaca é bloquear a actividade de calicreína do plasma com aprotinina, um inibidor de proteases de largo espectro de 6 kDa derivado de tecido pulmonar bovino. 0 inibidor liga-se a calicreína do plasma com um Ki de 30 nM e assim interrompe a via de coagulação intrínseca, através da supressão da activação do factor XII. Ainda, a inibição de calicreína do plasma diminui a conversão do plasminogénio em plasmina e portanto reduz a fibrinólise e hemorragia associada. A aprotinina é também um inibidor directo da plasmina (Ki = 3 nM) . Pensa-se que a inibição directa da plasmina seja o principal mecanismo dos efeitos antifibrinolíticos conducentes a redução da perda de sangue e reduza a necessidade de transfusão. O fármaco também possui efeitos adversos tais como anafilaxia e toxicidade renal (revisto em Mahdy A. M. and Webster N. R., Br. J. Anaesth., 2004). Um inibidor alternativo da calicreína do plasma baseado no suporte do domínio kunitz humano (6 kDa) foi recentemente desenvolvido (Markland, W, et al., Biochemistry, 1996). O fármaco possui uma afinidade (Ki = 30 pM) e especificidade significativamente mais elevadas para calicreína do plasma e espera-se que seja menos imunogénico devido ao seu suporte humano. Está actualmente a ser testado em ensaios clínicos de fase 130 ΡΕ2257624 2 (Dyax Corp., www.dyax.com). Mesmo assim o nosso inibidor candidato a fármaco agora desenvolvido possui uma afinidade cerca de 50 vezes mais baixa para a calicreina do plasma humano que o produto inibidor baseado no domínio kunitz e provou suprimir eficazmente a activação por contacto ex vivo. 0 seu pequeno tamanho (2 kDa) permite não só uma síntese química fácil como também, vantajosamente, minimiza o risco de uma reacção imunogénica e torna o composto um inibidor atraente para desenvolvimento a usar em operações CPB.
Exemplo 7: Interacções não covalentes 0 composto de conjugação do invento proporciona ainda a vantagem de influenciar/estabilizar ou impor restrições conformacionais no polipéptido alvo devido a ligações não covalentes formadas entre o composto de conjugação e o polipéptido alvo. Vantajosamente, estas são proporcionadas para além das ligações covalentes entre o composto de conjugação e o polipéptido alvo.
Deve-se notar que tal ligação e restrições não foram proporcionadas em técnicas anteriores tais como ligação cruzada. Primeiro, os agentes de ligação cruzada são tipicamente demasiado pequenos e/ou demasiado flexíveis para conferir restrição conformacional. Segundo, no exemplo específico de reacção cruzada conhecido e atrás discutido (e.g. Roberts US2003/0236852A1) o elemento de ligação bivalente é pequeno (propilo) e altamente flexível propositadamente e não existe evidência que este produza quais- 131 ΡΕ2257624 quer interacções não covalentes ou imponha qualquer restrição conformacional para além da ligação dos dois residuos dentro do polipéptido. Em qualquer dos casos, este elemento de ligação cruzada anteriormente usado é apenas bivalente.
Neste exemplo demonstramos que é possível a ligação não covalente vantajosa entre o composto de conjugação e o polipéptido alvo do invento. A estrutura de um inibidor de calicreína de plasma humano gerado com o método do invento (ver exemplos atrás) foi resolvida por NMR. Na estrutura proposta, vários átomos de carbono do polipéptido estão em estreita proximidade (<4 angstrom) com os átomos de carbono do composto de conjugação. Isto sugere que as interacções não covalentes estão presentes, neste exemplo interacções hidrofóbicas, entre o núcleo central e o polipéptido do invento.
Estas interacções são:
Ser3 CB Rng C2 6 3, 62 Â Ser3 CB Rng C2 4,0 Â Ser3 CB Rng CMe2 3, 63 Â Cys2 CB Rng CMe2 2,56 Â Cys9 CB Rng C29 3, 13 Â Cys 9 CB Rng C9 3,32 Â Prol0 CG - Rng CMe9 3, 8 Â Prol0 CD - Rng CMe9 3, 13 Â Cysl6 CB - Rng Cl 6 3,43 Â Cysl6 CB - Rng C26 3,79 Â 132 ΡΕ2257624
Ainda, as interacções hidrogénio-hidrogénio entre átomos de hidrogénio do polipéptido e átomos de hidrogénio do composto de conjugação foram detectadas por espectros-copia 1H-NMR NOESY.
Assim, são demonstradas múltiplas classes de interacção não covalente entre o composto de conjugação e o polipéptido alvo do invento. Estas vantajosamente proporcionam ainda restrição conformacional aos polipéptidos do invento.
Exemplo 8: Bibliotecas quimicas combinatórias codificadas por fagos
Visão global
Anteriormente demonstrou-se que a tecnologia de apresentação fágica é eficaz na preparação de anticorpos terapêuticos a partir de bibliotecas combinatórias, mas difícil de aplicar na preparação de fármacos moleculares pequenos. Aqui descrevemos uma estratégia fágica para a selecção de simulações dos compostos macrociclicos produzidos pelas sintetases de péptidos não ribossomais. Os reportórios peptidicos foram projectados com três resíduos de cisteína reactivos, cada um deles espaçado por vários resíduos de aminoácidos ao acaso e fundidos com a proteína do gene 3 fágica. A conjugação com o composto de conjugação 133 ΡΕ2257624 (neste exemplo tris-(bromometil)benzeno) através das cisternas reactivas gerou reportórios dos conjugados peptí-dicos com duas ansas peptídicas ancoradas a um núcleo de mesitileno. As selecções de afinidade iterativa deram vários inibidores de enzimas; após mutagénese e selecção, isolámos um inibidor candidato (PK15) (Ki = 1,5 nM) específico da calicreína do plasma humano que, eficazmente, interrompe a via de coagulação intrínseca em plasma humano testado ex vivo. Assim, demonstrámos que esta abordagem proporciona um meio poderoso de gerar e rastrear tais simulações macrocíclicas.
Fundamento A descoberta de novos ligandos para alvos rece-ptores, enzimas e ácidos nucleicos representa a primeira fase no desenvolvimento de fármacos terapêuticos. Para fármacos baseados em ligandos orgânicos pequenos, o ras-treio de elevado número de amostras (HTS) proporcionou uma estratégia popular; grandes bibliotecas de compostos foram sintetizadas (ou adquiridas) e cada um dos compostos testado relativamente à ligação aos alvos. Com a utilização de robots é possível rastrear 105-106 compostos por dia, mas os candidatos geralmente requerem mais química para melhorar a sua afinidade de ligação e especificidade do alvo1,2. Para fármacos baseados em ácidos nucleicos, péptidos ou proteínas, os métodos de selecção biológicos oferecem uma estratégia alternativa. Estes métodos (tais como tecnologias de apresentação fágica, apresentação ribossó- 134 ΡΕ2257624 mica, apresentação por mRNA ou aptâmeros de RNA/DNA) baseiam-se em (a) criação de uma biblioteca diversa em que o fenótipo (ligação ao alvo) de cada membro da biblioteca está ligado ao seu genótipo (o DNA ou RNA codificador) e (b) um ciclo interactivo em que os membros da biblioteca são seleccionados relativamente à ligação ao alvo e depois amplificados (por replicação numa célula hospedeira ou copiando o ácido nucleico codificado in vitro). Em cada ciclo de selecção os elementos de ligação são assim enriquecidos relativamente aos elementos de não ligação. Bibliotecas muito grandes (109-1013 membros) podem ser eficientemente testadas através de alguns ciclos de selecção e os candidatos podem ser refinados por mutação e posterior selecção3. A abordagem é muito poderosa e tem sido usada para criar anticorpos terapêuticos tais como Hurnira™4'5. Foram feitas várias tentativas para desenvolver métodos de selecção para o isolamento de pequenos ligandos orgânicos. Tipicamente, o DNA é usado como uma marca que pode ser facilmente sintetizada, sequenciada, amplificada e/ou hibri-dada. Por exemplo, pequenas moléculas podem ser cada uma conjugada com uma marca de DNA único6 (ou bacteriófago7) e os conjugados misturados para criar uma biblioteca de pequenas moléculas marcadas. Após selecção da biblioteca contra o alvo, as moléculas pequenas candidatas podem ser identificadas pelas sequências das suas marcas (amplificadas) . Como alternativa, as marcas de DNA podem ser introduzidas durante a sintese de bibliotecas combinatórias químicas. Por exemplo, pequenas moléculas e uma marca correspondente são sintetizadas em paralelo na mesma 135 ΡΕ2257624 esfera8, ou a hibridação da marca é usada para orientar a via de síntese química9. A partir de tais bibliotecas, a via de síntese (e assim a estrutura) dos candidatos seleccionados pode ser deduzida a partir da sequência da marca. Não esquecendo a sua ingenuidade, estes métodos sofrem de uma desvantagem comum; a pequena molécula é ligada à marca de DNA apenas durante o primeiro ciclo de selecção, tornando os ciclos iterativos impossíveis (e limitando a aplicação a pequenas bibliotecas) . Assim, os trabalhos anteriores apresentam numerosas dificuldades.
Neste exemplo, demonstramos que o invento pode ser usado para modificar quimicamente péptidos no fago durante o processo de selecção10'11 para criar simulações de composto peptídicos macrocíclicos. Recentemente foram descritos métodos para ligar péptidos através de cadeias laterais reactivas (e.g. cisternas) aos grupos funcionais de um suporte orgânico12, e gerando assim conjugados de péptidos policíclicos compreendendo um núcleo orgânico decorado com ansas peptídicas. Uma vez que as estruturas são reminiscentes dos fármacos peptídicos macrocíclicos, explorámos a possibilidade de criar e seleccionar bibliotecas de tais conjugados em fagos filamentosos (Fig. 9A) . Enquanto os macrocíclicos peptídicos são normalmente preparados in vivo por sintetases de péptidos não ribosso-mais13'14, a nossa estratégia usa síntese ribossomal in vivo seguida de conjugação química ex vivo. 136 ΡΕ2257624
Resultados
Conjugação do suporte orgânico com os péptidos apresentados em fagos
Usámos o pequeno composto orgânico tris-(bromome-til)benzeno (TBMB) como um suporte (composto de conjugação) para ancorar péptidos contendo três resíduos de cisteí-na12,15 (Fig. 9a) . A reacção ocorre em solventes aquosos à temperatura ambiente e os três eixos de simetria da molécula TBMB assegura a formação de um isómero estrutural e espacialmente único.
Determinámos primeiro as condições de reacção para conjugação do péptido NGCGSGCGSGCGc fundido com os domínios solúveis D1-D2 do fago pIII, análise da massa molecular dos produtos por espectroscopia de massa. No entanto, fomos incapazes de selectivamente conjugar os três resíduos de cisteína do péptido com TBMB poupando ao mesmo tempo as pontes dissulfureto de Dl e D2 (C7-C36, C46-C53, C188-C201). Isto levou-nos a tirar partido de uma proteína do gene 3 sem pontes dissulfureto recentemente desenvolvida por Schmidt F.X. e colaboradores16. A proteína de fusão péptido-Dl-D2 (sem dissulfuretos) foi reduzida com tris-(carboxietil)fosfino (TCEP), o TCEP foi removido e adicionado TBMB. Uma concentração de TBMB 10 μΜ foi suficiente para a reacção quantitativa com a proteína de fusão com péptido a 30°C numa hora, dando predominantemente um produto com a massa molecular esperada (Δ massa esperada = 137 ΡΕ2257624 114 Da; Fig. 10a). Não foi detectado produto com a proteína D1-D2 (sem dissulfuretos). Inesperadamente, encontrámos que a reacção de TBMB com as fusões péptido-Dl-D2 (sem dissulfureto), contendo apenas dois resíduos de cisteína (nAGSGCGSGCGc-D1-D2) , deu um produto com uma massa molecular consistente com a reacção de ambas as cisteínas e do grupo α-amino no extremo N do péptido (Fig. 15a e 15b). De forma semelhante, a reacção de TBMB com fusões péptido-D1-D2 (sem dissulfureto) tendo uma cisteína e uma lisina (nAGSGKGSGCGc-D1-D2) deu uma massa molecular consistente com a reacção da cisteína, o grupo α-amina do extremo N e o grupo ε-amina da lisina (Fig. 15c e 15d) . Tendo identificado condições adequadas, reagimos TBMB com o fago (p3 sem dissulfureto) portador do péptido nGCGSGCGSGCGc. Isto conduziu a uma perda pequena (5 vezes) da infecciosidade do fago (Fig. 10b).
Criação da biblioteca de péptidos policíclicos e selecção por afinidade
Desenhámos uma biblioteca de péptidos compreendendo duas sequências de seis aminoácidos ao acaso flanqueados por três cisteínas (Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys; Fig. 11a) para apresentação no fago (p3 sem dissulfureto) . Um resíduo de alanina foi adicionado ao extremo N do péptido para assegurar um processamento correcto da sequência sinal. Um elemento de ligação Gly-Gly-Ser-Gly foi colocado entre a terceira cisteína e a proteína do gene 3. Como o fago (p3 sem dissulfureto) tinha uma infecciosidade reduzi- 138 ΡΕ2257624 da em 100 vezes comparativamente com o fago selvagem, foram produzidas grandes quantidades de particulas fágicas a partir da biblioteca (estimou-se 4,4 x 109 variantes). Um litro de cultura incubado durante a noite a 30°C deu, tipicamente, 1011-1012 particulas infecciosas.
Testámos a biblioteca de péptidos policiclicos relativamente à ligação e inibição das proteases humanas calicreina do plasma e catepsina G. Cerca de 1012 particulas fágicas infecciosas purificadas foram modificadas quimicamente com TBMB e depois incubadas com as proteínas alvo biotiniladas. Após captura em esferas magnéticas de estreptavidina ou avidina, os fagos enriquecidos foram tratados com mais dois ciclos de selecção, cada ciclo compreendendo a amplificação (por infecção bacteriana), a conjugação química e a captura com alvos biotiniladsos. O título dos fagos aumentou após os segundo e terceiro ciclos, sugerindo o enriquecimento em elementos de ligação específicos. O DNA codificador dos péptidos foi amplificado por PCR a partir da população seleccionada de fagos do terceiro ciclo e reclonado para expressão periplasmática como proteínas de fusão péptido-Dl-D2 (D1-D2 sem dissul-fureto) e sequenciado. Isto revelou sequências de consenso numa ou em ambas as ansas peptídicas (Fig. 11b e 11c) e várias foram expressas, purificadas, conjugadas com TBMB e testado relativamente à sua actividade inibidora de proteases. Os melhores inibidores de calicreina do plasma e de catepsina G tinham um IC50 de 400 nM (PK2 e PK4) e 100 nM (CG2 e CG4) respectivamente, e foram testadas como uma 139 ΡΕ2257624 fusão D1-D2. Uma vez que rastreámos os clones de fagos seleccionados relativamente à inibição (em vez da ligação) não podemos estabelecer se também foram seleccionadas moléculas que se ligam a proteases mas não as inibem. No entanto, o facto de a grande maioria dos clones testados após a selecção de fagos apresentar actividades inibidoras sugere que foram seleccionados predominantemente inibi-dores.
Maturaçao por afinidade de inibidores da cali-creina de plasma humano. A maior parte das sequências dos elementos de ligação a calicreina revelaram sequências de consenso numa ou noutra das ansas peptidicas. Três novas bibliotecas foram criadas com uma das três regiões de consenso numa ansa e seis aminoácidos ao acaso na outra ansa (Fig. 12a). As bibliotecas foram misturadas e os fagos adsorvidos em condições restringentes (1 nM a 200 pM de calicreina bio-tinilada) . A sequência ao acaso convergiu para um novo consenso, dando clones com sequências de consenso em ambas as ansas (Fig. 12b). Os ensaios de inibição revelaram que o IC5o do melhor inibidor (PK15) foi 20 nM quando testado como uma fusão D1-D2.
Actividade e especificidade de inibidores sintetizados quimicamente Péptidos sintéticos correspondentes a quatro 140 ΡΕ2257624 inibidores de calicreína da selecção primária (PK2, PK4, PK6 e PK13) e o melhor inibidor da selecção de maturação por afinidade (PK15) foram produzidos por sintese química em fase sólida. Os péptidos tinham um resíduo de alanina no extremo N e uma glicina amidada no extremo C para representar a carga e o ambiente químico dos péptidos apresentados por fagos. Os péptidos sintéticos conjugados com TBMB foram pelo menos 250 vezes mais potentes como inibidores da actividade de calicreína que os péptidos não conjugados (Tabela 1).
Tabela 1- Inibidores peptídicos sintetizados quimicamente. Estão apresentadas sequências de aminoácidos de cinco inibidores da calicreína do plasma (17-meros). As sequências dos péptidos sintéticos derivam dos clones PK2, PK4, PK6, PK13 (isolados em selecções de fagos usando a biblioteca 1) e do clone PK15 (um clone maturado por afinidade isolado a partir da biblioteca 2). Estão indicadas as massas moleculares e as actividades inibidoras, antes e após a modificação dos péptidos com TBMB. Clone Sequência de aminoácidos Massa (Da) IC50 (nM) Péptido linear Péptido biciclico Péptido linear Péptido biciclico PK2 h-acsdrfpncplwsgtcg-nh2 1871,2 1985,3 >10000 28,6 PK4 H-ACSTERRYCPIEIFPCO-NH2 1942,9 2055,9 7181 33 PK6 H-ACAPWRTACYEDIMftTCG-NHz 1974,8 2088,7 5707 21,2 PK13 H-ACGTGEGRCRVNWTPCG-NHz 1764,8 1879,1 >10000 39,1 PK15 h-acsdrffncpadealcg-nh2 1825 1939,4 >100000 1,7 141 ΡΕ2257624
Eles mostraram ser inibidores mais potentes que os conjugados péptido-Dl-D2 por um factor de mais de dez (Tabela 1; Fig. 13); presumivelmente isto é devido à ligação do grupo peptídico conjugado ao grupo D1-D2. A constante de inibição aparente (Ki) do conjugado peptidico PK15 (Fig. 9b) foi calculada como sendo 1,5 nM usando a equação de Cheng e Prusoff17. A incubação do conjugado PK15 com calicreina conduz à hidrólise de uma ligação peptídica após incubação prolongada (90% de clivagem após 24 h a 37°C), como se mostra pelo aumento de massa de 18 Da, mas as actividades inibidores das amostras clivadas e não clivadas mostraram-se semelhantes (IC50 2,2 nM e 1,6 nM, respectivamente).
Os cinco inibidores foram igualmente testados contra calicreina de plasma de murganho (79% de identidade de sequências) ou contra o homólogo de proteases serinicas factor Xla (63% de identidade de sequências) e trombina (36% de identidade de sequências). Nenhum inibiu estas enzimas na concentração mais elevada testada (10 μΜ). A interrupção da via de coagulação intrínseca pelo inibidor da calicreina do plasma humano A calicreina do plasma humano desempenha um papel chave nos primeiros eventos da via de coagulação intrínseca através da conversão do factor XII no factor Xlla que, depois, actua sobre a protease seguinte da via. Testámos se PK15 conjugado poderia inibir a activação do factor Xlla em 142 ΡΕ2257624 amostras de plasma humano. A via foi induzida com caulino e a actividade do factor Xlla foi medida com um substrato colorimétrico. A actividade de Xlla foi metade na presença do conjugado PK15 160 nM (Fig. 16). Por comparação, 5 μΜ de aprotinina, um inibidor bovino de proteases serinicas de 6 kDa também usado clinicamente como um inibidor da calicreí-na do plasma (Ki = 30 nM) , foi necessário para o mesmo efeito.
Determinação da estrutura do péptido PK15 modificado com TBMB
Os espectros 2D ΧΗ NMR do conjugado PK15 foram registados e foi possível um alinhamento específico da sequência dos desvios químicos dos espectros TOCSY e NOESY. Uma conformação do inibidor, calculada nas restrições de distâncias derivadas de NOESY, está apresentada na Figura 14. As duas ansas peptídicas estão arranjadas à volta do núcleo de mesitileno ao qual estão covalentemente ligados nas não interagem uma com a outra. As ansas não se empilham densamente contra o núcleo central, mas vários átomos de carbono do polipéptido (Cys 9 CB, Cysl6 CA, Gly 17 CA) estão dentro de 4Â do núcleo molecular sugerindo que podem existir algumas interacções hidrofóbicas.
Discussão do Exemplo 8
Demonstrámos como a reacção de tris-(bromometil)-benzeno (TBMB) 12 com bibliotecas de péptidos ricos em 143 ΡΕ2257624 cisteína apresentados em bacteriófagos filamentosos gera conjugados (complexos de acordo com o presente invento) susceptiveis de selecção iterativa. Foi um desafio conjugar o péptido apresentado poupando ao mesmo tempo o fago e tivemos de variar as concentrações do reagente, composição do solvente e temperatura de reacção e também usámos fagos sem dissulfitos na proteína do gene 3. A partir de uma biblioteca de >109 membros e selecções iterativas conseguimos isolar inibidores da calicreína de plasma humano (<2000 Da) . O nosso candidato promissor (PK15) com Ki = 1,5 nM interrompeu eficazmente a via de coagulação intrínseca em plasma humano testado ex vivo e foi altamente específico: não inibe a calicreína de plasma de murganho ou as proteases homólogas do plasma humano factor Xla e trombina. O nosso reportório foi construído a partir de 17 resíduos com três cisteínas, cada um espaçado em seis aminoácidos ao acaso. Após conjugação com TBMB espera-se que os péptidos formem duas ansas de seis resíduos ligadas a um núcleo de mesitileno, como de facto confirmado pela estrutura do inibidor da calicreína PK15 resolvida por NMR (Fig. 14). Tais péptidos policíclicos deverão ter vantagens relativamente a péptidos ligados por dissulfureto e lineares. As vantagens dos péptidos policíclicos relativamente aos péptidos ligados por dissulfureto são que as ligações covalentes carbono-enxofre uma vez formadas são inertes a alteração18 e são igualmente estáveis nos ambientes redutores18. A vantagem dos péptidos policíclicos, relativamente aos péptidos lineares, é que estão ligados de forma cruzada 144 ΡΕ2257624 e mais restringidos. Isto tem duas consequências principais: (a) espera-se que os péptidos restringidos se liguem mais ligeiramente aos alvos (devido à menor perda de entropia conformacional). A nossa revisão da literatura dos inibidores de péptidos isolados por apresentação fágica mostra que a maioria contém dissulfuretos e possuem constantes de inbição na gama de micromolar (Tabela 3).
Tabela 3: Péptidos inibidores seleccionados por fagos. Estão indicadas as sequências dos péptidos, os alvos das enzimas e as afinidades de ligação. Os resíduos de cisteína que formam pontes dissulfureto estão sublinhados.
Alvo Antigénio específico da próstata (PSA) Calicreína humana 2 Activador do plasminogénio tipo urocinase (uPA) Activador do plasminogénio tipo urocinase (uPA) Quimotripsina TF-fVII Enzima conversora da angiotensina (ACE2) ErbB-2 Urease Lípase pancreática Beta-lactamase DNase II
Afinidade Referência KD = 2,9 pM 1 IC50 = 3,4 pM 2 Ki = 6,7 pM 3 Ki = 0,4 pM 4 K± = 0,4 pM 5 IC50 = 1,5 nM 6 K± = 2,8 nM 7 K± = 30 pM 8 IC50 = 30 pM 9 IC50 = 16 pM 10 IC50 = 9 pM 11 Ki = 0,2 pM 12
Sequência peptídica CVAYCIEHHCWTC SRFKVWWAAF CSWRGLENHRMC CPAYSRYLDC CCFSWRCRC EEWEVICWTWETCER GDY SHCS PLRYYPWWKCTYPDP KCCYSL YDFYWW CQPHPGQTC CVHSPNREC CIItLIbWFLWAC _
Apenas dois inibidores peptídicos foram tão po- 145 ΡΕ2257624 tentes quanto PK15; ambos continham uma ligação dissulfu-reto e pelo menos dois resíduos de triptofano19,20. Isto sugere que a conformação restringida e a possibilidade de interacções hidrofóbicas são chaves para estas elevadas afinidades; (b) Os péptidos restringidos (e ligados de forma cruzada) deverão também ser mais resistentes à clivagem e/ou inactivação que os péptidos lineares. De facto, no nosso trabalho, o inibidor PK15 foi clivado numa das ansas após incubação prolongada com calicreína de plasma humano, mas manteve-se intacto e activo.
Os conjugados policíclicos são susceptíveis de manipulação genética e química. A massa molecular de PK15 (1939,4 Da) é superior e vários fármacos peptídicos macro-cíclicos (Tabela 2) mas será impossível usar ansas peptí-dicas mais pequenas. Por exemplo, através da alteração do espaçamento das cisteínas, o comprimento da ansa varia facilmente ou mesmo segmentos extra adicionados aos extremos.
Tabela 2 - Comparação do tamanho de fármacos macrocíclicos
Nome Tamanho(s) dos anéis Massa molecular Aplicação (Da) Actinomicina 16, 16 1255,42 Anticancro Amfotericina B 38 924,08 Antifúngica Azitromicina 15 748,88 Antibiótico Caspofungina 21 1093,31 Antifúngica Ciclosporina 32 1202,61 Imunossupressão Daptomicina 31 1619,71 Antibiótico 146 ΡΕ2257624 (continuação)
Nome Tamanho(s) dos anéis Massa molecular Aplicação (Da) Eritromicina 14 733,93 Antibiótico Ixabepilona 16 506,70 Anticancro Ocreótido 20 1019,24 Hormona oxitoxina 20 1007,19 Hormona Polimixina B 23 1301,56 Antibiótico Rapamizina 29 914,17 Imunossupressão Rifabutina 27 847,01 Antibiótico Vancomicina 16, 16, 12 1449,30 Antibiótico
Outras variações poderão incluir mutagénese das ansas (tal como com a maturação por afinidade de PK15) ; clivagem proteolitica numa ou em ambas as ansas para gerar segmentos peptidicos "ramificados" nas cisteínas; conjugação quimica com o extremo do péptido nascente após clivagem da ansa21; ou a utilização de vários núcleos orgânicos. Por exemplo, um núcleo orgânico maior, ou um com mais grupos funcionais, poderá interagir mais extensivamente com as ansas ou com o alvo, e poderá também ser usado para introduzir funções totalmente novas tais como fluorescência. Se estas operações forem realizadas no conjugado apresentado em fagos, as variações poderão ser seleccioná-veis por um processo iterativo. Uma vez que os conjugados peptidicos são também susceptíveis de síntese química, outras variações (tais como a substituição por aminoácidos não naturais) poderão ser introduzidas sinteticamente. 147 ΡΕ2257624
Os inibidores da calicreína de plasma humano estão a ser desenvolvidos em termos clínicos para o tratamento de angiodema hereditário e na cirurgia de "bypass" coronário, mas mostrou-se difícil fazer moléculas pequenas que sejam específicas da calicreína (revisto em 22,23). 0 facto de termos tão facilmente obtido um inibidor de elevada afinidade e altamente específico, por selecção iterativa de conjugados peptídicos policíclicos em fagos, prevê um bom futuro para esta estratégia.
Materiais e métodos
Modificação química dos reportórios peptídicos com TBMB em fagos
As bibliotecas fágicas de péptidos que são baseadas no plasmídeo fdg3p0ss2116 foram clonadas e produzidas como descrito abaixo. Tipicamente 10u-1012 t.u. de fagos purificados com PEG foram reduzidos em 20 ml de NH4HCO3 20 mM, pH 8 com TCEP 1 mM a 42°C durante 1 h. Os fagos foram centrifugados a 4000 rpm num filtro Vivaspin-20 (MWCO de 10000) para reduzir o volume do tampão de redução para 1 ml e lavados duas vezes com 10 ml de tampão de reacção arrefecido em gelo (NH4HCO3 20 mM, EDTA 5 mM, pH 8) . O volume dos fagos reduzidos foi ajustado a 32 ml com tampão de reacção e 8 ml de TBMB 50 μΜ em ACN foram adicionados para se obter uma concentração final de TBMB de 10 μΜ. A reacção foi incubada a 30°C, durante 1 h, antes do 148 ΡΕ2257624 TBMB que não reagiu ser removido por precipitação dos fagos com 1/5 do volume de PEG a 20%, NaCl 2,5 M, em gelo, e centrifugação a 40000 rpm durante 30 minutos.
Selecções de fagos com calicreína de plasma humano e catepsina G
Calicreína de plasma humano e catepsina G bio-tiniladas (5 a 20 yg: o protocolo usado para a biotinilação pode ser encontrado abaixo) foram bloqueados por incubação em 0,5 ml de tampão de lavagem Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mm, MgCl2 10 mM, CaCl2 1 mM) contendo 1% BSA e 0,1% Tween 20, durante 30 minutos. Os fagos modificados quimicamente (tipicamente 101°-1011 t.u. dissolvidos em 2 ml de tampão de lavagem) foram bloqueados pela adição de 1 ml de tampão de lavagem contendo 3% BSA e 0,3% Tween 20 e incubação durante 30 minutos. 3 ml de fagos bloqueados foram pipetados para 0,5 ml de antigénio bloqueado e incubados durante 30 minutos numa roda giratória à TA. 50 μΐ de esferas magnéticas com estreptavidina (Dynal, M-280 da Invitrogen, Paisley, UK) foram bloqueadas por incubação em 0,5 ml de tampão de lavagem contendo 1% BSA e 0,1% Tween 20 durante 30 minutos. As esferas bloqueadas foram adicionadas à mistura de fagos/antigénio e incubadas durante 5 minutos à TA numa roda giratória. As esferas foram lavadas 8 vezes com tampão de lavagem contendo 0,1% Tween 2 0 e duas vezes com tampão de lavagem, antes da incubação com 100 μΐ de glicina 50 μΜ, pH 2,2 durante 5 minutos. Os fagos eluídos foram transferidos para 50 μΐ de 149 ΡΕ2257624
Tris-HCl 1 Μ, pH 8 para neutralização, incubados com 50 ml de células TG1 a D06oo = 0,4, durante 90 minutos, a 37°C e as células foram semeadas em grandes placas de 2YT/cloranfenicol. Dois ciclos adicionais de adsorção foram realizados usando os mesmos procedimentos. No segundo ciclo de selecção, esferas revestidas com neutravidina foram usadas para evitar o enriquecimento em péptidos específicos de estreptavidina. As esferas de neutravidina foram preparadas por reacção de 0,8 mg de neutravidina (Pierce, Rockford, IL, USA) com 0,5 ml de esferas magnéticas activadas com tosilo (Dynal, M-280 da Invitrogen, Paiseley, UK) de acordo com as instruções do fabricante.
Rastreio de clones seleccionados relativamente à actividade inibidora
Os genes que codificam os péptidos seleccionados no segundo e terceiro ciclo de bioadsorção foram clonados num vector baseado em pUC119 para expressão das proteínas de fusão péptido-Dl-D2 (proteína D1-D2 sem dissulfureto; os procedimentos de clonagem e expressão estão descritos abaixo). Os grupos sulfidrilo oxidados dos péptidos foram reduzidos por incubação da proteína (1-10 μΜ) com TCEP 1 mM em NH4HCO3 20 mM, pH 8 a 42°C, durante 1 h. O agente redutor foi removido por cromatografia de exclusão com uma coluna PD-10 (Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden) usando tampão NH4HCO3 20 mM, EDTA 5 mM, pH 8. Os grupos tiol das proteínas reagiram por incubação com TBMB 10 μΜ em tampão de reacção (NH4HCO3 20 mM, EDTA 5 mM, pH 8, 20% ACN) a 30°C 150 ΡΕ2257624 durante 1 h. Para remoção do TBMB que não reagiu e concentração, a proteína foi filtrada com um microcon YM-30 (Millipore, Bedford, MA) . As concentrações dos produtos foram determinadas medindo a aborsão óptica a 280 nm. O IC50 foi medido através da incubação de várias concentrações das proteínas de fusão com péptido modificado (diluições de 2 vezes) com calicreína de plasma humano (0,1 nM) ou catpesina G (20 nM) e determinada a actividade residual em Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mm, MgCl2 10 mM, CaCl2 1 mM, 0,1% BSA, 0,01 Triton-X-100. A actividade de calicreína do plasma humano foi medida com o substrato fluorogénico Z-Phe-Arg-AMC (Bachem, Bubendorf, Switzerland) numa concentração de 100 μΜ, num leitor de fluorescência de placas Spectramax Gemini (excitação a 355 nm, registo da emissão a 460 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). A actividade de catepsina G humana foi medida com o substrato colorimétrico N-Suc-Ala-Ala-Phe-Pro-pNA (Bachem, Bubendorf, Switzerland) numa concentração de 1 mM com um leitor de placas de absorção Spectromax (registando a 410 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Síntese química de péptidos bicíclicos
Os péptidos com uma amina livre no extremo B e uma amida no extremo C foram sintetizados quimicamente numa escala de 25 mg por química de fase sólida (JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany). Os péptidos brutos em 1 ml de 7 0% NH4HCO3, pH 8 e 30% ACN (1 mM) reagiram com TBMB (1,2 mM) durante 1 h à TA. O produto de reacção foi purifi- 151 ΡΕ2257624 cado por cromatografia líquida de alta resolução em fase reversa (HPLC) usando uma coluna C18 e eluição com gradiente com uma fase móvel composta por ACN e solução a 0,1% de ácido trifluoroacético aquoso (TFA), a um fluxo de 2ml/min. Os péptidos purificados foram liofilizados e dissolvidos em DMSO ou num tampão de Tris-HCl 50 mM pH 7,8, NaCl 150 mM para medições de actividade.
Clonagem e expressão das proteínas de fusão péptido-Dl2
Os domínios D1-D2 da g3p (compreendendo os resíduos de aminoácidos 2 a 217 de fd-g3p madura) com e sem o péptido nACGSGCGSGCGc fundido no extremo N foram expressos em E. coli. O vector de expressão baseado em pUC119 com uma sequência líder e o gene D1-D2 com uma cauda de hexa-his-tidina C-terminal (aqui designado pUC119H6D12) foi gentilmente cedido por Phill Holliger do Laboratory of Molecular Biology (LMB) em Cambridge. Um plasmídeo para a expresso de D1-D2 com o péptido N-terminal foi clonado por amplificação por PCR do gene D1-D2 com as sequências iniciadoras pepdl2ba (codificadora da sequência peptídica) e dl2fo e ligação a pUC119H6D12 digerido com Sfil/NotI. O gene para expressão de D1-D2 sem dissulfureto com um total de 20 aminoácidos foi amplificado por PCR a partir do vector fdg3pOss21 com o par de sequências iniciadoras dl20ssba/ dl20ssfo, pepdl20ssba/dl20ssfo, P2cdl20ssba/dl20ssfo ou Plcdl20ssba/dl20ssfo e ligado em Sifl/Notl a pUC119H6D12 para expressão de D1-D2 sem ligações dissulfureto com e sem 152 ΡΕ2257624 os péptidos nACGSGCGSGCGc, nAGSGCGSGCGc ou nAGSGKGSGCGc fundidos no extremo N. As 6 proteínas foram expressas em células E. coli TG1 a 30 °C durante 8 horas e a fracção periplásmica foi purificada em vários passos por cromato-grafia de afinidade com Ni e filtração em gel numa coluna Superdex 75 em NH4HCO3 2 0 mM, pH 7,4.
Análise por espectrometria de massa das proteínas de fusão com o péptido D12
As massas moleculares das proteinas (5-20 μΜ) , antes e depois da modificação com TBMB, foram determinadas por desnaturação das proteinas em 4 volumes de 50% MeOH, 1% de ácido fórmico e análise num espectrómetro de massa por tempo de voo com ionização por electrovaporização (Micromass, Millford, MA, USA). As massas moleculares foram obtidas por deconvolução de espectros de massa de proteinas multiplamente carregadas usando MassLynx versão 4.1.
Criação da biblioteca fágica de péptidos 1
Os genes codificadores de um péptido meio ao acaso com a sequência Ala-Cys-(Xaa) 6-CYs- (Xaa) 6-Cys, o elemento de ligação Gly-Gly-Ser-Gly e os dois domínios Dl e D2 sem pontes dissulfureto foram clonados na orientação correcta no vector fágico fdODl2 para se obter a biblioteca fágica 1. O vector fdOD12, sem os genes dos domínios Dl e D2 do gene 2 e tendo um segundo local de restrição Sfil foram previamente criados por amplificação por PCR de 153 ΡΕ2257624 plasmídeo completo do fdg300ss21 usando ecoG3pNba e pelbs-fiecofo. Os genes codificadores do reportório de péptidos e os dois dominios do gene 3 foram criados gradualmente em duas reacções de PCR consecutivas. Primeiro, os genes de Dl e D2 foram amplificados por PCR com as duas sequências iniciadoras prepcr e sfi2fo usando o vector fdg3p0ss21 como matriz. Segundo, o DNA codificador dos péptidos ao acaso foram apensos numa reacção de PCR usando as sequências iniciadoras ecoG3pNba e pelbsfiecofo. A ligação de 33 e 9 yg do plasmideo fdOD12 digerido com Sfil e produto de PCR deu 4,4 x 109 colónias em 12 placas de 20x20 cm de 2YT com cloranfenicol (30 yg/ml). As colónias foram raspadas das placas com meio 2YT, suplementado com 15% de glicerol e guardadas a -80°C. Os stocks de glicerol foram diluídos para uma D0600 = 0,1 em 1 litro de 2YT/cloranfenicol (30 yg/ml) e os fagos foram expressos a 30°C durante a noite (12 a 16 hrs).
Biotinilação dos antigénios A calicreína de plasma humano (activada com factor Xlla) foi adquirida à Innovative Research (Southfiled, MI. USA) e biotinilada numa concentração de 1,2 μΜ com um excesso molar de 5 vezes de Sul-NHS-LC-biotina (Pierce, Rockford, IL, USA) em PBS, pH 7,4/5% DNSO à TA durante 1 horas. A proteína biotinilada foi purificada numa coluna PD-10 usando um tampão de NaAc 50 mM, pH 5,5, NaCl 200 mM. Catepsina G humana já biotinilada foi adquirida à Lee Biosolutions (St. Louis, MI, USA). 154 ΡΕ2257624
Subclonagem e rastreio da expressão de clones seleccionados de fagos 0 DNA de plasmídeo dos clones seleccionados após os segundo e terceiro ciclos de selecção por adsorção foi amplificado por PCR num único tubo com as sequências iniciadoras 21seqba e flagfo e clonado no vector pUC119H6D12 nos locais Sfil e Notl, para expressão no espaço periplásmico dos péptidos fundidos com os dominios Dl e D2 sem dissulfureto com uma marca FLAG C-terminal e uma cauda de hexa-histidina. Os plasmideos ligados foram electroporados para células TG1 e semeados em placas de 2YT/ampicilina (100 pg/ml). Os clones que expressavam a proteina recombinante foram identificados como se sege: 1 ml de 2YT/ampicilina (100 yg/ml) em placas de 96 alvéolos fundas foram inoculados com células de colónias individuais e incubados a 37°C. A expressão proteica foi induzida com IPTG 1 mM quando as culturas estavam turvas e as placas foram agitadas a 300 rpm, a 30°C durante a noite. As células foram semeadas por centrifugação a 3500 rpm durante 30 minutos, lisadas com tampão de lavagem contendo 1 mg/ml de lisozima e centrifugadas a 3500 rpm para sedimentar os detritos celulares. Os sobrenadantes foram transferidos para placas Polysorp de 96 alvéolos (Nunc, Roskilde, Denmark) para adsorção não especifica. Os alvéolos foram lavados duas vezes com tampão de lavagem contendo 0,1% Tween 20 e bloqueados com tampão de lavagem contendo 1% BSA e 0,1% Tween 20 durante 1 h. O conjugado anti-FLAG M2- 155 ΡΕ2257624 peroxidase (Sigma-Aldrich. St Louis, MO, USA) foi diluído a 1:5000 e bloqueado em tampão de lavagem contendo 1% BSA e 0,1% Tween 20 e adicionado às placas durante 1 h. Os alvéolos foram lavados (5 vezes com tampão de lavagem contendo 0,1% Tween 20 e uma vez com detergente) e a peroxidase ligada foi detectada com solução do substrato TMB (eBiosciences, San Diego, USA) . O DNA de plasmídeo dos clones que expressavam proteína foi sequenciado (Geneser-vice, Cambridge, UK).
Maturação por afinidade dos inibidores de cali-creína de plasma humano
Foram criadas três biblioteca fágicas para péptidos essencialmente como descrito para a biblioteca 1 (ver atrás) mas usando a sequência iniciadora degenerada sficxôabc (biblioteca 2), sficxôabb (biblioteca 3) e sficxôaba (biblioteca 4) em vez de sficxôba. A electropo-ração das reacções de ligação em células TG1 deu 9,5 x 108 (biblioteca 2), 1,1 x 109 (biblioteca 3) e 1,2 x 109 (biblioteca 4) transformantes. Os fagos de cada biblioteca foram produzidos em culturas de 1 litro, purificados, reunidos e reagidos com TBMB. Três ciclos de selecção por adsorção foram realizados essencialmente como nas selecções descritas atrás, mas usando a calicreína de plasma humano biotinilada numa concentração mais baixa (1 nM nos Io e 2° ciclos, 200 pM no 3o ciclo). 156 ΡΕ2257624
Medição da actividade e da especificidade dos inibidores da calicreina do plasma humano
As actividades inibidoras (IC50) foram determinadas por medição das actividades residuais da enzima quando da incubação (30 min, TA) com diferentes concentrações de inibidor (tipicamente variando entre 10 μΜ e 0,5 pM). As actividades da calicreina do plasma humano (0,1 nM) e do factor Xla (0,8 nM; Innovative Research, Southfiled, MI, USA) foram medidas com Z-Phe-Arg-AMC (100 μΜ) e a actividade de trombina humana (2 nM; Innovative Research, Sothfiled, MI, USA) com Boc-Phe-Ser-Arg-AMC (100 μΜ) em Tris-Cl 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM CaCl2 1 mM, 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100 e 5% DMSO. A calicreina de plasma humano recombinante da R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) com um péptido sinal foi activada proteoliticamente com 0,5 mg/ml de termolisina a 37°C, durante 1 h. A actividade da calicreina do plasma humano (3 nM) foi medida com Z-Phe-Arg-AMC (100 μΜ) em Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, CaCl2 10 mM e NaCl 250 mM, 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100 e 5% DMSO. O inibidor hidrolisado numa ansa da ligação foi gerado por incubação do péptido PK15 modificado com TBMB com calicreina de plasma humano, numa razão molar de 5:1, durante 24 horas, a 37°C e subsequente inactivação pelo calor da enzima a 60°C (30 min. Os valores de Ki aparente foram calculados de acordo com a equação de Cheng e
Prusoff. ΡΕ2257624 157
Medição da activação do factor XII em plasma humano
Plasma humano normal de dadores isolados foi adquirido a 3H Biomedial (Uppsala, Sweden). 0 plasma foi centrifugado a 1500 xg a 20°C, durante 15 minutos, para se obter plasma empobrecido em plaquetas (PPP). Alíquotas do PPP foram guardadas em tubos de polipropileno a -80°C. Foram preparadas amostras de 60 μΐ de PPP contendo 5, 50, 500 ou 5000 nM de aprotinina (Roche, Mannheim, Germany) ou péptido PK15 modificado com TBMB. O tempo de activação da trombina foi medido a 37°C pela adição de 20 μΐ de actina FS diluida a 1:10 (Dade Behring, Marburg, Germany) e 20 μΐ de tampão Hepes 20 mM pH 7,4, CaCÍ2 100 mM, 5 mg/ml de BSA e Z-Gly-Gly-Arg-AMC 1 mM à amostra de plasma e monitorização da intensidade de fluorescência com um leitor de fluorescência em placas (excitação a 355 nm, registo de emissão a 460 nm; PHERAStar, Labtech, Offenburg, Germany). A activação do factor Xlla e da calicreina de plasma humano foi medida como se segue. 2 pg de caulino foi adicionado às amostras de plasma, misturados bem e incubados durante 20 minutos a 37°C. As amostras foram diluidas 250 vezes em Tris-HCl 50 mM pH 7,8, NaCl 150 mM. A actividade tipo calicreina do plasma foi medida com o substrato cromogénico H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (100 μΜ; Bachem, Bubendorf, Switzer-land) usando um leitor de absorção de placas (absorção a 450 nm; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). 158 ΡΕ2257624
Determinação da estrutura do péptido PK15 modificado com TBMB 1 mg do péptido PK15 modificado com TBMB foi dissolvido em 550 μΐ Tris-HCl deuterado 10 mM, pH 6,6, NaCl 150 mM, MgCl2 10 mM CaCl2 1 mM para obter uma concentração de inibidor de 1 mM. Os espectros do inibidor foram registados a 800 MHz (Bruker Avance com crio-sonda TCI) . A análise dos espectros foi baseada em espectros TOCSY e NOESY. As restrições de distâncias foram dos espectros NOESY. Foram calculadas 50 estruturas de confórmeros, O programa PyMOL foi usado para análise da estrutura e visualização dos modelos moleculares.
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Todas as publicações referidas na especificação acima são aqui incluídas por referência. Várias modificações e variação dos aspectos e realizações descritos serão aparentes para os familiarizados com a matéria sem se afastarem do âmbito do presente invento. Apesar do presente invento ter sido descrito em relação com as realizações preferidas específicas, deverá ser entendido que o invento como reivindicado não deve ser indevidamente limitado a tais realizações específicas. De facto, várias modificações dos modos descritos para a realização do invento, que são aparentes para os familiarizados com a área, pretende-se que estejam dentro do âmbito das reivindicações.
Listagem de Sequências
Sequência das sequências iniciadoras de DNA
Os locais de nucleases de restrição estão sublinhados pepdl2ba 5’CTCGGQGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTOTGGCTCTGGCTGCGGTTCCGGCTOTGGTGCAG AAACTGTTG AAAGTTG-3 ’ dl2fo 5'-GAGTCATTCTGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTC-3' dl20ssba 5'-CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3' dl20ssfo 5'-GAGTCATTCTGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3' pepdl20ssba 164 ΡΕ2257624
5-CTC<K:<3G<X^AGC03GCCATGGCAGCGTGTGGCTCrGOCrG<XKÍTT^GGCrGT<^TGCTQ AAACTGTTGAAAGTAG-V p2cdl2 Ossba 5’ CTCGCGGCCC AGCCGGCC ATGGC AGCGGGCTCTGGCTGCGGTTCCGGCT GTGGT GCTGAAACTGTTGAAAGrA0-3' plcdl2 Ossba
SGtCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGGGCTCTGGCAAAGGTTCCGGCTGTOGT GCtGAAACTGTTGAAAGTAG-3’ ecoG3pNba
SOCATGAATTCCAGTCAGTACGGCÇTCGGGGGCCAlGGCTTCtGGTACCCCGGTTAAC -3* . , pelbsfiecofo S'GCAÍGAATTCCGATGACTGAGGCCGGCrGGGCCGCATAGAAAGGAACAACTAAAG GAAT r3‘ prepcrba 5'-GGCGGTTCTGGCGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3' sfi2fo 5'-GAAGCCATGGCCCCCGAGGCCCCGGACGGAGCATTGACAGG-3' sficxôba
57ATGCGGCCCAGCCGGCCàTGGCAGCGTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKTGCNN*NNK NNKNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG-3' flagfo SGAfTCTGCGGCCGCCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTGCAGCATTGACAGGAGGTTG AGGC AGGT A-3* sficx6aba S^ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTNNKHNKNNKNNKNNXNNKTGCCGCGTy AATTGGACCCCGTGTGGCGGTTCtGGCGCTG-3’ sficxôabb
STATGCGGCCCAÒCCGGCCATGGCAGCGTGTGCGCCGTGGCGCACCGCGTGCHN KNNKNNKNNKNNKNNKTGTGGCGGTfCTGGCGCTG-3' sficx6abc 165 ΡΕ2257624
5*TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTAGCGATCGTTTrCGTAATTGCNNKNN>C NNKNNKNNKNNKTGTGGCGGTTCTGGCGCTG*3>
As sequências peptídicas estão descritas na secção dos exemplos
Sequência das sequências iniciadoras de DNA do
Exemplo 8
Os locais de nucleases de restrição estão sublinhados pepdl2ba 5'-CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCCTGTGGTC TGGCTGGGTTCCGGCTGTGGCAGAAAGAGTTG-3' dl2ba 5'-GAGTCAT TC TGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3' dl20ssba 5'-CATGCCATGACTCGGGGCCCAGCCGGCCATGGCTGAAACTGTTGAAAGTAG-3' dl20ssba 5'-GAGTCATTCTGCGGCCGGATTGACAAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3' pepdl20ssba 5'-
CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGTGTCCCTCTCGGCTGCCCTTCCGGCTGTCCTGGCTGAAACTGT TGAAAGTAG-3' p2cdl20ssba 5'- CTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGCGGGCTCTGGCTTGCGGTTCCGGCTGTGCTGAAACGTTGAAAGTA G-3 ' plodl20ssba 5' - CTCGCGGCCTAGCCGCCATGGCATGGCAGCCCCCTCTGGAAAGGTTCCGGCTCTGGGTCTTGAAAGTA-3 ' ocog3pttoo 5'-GCATGAATTCCAGTCAGTACGGCCTCGGGCGCCATGGCTTCTGGTACCCCGTTAAC-3' po 5'GCATGAATTCCGATCCGAGCCGGTGGGCCCATAGGGAAAGGCAACTAAAGGAAT-3' propotoo 5'-GGCGGTTCTGGCGTGAAACTCTTGAAAGTAG-3' dl2 lo 5'-GAAGCCATGGCCCCCGAGGCCCCCGAGCCGAGCATTGACAGG-3' uficarbo 5'-TATGCGGCCCGCCCAGCCGCCATGGCTCGAGCGTGC5'-GAGTCATTCTGCGGCCGCATTGACAGGAGGTTGAGGCAGGTG-3' nopto 166 ΡΕ2257624 5'-GATTCTGCGGCCGCATTGATAGGAGGTTGAGGCAGGTA-3' dic 5'-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCACCTGC GGCCGCATTGACAGGAG GCCCGCATTAATTGGACCCCGTGTGGCCGGCCCTTCTGGCCGCTG-3' disc 5'-TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCACCTGCAGCGTTGTGGCGCCGTGGCCAGCGGCTGGC CTGTGGCGCCGTTCTGGCGCCTGG-3'P eficxdssba
5'TATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCAGTGTCTAGCGATCGTTTTCGTAAT
Lisboa, 22 de Maio de 2012

Claims (24)

  1. ΡΕ2257624 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um complexo compreendendo uma partícula fágica, a referida partícula fágica compreendendo (i) um ácido nucleico codificador de um poli-péptido (ii) o polipéptido expresso pelo ácido nucleico de (i) e apresentado na superfície do fago; (iii) um composto de conjugação ligado ao referido polipéptido em que o referido composto de conjugação está ligado ao polipéptido através de pelo menos três ligações covalentes discretas.
  2. 2. Um complexo de acordo com a reivindicação 1 em que o composto de conjugação possui simetria molecular correspondente ao número de ligações covalentes pelas quais está ligado ao polipéptido.
  3. 3. Um complexo de acordo com a reivindicação 2 em que o composto de conjugação possui três eixos de simetria e o composto de conjugação está ligado ao polipéptido através de três ligações covalentes.
  4. 4. Um complexo de acordo com qualquer uma das 2 ΡΕ2257624 reivindicações anteriores em que o composto de conjugação compreende um grupo quimico estruturalmente rigido.
  5. 5. Um complexo de acordo com a reivindicação 4 em que o composto de conjugação compreende tris-(bromo-metil)benzeno (TBMB).
  6. 6. Um complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que o referido polipéptido compreende um residuo de cisterna e em que pelo menos uma das referidas três ligações covalentes discretas para ligação do composto de conjugação ao polipéptido compreende uma ligação ao referido residuo de cisterna.
  7. 7. Uma biblioteca de polipéptidos codificados geneticamente, compreendendo pelo menos dois complexos diferentes de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
  8. 8. Um método para a preparação de um complexo, o referido método compreendendo (i) obtenção de uma particula fágica compreendendo um ácido nucleico e um polipéptido expresso pelo ácido nucleico e apresentado na particula fágica (ii) obtenção de um composto de conjugação e (iii) ligação do referido composto de conjugação ao referido polipéptido através da formação de 3 ΡΕ2257624 pelo menos três ligações covalentes entre o referido composto de conjugação e o polipéptido.
  9. 9. Um método de acordo com a reivindicação 8 em que os grupos reactivos do polipéptido apresentado na partícula fágica estão reduzidos e em que a partícula fágica apresentadora do polipéptido compreendendo os grupos reactivos reduzidos é ainda purificada por filtração antes do passo (iii).
  10. 10. Um método de acordo com a reivindicação 9 em que após o passo de purificação por filtração, o polipéptido é mantido no estado reduzido para ligação ao composto de conjugação através da incubação em tampão desgaseado e na presença de um agente quelante.
  11. 11. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que o passo (iii) compreende incubação do polipéptido e do composto de conjugação em conjunto a 30°C, a pH 8, em tampão aquoso compreendendo acetonitrilo.
  12. 12. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11 em que o composto de conjugação compreende tris-(bromometil)benzeno (TBMB).
  13. 13. Um método de acordo com a reivindicação 12 em que o tris-(bromometil)benzeno está presente a 10 μΜ. 4 ΡΕ2257624
  14. 14. Um método de acordo com a reivindicação 13 em que o agente quelante é ácido etilenodiaminatetracético (EDTA) , o acetonitrilo está presente a 20% e o passo de incubação (iii) é conduzido durante 1 hora.
  15. 15. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, o referido método compreendendo ainda o passo de (iv) clivagem de uma ou mais ligações da cadeia polipeptídica.
  16. 16. Um método de acordo com a reivindicação 15 em que o referido passo de clivagem compreende o contacto do referido polipéptido com uma protease.
  17. 17. Um complexo obtido pelo método de qualquer uma das reivindicações 8 a 16.
  18. 18. Um método para identificação de um complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores que é capaz de se ligar a um ligando, o método compreendendo (i) obtenção de um complexo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores (ii) contacto do referido complexo com o ligando e (iii) selecção dos complexos que se ligam ao referido ligando. 5 ΡΕ2257624
  19. 19. Um método de acordo com a reivindicação 18 compreendendo ainda a determinação da sequência do ácido nucleico do referido complexo.
  20. 20. Um método de acordo com a reivindicação 18 compreendendo ainda o passo de produção do complexo isolado capaz de se ligar ao referido ligando.
  21. 21. Um método de acordo com a reivindicação 18 compreendendo ainda o passo de produção de um conjugado polipéptido-composto de conjugação isolado ou identificado por um método do invento, a referida produção compreendendo a ligação do composto de conjugação ao polipéptido, em que o referido polipéptido é expresso por técnicas recombinantes ou por sintese química.
  22. 22. Um método de acordo com a reivindicação 21 compreendendo ainda o passo de extensão do polipéptido num ou em ambos os extremos N e C do polipéptido.
  23. 23. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 22 comprendendo ainda o passo de conjugação do referido conjugado de polipéptido-composto de conjugação a um outro polipéptido.
  24. 24. Um método de acordo com a reivindicação 23 em que a referida conjugação é realizada por 6 ΡΕ2257624 (i) adição de uma outra cisteína ao polipéptido após ligação ao composto de conjugação e (ii) conjugação do referido polipéptido ao referido outro polipéptido através de uma ligação dissulfu-reto com a referida outra cisterna. Lisboa, 22 de Maio de 2012
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