ES2743448T3 - Procedimiento y composición del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca - Google Patents
Procedimiento y composición del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca Download PDFInfo
- Publication number
- ES2743448T3 ES2743448T3 ES16718650T ES16718650T ES2743448T3 ES 2743448 T3 ES2743448 T3 ES 2743448T3 ES 16718650 T ES16718650 T ES 16718650T ES 16718650 T ES16718650 T ES 16718650T ES 2743448 T3 ES2743448 T3 ES 2743448T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- group
- seq
- peptides
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 0 C*(C)C1=C***1 Chemical compound C*(C)C1=C***1 0.000 description 13
- WYNZSZKMIUSVHJ-UHFFFAOYSA-N CC(C)(C(N=CC1=O)=CC1=O)N Chemical compound CC(C)(C(N=CC1=O)=CC1=O)N WYNZSZKMIUSVHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/10—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un procedimiento para seleccionar un péptido de interés, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) preparar una colección de péptidos usando un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende el péptido de interés que se va a identificar; b) seleccionar el péptido de interés de la colección de péptidos poniendo en contacto una molécula diana con el péptido de interés en el que la molécula diana se inmoviliza sobre un soporte sólido o está en solución; e c) identificar la secuencia de aminoácidos del péptido de interés, en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X*)cSYTYNYEHVDVWGCGSADYKDDDDKKK (SEQ ID NO: 3) en la que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en la que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento y composición del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a un procedimiento para seleccionar un péptido de interés usando un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm. La invención también se refiere al polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende un péptido de interés y a una micromatriz de péptidos que comprende el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende un péptido de interés o a una micromatriz de péptidos que comprende un péptido de interés como se describe en el presente documento.
ANTECEDENTES
Con la identificación de vías celulares y dianas que desempeñan papeles clave en el metabolismo y la progresión de la enfermedad, la comprensión de los estados de enfermedad continúa expandiéndose exponencialmente. Sin embargo, nuestra capacidad para tratar enfermedades se queda rezagada debido a las limitaciones inherentes a las plataformas de fármacos existentes. En la actualidad, las plataformas de fármacos disponibles se basan principalmente en moléculas pequeñas y proteínas terapéuticas, que abordan solo alrededor de un 10 a un 20 por ciento de las dianas terapéuticas identificadas para el tratamiento de enfermedades. La mayoría de las dianas y enfermedades son actualmente "no quimiomodulables" usando las modalidades terapéuticas existentes.
Los péptidos combinan la alta especificidad de los fármacos biológicos con la biodisponibilidad de las moléculas pequeñas y, por tanto, ofrecen oportunidades interesantes para abordar dianas difíciles para el tratamiento de enfermedades. De hecho, los péptidos han demostrado ser eficaces cuando se usan para dirigirse a receptores extracelulares y se han realizado numerosos esfuerzos para usar péptidos para modular los procesos intracelulares. Sin embargo, todavía quedan grandes desafíos, ya que los péptidos se metabolizan rápidamente por enzimas proteolíticas y, típicamente, no atraviesan fácilmente las membranas celulares.
Con su rigidez conformacional, los péptidos cíclicos son sumamente prometedores para superar estas limitaciones. Los péptidos cíclicos son cadenas polipeptídicas que adoptan una estructura en anillo cíclico. La estructura en anillo se puede formar uniendo un extremo del péptido con el otro con un enlace amida, u otros enlaces químicamente estables tal como lactona, éter, tioéter, disulfuro, etc. La rigidez de los péptidos cíclicos disminuye la energía libre y, por lo tanto, permite la unión potenciada a moléculas diana. Además, debido a su falta de extremos libres, los péptidos cíclicos son más resistentes a la digestión. Además, previamente se ha demostrado que los péptidos cíclicos tienen una mejor capacidad de penetración celular que sus homólogos lineales. Estas propiedades excepcionales han hecho que los péptidos cíclicos sean candidatos atractivos para el descubrimiento de fármacos. En el pasado, se han aislado péptidos cíclicos de grandes colecciones combinatorias usando herramientas de cribado de colecciones, tales como la presentación en fagos y la presentación en ARNm. La presentación en ARNm es una posibilidad atractiva para el cribado de péptidos debido a su naturaleza in vitro, el gran tamaño de la colección y la capacidad de incluir aminoácidos naturales, no naturales y modificados. *) véase la página 2a
SUMARIO
Los solicitantes han creado novedosos procedimientos de presentación y selección para péptidos cíclicos usando un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca para presentar una colección de péptidos de una manera estructuralmente restringida. Los anticuerpos bovinos tienen las regiones CDR H3 más largas que se conocen actualmente, con un subconjunto ultralargo que varía en longitud de 50 a 67 aminoácidos. Estas regiones CDR H3 inusuales a menudo tienen múltiples cisteínas y confieren una novedosa conformación de tallo y botón. Adoptando las secuencias excepcionales que codifican la región de tallo y botón, los solicitantes han creado polipéptidos de andamio de anticuerpos de vaca que pueden presentar péptidos confinados utilizando el compartimento de botón protuberante de los anticuerpos de vaca. El uso de los excepcionales polipéptidos de andamio de anticuerpos de vaca de los solicitantes con una gran versatilidad de péptidos puede no solo permitir la selección y optimización de tratamientos con péptidos cíclicos, sino también permitir la selección de péptidos cíclicos que pueden penetrar en las hendiduras de la cúpula en la molécula diana (por ejemplo, una proteína) y se pueden unir con alta afinidad y especificidad debido a áreas contiguas de complementariedad en la superficie.
En un modo de realización, se proporciona un procedimiento para seleccionar un péptido de interés. El procedimiento comprende las etapas de a) preparar una colección de péptidos usando un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende el péptido de interés que se va a identificar, b) seleccionar el péptido de interés de la colección de péptidos poniendo en contacto una molécula diana con el péptido de interés en el que la molécula diana se inmoviliza sobre un soporte sólido o está en solución y c) identificar la secuencia de aminoácidos del péptido de interés.
En otro modo de realización, se proporciona un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende un péptido de interés.
Aún en otro modo de realización, se proporciona una micromatriz de péptidos que comprende un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende un péptido de interés. En otro modo de realización, se proporciona una micromatriz de péptidos que comprende un péptido de interés como se describe en el presente documento. Varios modos de realización de la invención también se describen mediante las siguientes cláusulas enumeradas: 1. Un procedimiento para seleccionar un péptido de interés, comprendiendo el procedimiento las etapas de a) preparar una colección de péptidos usando un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende el péptido de interés que se va a identificar;
b) seleccionar el péptido de interés de la colección de péptidos poniendo en contacto una molécula diana con el péptido de interés en el que la molécula diana se inmoviliza sobre un soporte sólido o está en solución; e
c) identificar la secuencia de aminoácidos del péptido de interés.
2. El procedimiento de la cláusula 1, en el que la etapa de preparación de la colección de péptidos comprende la etapa de transcripción in vitro de una colección de ADN para formar una colección de ARNm.
3. El procedimiento de la cláusula 2, que comprende además la etapa de digerir la colección de ADN con DNasa. 4. El procedimiento de la cláusula 2 o 3, que comprende además la etapa de conjugar el ARNm de la colección de ARNm con un conector oligonucleotídico de puromicina.
5. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 2 a 4, que comprende además la etapa de traducir in vitro el ARNm de la colección de ARNm para formar conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm que comprenden el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende una marca de purificación.
6. El procedimiento de la cláusula 5, que comprende además la etapa de purificar los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm usando la marca de purificación.
7. El procedimiento de la cláusula 5 o 6, que comprende además la etapa de retrotranscribir el ARNm de la colección de ARNm para formar híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm.
8. El procedimiento de la cláusula 7, en el que la etapa de selección comprende poner en contacto los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm con la molécula diana.
9. El procedimiento de la cláusula 8, que comprende además la etapa de regenerar el ADN de los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm.
10. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 2 a 9, en el que la colección de ADN es una colección de ADNc.
11. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 2 a 10, en el que la transcripción in vitro se realiza usando ARN polimerasa T7.
12. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 4 a 11, en el que el conector oligonucleotídico de puromicina se une al ARNm en el extremo 3' del ARNm.
13. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 5 a 12, en el que la marca de purificación es una marca FLAG.
14. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 2 a 13, en el que los miembros de la colección de ADN comprenden una secuencia promotora de ARN polimerasa, una secuencia potenciadora y una secuencia de marca de purificación.
15. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 5 a 13, en el que la marca de purificación es una marca C terminal.
18. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca tiene que comprender la secuencia MOCTSVHQETKKYQS(X*)cSYTYNYEHVDVWGCGSADYKDDDDKKK (SEQ ID NO: 3) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
19. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 18 en el que X* comprende un aminoácido natural.
20. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 18 en el que X* comprende un aminoácido no natural.
21. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 18 a 20, en el que c es un número entero de 1 a 40. 22. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 18 a 20, en el que c es un número entero de 1 a 10. 23. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas anteriores, que comprende además las etapas de:
a) sintetizar el péptido de interés, o derivados del mismo, en una primera micromatriz de péptidos, en el que los derivados del péptido de interés incluyen al menos una alteración en la secuencia del péptido de interés seleccionada de una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos, y una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos;
b) formar a partir de los péptidos funcionalizados, en los que los péptidos funcionalizados están en forma lineal, péptidos cíclicos de fórmula I
en la que cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector N terminal;
R7 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal, un grupo protector C terminal, y
cada R8 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
R9 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal y un grupo protector C terminal; Q se selecciona del grupo que consiste en un enlace, un carbonilo, una cadena lateral de aminoácido natural y una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada X e Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z;
Z es un grupo que comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida, un enlace disulfuro, un enlace isopeptídico, un 1,2,3-triazol y una 1,2-quinona opcionalmente sustituida;
cada L' y L" es independientemente un grupo de unión bivalente opcional o un enlace;
b es un número entero de 0 a 50;
m es un número entero de 0 a 6;
n es 0 o 1;
p es 0 o 1;
q es un número entero de 0 a 6;
r es 0 o 1;
s es un número entero de 0 a 100;
t es 0 o 1;
u es 0 o 1;
v es un número entero de 0 a 100;
w es 0 o 1; y * es un punto de conexión que conecta el péptido cíclico a un soporte de matriz que tiene una superficie reactiva; y *** es un punto de conexión con el resto del péptido funcionalizado;
comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un péptido funcionalizado de fórmula II en condiciones que hacen que se forme Z
en la que R1, R2 R3, R4, R5, R6, m, n, p, q, r, s, t, v, w, L', L", * y *** son como se define para la fórmula I;
R10 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal, un grupo protector C terminal, y
cada R11 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
R12 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal y un grupo protector C terminal;
Q' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, un carbonilo, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
X' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
Y' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z' y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z';
cada Z' y Z" se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, -OH, hidrógeno, un tiol, una amina, un ácido carboxílico, una amida, un alquino, una acida, un aminofenol opcionalmente sustituido, una cadena lateral de aminoácido natural, una cadena lateral de aminoácido no natural, un grupo protector N terminal y un grupo protector C terminal, siempre que Z' y Z" sean grupos complementarios que se combinen para formar Z;
g es un número entero de 0 a 50; e
y es 0 o 1;
en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos se inmovilizan en la superficie reactiva;
c) exponer los péptidos cíclicos a la molécula diana, con lo que la molécula diana se une a al menos un péptido cíclico; d) identificar uno o más de los péptidos cíclicos que demuestran una fuerte unión a la molécula diana, con lo que se determina una secuencia de unión al núcleo madurada;
e) realizar al menos una de la extensión N terminal y C terminal de la secuencia de unión al núcleo madurada determinada en la etapa d para proporcionar una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada en una segunda micromatriz de péptidos;
f) exponer la molécula diana a la segunda micromatriz de péptidos que comprende una población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada generados en la etapa e en la que la población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada comprende péptidos cíclicos formados como en la etapa b; e g) identificar un péptido cíclico extendido y madurado con una fuerte unión a la molécula diana.
24. El procedimiento de la clausula 23, en el que Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un
en el que d es un número entero de 0 a 6, e es un número entero de 0 a 6 y f es un número entero de 0 a 6, y ** es un punto de conexión con el resto del péptido cíclico.
25. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que Z comprende un enlace peptídico, Z" comprende un grupo protector N terminal, t es 0, u es 0 e y es 0.
26. El procedimiento de la cláusula 25, que comprende además eliminar Z" del resto del péptido funcionalizado para provocar que se forme el enlace peptídico.
27. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que Q y X son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Q' es un enlace a Z', Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína, t es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
28. El procedimiento de la cláusula 27, que comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S -S - **.
29. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Y' es un enlace a Z', Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína, t es 1, u es 1 e y es 1.
30. El procedimiento de la cláusula 29, que comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S -S - **.
32. El procedimiento de la cláusula 31, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
* * * ( h 2c ^
enlace a Z1, Z1 comprende > Z" comprende una acida, d es 1, u es 1 e y es 1.
34. El procedimiento de la cláusula 33, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
35. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que Q es un enlace a Z, Z comprende Q' es un , ( h2c ^
enlace a Z\ Z' comprende e , Z" comprende una acida, e es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
36. El procedimiento de la cláusula 35, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
38. El procedimiento de la cláusula 37, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
un enlace a Z', Z' comprende IN n 2 , Z" comprende una amina, f es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
40. El procedimiento de la cláusula 39, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
42. El procedimiento de la cláusula 41, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
43. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que R4, R10 y R11 se definen de modo que el péptido funcionalizado
comprende una secuencia de reconocimiento de butelasa 1, Y es un enlace a Z, Z comprende Y' es un enlace a Z', Z' es una cadena lateral de asparagina o ácido aspártico, u es 1 e y es 1.
44. El procedimiento de la cláusula 43, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con O
butelasa 1 para provocar que se forme „„ ^ J **.
Q' es un enlace a Z', X' es un enlace a Z", Z' es una cadena lateral de glutamina y Z" es una cadena lateral de lisina o Z' es una cadena lateral de lisina y Z" es una cadena lateral de glutamina, t es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0. 46. El procedimiento de la cláusula 45, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con una
47. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende H , X1 es un enlace a Z", Y1 es un enlace a Z, Z es una cadena lateral de glutamina y Z" es una cadena lateral de Usina o Z es una cadena lateral de lisina y Z" es una cadena lateral de glutamina, t es 1, u es 1 e y es 1.
48. El procedimiento de la cláusula 47, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con una
transglutaminasa microbiana para provocar que se forme h .
49. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 48, en el que cada L' y L" es independientemente de la fórmula V
— (-cr13r133'h-
V
en la que cada R13 y R13' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10, heteroarilo de 5 a 7 miembros, -O R 14, -OC(O)R14, -N R 14R14', -N R 14C(O)R15, -C(O)R14, -C(O)OR14 y -C(O)NR14R14', en el que cada átomo de hidrógeno en alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros está independientemente sustituido opcionalmente con halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, -O R 16; cada R14, R14', R15 y R16 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, hidroxilo, alquilo C1-C 7, alquenilo C2-C 7, alquinilo C2-C 7, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros; y h es un número entero de 1 a 10; o la fórmula VI o VII
en la que j es un número entero de 0 a 30.
50. El procedimiento de la cláusula 49, en el que cada R13 y R13' es hidrógeno.
51. El procedimiento de la cláusula 49 o 50, en el que L' está presente, h es 5, m es 0, n es 1 y p es 1.
52. El procedimiento de la cláusula 49, en el que al menos uno de L' y L" es de la fórmula VI o VII
en la que j es 7.
53. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 52, en el que el grupo protector N terminal es un grupo fotoprotector.
54. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 53, en el que el grupo protector N terminal es 2-(2-nitrofen¡l)prop¡lox¡carbon¡lo.
55. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 1 a 22 que comprende además la etapa de sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca en una o más micromatrices de péptidos en las que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende el péptido de interés.
56. El procedimiento de la cláusula 55, que comprende las etapas de:
a) sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende el péptido de interés, o derivados del péptido de interés, en una primera micromatriz de péptidos, en el que los derivados del péptido de interés incluyen al menos una alteración en la secuencia del péptido de interés seleccionada de una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos, y una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos;
b) formar a partir de los péptidos funcionalizados, en los que los péptidos funcionalizados están en forma lineal, péptidos cíclicos de fórmula VIII
en la que cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R5 y R6 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido
cada R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector N terminal;
R8 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector; cada X e Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z;
Z es un grupo que comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida, un enlace disulfuro, un enlace isopeptídico, un 1,2,3-triazol y una 1,2-quinona opcionalmente sustituida;
L' es un grupo de unión bivalente opcional o un enlace;
m es un número entero de 0 a 6;
n es 0 o 1;
p es 0 o 1;
q es un número entero de 0 a 50;
r es un número entero de 0 a 50;
s es un número entero de 0 a 50;
t es un número entero de 0 a 50;
u es un número entero de 0 a 50; y * es un punto de conexión que conecta el péptido cíclico a un soporte de matriz que tiene una superficie reactiva;
comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un péptido funcionalizado de fórmula IX en condiciones que hacen que se forme Z
en la que R1, R2 R3, R4, R5, R6, R7 y R8, m, n, p, q, r, s, t, u, L' y * son como se define para la fórmula VIII;
X' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
Y' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z' y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z'; y
cada Z' y Z" se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, -OH, hidrógeno, un tiol, una amina, un ácido carboxílico, una amida, un alquino, una acida, un aminofenol opcionalmente sustituido, una cadena lateral de aminoácido natural, una cadena lateral de aminoácido no natural, un grupo protector N terminal y un grupo protector C terminal, siempre que Z' y Z" sean grupos complementarios que se combinen para formar Z;
en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos se inmovilizan en la superficie reactiva;
c) exponer los péptidos cíclicos a la molécula diana, con lo que la molécula diana se une a al menos un péptido cíclico; d) identificar uno o más de los péptidos cíclicos que demuestran una fuerte unión a la molécula diana, con lo que se determina una secuencia de unión al núcleo madurada;
e) realizar al menos una de la extensión N terminal y C terminal de la secuencia de unión al núcleo madurada determinada en la etapa d para proporcionar una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada en una segunda micromatriz de péptidos;
f) exponer la molécula diana a la segunda micromatriz de péptidos que comprende una población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada generados en la etapa e en la que la población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada comprende péptidos cíclicos formados como en la etapa b; e g) identificar un péptido cíclico extendido y madurado con una fuerte unión a la molécula diana.
57. El procedimiento de la cláusula 56, en el que Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un
en el que d es un número entero de 0 a 6, e es un número entero de 0 a 6 y f es un número entero de 0 a 6, y ** es un punto de conexión con el resto del péptido cíclico.
58. El procedimiento de la cláusula 56 o 57, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Y' es un enlace a Z', y Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína.
59. El procedimiento de la cláusula 58, que comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S -S - **.
61. El procedimiento de la cláusula 60, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
62. El procedimiento de la cláusula 56 o 57, en el que Y es un enlace a Z, Z comprende ? Y1 es un ( h 2c£ = _ . ..
enlace a Z , Z comprende e , Z comprende una acida y e es 1.
63. El procedimiento de la cláusula 62, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
65. El procedimiento de la cláusula 64, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
X1 es un enlace a Z", Y1 es un enlace a Z\ y Z' es una cadena lateral de glutamina y Z" es una cadena lateral de Usina o Z' es una cadena lateral de lisina y Z" es una cadena lateral de glutamina.
67. El procedimiento de la cláusula 66, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con una
transglutaminasa microbiana para provocar que se forme h
68. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 56 a 67, en el que L' es de la fórmula (X)
en la que cada R13 y R13' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10, heteroarilo de 5 a 7 miembros, -O R 14, -OC(O)R14, -N R 14R14', -N R 14C(O)R15, -C(O)R14, -C(O)OR14 y -C(O)NR14R14', en el que cada átomo de hidrógeno en alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros está independientemente sustituido opcionalmente con halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, -O R 16; cada R14, R14', R15 y R16 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, hidroxilo, alquilo C1-C 7, alquenilo C2-C 7, alquinilo C2-C 7, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros; y h es un número entero de 1 a 10; o la fórmula XI o XII
en la que j es un número entero de 0 a 30.
69. El procedimiento de la cláusula 68, en el que cada R13 y R13' es hidrógeno.
70. El procedimiento de la cláusula 68 o 69, en el que L' está presente, h es 5, m es 0, n es 1 y p es 1.
71. El procedimiento de la cláusula 68, en el que L' es de la fórmula XI o XII
en la que j es 7.
72. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 56 a 71, en el que el grupo protector N terminal es un grupo fotoprotector.
73. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 56 a 72, en el que el grupo protector N terminal es 2-(2-nitrofenil)propiloxicarbonilo.
74. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 73, en el que se realiza al menos uno de un análisis sin marcador y uno de afinidad de los péptidos de secuencia de unión al núcleo extendidos y madurados. 75. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 74, en el que la primera o segunda micromatriz de péptidos comprende al menos uno de compuesto de vidrio, plástico y carbono.
76. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 75, en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos en la primera o la segunda micromatriz de péptidos comprenden el mismo número de aminoácidos.
77. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 76, en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos en la primera o la segunda micromatriz de péptidos no incluyen el aminoácido cisteína o metionina, o los motivos de histidina-prolina-glutamina, o repeticiones de aminoácidos de 2 o más aminoácidos.
78. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 77, en el que la población de péptidos de secuencia de unión al núcleo extendidos y madurados incluye al menos uno de un oligopéptido de síntesis con titubeo N terminal y un oligopéptido de síntesis con titubeo C terminal.
79. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 78, en el que la primera o segunda micromatriz de péptidos comprende uno o más péptidos lineales y en el que el procedimiento comprende además la etapa de poner en contacto los uno o más péptidos lineales en la primera o segunda micromatriz de péptidos con una proteasa que pueda digerir los uno o más péptidos lineales.
80. El procedimiento de la cláusula 79, en el que la proteasa es una amino proteasa o una mezcla de amino proteasas.
81. El procedimiento de la cláusula 79 en el que la proteasa es dipeptidil peptidasa IV, aminopeptidasa m o una combinación de las mismas.
82. Un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende un péptido de interés.
83. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de la cláusula 82 que comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X*)cSYTYNYEHVDVWGCG (SEQ ID NO: 1) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
84. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de la cláusula 82 que comprende la secuencia MGCTSVHQETKK.YQS(X*)cSYTYNYEHVDVWGCGSADYK.DDDDK (SEQ ID NO: 2) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
85. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de la cláusula 82 que comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X*KSYTYNYEHVDVWGCGSADYKDI5DDKICK (SEQ ID NO: 3) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
86. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 85 en el que X* comprende un aminoácido natural.
87. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 85 en el que X* comprende un aminoácido no natural.
88. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 87, en el que c es un número entero de 1 a 40.
89. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 87, en el que c es un número entero de 1 a 10.
90. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 89 en el que (X*)c comprende la secuencia del péptido de interés.
91. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de la cláusula 90 en el que el péptido de interés es un péptido terapéutico.
92. Una micromatriz de péptidos que comprende un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende un péptido de interés.
93. La micromatriz de péptidos de la cláusula 92, en la que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X*)cSYTY\YEHVDV\VGCG (SEQ ID NO: 1) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
94. La micromatriz de péptidos de la cláusula 92, en la que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVHQETKK.YQS(X«)£SYTYNYEHVDVWGCGSADYK.DDDDK (SEQ ID NO: 2) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
95. La micromatriz de péptidos de la cláusula 92, en la que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X*KSYTYNYEHVDVWGCGSADYKDDDDKKK (SEQ ID NO: 3) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
96. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 95, en la que X* comprende un aminoácido natural.
97. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 95 en la que X* comprende un aminoácido no natural.
98. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 97, en la que c es un número entero de 1 a 40.
99. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 97, en la que c es un número entero de 1 a 10.
100. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 99 en la que (X*)c comprende la secuencia del péptido de interés.
101. La micromatriz de péptidos de la cláusula 100 en la que el péptido de interés es un péptido terapéutico.
102. El procedimiento, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm o la micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 1 a 101, en los que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria y el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria comprende la secuencia del péptido de interés.
103. El procedimiento, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm o la micromatriz de péptidos de la cláusula 102, en los que el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria no incluye la secuencia de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo o un fragmento de péptido derivado de un anticuerpo.
104. El procedimiento de la cláusula 43 o 44 en el que la secuencia de reconocimiento de butelasa 1 es NHV-105. El procedimiento de la cláusula 45, 46, 66 o 67, en el que la cadena lateral de glutamina es parte de la secuencia [WY][l)E][DE][Y\V]ALQ[GST]YD (SEQ ID NO: 4) y la cadena lateral de lisinaes parte de la secuencia RSKLG (SEQ ID NO: 5). " 106. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 1 a 22 que comprende además la etapa de sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende el péptido de interés en una micromatriz de péptidos para madurar y/o extender el péptido de interés o la etapa de sintetizar el péptido de interés en una micromatriz de péptidos para madurar y/o extender el péptido de interés.
107. El procedimiento, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm o la micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 1 a 101, en los que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria en los que el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria comprende la secuencia del péptido de interés y en los que el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria se usa para la selección de péptidos de interés.
108. Un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra un dibujo esquemático de un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca. La figura 1 divulga las SEQ ID NO 400 y 401, respectivamente, en orden de aparición.
La figura 2 muestra un gel desnaturalizante de un único péptido de unión a trombina injertado en un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca.
La figura 3 muestra la electroforesis en gel de agarosa de diversos ciclos de PCR para determinar los niveles de detección de productos de amplificación.
La figura 4 muestra un sensograma de Biacore de una medición de la cinética de un solo ciclo de péptidos brutos de una mezcla de traducción y constantes de unión derivadas.
La figura 5 muestra sensogramas de Biacore de mediciones de la cinética de múltiples ciclos de las proteínas de unión a trombina seleccionadas. La figura 5 divulga las SEQ ID NO 367-368, respectivamente, en orden de aparición. La figura 6 muestra un dibujo esquemático de un motivo N (base N terminal), un motivo A (hebra beta ascendente), un motivo R (aleatorio), un motivo D (hebra beta descendente) y un motivo C (base C terminal) (SEQ ID NO: 402) en un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN ILUSTRATIVOS
Como se usa en el presente documento, "polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca" significa un polipéptido que comprende secuencias de la región CDR H3 de un anticuerpo de vaca. Los polipéptidos de andamio de anticuerpos de vaca descritos en el presente documento son útiles para la presentación en ARNm de péptidos de interés y la síntesis in situ en una micromatriz de péptidos de los péptidos de interés para generar péptidos lineales o cíclicos.
En un modo de realización, el término "péptido" o "péptidos" en las frases "péptido de interés", "micromatriz de péptidos", "primera micromatriz de péptidos", "segunda micromatriz de péptidos", "péptido cíclico", "péptido lineal", "péptido funcionalizado"," péptido de unión al núcleo", "péptido cíclico maduro de interés", "péptido de secuencia de unión al núcleo maduro y extendido", "péptido cíclico extendido y maduro" y "colección de péptidos" no significa un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo ni un fragmento de péptido derivado de un anticuerpo.
En diversos modos de realización, los péptidos de interés, péptidos cíclicos, péptidos lineales, péptidos funcionalizados, péptidos de unión al núcleo, péptidos de interés cíclicos maduros, péptidos de unión al núcleo extendidos y maduros y péptidos cíclicos extendidos y maduros descritos en el presente documento pueden ser de 4 a 50 aminoácidos, de 4 a 40 aminoácidos, de 4 a 30 aminoácidos, de 4 a 20 aminoácidos, de 4 a 19 aminoácidos, de 4 a 18 aminoácidos, de 4 a 17 aminoácidos, de 4 a 16 aminoácidos, de 4 a 15 aminoácidos, de 4 a 14 aminoácidos, de 4 a 13 aminoácidos, de 4 a 12 aminoácidos, de 4 a 11 aminoácidos, de 4 a 10 aminoácidos, de 4 a 9 aminoácidos, de 4 a 8 aminoácidos, de 4 a 7 aminoácidos, de 4 a 6 aminoácidos, o los péptidos pueden tener 5 aminoácidos de longitud o aproximadamente 5 aminoácidos de longitud. Los aminoácidos descritos en el presente documento pueden ser aminoácidos naturales o no naturales.
En los modos de realización descritos en el presente documento, el término "aminoácido natural" se refiere a uno de los 20 aminoácidos que se encuentran típicamente en proteínas y se usan para la biosíntesis de proteínas, así como a otros aminoácidos que se pueden incorporar en las proteínas durante la traducción (incluyendo pirrolisina y selenocisteína). Los 20 aminoácidos naturales incluyen histidina, alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, glutamina, asparagina, treonina, arginina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, cisteína, metionina y lisina.
En los modos de realización descritos en el presente documento, el término "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que no está entre los codificados por el código genético estándar o se incorpora en las proteínas durante la traducción. Por lo tanto, los aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos o análogos de aminoácidos, los estereoisómeros D de aminoácidos, los análogos beta-amino de aminoácidos, citrulina, homocitrulina, homoarginina, hidroxiprolina, homoprolina, ornitina, 4-amino-fenilalanina, ciclohexilalanina, ácido aaminoisobutírico, W-metil-alanina, W-metil-glicina, norleucina, ácido W-metil glutámico, terc-butilglicina, ácido aaminobutírico, terc-butilalanina, ácido 2-aminoisobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 2-aminoindano-2-carboxílico, selenometionina, deshidroalanina, lantionina, ácido Y-aminobutírico y derivados de los mismos en los que el nitrógeno amínico está mono o dialquilado.
Varios modos de realización de la invención se describen en la sección Sumario de esta solicitud de patente y cada uno de los modos de realización descritos en esta sección de Descripción detallada de la solicitud se aplica a los modos de realización descritos en el Sumario, incluyendo los modos de realización descritos por las cláusulas enumeradas a continuación.
1. Un procedimiento para seleccionar un péptido de interés, comprendiendo el procedimiento las etapas de
a) preparar una colección de péptidos usando un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende el péptido de interés que se va a identificar;
b) seleccionar el péptido de interés de la colección de péptidos poniendo en contacto una molécula diana con el péptido de interés en el que la molécula diana se inmoviliza sobre un soporte sólido o está en solución; e
c) identificar la secuencia de aminoácidos del péptido de interés.
2. El procedimiento de la cláusula 1, en el que la etapa de preparación de la colección de péptidos comprende la etapa de transcripción in vitro de una colección de ADN para formar una colección de ARNm.
3. El procedimiento de la cláusula 2, que comprende además la etapa de digerir la colección de ADN con DNasa.
4. El procedimiento de la cláusula 2 o 3, que comprende además la etapa de conjugar el ARNm de la colección de ARNm con un conector oligonucleotídico de puromicina.
5. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 2 a 4, que comprende además la etapa de traducir in vitro el ARNm de la colección de ARNm para formar conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm que comprenden el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende una marca de purificación.
6. El procedimiento de la cláusula 5, que comprende además la etapa de purificar los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm usando la marca de purificación.
7. El procedimiento de la cláusula 5 o 6, que comprende además la etapa de retrotranscribir el ARNm de la colección de ARNm para formar híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm.
8. El procedimiento de la cláusula 7, en el que la etapa de selección comprende poner en contacto los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm con la molécula diana.
9. El procedimiento de la cláusula 8, que comprende además la etapa de regenerar el ADN de los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm.
10. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 2 a 9, en el que la colección de ADN es una colección de ADNc.
11. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 2 a 10, en el que la transcripción in vitro se realiza usando ARN polimerasa T7.
12. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 4 a 11, en el que el conector oligonucleotídico de puromicina se une al ARNm en el extremo 3' del ARNm.
13. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 5 a 12, en el que la marca de purificación es una marca FLAG.
14. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 2 a 13, en el que los miembros de la colección de ADN comprenden una secuencia promotora de ARN polimerasa, una secuencia potenciadora y una secuencia de marca de purificación.
15. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 5 a 13, en el que la marca de purificación es una marca C terminal.
16. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 1 a 15, en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia V1GfTSVHQF.TKKYQS(X*XSYTYNYF.HVDV\VOCC. (SEQ ID NO: 1) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
17. El procedimiento de la cláusula 16, en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X*)<SYTYNYF.HVDVWGCGSADYKDDDDK (SEQ ID NO: 2) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
18. El procedimiento de la cláusula 17, en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVIIQETK.KYQS(X*JtSYTYNYEíIVDVWGCGSADYKDDDDKKK (SEQ ID NO: 3) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
19. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 16 a 18 en el que X* comprende un aminoácido natural. 20. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 16 a 18 en el que X* comprende un aminoácido no natural.
21. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 16 a 20, en el que c es un número entero de 1 a 40.
22. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 16 a 20, en el que c es un número entero de 1 a 10.
23. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 1 a 22, que comprende además las etapas de:
a) sintetizar el péptido de interés, o derivados del mismo, en una primera micromatriz de péptidos, en el que los derivados del péptido de interés incluyen al menos una alteración en la secuencia del péptido de interés seleccionada de una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos, y una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos;
b) formar a partir de los péptidos funcionalizados, en los que los péptidos funcionalizados están en forma lineal, péptidos cíclicos de fórmula I
en la que cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector N terminal;
R7 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal, un grupo protector C terminal, y
cada R8 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
R9 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal y un grupo protector C terminal; Q se selecciona del grupo que consiste en un enlace, un carbonilo, una cadena lateral de aminoácido natural y una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada X e Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z;
Z es un grupo que comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida, un enlace disulfuro, un enlace isopeptídico, un 1,2,3-triazol y una 1,2-quinona opcionalmente sustituida;
cada L' y L" es independientemente un grupo de unión bivalente opcional o un enlace;
b es un número entero de 0 a 50;
m es un número entero de 0 a 6;
n es 0 o 1;
p es 0 o 1;
q es un número entero de 0 a 6;
r es 0 o 1;
s es un número entero de 0 a 100;
t es 0 o 1;
u es 0 o 1;
v es un número entero de 0 a 100;
w es 0 o 1; y * es un punto de conexión que conecta el péptido cíclico a un soporte de matriz que tiene una superficie reactiva; y *** es un punto de conexión con el resto del péptido funcionalizado;
comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un péptido funcionalizado de fórmula II en condiciones que hacen que se forme Z
en la que R1, R2 R3, R4, R5, R6, m, n, p, q, r, s, t, v, w, L', L", * y *** son como se define para la fórmula I;
R10 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal, un grupo protector C terminal, y
cada R11 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
R12 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal y un grupo protector C terminal; Q' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, un carbonilo, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
X' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
Y' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z' y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z';
cada Z' y Z" se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, -OH, hidrógeno, un tiol, una amina, un ácido carboxílico, una amida, un alquino, una acida, un aminofenol opcionalmente sustituido, una cadena lateral de aminoácido natural, una cadena lateral de aminoácido no natural, un grupo protector N terminal y un grupo protector C terminal, siempre que Z' y Z" sean grupos complementarios que se combinen para formar Z;
g es un número entero de 0 a 50; e
y es 0 o 1;
en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos se inmovilizan en la superficie reactiva;
c) exponer los péptidos cíclicos a la molécula diana, con lo que la molécula diana se une a al menos un péptido cíclico; d) identificar uno o más de los péptidos cíclicos que demuestran una fuerte unión a la molécula diana, con lo que se determina una secuencia de unión al núcleo madurada;
e) realizar al menos una de la extensión N terminal y C terminal de la secuencia de unión al núcleo madurada determinada en la etapa d para proporcionar una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada en una segunda micromatriz de péptidos;
f) exponer la molécula diana a la segunda micromatriz de péptidos que comprende una población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada generados en la etapa e en la que la población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada comprende péptidos cíclicos formados como en la etapa b; e g) identificar un péptido cíclico extendido y madurado con una fuerte unión a la molécula diana.
24. El procedimiento de la cláusula 23, en el que Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un
en el que d es un número entero de 0 a 6, e es un número entero de 0 a 6 y f es un número entero de 0 a 6, y ** es un punto de conexión con el resto del péptido cíclico.
25. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que Z comprende un enlace peptídico, Z" comprende un grupo protector N terminal, t es 0, u es 0 e y es 0.
26. El procedimiento de la cláusula 25, que comprende además eliminar Z" del resto del péptido funcionalizado para provocar que se forme el enlace peptídico.
27. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que Q y X son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Q' es un enlace a Z', Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína, t es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
28. El procedimiento de la cláusula 27, que comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S -S - **.
29. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Y' es un enlace a Z', Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína, t es 1, u es 1 e y es 1.
30. El procedimiento de la cláusula 29, que comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S -S - **.
32. El procedimiento de la cláusula 31, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
34. El procedimiento de la cláusula 33, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
35. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que Q es un enlace a Z, Z comprende Q' es un *** (H j C j ^
enlace a Z, Z comprende e Z" comprende una acida, e es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
36. El procedimiento de la cláusula 35, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
37. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que Y es un enlace a Z, Z comprende ? Y1 es un *** (H2c f =
enlace a Z, Z comprende e , Z" comprende una acida, e es 1, u es 1 e y es 1.
38. El procedimiento de la cláusula 37, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
40. El procedimiento de la cláusula 39, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
42. El procedimiento de la cláusula 41, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
43. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que R4, R10 y R11 se definen de modo que el péptido funcionalizado
comprende una secuencia de reconocimiento de butelasa 1, Y es un enlace a Z, Z comprende Y' es un enlace a Z', Z' es una cadena lateral de asparagina o ácido aspártico, u es 1 e y es 1.
44. El procedimiento de la cláusula 43, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con O
butelasa 1 para provocar que se forme JJ **.
45. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que Q y X son enlaces a Z, Z comprende Q1 es un enlace a Z\ X' es un enlace a Z", Z1 es una cadena lateral de glutamina y Z" es una Z' es una cadena lateral de lisina y Z" es una cadena lateral de glutamina, t es 1, u es 0, v e
46. El procedimiento de la cláusula 45, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con una
47. El procedimiento de la cláusula 23 o 24, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende X1 es un enlace a Z", Y1 es un enlace a Z\ Z1 es una cadena lateral de glutamina y Z" es una
Z' es una cadena lateral de lisina y Z" es una cadena lateral de glutamina, t es 1, u es 1 e y
48. El procedimiento de la cláusula 47, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con una
transglutaminasa microbiana para provocar que se forme h
49. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 48, en el que cada L' y L" es independientemente de la fórmula V
en la que cada R13 y R13' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10, heteroarilo de 5 a 7 miembros, -O R 14, -OC(O)R14, -N R 14R14', -N R 14C(O)R15, -C(O)R14, -C(O)OR14 y -C(O)NR14R14', en el que cada
átomo de hidrógeno en alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros está independientemente sustituido opcionalmente con halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, -O R 16; cada R14, R14', R15 y R16 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, hidroxilo, alquilo C1-C 7, alquenilo C2-C 7, alquinilo C2-C 7, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros; y h es un número entero de 1 a 10; o la fórmula VI o VII
en la que j es un número entero de 0 a 30.
50. El procedimiento de la cláusula 49, en el que cada R13 y R13' es hidrógeno.
51. El procedimiento de la cláusula 49 o 50, en el que L' está presente, h es 5, m es 0, n es 1 y p es 1.
52. El procedimiento de la cláusula 49, en el que al menos uno de L' y L" es de la fórmula VI o VII
en la que j es 7.
53. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 52, en el que el grupo protector N terminal es un grupo fotoprotector.
54. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 53, en el que el grupo protector N terminal es 2-(2-nitrofenil)propiloxicarbonilo.
55. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 1 a 22 que comprende además la etapa de sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca en una o más micromatrices de péptidos en las que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende el péptido de interés.
56. El procedimiento de la cláusula 55, que comprende las etapas de:
a) sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende el péptido de interés, o derivados del péptido de interés, en una primera micromatriz de péptidos, en el que los derivados del péptido de interés incluyen al menos una alteración en la secuencia del péptido de interés seleccionada de una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos, y una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos;
b) formar a partir de los péptidos funcionalizados, en los que los péptidos funcionalizados están en forma lineal, péptidos cíclicos de fórmula VIII
en la que cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R5 y R6 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido
cada R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector N terminal;
R8 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector; cada X e Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z;
Z es un grupo que comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida, un enlace disulfuro, un enlace isopeptídico, un 1,2,3-triazol y una 1,2-quinona opcionalmente sustituida;
L' es un grupo de unión bivalente opcional o un enlace;
m es un número entero de 0 a 6;
n es 0 o 1;
p es 0 o 1;
q es un número entero de 0 a 50;
r es un número entero de 0 a 50;
s es un número entero de 0 a 50;
t es un número entero de 0 a 50;
u es un número entero de 0 a 50; y * es un punto de conexión que conecta el péptido cíclico a un soporte de matriz que tiene una superficie reactiva;
comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un péptido funcionalizado de fórmula IX en condiciones que hacen que se forme Z
en la que R1, R2 R3, R4, R5, R6, R7 y R8, m, n, p, q, r, s, t, u, L' y * son como se define para la fórmula VIII;
X' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
Y' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z' y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z'; y
cada Z' y Z" se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, -OH, hidrógeno, un tiol, una amina, un ácido carboxílico, una amida, un alquino, una acida, un aminofenol opcionalmente sustituido, una cadena lateral de aminoácido natural, una cadena lateral de aminoácido no natural, un grupo protector N terminal y un grupo protector C terminal, siempre que Z' y Z" sean grupos complementarios que se combinen para formar Z;
en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos se inmovilizan en la superficie reactiva;
c) exponer los péptidos cíclicos a la molécula diana, con lo que la molécula diana se une a al menos un péptido cíclico; d) identificar uno o más de los péptidos cíclicos que demuestran una fuerte unión a la molécula diana, con lo que se determina una secuencia de unión al núcleo madurada;
e) realizar al menos una de la extensión N terminal y C terminal de la secuencia de unión al núcleo madurada determinada en la etapa d para proporcionar una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada en una segunda micromatriz de péptidos;
f) exponer la molécula diana a la segunda micromatriz de péptidos que comprende una población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada generados en la etapa e en la que la población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada comprende péptidos cíclicos formados como en la etapa b; e g) identificar un péptido cíclico extendido y madurado con una fuerte unión a la molécula diana.
57. El procedimiento de la cláusula 56, en el que Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un
en el que d es un número entero de 0 a 6, e es un número entero de 0 a 6 y f es un número entero de 0 a 6, y ** es un punto de conexión con el resto del péptido cíclico.
58. El procedimiento de la cláusula 56 o 57, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Y' es un enlace a Z', y Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína.
59. El procedimiento de la cláusula 58, que comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S -S - **.
61. El procedimiento de la cláusula 60, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
*** ( h 2c ) =
enlace a Z', Z'comprende e , Z" comprende una acida y e es 1.
63. El procedimiento de la cláusula 62, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
65. El procedimiento de la cláusula 64, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
X' es un enlace a Z", Y' es un enlace a Z', y Z' es una cadena lateral de glutamina y Z" es una cadena lateral de Usina o Z' es una cadena lateral de lisina y Z" es una cadena lateral de glutamina.
67. El procedimiento de la cláusula 66, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con una
68. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 56 a 67, en el que L' es de la fórmula (X)
— (-c r 13r 133 -
fX)
en la que cada R13 y R13' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10, heteroarilo de 5 a 7 miembros, -O R 14, -OC(O)R14, -N R 14R14', -N R 14C(O)R15, -C(O)R14, -C(O)OR14 y -C(O)NR14R14', en el que cada átomo de hidrógeno en alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros está independientemente sustituido opcionalmente con halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, -O R 16; cada R14, R14', R15 y R16 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, hidroxilo, alquilo C1-C 7, alquenilo C2-C 7, alquinilo C2-C 7, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros; y h es un número entero de 1 a 10; o la fórmula XI o XII
en la que j es un número entero de 0 a 30.
69. El procedimiento de la cláusula 68, en el que cada R13 y R13' es hidrógeno.
70. El procedimiento de la cláusula 68 o 69, en el que L' está presente, h es 5, m es 0, n es 1 y p es 1.
71. El procedimiento de la cláusula 68, en el que L' es de la fórmula XI o XII
en la que j es 7.
72. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 56 a 71, en el que el grupo protector N terminal es un grupo fotoprotector.
73. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 56 a 72, en el que el grupo protector N terminal es 2-(2-nitrofenil)propiloxicarbonilo.
74. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 73, en el que se realiza al menos uno de un análisis sin marcador y uno de afinidad de los péptidos de secuencia de unión al núcleo extendidos y madurados. 75. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 74, en el que la primera o segunda micromatriz de péptidos comprende al menos uno de compuesto de vidrio, plástico y carbono.
76. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 75, en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos en la primera o la segunda micromatriz de péptidos comprenden el mismo número de aminoácidos.
77. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 76, en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos en la primera o la segunda micromatriz de péptidos no incluyen el aminoácido cisteína o metionina, o los motivos de histidina-prolina-glutamina, o repeticiones de aminoácidos de 2 o más aminoácidos.
78. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 77, en el que la población de péptidos de secuencia de unión al núcleo extendidos y madurados incluye al menos uno de un oligopéptido de síntesis con titubeo N terminal y un oligopéptido de síntesis con titubeo C terminal.
79. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 23 a 54 y 56 a 78, en el que la primera o segunda micromatriz de péptidos comprende uno o más péptidos lineales y en el que el procedimiento comprende además la etapa de poner en contacto los uno o más péptidos lineales en la primera o segunda micromatriz de péptidos con una proteasa que pueda digerir los uno o más péptidos lineales.
80. El procedimiento de la cláusula 79, en el que la proteasa es una amino proteasa o una mezcla de amino proteasas.
81. El procedimiento de la cláusula 79, en el que la proteasa es dipeptidil peptidasa IV, aminopeptidasa m o una combinación de las mismas.
82. Un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende un péptido de interés.
83. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de la cláusula 82 que comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X% SYTYNYEHV[)VW (¡C(i (SEQ ID NO: 1) en el que (X*)c es una secuencia de
aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
84. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de la cláusula 82 que comprende la secuencia MGCTSVHQETKK.YQS(X*)cSYTYNYEHVDVWGCGSADYKDDDDK (SEQ ID NO: 2) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
85. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de la cláusula 82 que comprende la secuencia MG(TSYMIQETKKYQS(X*)cSYTYNYElIVDVWGCGSADYKDDDDKKK. (SEQ ID NO: 3) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
86. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 85 en el que X* comprende un aminoácido natural.
87. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 85 en el que X* comprende un aminoácido no natural.
88. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 87, en el que c es un número entero de 1 a 40.
89. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 87, en el que c es un número entero de 1 a 10.
90. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de una cualquiera de las cláusulas 83 a 89 en el que (X*)c comprende la secuencia del péptido de interés.
91. El polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm de la cláusula 90 en el que el péptido de interés es un péptido terapéutico.
92. Una micromatriz de péptidos que comprende un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende un péptido de interés.
93. La micromatriz de péptidos de la cláusula 92, en la que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X*kSYTYNYEHVDVWGCG (SEQ ID NO: 1) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
94. La micromatriz de péptidos de la cláusula 92, en la que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X*)<SYTYNYEHVDVWGCGSADYKDDDDK (SEQ ID NO: 2) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
95. La micromatriz de péptidos de la cláusula 92, en la que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVHQETKKYQS(X*)cSYTYNYEHVDVWGCGSADYKDDDDKKK (SEQ ID NO: 3) en el que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en el que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
96. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 95, en la que X* comprende un aminoácido natural.
97. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 95 en la que X* comprende un aminoácido no natural.
98. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 97, en la que c es un número entero de 1 a 40.
99. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 97, en la que c es un número entero de 1 a 10.
100. La micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 93 a 99 en la que (X*)c comprende la secuencia del péptido de interés.
101. La micromatriz de péptidos de la cláusula 100 en la que el péptido de interés es un péptido terapéutico.
102. El procedimiento, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm o la micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 1 a 101, en los que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria y el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria comprende la secuencia del péptido de interés.
103. El procedimiento, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm o la micromatriz de péptidos de la cláusula 102, en los que el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria no incluye la secuencia de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo o un fragmento de péptido derivado de un anticuerpo.
104. El procedimiento de la cláusula 43 o 44 en el que la secuencia de reconocimiento de butelasa 1 es NHV-
105. El procedimiento de la cláusula 45, 46, 66 o 67, en el que la cadena lateral de glutamina es parte de la secuencia [WY][DE][DE][YW]ALQ[GST]YD (SEQ ID NO: 4) y la cadena lateral de Usina es parte de la secuencia RSKLti (SEQ ID NO: 5).
106. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 1 a 22 que comprende además la etapa de sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende el péptido de interés en una micromatriz de péptidos para madurar y/o extender el péptido de interés o la etapa de sintetizar el péptido de interés en una micromatriz de péptidos para madurar y/o extender el péptido de interés.
107. El procedimiento, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm o la micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 1 a 101, en los que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria en los que el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria comprende la secuencia del péptido de interés y en los que el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria se usa para la selección de péptidos de interés.
108. Un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria.
En cualquiera de los diversos modos de realización descritos en el presente documento, los siguientes rasgos característicos pueden estar presentes donde corresponda, proporcionando modos de realización adicionales de la invención. Para todos los modos de realización, también se contempla cualquier combinación aplicable de modos de realización.
Presentación en ARNm usando polipéptidos de andamio de anticuerpos de vaca
En un modo de realización de los procedimientos y composiciones descritos en el presente documento, la presentación en ARNm se puede usar como un procedimiento para seleccionar un péptido de interés. En modos de realización alternativos, se pueden usar otras técnicas de presentación para seleccionar péptidos de interés, que incluyen, pero sin limitarse a, la presentación en fagos, la presentación en superficie de levadura, la presentación en ADNc y la presentación en ribosomas.
La presentación en ARNm es una técnica de presentación y selección usada para la identificación in vitro de péptidos, por ejemplo, que tienen propiedades deseadas y se pueden unir a una molécula diana de interés con alta afinidad. La presentación en ARNm da como resultado péptidos traducidos que están asociados con su ARNm molde por medio de un enlace aceptor de peptidilo. Para lograr un complejo de este tipo, se puede usar un conector aceptor de peptidilo, tal como puromicina, que es un análogo terminal de ARNt acilado. Por ejemplo, se puede unir puromicina al extremo 3' del ARNm por medio de un conector adecuado, y el conjugado unido se añade a una reacción de traducción in vitro para incorporar puromicina al sitio A del ribosoma, y para formar un enlace covalente entre la puromicina y un péptido en el proceso de alargamiento. Los conjugados de fusión ARNm-péptido (por ejemplo, los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm descritos en el presente documento) se pueden retrotranscribir a ADN (por ejemplo, para formar los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm descritos en el presente documento). Los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm se pueden unir a una molécula diana inmovilizada o una molécula diana en solución en una etapa de selección, tal como cromatografía de afinidad. Se pueden aislar híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm que se unen fuertemente a la molécula diana, y su secuencia se puede amplificar por medio de PCR. El resultado es una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido que se puede unir con alta afinidad a la molécula diana. Usando la presentación en ARNm, se pueden crear diversas colecciones de péptidos con un gran número de secuencias aleatorias (por ejemplo, del orden de 1013 secuencias aleatorias o 1013 secuencias aleatorias con diez aminoácidos aleatorios).
Los procedimientos para la presentación en ARNm son bien conocidos en la técnica y se describen en Roberts et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 1997, 94:12297-12302, Nemoto et al., FEBS Lett., 1997, 414:405-408, Keefe et al., Nature, 2001, 410:715-718, Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98:3750-3755; Cho et al., J Mol Biol., 2000, 297:309-319, las patentes de EE. UU. n.os 6.258.558, 6.261.804, 6.214.553, 6.281.344, 6.207.446 y 6.518.018, el
documento WO 98/16636, el documento WO 00/34784, el documento WO 01/64942, el documento WO 02/032925 y el documento WO 98/31700. Los procedimientos de tecnología de ADN recombinante, incluyendo, pero sin limitarse a, la preparación de colecciones de ADN, los procedimientos de transcripción in vitro y de traducción in vitro, los procedimientos de retrotranscripción y la regeneración del ADN usada en la presentación en ARNm también son bien conocidos en la técnica y se describen en Sambrook etal., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001).
En un aspecto, la transcripción y traducción in vitro se puede llevar a cabo en un sistema libre de células tal como, por ejemplo, un extracto de germen de trigo, un lisado de reticulocitos de conejo, un extracto de Escherichia coli S30 o un sistema disponible comercialmente (por ejemplo, Síntesis de proteínas in vitro PURExpress, New England BioLabs, Inc.; Sistema de transcripción/traducción de acoplamiento rápido TNT T7 (Promega, Madison, Wisconsin)).
En un modo de realización, los péptidos traducidos en la presentación en ARNm se asocian con su ARNm molde por medio de un enlace aceptor de peptidilo. Un enlace aceptor de peptidilo se puede referir a cualquier molécula que se pueda añadir al extremo C de una cadena peptídica o proteica en crecimiento por la actividad catalítica de una peptidil transferasa ribosómica. Típicamente, dichos enlaces contienen (i) un nucleótido o un resto similar a un nucleótido (por ejemplo, puromicina y análogos de la misma), (ii) un aminoácido o un resto similar a un aminoácido (por ejemplo, cualquiera de los 20 aminoácidos D o L o cualquiera de los análogos de aminoácidos de los mismos (por ejemplo, 0-metil tirosina o cualquiera de los análogos descritos por Ellman et al., Meth. Enzymol., 202:301 (1991), incorporados en el presente documento por referencia), y (iii) un enlace entre los dos (por ejemplo, un enlace éster, amida o cetona en la posición 3' o, menos preferentemente, la posición 2').
En algunos modos de realización, el enlace aceptor de peptidilo es una estructura similar a ARNt distinta de la puromicina. Dichos compuestos incluyen, sin limitación, cualquier compuesto que posea un aminoácido unido a una adenina o un compuesto similar a adenina, tales como nucleótidos de aminoácidos, fenilalanil-adenosina (A-Phe), tirosil adenosina (A-Tyr) y alanil adenosina (A-Ala), así como estructuras unidas a amida, tales como fenilalanil 3' desoxi 3' amino adenosina, alanil 3' desoxi 3' amino adenosina y tirosil 3' desoxi 3' amino adenosina; en cualquiera de estos compuestos, se puede usar cualquiera de los aminoácidos L naturales o sus análogos. Además, también se puede usar un conjugado de estructura 3' similar a ARNt-puromicina.
En algunos modos de realización, los conjugados de fusión de ARNm-péptido (por ejemplo, los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm descritos en el presente documento) se purifican antes de la unión a la molécula diana, por ejemplo, por cromatografía de afinidad. En determinados modos de realización, los conjugados de fusión de ARNm-péptido (por ejemplo, los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm descritos en el presente documento) se purifican mediante la unión a un anticuerpo específico para un epítopo presente en el componente peptídico de los conjugados de fusión. El epítopo, por ejemplo, puede ser una marca de secuencia de aminoácidos, por ejemplo, marcas FLAG o HA, incorporadas en la secuencia de aminoácidos del componente peptídico de los conjugados de fusión ARNm-péptido (por ejemplo, los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm descritos en el presente documento), por ejemplo, en la región N terminal o C terminal.
En algunos aspectos, antes de la unión a la molécula diana, los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm se pueden retrotranscribir. En otro modo de realización, para unir los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm (formados después de la retrotranscripción) a la molécula diana de interés, la colección de híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm se incuban con la molécula diana. Típicamente, la molécula diana se inmoviliza sobre un soporte sólido, tal como una microesfera, pero los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm se pueden poner en contacto con la molécula diana en solución, o se puede usar una combinación de estos procedimientos. Después de que los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm se incuban con la molécula diana, por ejemplo, inmovilizados sobre un soporte sólido, los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm que se unen a la molécula diana permanecen asociados con la molécula diana, y las moléculas que no se unen se eliminan mediante lavado. Los soportes sólidos ejemplares incluyen, por ejemplo, una resina epoxídica, una columna de agarosa, una columna SEPHAROSE™ o un chip BIACORE™. En algunos modos de realización, se puede usar a continuación PCR para amplificar el ADN capturado (es decir, denominado en el presente documento regenerar el ADN), ahora enriquecido para secuencias que codifican péptidos que se unen con alta afinidad a la molécula diana. Un experto en la técnica puede determinar qué constituye una unión de alta afinidad para cualquier interacción específica péptido-molécula diana.
En un aspecto ilustrativo, la población enriquecida se puede introducir a continuación en rondas adicionales de selección de presentación en ARNm. En cualquiera de los modos de realización descritos en el presente documento, se pueden preparar colecciones adicionales de ADN y péptidos para rondas adicionales de selección mediante generación de mutantes usando, por ejemplo, PCR propensa a errores. Estas colecciones adicionales se pueden transcribir y traducir in vitro siguiendo etapas similares a las de la primera ronda de selección. Los péptidos de interés adicionales presentados en ARNm se pueden someter a rondas adicionales de cribado frente a la misma molécula diana para seleccionar péptidos de interés con mayor afinidad que el/los seleccionado(s) de la primera ronda de
selección. En un aspecto, se pueden realizar múltiples rondas de selección. En un modo de realización ilustrativo, se puede secuenciar el ADN que codifica un péptido de interés (es decir, un péptido que se une a la molécula diana con alta afinidad) y se puede generar y caracterizar el péptido.
En un modo de realización descrito en el presente documento, se proporciona un procedimiento para seleccionar un péptido de interés. El procedimiento comprende las etapas de a) preparar una colección de péptidos usando un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende un péptido de interés que se va a identificar, b) seleccionar el péptido de interés de la colección de péptidos poniendo en contacto una molécula diana con el péptido de interés en el que la molécula diana se inmoviliza sobre un soporte sólido o está en solución y c) identificar la secuencia de aminoácidos del péptido de interés.
En un aspecto ilustrativo, la presentación en ARNm puede incluir las etapas de 1) preparar una colección de péptidos mediante la transcripción in vitrode una colección de ADN para formar una colección de ARNm, 2) digerir la colección de ADN con DNasa para eliminar el ADN, conjugando el ARNm de la colección de ARNm con un conector, tal como un conector oligonucleotídico de puromicina, 3) traducir in vitro el ARNm de la colección de ARNm para formar conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm (por ejemplo, donde el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca está unido al ARNm por un conector, tal como un conector oligonucleotídico de puromicina), 4) purificar los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm usando una marca de purificación que es parte del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca, 5) retrotranscribir el ARNm de la colección de ARNm para formar híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm, 6) poner en contacto los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm con la molécula diana para seleccionar un péptido de interés, y 7) regenerar el ADN a partir de los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm.
En este modo de realización de presentación en ARNm, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca puede comprender la secuencia
M G C TS VH Q E TK KY Q S(X*)cSYTYN YE H V D V W G C G (SEQ ID NO:1) M G C TSVH Q E TK KY Q S(X*)cSY TYN YE H V D V W G C G SAD Y KD D D D K (SEQ ID NO:2) o V 1G C TS V H Q ETK.K YQ S (X *)cSYTY N Y EH VD VY VG C G S AD YK .D D D D KK K (SEQ ID NO: 3)
en la que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en la que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria. En un modo de realización, X* puede comprender un aminoácido natural o un aminoácido no natural. En otro modo de realización, c puede ser un número entero de 1 a 5, 1 a 6, 1 a 7, 1 a 8, 1 a 9, 1 a 10, 1 a 11, 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 29, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39 o 1 a 40. En un modo de realización ilustrativo, (X*)c puede comprender la secuencia del péptido de interés. En otro modo de realización, el péptido de interés es un péptido terapéutico.
En un modo de realización, los polipéptidos de andamio de anticuerpos de vaca descritos en el presente documento comprenden un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria. El casete de secuencia de aminoácidos aleatoria incluye una secuencia de aminoácidos aleatoria para la selección de péptidos de interés, y se indica como (X*)c en el modo de realización ejemplar anterior.
En este modo realización de presentación en ARNm, la colección de ADN puede ser una colección de ADNc, la transcripción in vitro se puede realizar usando una ARN polimerasa, tal como la ARN polimerasa T7, el conector, tal como un conector oligonucleotídico de puromicina, se puede unir al ARNm en el extremo 3' del ARNm, la marca de purificación que forma parte del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca puede ser cualquier marca de purificación adecuada, tal como una marca FLAG, una AviTag, una marca HA, una marca His o cualquier otra marca de purificación adecuada conocida en la técnica, y puede estar en el extremo N o el extremo C del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca, y los miembros de la colección de ADN pueden comprender una secuencia promotora de ARN polimerasa, una secuencia potenciadora y una secuencia de marca de purificación.
En otro modo de realización, se proporciona un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende un péptido de interés. En diversos aspectos, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca puede comprender la secuencia
M G C TS VH Q E TK KY Q S(X*)cSY TYN YE H V D V W G C G (SEQ ID NO:1) M G C TS VH Q E TK K Y Q S ÍX ^cS Y TY N Y E H V D V W G C G S A D Y K D D D D K (SEQ ID NO:2) o M G C TSVH Q ETKKYQ S(X*)cS Y TYN YE H V D V W G C G SAD YK D D D D KK K (SEQ ID NO: 3)
en la que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en la que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria. En un modo de realización, X* puede comprender un aminoácido natural o un aminoácido no natural. En otro modo de realización, c puede ser un número entero de 1 a
5, 1 a 6, 1 a 7, 1 a 8, 1 a 9, 1 a 10, 1 a 11, 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 29, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39 o 1 a 40. En un modo de realización ilustrativo, (X*)c puede comprender la secuencia del péptido de interés. En otro modo de realización, el péptido de interés es un péptido terapéutico. En un modo de realización, los polipéptidos de andamio de anticuerpos de vaca descritos en el presente documento comprenden un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria. El casete de secuencia de aminoácidos aleatoria incluye una secuencia de aminoácidos aleatoria para la selección de péptidos de interés, y se indica como (X*)c en el modo de realización ejemplar anterior.
En otros modos de realización, se pueden usar otros polipéptidos de andamio de anticuerpos de vaca como sigue. En un modo de realización, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca puede comprender un motivo N (base N terminal), un motivo A (hebra beta ascendente), un motivo R (aleatorio), un motivo D (hebra beta descendente) y un motivo C (base C terminal) (véase la figura 6 por ejemplo). En un modo de realización, el motivo N puede comprender un péptido seleccionado del grupo que consiste en CTTVHQ (SEQ ID NO:6), CTSVHQ (SEQ ID NO:7), CSSVTQ (SEQ ID NO:8), CSTVHQ (SEQ ID NO:9), CATVRQ (SEQ ID NO:10), CSPVHQ (SEQ ID NO:11), CATVYQ (SEQ ID NO:12), CTAVYQ (SEQ ID NO:13), CTNVHQ (SEQ ID NO:14), CATVHQ (SEQ ID NO:15), CTTVRQ (SEQ ID NO:16), CSTVYQ (SEQ ID NO:17). CTIVHQ (SEQ ID NO:18). CAIVYQ (SEQ ID NO:19), CTTVYQ (SEQ ID NO:20). CTTVFQ (SEQ ID NO:21). CAAVFQ (SEQ ID NO:22). CGTVHQ (SEQ ID NO:23), CASVHQ (SEQ ID NO:24), CTAVFQ (SEQ ID NO:25), CATVFQ (SEQ ID NO:26). CAAAHQ (SEQ ID NO:27), CVWYQ (SEQ ID NO:28), CGTVFQ (SEQ ID NO:29), CGAVHQ (SEQ ID NO:30). CATKKQ (SEQ ID NO:31), CITVHQ (SEQ ID NO:32), CTIVHQ (SEQ ID NO:33), CITAHQ (SEQ ID NO:34). CVIVHQ (SEQ ID NO:35), CTIVNQ (SEQ ID NO:36), CAAVHQ (SEQ ID NO:37), CGTVYQ (SEQ ID NO:38). CVTVHQ (SEQ ID NO:39), CTTVLQ (SEQ ID NO:40), CTTTHQ (SEQ ID NO: 41) y CTTDYQ (SEQ ID NO: 42). En otro modo de realización, el motivo A puede comprender un péptido seleccionado del grupo que consiste en ETKKYQS (SEQ ID NO:43), ETRKT (SEQ ID NO:44), RTHVSRS (SEQ ID NO:45), KTTRKTC (SEQ ID NO:46), IF (SEQ ID NO:47). KTRTTQGNT (SEQ ID NO:48), TTLRD (SEQ ID NO:49).
KTRTTQGEYLSLMVTLLKDD (SEQ ID NO:50), KTRTTQGNNLSLMVTLLKDD (SEQ ID NO:51), KTRTTQGNT (SEQ ID NO:52), KPGQHKGILVLMVTLLKDD (SEQ ID NO:53), KTRTTQGILVLMVTLLKDD (SEQ ID NO:54), ETKKN (SEQ ID NO:55), EIRKC (SEQ ID NO:56), QTRKC (SEQ ID NO:57), QTRKS (SEQ ID NO:58), KTNQSKN (SEQ ID NO:59), TTHQIHT (SEQ ID NO:60), KTTSIRS (SEQ ID NO:61), KTKKT (SEQ ID NO:62), KTKKL (SEQ ID NO:63), HTNKKR (SEQ ID NO:64). HTNQNR (SEQ ID NO:65), KTNER (SEQ ID NO:66). KTNERC (SEQ ID NO:67), KTNRERC (SEQ ID NO:68), STNKKD (SEQ ID NO:69), ETLIR (SEQ ID NO:70), KTRTT (SEQ ID NO:71), KTNREMS (SEQ ID NO:72), ETKRS (SEQ ID NO:73). RTRQR (SEQ ID NO:74). KTETR (SEQ ID NO:75). KTNKKES (SEQ ID NO:76). KSRKESS (SEQ ID NO:77), ETRTN (SEQ ID NO:78). KTEKH (SEQ ID NO:79). KTKEL (SEQ ID NO:80). HTEPT (SEQ ID NO:81).
ETRKS (SEQ ID NO:82), ETRKD (SEQ ID NO:83), ETKKS (SEQ ID NO:84), KTRTTQGNT (SEQ ID NO:85), KTNSQKS (SEQ ID NO:86). QTHKVRD (SEQ ID NO:87), RTGQK (SEQ ID NO:88), KTKQN (SEQ ID NO:89), QTHEKRS (SEQ ID NO:90), QTKRKSG (SEQ ID NO:91), ETKRT (SEQ ID NO:92), ETQKS (SEQ ID NO:93), ETHKR (SEQ ID NO:94), ETHKN (SEQ ID NO:95), QTHATRR (SEQ ID NO:96). RTEGQQS (SEQ ID NO:97), ETKTKSG (SEQ ID NO:98), HTKEIKT (SEQ ID NO:99). ETHQQRG (SEQ ID NO:100), KTEKK (SEQ ID NO:101). RTQKS (SEQ ID NO:102). QTNKR (SEQ ID NO:103), ETQRTS (SEQ ID NO:104). KDKH (SEQ ID NO:105), QTTEKGKT (SEQ ID NO:106). KTDVT (SEQ ID NO:107), ETHTQRT (SEQ ID NO:108), KTEKS (SEQ ID NO:109), KTNQKWG (SEQ ID NO:110), ETRTN (SEQ ID NO:111), KTTTTKS (SEQ ID NO:112), KTEQR (SEQ ID NO:113), MTIKT (SEQ ID NO:114), KTESVRS (SEQ ID NO:115), QTTNR (SEQ ID NO:116), LTKKT (SEQ ID NO:117), KTTQQS (SEQ ID NO:118).
HTNKKR (SEQ ID NO:119), QTRKS (SEQ ID NO:120), KTARS (SEQ ID NO:121), IC (SEQ ID NO:122), QTTKR (SEQ ID NO:123), LTRAH (SEQ ID NO:124), RTEKS (SEQ ID NO:125), RTKRS (SEQ ID NO:126), ITHKE (SEQ ID NO:127), HTTTKNT (SEQ ID NO:128), KTLEKT (SEQ ID NO:129), EVQKKT (SEQ ID NO:130), KTQRS (SEQ ID NO: 131), ETKTRST (SEQ ID NO:132), RTTTERS (SEQ ID NO:133), KTQRT (SEQ ID NO:134), y KTRTTQGNT (SEQ ID NO: 135). Aún en otro modo de realización, el D puede comprender un péptido seleccionado del grupo que consiste en CYTYNYEF
(SEQ ID NO:136), HYTYTYDF (SEQ ID NO:137). HYTYTYEW (SEQ ID NO:138). KHRYTYEW (SEQ ID NO:139), NYIYKYSF (SEQ ID NO:140). PYIYTYQF (SEQ ID NO:141), SFTYTYEW (SEQ ID NO:142), SYIYIYQW (SEQ ID NO:143), SYNYTYSW (SEQ ID NO:144). SYSYSYEY (SEQ ID NO:145), SYTYNYDF (SEQ ID NO:146). SYTYNYEW (SEQ ID NO:147), SYTYNYQF (SEQ ID NO:148). SYVWTHNF (SEQ ID NO:149), TYKYVYEW (SEQ ID NO:150).
TYTYTYEF (SEQ ID NO:151), TYTYTYEW (SEQ ID NO:152), VFTYTYEF (SEQ ID NO:153), AYTYEW (SEQ ID NO:154), DYIYTY (SEQ ID NO:155). IHSYEF (SEQ ID NO:156), SFTYEF (SEQ ID NO:157). SHSYEF (SEQ ID NO:158), THTYEF (SEQ ID NO:159), TWTYEF (SEQ ID NO:160), TYNYEW (SEQ ID NO:161), TYSYEF (SEQ ID NO:162), TYSYEH (SEQ ID NO:163), TYTYDF (SEQ ID NO:164), TYTYEF (SEQ ID NO:165), TYTYEW (SEQ ID NO:166), AYEF (SEQ ID NO:167), AYSF (SEQ ID NO:168), AYSY (SEQ ID NO:169). CYSF (SEQ ID NO:170), DYTY (SEQ ID NO:171). KYEH (SEQ ID NO:172), KYEW (SEQ ID NO:173). MYEF (SEQ ID NO:174), NWIY (SEQ ID NO:175), NYDY (SEQ ID NO:176), NYQW (SEQ ID NO:177), NYSF (SEQ ID NO:178), PYEW (SEQ ID NO:179), RYNW (SEQ ID NO:180), RYTY (SEQ ID NO:181), SYEF (SEQ ID NO:182), SYEH (SEQ ID NO:183), SYEW (SEQ ID NO:184), SYKW (SEQ ID NO:185), SYTY (SEQ ID NO:186), TYDF (SEQ ID NO:187). TYEF (SEQ ID NO:188), TYEW (SEQ ID NO:189), TYQW (SEQ ID NO:190), TYTY (SEQ ID NO:191), y VYEW (SEQ ID NO: 192). Todavía en otro modo de realización ilustrativo, el motivo C puede comprender un péptido seleccionado del grupo que consiste en yvdaw
(SEQ ID NO: 193), HVDVW (SEQ ID NO:194). HVDAW (SEQ ID NO:195). GVDAW (SEQ ID NO:196), VIDAW (SEQ ID NO:197), HVDSW (SEQ ID NO:198), HIDAW (SEQ ID NO:199), YVDTW (SEQ ID NO:200), NVDAW (SEQ ID NO:201). HVNAW (SEQ ID NO:202). YVTAW (SEQ ID NO:203). YITAW (SEQ ID NO:204), YVEAW (SEQ ID NO:205). HVDEW (SEQ ID NO:206), HVDTW (SEQ ID NO:207), YADAW (SEQ ID NO:208), YGDAW (SEQ ID NO:209), HADAW (SEQ ID NO:210), YVEAW (SEQ ID NO:211), NVDSW (SEQ ID NO:212), NVDAW (SEQ ID NO:213). GVDAW (SEQ ID NO:214), NIDAW (SEQ ID NO:215). RIDVM (SEQ ID NO:216). YVETW (SEQ ID NO:217). YVNAW (SEQ ID NO:218), HADVW (SEQ ID NO:219), HVESW (SEQ ID NO:220). HVETW (SEQ ID NO:221).
NVEAW (SEQ ID NO:222), YVDSW (SEQ ID NO:223). y RVDTW (SEQ ID NO: 224). En otro aspecto, el motivo R puede ser una secuencia de aminoácidos aleatoria (X*)c, en la que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
En los diversos modos de realización descritos en el presente documento, la molécula diana puede ser cualquier molécula, incluyendo, pero sin limitarse a, una biomacromolécula, tal como una proteína, un péptido, un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN), un policarbohidrato o una molécula pequeña tal como un compuesto orgánico o un complejo organometálico, o cualquier otra molécula que contribuya a una enfermedad, tal como las enfermedades enumeradas a continuación (por ejemplo, un receptor para el péptido terapéutico, una enzima inhibida o activada por el péptido terapéutico, o cualquier otra molécula en la que la actividad de la molécula se altera por el péptido terapéutico). En un modo de realización, la molécula diana puede ser una molécula implicada en un estado de enfermedad y el péptido de interés o el péptido cíclico pueden ser un péptido terapéutico.
En el modo de realización donde el péptido de interés o el péptido cíclico es un péptido terapéutico, la enfermedad que se trata se puede seleccionar del grupo que consiste en cáncer, una enfermedad infecciosa, cardiopatía (por ejemplo, ateroesclerosis) y otras enfermedades relacionadas con el colesterol, apoplejía, heridas, dolor, una enfermedad inflamatoria, tal como artritis (por ejemplo, artritis reumatoide), enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, diabetes mellitus o una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad respiratoria, tal como asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedades diarreicas, una enfermedad genética, un trastorno neurológico, tal como enfermedad de Alzheimer, distrofia muscular o enfermedad de Parkinson, un trastorno mental o cualquier otro tipo de enfermedad que se pueda tratar con un péptido terapéutico (por ejemplo, un péptido cíclico).
En otros modos de realización, la enfermedad puede ser un cáncer seleccionado del grupo que consiste en un carcinoma, un sarcoma, un linfoma, un melanoma, un mesotelioma, un carcinoma nasofaríngeo, una leucemia, un adenocarcinoma y un mieloma. Aún en otros modos de realización, la enfermedad puede ser un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de recto, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, enfermedad hodgkiniana, cáncer de esófago, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, mesotelioma, cáncer de vejiga, linfoma de Burkitt, cáncer de riñón y cáncer cerebral, o cualquier otro tipo de cáncer que se pueda tratar con un péptido terapéutico (por ejemplo, un péptido cíclico).
Micromatrices de péptidos y su uso
En un modo de realización, se proporciona una micromatriz de péptidos que comprende un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende un péptido de interés. En otro modo de realización, se proporciona una micromatriz de péptidos que comprende el péptido de interés identificado usando el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca.
En diversos aspectos, el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca puede comprender la secuencia MGCTSVHQF.TKKYQS(X*)tSYTYNYF.NVDVWGCG (SEQ ID NO: 1), MGCTSVHQETKKYQS(X*)iSYTYNYEHVDV\VGCGSADYKDDDDK (SEQ ID NO: 2) o MGCTSVHQF.TKKYQ S(X*KSYTYNYFFIVDVWGCGSADYKDDDDKKK (SEQ ID NO: 3) en la que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en la que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria. En un modo de realización, X* puede comprender un aminoácido natural o un aminoácido no natural. En otro modo de realización, c puede ser un número entero de 1 a 5, 1 a 6, 1 a 7, 1 a 8, 1 a 9, 1 a 10, 1 a 11, 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 29, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39 o 1 a 40. En un modo de realización ilustrativo, (X*)c puede comprender la secuencia del péptido de interés. En otro modo de realización, el péptido de interés es un péptido terapéutico.
En un modo de realización, los polipéptidos de andamio de anticuerpos de vaca descritos en el presente documento comprenden un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria. El casete de secuencia de aminoácidos aleatoria incluye una secuencia de aminoácidos aleatoria para la selección de péptidos de interés, y se indica como (X*)c en el modo de realización ejemplar anterior.
En estos modos de realización, el término "aminoácido natural" se refiere a uno de los 20 aminoácidos que se encuentran típicamente en proteínas y se usan para la biosíntesis de proteínas, así como a otros aminoácidos que se
pueden incorporar en las proteínas durante la traducción (incluyendo pirrolisina y selenocisteína). Los 20 aminoácidos naturales incluyen histidina, alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, glutamina, asparagina, treonina, arginina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, cisteína, metionina y lisina.
En estos modos de realización, el término "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que no está entre los codificados por el código genético estándar o se incorpora en las proteínas durante la traducción. Por lo tanto, los aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a aminoácidos o análogos de aminoácidos, los estereoisómeros D de aminoácidos, los análogos beta-amino de aminoácidos, citrulina, homocitrulina, homoarginina, hidroxiprolina, homoprolina, ornitina, 4-amino-fenilalanina, ciclohexilalanina, ácido a-aminoisobutírico, W-metilalanina, W-metil-glicina, norleucina, ácido W-metil glutámico, ferc-butilglicina, ácido a-aminobutírico, ferc-butilalanina, ácido 2-aminoisobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 2-aminoindano-2-carboxílico, selenometionina, deshidroalanina, lantionina, ácido Y-aminobutírico y derivados de los mismos en los que el nitrógeno amínico está mono o dialquilado.
En el modo de realización donde el péptido de interés o el péptido cíclico es un péptido terapéutico, la enfermedad que se trata se puede seleccionar del grupo que consiste en cáncer, una enfermedad infecciosa, cardiopatía (por ejemplo, ateroesclerosis) y otras enfermedades relacionadas con el colesterol, apoplejía, heridas, dolor, una enfermedad inflamatoria, tal como artritis (por ejemplo, artritis reumatoide), enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, diabetes mellifus o una enfermedad autoinmunitaria, una enfermedad respiratoria, tal como asma o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedades diarreicas, una enfermedad genética, un trastorno neurológico, tal como enfermedad de Alzheimer, distrofia muscular o enfermedad de Parkinson, un trastorno mental o cualquier otro tipo de enfermedad que se pueda tratar con un péptido terapéutico (por ejemplo, un péptido cíclico).
En otros modos de realización, la enfermedad puede ser un cáncer seleccionado del grupo que consiste en un carcinoma, un sarcoma, un linfoma, un melanoma, un mesotelioma, un carcinoma nasofaríngeo, una leucemia, un adenocarcinoma y un mieloma. Aún en otros modos de realización, la enfermedad puede ser un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer óseo, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de endometrio, cáncer de recto, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de cuello uterino, enfermedad hodgkiniana, cáncer de esófago, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, mesotelioma, cáncer de vejiga, linfoma de Burkitt, cáncer de riñón y cáncer cerebral, o cualquier otro tipo de cáncer que se pueda tratar con un péptido terapéutico (por ejemplo, un péptido cíclico).
En el modo de realización donde el péptido de interés o el péptido cíclico es un péptido terapéutico, la molécula diana puede ser, por ejemplo, una proteína u otra molécula que contribuye a una enfermedad, tal como las enfermedades enumeradas anteriormente (por ejemplo, un receptor para el péptido terapéutico, una enzima inhibida o activada por el péptido terapéutico, o cualquier otra molécula en la que la actividad de la molécula se altera por el péptido terapéutico).
En otro modo de realización, la presentación en ARNm como se describe anteriormente en el presente documento usando el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca para seleccionar un péptido de interés va seguida de la sintetización del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende el péptido de interés en una o más micromatrices de péptidos o la sintetización del péptido de interés, identificado usando el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca, en una o más micromatrices de péptidos. En diversos modos de realización, este procedimiento puede comprender cualquiera de los procedimientos de las cláusulas 56 a 73 descritos anteriormente en esta sección de Descripción detallada de la solicitud.
Aún en otro modo de realización, el péptido de interés, identificado usando la presentación en ARNm, se sintetiza a continuación en una micromatriz de péptidos y se madura y/o extiende y se cicla in sifu en la micromatriz de péptidos.
En un modo de realización ilustrativo, el procedimiento de maduración/extensión/ciclación comprende las etapas de:
a) sintetizar el péptido de interés, o derivados del mismo, en una primera micromatriz de péptidos, en el que los derivados del péptido de interés incluyen al menos una alteración en la secuencia del péptido de interés seleccionada de una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos, y una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos;
b) formar a partir de los péptidos funcionalizados, en los que los péptidos funcionalizados están en forma lineal, péptidos cíclicos de fórmula I
en la que cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R5 y R6 es independientemente hidrógeno o un grupo de caperuza N terminal;
cada R7 es independientemente -OH o un grupo de caperuza C terminal;
Q se selecciona del grupo que consiste en un carbonilo, una cadena lateral de aminoácido natural y una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada X e Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z;
Z es un grupo que comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida, un enlace disulfuro, un enlace isopeptídico, un 1,2,3-triazol y una 1,2-quinona opcionalmente sustituida;
L' y L" son cada uno independientemente un grupo de unión bivalente opcional o un enlace;
m es un número entero de 0 a 6;
n es un número entero de 0 a 6;
p es un número entero de 0 a 100;
q es 0 o 1;
r es 0 o 1;
t es un número entero de 0 a 100;
u es 0 o 1; y * es un punto de conexión que conecta el péptido cíclico a un soporte de matriz que tiene una superficie reactiva;
comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un péptido funcionalizado de fórmula II en condiciones que hacen que se forme Z
cada R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal y
cada R8 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R9 es independientemente -OH o un grupo de caperuza C terminal;
cada X' se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z"; cada Y' se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z' y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z';
Z' y Z" se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en un enlace, -OH, hidrógeno, un tiol, una amina, un ácido carboxílico, una amida, un alquino, una acida, un aminofenol opcionalmente sustituido, una cadena lateral de aminoácido natural, una cadena lateral de aminoácido no natural, un grupo protector N terminal y un grupo protector C terminal, siempre que Z' y Z" sean grupos complementarios que se combinen para formar Z;
b es un número entero de 0 a 50;
y *** es un punto de conexión con el resto del péptido funcionalizado;
en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos se inmovilizan en la superficie reactiva;
c) exponer los péptidos cíclicos a la molécula diana, con lo que la molécula diana se une a al menos un péptido cíclico; d) identificar uno o más de los péptidos cíclicos que demuestran una fuerte unión a la molécula diana, con lo que se determina una secuencia de unión al núcleo madurada;
e) realizar al menos una de la extensión N terminal y C terminal de la secuencia de unión al núcleo madurada determinada en la etapa d para proporcionar una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada en una segunda micromatriz de péptidos;
f) exponer la molécula diana a la segunda micromatriz de péptidos que comprende una población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada generados en la etapa e en la que la población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada comprende péptidos cíclicos formados como en la etapa b; e g) identificar un péptido cíclico extendido y madurado con una fuerte unión a la molécula diana.
En un aspecto, Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida,
en el que v es un número entero de 0 a 6, w es un número entero de 0 a 6 e y es un número entero de 0 a 6, y ** es un punto de conexión con el resto del péptido cíclico. En otro aspecto, Z comprende un enlace peptídico, Z" comprende un grupo protector N terminal, Q es un carbonilo, q es 0, r es 1 y u es 0.
En otro modo de realización, el procedimiento comprende además eliminar Z" del resto del péptido funcionalizado para provocar que se forme el enlace peptídico.
Aún en otro modo de realización, X e Y son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Y' es un enlace a Z', Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína, q es 1 y u es 1. En otro aspecto, el procedimiento comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S-S-
*** (
comprende v , Z" comprende una acida, u es 1 y v es 1. En este modo de realización, el procedimiento puede comprender además poner en contacto el péptido funcionalizado con un catalizador de cobre para provocar
*** | HjC
v , Z" comprende una acida, u es 1 y v es 1. En este aspecto, el procedimiento puede comprender además poner en contacto el péptido funcionalizado con un catalizador de cobre para provocar que se forme
además poner en contacto el péptido funcionalizado con ferricianuro de potasio para provocar que se forme
Todavía en otro modo de realización, R3 y R8 se definen de modo que el péptido funcionalizado comprende una
secuencia de reconocimiento de butelasa 1, Y es un enlace a Z, Z comprende , Y' es un enlace a Z', Z' es una cadena lateral de asparagina o ácido aspártico, q es 0 y u es 1. En este modo de realización, el procedimiento puede comprender además poner en contacto el péptido funcionalizado con butelasa 1 para provocar que se forme O
A . ■
En otro aspecto, X e Y son enlaces a Z, Z comprende H , X' es un enlace a Z", Y' es un enlace a Z', Z' es una cadena lateral de glutamina y Z" es una cadena lateral de Usina o Z' es una cadena lateral de Usina y Z" es una cadena lateral de glutamina, q es 1 y u es 1. En este aspecto, el procedimiento puede comprender además oner en contacto el éptido funcionalizado con una transglutaminasa microbiana para provocar que se forme
En otros modos de realización ilustrativos de este procedimiento de ciclación in situ, 1) se puede realizar al menos uno de un análisis sin marcador y uno de afinidad del péptido de la secuencia de unión al núcleo extendido y madurado, 2) los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos en la primera o la segunda micromatriz de péptidos pueden comprender el mismo número de aminoácidos, 3) los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos en la primera o la segunda micromatriz de péptidos no incluyen el aminoácido cisteína o metionina, o motivos de histidina-prolinaglutamina o repeticiones de aminoácidos de 2 o más aminoácidos, y/o 4) la población de péptidos de secuencia de unión al núcleo extendidos y madurados puede incluir al menos uno de un oligopéptido de síntesis con titubeo N terminal y un oligopéptido de síntesis con titubeo C terminal.
En un modo de realización para los derivados de péptidos de interés descritos en la etapa a) anterior, el péptido de interés se puede modificar mediante una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos o una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos. En este modo de realización, los aminoácidos en los péptidos de interés pueden estar sustituidos con cualquiera de los otros 19 aminoácidos naturales o con cualquier aminoácido no natural adecuado. En otro modo de realización ilustrativo, los péptidos de interés o péptidos cíclicos descritos en el presente documento pueden comprender aminoácidos naturales o no naturales, o una combinación de los mismos.
En un modo de realización, se puede realizar otra etapa para incrementar el rendimiento de péptidos cíclicos en la micromatriz de péptidos. En este aspecto, la primera o segunda micromatriz de péptidos comprende uno o más péptidos lineales, junto con péptidos cíclicos debido a la ineficacia de la ciclación. Por tanto, en este aspecto, el procedimiento de ciclación puede comprender además la etapa de poner en contacto los uno o más péptidos lineales en la primera o segunda micromatriz de péptidos con una proteasa que pueda digerir los uno o más péptidos lineales. En este modo de realización, las etapas del procedimiento de maduración/extensión/ciclación descrito anteriormente se pueden repetir para incrementar el rendimiento de péptidos cíclicos en la micromatriz de péptidos. En un modo de realización ilustrativo, la proteasa puede ser una aminoproteasa, tal como aminopeptidasa m, cistinil aminopeptidasa, glutamil aminopeptidasa, leucil aminopeptidasa o piroglutamil peptidasa, o una mezcla de aminoproteasas. En otro aspecto ilustrativo, la proteasa puede ser una dipeptidasa, tal como dipeptidil peptidasa IV, una carboxipeptidasa, una tripeptidilpeptidasa, una metaloexopeptidasa, o una combinación de las mismas.
En un modo de realización del procedimiento de maduración/extensión/ciclación descrito anteriormente, se puede formar un enlace isopeptídico para ciclar péptidos en una micromatriz de péptidos. En un aspecto, los aminoácidos que se pueden unir pueden ser un residuo de glutamina y un residuo de lisina en el mismo péptido, y el enlace se puede formar usando una transglutaminasa.
En este modo de realización, la parte que contiene glutamina del péptido puede comprender un motivo de secuencia de GDYALQGPG (SEQ ID NO: 225). En el modo de realización donde el motivo de secuencia es GDYALQGPG (SEQ ID NO: 225), la parte que contiene glutamina del péptido puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en CGGDYALQGPG
(SEQ ID NO:226). WGGDYALQGPG {SEQ ID NO:227), YGGDYALQGPG (SEQ ID NO:228), DGGDYALQGPG (SEQ ID NO:229), GDGDYALQGPG (SEQ ID NO:230), NGGDYALQGPG (SEQ ID NO:231), GCGDYALQGPG (SEQ ID NO:232). EGGDYALQGPG (SEQ ID NO:233), PGGDYALQGPG (SEQ ID NO:234), TGGDYALQGPG (SEQ ID NO:235). QGGDYALQGPG (SEQ ID NO:236), IGGDYALQGPG (SEQ ID NO:237). FGGDYALQGPG (SEQ ID NO:238), HGGDYALQGPG (SEQ ID NO:239), LGGDYALQGPG (SEQ ID NO:240), VGGDYALQGPG (SEQ ID NO:241), RGGDYALQGPG (SEQ ID NO:242), GWGDYALQGPG (SEQ ID NO:243), MGGDYALQGPG (SEQ ID NO:244). SGGDYALQGPG (SEQ ID NO:245). AGGDYALQGPG (SEQ ID NO:246), GYGDYALQGPG (SEQ ID NO:247), GEGDYALQGPG (SEQ ID NO:248), GPGDYALQGPG (SEQ ID NO:249), GHGDYALQGPG
(SEQ ID NO: 250) y GNGDYALQGPG (SEQ ID NO: 251), o una combinación de las mismas. En otro modo de realización, la parte que contiene glutamina del péptido puede comprender la secuencia DYALQ (SEQ ID NO: 252).
En otro modo de realización, la parte que contiene glutamina del péptido puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en GGGDYALQGGG (SEQ ID NO:253), WDGDYALQGGG (SEQ ID NO:254), GGGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 255) y GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 256), o una combinación de las mismas. En otro modo de realización, la parte que contiene glutamina del péptido puede comprender la secuencia GGGDYALQGGG (SEQ ID NO: 253).
Aún en otro modo de realización, la parte que contiene glutamina del péptido puede comprender un motivo de secuencia de [YF][VA]LQG (SEQ ID NO: 257). En este modo de realización, la parte que contiene glutamina del péptido puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en DYALQ (SEQ ID NO:252). DYVLQ (SEQ ID NO:258), NYALQ
(SEQ ID NO:259), EYALQ (SEQ ID NO:260), PYALQ (SEQ ID NO:261), EYVLQ (SEQ ID NO:262), DFALQ (SEQ ID NO:263), FYALQ (SEQ ID NO:264), NYVLQ (SEQ ID NO:265), RYALQ (SEQ ID NO:266). YFALQ (SEQ ID NO:267). PYVLQ (SEQ ID NO:268), WYALQ (SEQ ID NO:269). SYALQ (SEQ ID NO:270). HYALQ (SEQ ID N0.271), EFALQ (SEQ ID NO: 272) y NFVLQ (SEQ ID NO: 273), o una combinación de las mismas.
Todavía en otro aspecto ilustrativo, la parte que contiene glutamina del péptido puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en DYFLQ (SEQ ID NO:274), EYVAQ (SEQ ID NO:275), DYVAQ (SEQ ID NO:276), DFYLQ (SEQ ID NO: 277), EYFLQ (SEQ ID NO: 278), o una combinación de las mismas.
Aún en otro modo de realización, el péptido puede contener una Usina y la parte que contiene Usina del péptido puede comprender un motivo de secuencia de SKfLSlK (SEQ ID NO: 279) o [KR)[ST]KL (SEQ ID NO: 280). En este modo de realización, la parte que contiene Usina del péptido puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en ARSKL (SEQ ID NO:281), KSKLA (SEQ ID NO:282), TKSKL (SEQ ID NO:283), KLSKL (SEQ ID NO:284), RSKLG (SEQ ID NO:285), RGSKL (SEQ ID NO:286), RSKSK (SEQ ID NO:287), SKSKL (SEQ ID NO:288), PKTKL (SEQ ID NO:289), RSKLA (SEQ ID NO:290), GRSKL (SEQ ID NO:291), SKLSK (SEQ ID NO:292), FTKSK (SEQ ID NO:293). RLKSK (SEQ ID NO:294), KLGAK (SEQ ID NO:295), QRSKL (SEQ ID NO:296). LSKLK (SEQ ID NO:297), NRTKL
(SEQ ID NO: 298), QRTKL (SEQ ID NO: 299), GGGRSKLAGGG (SEQ ID NO: 300) y GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 301), o una combinación de las mismas.
En otro modo de realización ilustrativo, el péptido puede contener una lisina y la parte que contiene lisina del péptido puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en RGTKL (SEQ ID NO:302), FPKLK (SEQ ID NO:303), KLKYK (SEQ ID NO:304), RAKYK (SEQ ID NO:305), KTKYK (SEQ ID NO:306), y GYKLK (SEQ ID NO: 307), o una combinación de las mismas.
Todavía en otro modo de realización, el péptido puede comprender un péptido sustrato de glutamina transglutaminasa y un péptido sustrato de Usina transglutaminasa. Aún en otro modo de realización, el péptido sustrato de glutamina y/o Usina transglutaminasa puede comprender una secuencia de DYALQ (SEQ ID NO: 252) o puede tener un motivo de secuencia que comprende [FY|[FYT|LQ (SEQ ID NO:308), ÍYF1VAQ (SEQ ID NO:309), KfYLSlK (SEQ ID NO:310). o TKL (SEQ ID NO: 311).
En otro modo de realización, se contemplan péptidos sustrato de transglutaminasa que tienen aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % de homología con cualquiera de SEQ ID NO: 4 a 85. La determinación del porcentaje de identidad o similitud entre secuencias se puede hacer, por ejemplo, usando el programa GAP (Genetics Computer Group, programa informático; disponible por medio de Accelrys en http://www.accelrys.com), y las alineaciones se pueden hacer usando, por ejemplo, el algoritmo ClustalW (programa informático VNTI, InforMax Inc.). Se puede realizar una búsqueda en una base de datos de secuencias usando la secuencia peptídica que se va a comparar. Los algoritmos para la búsqueda en la base de datos se basan típicamente en el programa informático BLAST (Altschul et al., 1990).
En un modo de realización ilustrativo, la unión de un péptido sustrato de glutamina transglutaminasa y un péptido sustrato de lisina transglutaminasa para formar un enlace isopeptídico que da como resultado la ciclación del péptido se puede realizar usando una transglutaminasa. En otro modo de realización, se puede usar una transglutaminasa microbiana (por ejemplo, una transglutaminasa de Streptoverticillium sp.) o una transglutaminasa de mamífero. En el modo de realización donde la enzima es una transglutaminasa de mamífero, la transglutaminasa de mamífero se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en transglutaminasa del factor XIII A humano, transglutaminasa del factor XIII B humano, una transglutaminasa del factor XIII, una transglutaminasa de queratinocitos, una transglutaminasa de tipo tisular, una transglutaminasa epidérmica, una transglutaminasa de próstata, una transglutaminasa neuronal, una transglutaminasa 5 humana y una transglutaminasa 7 humana.
En diversos aspectos ilustrativos, los péptidos cíclicos o péptidos de interés que constituyen las micromatrices de péptidos descritas en el presente documento pueden ser péptidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 19 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 18 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 17 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 16 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 15 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 14 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 13 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 12 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 11 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 10 aminoácidos, aproximadamente 5 a aproximadamente 9, aproximadamente 5 a aproximadamente 8, aproximadamente 5 a aproximadamente 7 o aproximadamente 5 a aproximadamente 6 aminoácidos. En otros aspectos ilustrativos, los péptidos cíclicos o péptidos de interés descritos en el presente documento pueden ser péptidos de 5 a 19 aminoácidos, 5 a 18 aminoácidos, 5 a 17 aminoácidos, 5 a 16 aminoácidos, 5 a 15 aminoácidos, 5 a 14 aminoácidos, 5 a 13 aminoácidos, 5 a 12 aminoácidos, 5 a 11 aminoácidos, 5 a 10 aminoácidos, 5 a 9 aminoácidos, 5 a 8 aminoácidos, 5 a 7 aminoácidos o 5 a 6 aminoácidos. Aún en otro modo de realización ilustrativo, los péptidos cíclicos o péptidos de interés se pueden seleccionar del grupo que consiste en pentámeros, hexámeros, heptámeros, octómeros, nonámeros, decámeros, undecámeros, dodecámeros, tridecámeros, tetradecámeros, pentadecámeros, hexadecámeros, heptadecámeros, octodecámeros o nonadecámeros, o una combinación de los mismos.
En diversos modos de realización, las micromatrices de péptidos descritas en el presente documento pueden tener al menos 1,6 x 105 péptidos, al menos 2,0 x 105 péptidos, al menos 3,0 x 105 péptidos, al menos 4,0 x 105 péptidos, al menos 5,0 x 105 péptidos, al menos 6,0 x 105 péptidos, al menos 7,0 x 105 péptidos, al menos 8,0 x 105 péptidos, al menos 9,0 x 105 péptidos, al menos 1,0 x 106 péptidos, al menos 1,2 x 106 péptidos, a al menos 1,4 x 106 péptidos, al menos 1,6 x 106 péptidos, al menos 1,8 x 106 péptidos, al menos 1,0 x 107 péptidos o al menos 1,0 x 108 péptidos unidos al soporte de matriz de la micromatriz de péptidos. En otros modos de realización, las micromatrices de péptidos descritas en el presente documento pueden tener aproximadamente 1,6 x 105 péptidos, aproximadamente 2,0 x 105 péptidos, aproximadamente 3,0 x 105 péptidos, aproximadamente 4,0 x 105 péptidos, aproximadamente 5,0 x 105 péptidos, aproximadamente 6,0 x 105 péptidos, aproximadamente 7,0 x 105 péptidos, aproximadamente 8,0 x 105 péptidos, aproximadamente 9,0 x 105 péptidos, aproximadamente 1,0 x 106 péptidos, aproximadamente 1,2 x 106 péptidos, aproximadamente 1,4 x 106 péptidos, aproximadamente 1,6 x 106 péptidos, aproximadamente 1,8 x 106 péptidos, aproximadamente 1,0 x 107 péptidos o aproximadamente 1,0 x 108 péptidos unidos al soporte de matriz de la micromatriz de péptidos. Como se describe en el presente documento, una micromatriz de péptidos que comprende un número particular de péptidos puede significar una única micromatriz de péptidos en un único soporte de matriz, o los péptidos se pueden dividir y unir a más de un soporte de matriz para obtener el número de péptidos descritos en el presente documento.
En un modo de realización, los péptidos cíclicos o péptidos de interés para su uso en las micromatrices de péptidos descritas en el presente documento pueden ser sintéticos. En un aspecto, los péptidos cíclicos o péptidos de interés en las micromatrices de péptidos descritas en el presente documento se pueden sintetizar como se describe en el ejemplo 1. También se puede usar cualquier protocolo apropiado para sintetizar péptidos para su uso en micromatrices de péptidos que son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En diversos modos de realización, los péptidos cíclicos o péptidos de interés unidos a las micromatrices de péptidos pueden carecer de cisteínas, pueden carecer de repeticiones de aminoácidos, pueden ser excepcionales (es decir, cada péptido es diferente de los otros péptidos en la matriz) y/o pueden representar péptidos cíclicos, péptidos de interés o péptidos cíclicos de interés con una longitud seleccionada del grupo que consiste en pentámeros, hexámeros, heptámeros, octómeros, nonámeros, decámeros, undecámeros y dodecámeros, o una combinación de los mismos.
Como se describe en el presente documento, una "micromatriz de péptidos" significa una colección de péptidos creada intencionalmente que se puede preparar sintéticamente. En un modo de realización, los péptidos en la micromatriz de péptidos pueden ser diferentes entre sí. Los procedimientos para sintetizar micromatrices de péptidos, incluyendo micromatrices de péptidos preparadas por síntesis de matrices de péptidos dirigida por luz sin máscara, son conocidos en la técnica y se describen procedimientos ejemplares en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. n.os US 2004/0023367 y US 2009/0176664 y las patentes de EE. UU. n.os 6.375.903 y 5.143.854. Procedimientos adicionales se describen a continuación en el presente documento en el ejemplo 1.
En un modo de realización, los péptidos en la micromatriz de péptidos están unidos a un soporte de matriz. Un soporte de matriz se refiere a un material o materiales que tienen una superficie o superficies rígidas o semirrígidas. En algunos
aspectos, al menos una superficie del soporte de matriz será sustancialmente plana, aunque en algunos aspectos las regiones pueden estar físicamente separadas para diferentes péptidos con, por ejemplo, pocillos, regiones elevadas, pasadores, zanjas grabadas o similares. Aún en otro modo de realización, la micromatriz de péptidos se prepara mediante síntesis de matrices de péptidos dirigida por luz sin máscara.
En diversos modos de realización, los materiales de soporte de matrices pueden incluir, por ejemplo, silicio, polímeros biocompatibles tales como, por ejemplo, poli(metacrilato de metilo) (PMMA) y polidimetilsiloxano (PDMS), vidrio, plástico, SiO2, cuarzo, nitruro de silicio, vidrio funcionalizado, oro, platino, compuesto de carbono o aluminio. Las superficies funcionalizadas incluyen, por ejemplo, vidrio funcionalizado con amina, vidrio funcionalizado con carboxilo y vidrio funcionalizado con hidroxilo. Adicionalmente, un soporte de matriz puede estar opcionalmente recubierto con una o más capas para proporcionar una superficie para la unión o funcionalización molecular, una reactividad incrementada o disminuida, detección de unión y similares. El material de soporte de matriz apropiado se puede seleccionar por un experto en la técnica.
En un modo de realización, la micromatriz de péptidos se puede preparar usando síntesis de matrices de péptidos dirigida por luz sin máscara. La síntesis de matrices de péptidos dirigida por luz sin máscara puede utilizar microespejos y óptica de proyección que enfocan una imagen de los microespejos en el soporte de matriz donde se llevan a cabo las reacciones. En un modo de realización, bajo el control de un ordenador, cada uno de los microespejos se cambia selectivamente entre una primera posición en la que proyecta la luz sobre el sustrato a través del sistema óptico y una segunda posición en la que desvía la luz del sustrato. En este modo de realización, los espejos controlables individualmente pueden dirigir haces de luz para producir imágenes o patrones de luz. En un modo de realización, se pueden modular reacciones en diferentes regiones en el soporte de matriz al proporcionar irradiación de diferentes potencias usando un dispositivo de microespejo. Dichos dispositivos están disponibles comercialmente. En un aspecto, la irradiación de luz controlada permite que el control de las reacciones proceda a una velocidad deseable.
En un modo de realización, los péptidos cíclicos o péptidos de interés se unen covalentemente al soporte de matriz. En otro modo de realización, los péptidos cíclicos, péptidos de interés o péptidos cíclicos de interés se unen no covalentemente al soporte de matriz. Aún en otro modo de realización, los péptidos se unen al soporte de matriz mediante un conector, tal como un conector escindible. En un modo de realización ilustrativo, el conector tiene una longitud de aproximadamente 4 a aproximadamente 40 átomos. Son conectores ejemplares aril acetileno, oligómeros de etilenglicol que contienen 2-10 unidades monoméricas (PEG), diaminas, diácidos, aminoácidos y similares, y combinaciones de los mismos.
Aún en otros modos de realización de los modos de realización descritos en el presente documento, el andamio de anticuerpo de vaca en cualquier modo de realización descrito en el presente documento se puede reemplazar con cualquier polipéptido de andamio de anticuerpo, incluyendo un polipéptido de andamio de anticuerpo de un animal no bovino. Como se usa en el presente documento, "polipéptido de andamio de anticuerpo" significa un polipéptido que comprende secuencias de la región CDR H3 de un anticuerpo de un animal no bovino. Los modos de realización que usan un "polipéptido de andamio de anticuerpo" incluyen los modos de realización descritos a continuación en las cláusulas 109 a 193. Los ejemplos de animales no bovinos incluyen, pero no se limitan a, un tiburón (por ejemplo, nuevos receptores de antígeno de inmunoglobulina (IgNAR) de suero de tiburón), un camello (por ejemplo, regiones de VnHs de camélido) y un ser humano (por ejemplo, anticuerpos contra el virus de la gripe y contra el VIH humanos con largas regiones CDR H3).
109. Un procedimiento para seleccionar un péptido de interés, comprendiendo el procedimiento las etapas de
a) preparar una colección de péptidos usando un polipéptido de andamio de anticuerpo presentado en ARNm a partir de una región CDR H3 de anticuerpo que comprende el péptido de interés que se va a identificar;
b) seleccionar el péptido de interés de la colección de péptidos poniendo en contacto una molécula diana con el péptido de interés en el que la molécula diana se inmoviliza sobre un soporte sólido o está en solución; e
c) identificar la secuencia de aminoácidos del péptido de interés.
110. El procedimiento de la cláusula 109, en el que la etapa de preparación de la colección de péptidos comprende la etapa de transcripción in vitro de una colección de ADN para formar una colección de ARNm.
111. El procedimiento de la cláusula 109 o 110, que comprende además la etapa de digerir la colección de ADN con DNasa.
112. El procedimiento de la cláusula 109 o 110, que comprende además la etapa de conjugar el ARNm de la colección de ARNm con un conector oligonucleotídico de puromicina.
113. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 110 a 112, que comprende además la etapa de traducir in vitro el ARNm de la colección de ARNm para formar conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpoARNm que comprenden el polipéptido de andamio de anticuerpo en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo comprende una marca de purificación.
114. El procedimiento de la cláusula 113, que comprende además la etapa de purificar los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo-ARNm usando la marca de purificación.
115. El procedimiento de la cláusula 113 o 114, que comprende además la etapa de retrotranscribir el ARNm de la colección de ARNm para formar híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo-ARNm.
116. El procedimiento de la cláusula 115, en el que la etapa de selección comprende poner en contacto los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo-ARNm con la molécula diana.
117. El procedimiento de la cláusula 116, que comprende además la etapa de regenerar el ADN de los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo-ARNm.
118. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 110 a 117, en el que la colección de ADN es una colección de ADNc.
119. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 110 a 118, en el que la transcripción in vitro se realiza usando ARN polimerasa T7.
120. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 112 a 119, en el que el conector oligonucleotídico de puromicina se une al ARNm en el extremo 3' del ARNm.
121. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 113 a 120, en el que la marca de purificación es una marca FLAG.
122. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 110 a 121, en el que los miembros de la colección de ADN comprenden una secuencia promotora de ARN polimerasa, una secuencia potenciadora y una secuencia de marca de purificación.
123. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 113 a 122, en el que la marca de purificación es una marca C terminal.
124. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 109 a 123, que comprende además las etapas de: a) sintetizar el péptido de interés, o derivados del mismo, en una primera micromatriz de péptidos, en el que los derivados del péptido de interés incluyen al menos una alteración en la secuencia del péptido de interés seleccionada de una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos, y una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos;
b) formar a partir de los péptidos funcionalizados, en los que los péptidos funcionalizados están en forma lineal, péptidos cíclicos de fórmula I
en la que cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector N terminal;
R7 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal, un grupo protector C terminal, y
cada R8 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
R9 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal y un grupo protector C terminal; Q se selecciona del grupo que consiste en un enlace, un carbonilo, una cadena lateral de aminoácido natural y una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada X e Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z;
Z es un grupo que comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida, un enlace disulfuro, un enlace isopeptídico, un 1,2,3-triazol y una 1,2-quinona opcionalmente sustituida;
cada L' y L" es independientemente un grupo de unión bivalente opcional o un enlace;
b es un número entero de 0 a 50;
m es un número entero de 0 a 6;
n es 0 o 1;
p es 0 o 1;
q es un número entero de 0 a 6;
r es 0 o 1;
s es un número entero de 0 a 100;
t es 0 o 1;
u es 0 o 1;
v es un número entero de 0 a 100;
w es 0 o 1; y * es un punto de conexión que conecta el péptido cíclico a un soporte de matriz que tiene una superficie reactiva; y *** es un punto de conexión con el resto del péptido funcionalizado;
comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un péptido funcionalizado de fórmula II en condiciones que hacen que se forme Z
en la que R1, R2 R3, R4, R5, R6, m, n, p, q, r, s, t, v, w, L', L", * y *** son como se define para la fórmula I;
R10 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal, un grupo protector C terminal, y
cada R11 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
R12 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal y un grupo protector C terminal; Q' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, un carbonilo, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
X' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
Y' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z' y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z';
cada Z' y Z" se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, -OH, hidrógeno, un tiol, una amina, un ácido carboxílico, una amida, un alquino, una acida, un aminofenol opcionalmente sustituido, una cadena lateral de aminoácido natural, una cadena lateral de aminoácido no natural, un grupo protector N terminal y un grupo protector C terminal, siempre que Z' y Z" sean grupos complementarios que se combinen para formar Z;
g es un número entero de 0 a 50; e
y es 0 o 1;
en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos se inmovilizan en la superficie reactiva;
c) exponer los péptidos cíclicos a la molécula diana, con lo que la molécula diana se une a al menos un péptido cíclico;
d) identificar uno o más de los péptidos cíclicos que demuestran una fuerte unión a la molécula diana, con lo que se determina una secuencia de unión al núcleo madurada;
e) realizar al menos una de la extensión N terminal y C terminal de la secuencia de unión al núcleo madurada determinada en la etapa d para proporcionar una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada en una segunda micromatriz de péptidos;
f) exponer la molécula diana a la segunda micromatriz de péptidos que comprende una población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada generados en la etapa e en la que la población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada comprende péptidos cíclicos formados como en la etapa b; e g) identificar un péptido cíclico extendido y madurado con una fuerte unión a la molécula diana.
125. El procedimiento de la cláusula 124, en el que Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un
en el que d es un número entero de 0 a 6, e es un número entero de 0 a 6 y f es un número entero de 0 a 6, y ** es un punto de conexión con el resto del péptido cíclico.
126. El procedimiento de la cláusula 124 o 125, en el que Z comprende un enlace peptídico, Z" comprende un grupo protector N terminal, t es 0, u es 0 e y es 0.
127. El procedimiento de la cláusula 126, que comprende además eliminar Z" del resto del péptido funcionalizado para provocar que se forme el enlace peptídico.
128. El procedimiento de la cláusula 124 o 125, en el que Q y X son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Q' es un enlace a Z', Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína, t es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
129. El procedimiento de la cláusula 128, que comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S -S - **.
130. El procedimiento de la cláusula 124 o 125, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Y' es un enlace a Z', Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína, t es 1, u es 1 e y es 1.
131. El procedimiento de la cláusula 130, que comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S -S - **.
enlace a Z', Z'comprende ■ '(h 2 cÍ ^ T , Z" comprende una acida, d es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
133. El procedimiento de la cláusula 132, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
135. El procedimiento de la cláusula 134, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
136. El procedimiento de la cláusula 124 o 125, en el que Q es un enlace a Z, Z comprende Q' es un enlace a Z', Z' comprende , Z" comprende una acida, e es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
137. El procedimiento de la cláusula 136, que comprende además oner en contacto el péptido funcionalizado con un
138. El procedimiento de la cláusula 124 o 125, en el que Y es un enlace a Z, Z comprende Y' es un enlace a Z', Z’ comprende , Z" comprende una acida, e es 1, u es 1 e y es 1.
139. El procedimiento de la cláusula 138, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
es un enlace a Z', Z' comprende Nnz , Z" comprende una amina, f es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
141. El procedimiento de la cláusula 140, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
143. El procedimiento de la cláusula 142, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
144. El procedimiento de la cláusula 124 o 125, en el que R4, R10 y R11 se definen de modo que el péptido funcionalizado comprende una secuencia de reconocimiento de butelasa 1, Y es un enlace a Z, Z comprende
Y' es un enlace a Z', Z' es una cadena lateral de asparagina o ácido aspártico, u es 1 e y es 1.
145. El procedimiento de la cláusula 144, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con O J J
butelasa 1 para provocar que se forme M **.
146. El procedimiento de la cláusula 124 o 125, en el que Q y X son enlaces a Z, Z comprende
cadena lateral de Usina o Z' es una cadena lateral de Usina y Z" es una cadena lateral de glutamina, t es 1, u es 0, v es 0, w es 1 e y es 0.
147. El procedimiento de la cláusula 146, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
una transglutaminasa microbiana para provocar que se forme h .
148. El procedimiento de la cláusula 124 o 125, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende
cadena lateral de Usina o Z' es una cadena lateral de Usina y Z" es una cadena lateral de glutamina, t es 1, u es 1 e y es 1.
149. El procedimiento de la cláusula 148, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
150. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 124 a 149, en el que cada L' y L" es independientemente de la fórmula V
en la que cada R13 y R13' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10, heteroarilo de 5 a 7 miembros, -O R 14, -OC(O)R14, -N R 14R14', -N R 14C(O)R15, -C(O)R14, -C(O)OR14 y -C(O)NR14R14', en el que cada átomo de hidrógeno en alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros está independientemente sustituido opcionalmente con halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, -O R 16; cada R14, R14', R15 y R16 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, hidroxilo, alquilo C1-C 7, alquenilo C2-C 7, alquinilo C2-C 7, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros; y h es un número entero de 1 a 10; o la fórmula VI o VII
en la que j es un número entero de 0 a 30.
151. El procedimiento de la cláusula 150, en el que cada R13 y R13' es hidrógeno.
152. El procedimiento de la cláusula 150 o 151, en el que L' está presente, h es 5, m es 0, n es 1 y p es 1.
153. El procedimiento de la cláusula 150, en el que al menos uno de L' y L" es de la fórmula VI o VII
en la que j es 7.
154. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 124 a 153, en el que el grupo protector N terminal es un grupo fotoprotector.
155. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 124 a 154, en el que el grupo protector N terminal es 2-(2-nitrofenil)propiloxicarbonilo.
156. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 109 a 123 que comprende además la etapa de sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo en una o más micromatrices de péptidos en las que el polipéptido de andamio de anticuerpo comprende el péptido de interés.
157. El procedimiento de la cláusula 156, que comprende las etapas de:
a) sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo que comprende el péptido de interés, o derivados del péptido de interés, en una primera micromatriz de péptidos, en el que los derivados del péptido de interés incluyen al menos una alteración en la secuencia del péptido de interés seleccionada de una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos, y una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos;
b) formar a partir de los péptidos funcionalizados, en los que los péptidos funcionalizados están en forma lineal, péptidos cíclicos de fórmula VIII
en la que cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R5 y R6 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido
cada R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector N terminal;
R8 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector; cada X e Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z;
Z es un grupo que comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida, un enlace disulfuro, un enlace isopeptídico, un 1,2,3-triazol y una 1,2-quinona opcionalmente sustituida;
L' es un grupo de unión bivalente opcional o un enlace;
m es un número entero de 0 a 6;
n es 0 o 1;
p es 0 o 1;
q es un número entero de 0 a 50;
r es un número entero de 0 a 50;
s es un número entero de 0 a 50;
t es un número entero de 0 a 50;
u es un número entero de 0 a 50; y * es un punto de conexión que conecta el péptido cíclico a un soporte de matriz que tiene una superficie reactiva;
comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un péptido funcionalizado de fórmula IX en condiciones que hacen que se forme Z
en la que R1, R2 R3, R4, R5, R6, R7 y R8, m, n, p, q, r, s, t, u, L' y * son como se define para la fórmula VIII;
X' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
Y' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z' y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z'; y
cada Z' y Z" se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, -OH, hidrógeno, un tiol, una amina, un ácido carboxílico, una amida, un alquino, una acida, un aminofenol opcionalmente sustituido, una cadena lateral de aminoácido natural, una cadena lateral de aminoácido no natural, un grupo protector N terminal y un grupo protector C terminal, siempre que Z' y Z" sean grupos complementarios que se combinen para formar Z;
en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos se inmovilizan en la superficie reactiva;
c) exponer los péptidos cíclicos a la molécula diana, con lo que la molécula diana se une a al menos un péptido cíclico; d) identificar uno o más de los péptidos cíclicos que demuestran una fuerte unión a la molécula diana, con lo que se determina una secuencia de unión al núcleo madurada;
e) realizar al menos una de la extensión N terminal y C terminal de la secuencia de unión al núcleo madurada determinada en la etapa d para proporcionar una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada en una segunda micromatriz de péptidos;
f) exponer la molécula diana a la segunda micromatriz de péptidos que comprende una población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada generados en la etapa e en la que la población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada comprende péptidos cíclicos formados como en la etapa b; e g) identificar un péptido cíclico extendido y madurado con una fuerte unión a la molécula diana.
158. El procedimiento de la cláusula 157, en el que Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un
en el que d es un número entero de 0 a 6, e es un número entero de 0 a 6 y f es un número entero de 0 a 6, y ** es un punto de conexión con el resto del péptido cíclico.
159. El procedimiento de la cláusula 157 o 158, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende ** -S -S - **, X' es un enlace a Z", Y' es un enlace a Z', y Z' y Z" comprenden cadenas laterales de cisteína.
160. El procedimiento de la cláusula 159, que comprende además someter el péptido funcionalizado a condiciones oxidativas para provocar que se forme ** -S -S - **.
162. El procedimiento de la cláusula 161, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
r ( H2C'
un enlace a Z', Z’ comprende , Z" comprende una acida y e es 1.
164. El procedimiento de la cláusula 163, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con un
166. El procedimiento de la cláusula 165, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
167. El procedimiento de la cláusula 157 o 158, en el que X e Y son enlaces a Z, Z comprende
una cadena lateral de Usina o Z' es una cadena lateral de Usina y Z" es una cadena lateral de glutamina.
168. El procedimiento de la cláusula 167, que comprende además poner en contacto el péptido funcionalizado con
una transglutaminasa microbiana para provocar que se forme h .
169. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 157 a 158, en el que L' es de la fórmula (X)
— (-cr13r133-
fX )
en la que cada R13 y R13' se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10, heteroarilo de 5 a 7 miembros, -O R 14, -OC(O)R14, -N R 14R14', -N R 14C(O)R15, -C(O)R14, -C(O)OR14 y -C(O)NR14R14', en el que cada átomo de hidrógeno en alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros está independientemente sustituido opcionalmente con halógeno, alquilo C1-C 6, alquenilo C2-C 6, alquinilo C2-C 6, -O R 16; cada R14, R14', R15 y R16 se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, D, hidroxilo, alquilo C1-C 7, alquenilo C2-C 7, alquinilo C2-C 7, cicloalquilo C3-C 6, heterocicloalquilo de 3 a 7 miembros, arilo C6-C 10 y heteroarilo de 5 a 7 miembros; y h es un número entero de 1 a 10; o la fórmula XI o XII
en la que j es un número entero de 0 a 30.
170. El procedimiento de la cláusula 169, en el que cada R13 y R13' es hidrógeno.
171. El procedimiento de la cláusula 169 o 170, en el que L' está presente, h es 5, m es 0, n es 1 y p es 1.
172. El procedimiento de la cláusula 169, en el que L' es de la fórmula XI o XII
en la que j es 7.
173. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 157 a 172, en el que el grupo protector N terminal es un grupo fotoprotector.
174. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 157 a 173, en el que el grupo protector N terminal es 2-(2-nitrofenil)propiloxicarbonilo.
175. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 124 a 155 y 157 a 174, en el que se realiza al menos uno de un análisis sin marcador y uno de afinidad de los péptidos de secuencia de unión al núcleo extendidos y madurados.
176. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 124 a 155 y 157 a 175, en el que la primera o segunda micromatriz de péptidos comprende al menos uno de compuesto de vidrio, plástico y carbono.
177. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 124 a 155 y 157 a 176, en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos en la primera o la segunda micromatriz de péptidos comprenden el mismo número de aminoácidos.
178. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 124 a 155 y 157 a 177, en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos en la primera o la segunda micromatriz de péptidos no incluyen el aminoácido cisteína o metionina, o los motivos de histidina-prolina-glutamina, o repeticiones de aminoácidos de 2 o más aminoácidos. 179. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 124 a 155 y 157 a 178, en el que la población de péptidos de secuencia de unión al núcleo extendidos y madurados incluye al menos uno de un oligopéptido de síntesis con titubeo N terminal y un oligopéptido de síntesis con titubeo C terminal.
180. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 124 a 155 y 157 a 179, en el que la primera o segunda micromatriz de péptidos comprende uno o más péptidos lineales y en el que el procedimiento comprende además la etapa de poner en contacto los uno o más péptidos lineales en la primera o segunda micromatriz de péptidos con una proteasa que pueda digerir los uno o más péptidos lineales.
181. El procedimiento de la cláusula 180, en el que la proteasa es una amino proteasa o una mezcla de amino proteasas.
182. El procedimiento de la cláusula 180 en el que la proteasa es dipeptidil peptidasa IV, aminopeptidasa m o una combinación de las mismas.
183. Un polipéptido de andamio de anticuerpo presentado en ARNm que comprende un péptido de interés.
184. El polipéptido de andamio de anticuerpo presentado en ARNm de la cláusula 183 en el que el péptido de interés es un péptido terapéutico.
185. Una micromatriz de péptidos que comprende un polipéptido de andamio de anticuerpo que comprende un péptido de interés.
186. La micromatriz de péptidos de la cláusula 185 en la que el péptido de interés es un péptido terapéutico.
187. El procedimiento, el polipéptido de andamio de anticuerpo presentado en ARNm o la micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 109 a 186, en los que el polipéptido de andamio de anticuerpo comprende un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria y el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria comprende la secuencia del péptido de interés.
188. El procedimiento, el polipéptido de andamio de anticuerpo presentado en ARNm o la micromatriz de péptidos de la cláusula 187, en los que el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria no incluye la secuencia de un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo o un fragmento de péptido derivado de un anticuerpo.
189. El procedimiento de la cláusula 144 o 145 en el que la secuencia de reconocimiento de butelasa 1 es n h v -
190. El procedimiento de la cláusula 146, 147, 167 o 168, en el que la cadena lateral de glutamina es parte de la secuencia [\VY][Dn][DF.][YW]ALQ[GST]YD (SEQ ID NO: 4) y la cadena lateral de lisina es parte de la secuencia RSK.LG (SEQ ID NO: 5).
191. El procedimiento de una cualquiera de las cláusulas 109 a 123 que comprende además la etapa de sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo que comprende el péptido de interés en una micromatriz de péptidos para madurar y/o extender el péptido de interés.
192. El procedimiento, el polipéptido de andamio de anticuerpo presentado en ARNm o la micromatriz de péptidos de una cualquiera de las cláusulas 109 a 186, en los que el polipéptido de andamio de anticuerpo comprende un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria en los que el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria comprende la secuencia del péptido de interés y en el que el casete de secuencia de aminoácidos aleatoria se usa para la selección de péptidos de interés.
193. Un polipéptido de andamio de anticuerpo que comprende un casete de secuencia de aminoácidos aleatoria.
En otro modo de realización, los procedimientos, las micromatrices de péptidos y los polipéptidos de andamio de anticuerpos de vaca presentados en ARNm y los polipéptidos de andamio de anticuerpos descritos en el presente documento incluyen los siguientes ejemplos. Los ejemplos ilustran además rasgos característicos adicionales de los diversos modos de realización de la invención descritos en el presente documento. Sin embargo, se debe entender que los ejemplos son ilustrativos y no se deben interpretar como limitantes de otros modos de realización de la invención descritos en el presente documento. Además, se aprecia que otras variaciones de los ejemplos se incluyen en los diversos modos de realización de la invención descritos en el presente documento.
Ejemplo 1
Micromatrices
En el estado de la técnica se conocen diversos procedimientos para la producción de micromatrices. Por ejemplo, la detección de péptidos prefabricados o la síntesis in situ mediante detección de reactivos, por ejemplo, en membranas, ejemplifican procedimientos conocidos. Otros procedimientos conocidos usados para generar matrices de péptidos de mayor densidad son las denominadas técnicas fotolitográficas, donde el diseño sintético de los biopolímeros deseados se controla mediante grupos protectores fotolábiles (PLPG) adecuados que liberan el sitio de enlace para el siguiente componente respectivo (por ejemplo, aminoácido) tras la exposición a radiación electromagnética, tal como la luz (Fodor et al., (1993) Nature 364:555-556; Fodor et al., (1991) Science 251:767-773). En el estado de la técnica se conocen dos técnicas fotolitográficas diferentes. La primera es una máscara fotolitográfica, usada para dirigir la luz a áreas específicas de la superficie de síntesis efectuando la desprotección localizada de los PLPG. Los procedimientos "enmascarados" incluyen la síntesis de polímeros utilizando un soporte (por ejemplo, una "máscara") que se acopla a un sustrato y proporciona un espacio de reactor entre el sustrato y el soporte. Los modos de realización ejemplares de dicha síntesis de matrices "enmascarada" se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 5.143.854 y 5.445.934. La segunda técnica fotolitográfica es la fotolitografía sin máscara, donde la luz se dirige a áreas específicas de la superficie de síntesis, efectuando la desprotección localizada de los PLPG mediante tecnologías de proyección digital, tales como dispositivos de microespejos (Singh-Gasson et al., Nature Biotechn. 17 (1999) 974-978). Se debe
entender que los modos de realización de los procedimientos divulgados en el presente documento pueden comprender o utilizar cualquiera de las diversas técnicas de síntesis de micromatrices descritas anteriormente.
El uso de PLPG (grupos protectores fotolábiles), que proporciona la base para la síntesis de micromatrices de péptidos basada en fotolitografía, es bien conocido en la técnica. Los PLPG comúnmente usados para la síntesis de biopolímeros basada en fotolitografía son, por ejemplo, a-metil-6-nitropiperonil-oxicarbonilo (MeNPOC) (Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91:5022-5026), 2-(2-nitrofenil)-propoxicarbonilo (NPPOC) (Hasan et al. (1997) Tetrahedron 53:4247-4264), nitroveratriloxicarbonilo (NVOC) (Fodor et al. (1991) Science 251:767-773) y 2-nitrobenciloxicarbonilo (Nb Oc ) (Patchornik et al. (1970) 21:6333-6335).
Se han introducido aminoácidos en la síntesis fotolitográfica de péptidos en fase sólida de micromatrices de péptidos, que estaban protegidos con NPPOC como un grupo protector amino fotolábil, en el que se usaban portaobjetos de vidrio como soporte (publicación de patente de EE. UU. n.° 2005/0101763 A1). El procedimiento que usa aminoácidos protegidos con NPPOC tiene la desventaja de que la semivida tras la irradiación con luz de todos los aminoácidos protegidos (excepto uno) está dentro del intervalo de aproximadamente 2 a 3 minutos en determinadas condiciones. Por el contrario, en las mismas condiciones, la tirosina protegida con NPPOC presenta una semivida de prácticamente 10 minutos. Dado que la velocidad del procedimiento de síntesis completo depende del subprocedimiento más lento, este fenómeno incrementa el tiempo del procedimiento de síntesis en un factor de 3 a 4. Simultáneamente, el grado de daño provocado por los iones radicalarios fotogenerados a los oligómeros en crecimiento se incrementa con el requisito de dosis de luz excesiva y en incremento.
Una única micromatriz de péptidos o, en algunos casos, múltiples micromatrices (por ejemplo, 3, 4, 5 o más micromatrices) se pueden localizar en un soporte de matriz. El tamaño de las micromatrices de péptidos depende del número de micromatrices en un soporte de matriz. Cuanto mayor sea el número de micromatrices por soporte de matriz, más pequeñas tienen que ser las matrices para que ajusten en el soporte de matriz. Las matrices se pueden diseñar en cualquier conformación, pero preferentemente se diseñan como cuadrados o rectángulos.
El término rasgo característico se refiere a un área definida en la superficie de una micromatriz de péptidos. El rasgo característico comprende biomoléculas, tales como péptidos, y similares. Un rasgo característico puede contener biomoléculas con diferentes propiedades, tales como diferentes secuencias u orientaciones, en comparación con otros rasgos característicos. El tamaño de un rasgo característico está determinado por dos factores: i) el número de rasgos característicos en una micromatriz, cuanto mayor sea el número de rasgos característicos en una micromatriz, más pequeño será cada rasgo característico único, ii) el número de elementos de espejo de aluminio direccionables individualmente que se usan para la irradiación de un rasgo característico. Cuanto mayor sea el número de elementos de espejo usados para la irradiación de un rasgo característico, mayor será el rasgo característico único. El número de rasgos característicos en una micromatriz puede estar limitado por el número de elementos de espejo (píxeles) presentes en el dispositivo de microespejo. Por ejemplo, el dispositivo de microespejo de última generación de Texas Instruments, Inc. actualmente contiene 4,2 millones de elementos de espejo (píxeles), por tanto el número de rasgos característicos dentro de una micromatriz ejemplar de este tipo está limitado por lo tanto por este número. Sin embargo, se debe entender que el dispositivo de microespejo de Texas Instruments, Inc. se proporciona solo para propósitos ejemplares y son posibles micromatrices de mayor densidad.
Se debe entender que el término soporte de matriz se refiere a cualquier material sólido que tenga un área de superficie a la que se puedan unir moléculas orgánicas a través de la formación de enlaces o que se puedan absorber a través de interacciones electrónicas o estáticas, tales como un enlace covalente o la formación de complejos a través de un grupo funcional específico. El soporte de matriz puede ser una combinación de materiales, tales como plástico sobre vidrio, carbono sobre vidrio y similares. La superficie funcional puede ser moléculas orgánicas simples, pero también puede comprender copolímeros, dendrímeros, cepillos moleculares y similares. Se puede usar plástico como soporte y, preferentemente, el plástico es una poliolefina con propiedades ópticas definidas, como TOPAS® o ZEONOR/EX®.
El término "grupo funcional", como se usa en este ejemplo, se refiere a cualquiera de numerosas combinaciones de átomos que forman parte de moléculas químicas, que experimentan reacciones características por sí mismas y que influyen en la reactividad del resto de la molécula. Los grupos funcionales típicos incluyen, pero no se limitan a, hidroxilo, carboxilo, aldehído, carbonilo, amino, acida, alquinilo, tiol y nitrilo. Los grupos funcionales potencialmente reactivos incluyen, por ejemplo, aminas, ácidos carboxílicos, alcoholes, dobles enlaces y similares. Los grupos funcionales preferentes son grupos funcionales potencialmente reactivos de aminoácidos, tales como grupos amino o grupos carboxilo.
Como se entiende por un experto en la técnica, las micromatrices de péptidos comprenden un principio de ensayo con el que miles (o millones) de péptidos (en algunos modos de realización presentados en múltiples copias) están unidos o inmovilizados a la superficie de un soporte de matriz (que en algunos modos de realización comprende un vidrio, compuesto de carbono y/o chip o portaobjetos de plástico). En algunos modos de realización, la micromatriz de péptidos, después de la incubación con una molécula diana, experimenta una o más etapas de lavado, y a continuación se expone a un sistema de detección, por ejemplo, que utiliza fluorescencia, quimioluminiscencia, procedimientos colorimétricos o autorradiografía.
En el caso de acontecimientos de unión, después de escanear los portaobjetos de micromatrices, el escáner puede grabar una imagen numérica de 20 bits, 16 bits u 8 bits en formato de archivo de imagen etiquetado (*.tif). La imagen .tif permite la interpretación y cuantificación de los datos obtenidos del portaobjetos de micromatrices escaneado. Estos datos cuantitativos pueden ser la base para realizar un análisis estadístico en acontecimientos de unión medidos o modificaciones de péptidos en el portaobjetos de micromatrices. Para la evaluación e interpretación de las señales detectadas se debe realizar una asignación del punto peptídico (visible en la imagen) y la secuencia peptídica correspondiente. Los datos para la asignación normalmente se guardan en el archivo de la lista de matrices de GenePix (.gal) y se suministran conjuntamente con la micromatriz de péptidos. El archivo .gal (un archivo de texto separado por tabulación) se puede abrir usando módulos de un programa informático de cuantificación de micromatrices o procesar con un editor de texto (por ejemplo, un bloc de notas) o Microsoft Excel. Este archivo 'gal' se proporciona más a menudo por el fabricante de micromatrices y se genera mediante los archivos de entrada txt y el programa informático de seguimiento integrado en los robots que realizan la fabricación de micromatrices.
Una micromatriz de péptidos es un portaobjetos plano con péptidos colocados en forma de puntos sobre el mismo o ensamblados directamente en la superficie mediante síntesis in situ. Los péptidos se unen idealmente covalentemente a través de un enlace quimioselectivo que da lugar a péptidos con la misma orientación para el perfil de interacción. Procedimientos alternativos incluyen la unión covalente inespecífica y la inmovilización en adhesivo.
Después de la identificación de una secuencia de unión al núcleo, se puede llevar a cabo un proceso de "maduración de péptidos" con el que la secuencia de unión al núcleo se altera de diversas maneras (a través de sustituciones, deleciones e inserciones de aminoácidos) en cada posición de la secuencia de unión al núcleo para optimizar/verificar además la secuencia de unión al núcleo apropiada. Por ejemplo, de acuerdo con algunos modos de realización (por ejemplo, cuando la secuencia de unión al núcleo comprende un número dado de, tal como 5, aminoácidos), se produce una matriz de maduración. La matriz de maduración puede tener, por ejemplo, inmovilizada a ella, una población de secuencias de unión al núcleo, con lo que cada aminoácido en la secuencia de unión al núcleo ha experimentado una sustitución aminoacídica en cada posición.
Una secuencia de unión al núcleo de ejemplo/hipotética se describe como que consiste en un péptido pentámero que tiene la secuencia de aminoácidos M1M2M3M4M5- (SEQ ID NO: 372). La maduración de aciertos puede implicar cualquiera de, o una combinación de cualquiera o la totalidad de, las sustituciones, deleciones e inserciones de aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5. Por ejemplo, con respecto a la secuencia de unión al núcleo hipotética M1M2M3M4M5- (SEQ ID NO: 372), los modos de realización pueden incluir el aminoácido M en la posición 1 que está sustituido con cada uno de los otros 19 aminoácidos (por ejemplo, A1M2M3M4M5- (SEQ ID NO: 373), P1M2M3M4M5- (SEQ ID NO: 374), V1M2M3M4M5- (SEQ ID NO: 375), Q1M2M3M4M5- (SEQ ID NO: 376), etc.). Cada posición (2, 3,4 y 5) también tendría el aminoácido M sustituido con cada uno de los otros 19 aminoácidos (por ejemplo, con la posición 2 las sustituciones se asemejarían a M IA2M3M4M5- (SEQ ID NO: 377), MIQ2M3M4M5-(SEQ ID NO: 378), M1P2M3M4M5- (SEQ ID NO: 379), M1N2M3M4M5- (SEQ ID NO: 380), etc.). Se debe entender que se crea un péptido (inmovilizado en una matriz) que comprende las secuencias sustituidas y/o delecionadas y/o insertadas del núcleo.
En algunos modos de realización de maduración de acuerdo con la presente divulgación, se puede realizar una doble sustitución aminoacídica. Una doble subestación de aminoácidos incluye alterar el aminoácido en una posición dada (por ejemplo, una sustitución M ^P , por ejemplo en la posición 1) y a continuación sustituir el aminoácido en la posición 2 con cada uno de los otros 19 aminoácidos, el aminoácido en la posición 2. Este proceso se repite hasta que se combinan todas las combinaciones posibles de las posiciones 1 y 2. A modo de ejemplo, en referencia de nuevo a la secuencia de unión al núcleo hipotética que tiene un péptido pentámero con secuencia de aminoácidos M 1M 2M 3M 4M 5- (SEQ ID NO: 372), una doble sustitución aminoacídica con respecto a las posiciones 1 y 2 puede incluir, por ejemplo, una sustitución M— >P en la posición 1, y a continuación una subestación de los 20 aminoácidos en la posición 2 (por ejemplo, -P1A2M 3M 4M 5- (SEQ ID NO: 381), -P 1 F 2 M 3M 4M 5- (SEQ ID NO: 382), -P1V 2M 3M 4M 5- (SEQ ID NO: 383), - P 1E2M3M4M5- (SEQ ID NO: 384), etc.), una sustitución M— >V en la posición 1, y a continuación una subestación de los 20 aminoácidos en la posición 2 (por ejemplo, _ y 1A2M3M4M5 (SEQ ID NO: 385), - V IF2M3M4M5- (SEQ ID NO: 386), -P1V2M3M4M5- (SEQ ID NO: 387), - V 1E2M3M4M5-(SEQ ID NO: 388), etc.), una sustitución M— >A en la posición 1, y a continuación una subestación de los 20 aminoácidos en la posición 2 (por ejemplo, _ a 1A2M3M4M5- (SEQ ID NO: 389), - A 1F2M3M4M5- (SEQ ID NO: 390), _ A 1V2M3M4M5- (SEQ ID NO: 391), - A 1E2M3M4M5- (SEQ ID NO: 392), etc.).
En algunos modos de realización de maduración, se puede realizar una deleción de aminoácidos para cada posición de aminoácido de la secuencia de unión al núcleo. Una deleción de aminoácidos incluye la preparación de un péptido que incluye la secuencia de unión al núcleo, pero la deleción de un único aminoácido de la secuencia de unión al núcleo (de modo que se cree un péptido en el que se deleciona el aminoácido en cada péptido). A modo de ejemplo, en referencia de nuevo a la secuencia de unión al núcleo hipotética que tiene un péptido pentámero con secuencia de aminoácidos -V11M2V13M4V15- (SEQ ID NO: 372), una deleción de aminoácidos incluiría la preparación de una serie de péptidos que tengan las siguientes secuencias M2M3M4M5 (SEQ ID NO: 393); M1M3M4M5 (SEQ ID NO: 393); -M 1 M 2 M 4 M 5 - (SEQ ID NO: 393); -M 1M 2M 3M 5- (SEQ ID NO: 393); y -M1M2M3M4 (SEQ ID NO: 393).
Cabe destacar que, después de una deleción de aminoácidos del hipotético pentámero, se crean 5 nuevos tetrámeros. De acuerdo con algunos modos de realización, se puede realizar una sustitución aminoacídica o un escaneo de una doble subestación de aminoácidos para cada nuevo tetrámero generado.
De forma similar al escaneo de deleciones de aminoácidos analizado anteriormente, algunos modos de realización de maduración pueden incluir un escaneo de inserciones de aminoácidos, con lo que cada uno de los 20 aminoácidos se inserta antes y después de cada posición de la secuencia de unión al núcleo. A modo de ejemplo, en referencia de nuevo a la secuencia de unión al núcleo hipotética que tiene un péptido pentámero con secuencia de aminoácidos -V11M2V13M4V15- (SEQ ID NO: 372), un escaneo de inserciones de aminoácidos podría incluir las siguientes secuencias, -X M 1M 2M 3M 4 M 5 - (SEQ ID NO: 394); - M1XM2M3M4M5- (SEQ ID NO: 395); -M 1M 2XM 3M 4M 5-(SEQ ID NO: 396); -M1M2M3XM4M5- (SEQ ID NO: 397); -M1M2M3M4XM5- (SEQ ID NO: 398); y -M IM 2 M 3 M 4 M 5X - (SEQ ID NO: 399) (donde X representa un amino individual, seleccionado de los 20 aminoácidos conocidos o un subconjunto específico definido de aminoácidos, con lo que se creará una réplica peptídica para cada uno de los 20 o subconjunto definido de aminoácidos ).
También se debe entender que los péptidos sustituidos con aminoácidos, los péptidos sustituidos con aminoácidos dobles, los péptidos de escaneo de deleciones de aminoácidos y los péptidos de escaneo de inserciones de aminoácidos descritos anteriormente también pueden incluir una, o ambas de, una secuencia de aminoácidos con titubeo N terminal y C terminal. Al igual que con las secuencias de aminoácidos con titubeo N terminal y C terminal, las secuencias de aminoácidos con titubeo N terminal y C terminal pueden comprender tan solo 1 aminoácido o hasta 15 o 20 aminoácidos, y la secuencia de aminoácidos con titubeo N terminal puede tener la misma longitud que, ser más larga o más corta que la secuencia de aminoácidos con titubeo C terminal. Además, las secuencias de aminoácidos con titubeo N terminal y C terminal pueden comprender cualquier grupo definido de aminoácidos en cualquier proporción dada (por ejemplo, glicina y serina en una proporción 3:1).
Una vez que se preparan las diversas variaciones de sustitución, deleción e inserción de la secuencia de unión al núcleo (por ejemplo, de forma inmovilizada en un soporte de matriz, tal como una micromatriz), se analiza una propiedad predeterminada de la molécula diana purificada, por ejemplo, en condiciones de reacción o unión apropiadas.
Tras la maduración de la secuencia de unión al núcleo (de modo que se identifica una secuencia de aminoácidos más óptima de la secuencia de unión al núcleo para unirse a la molécula diana, por ejemplo), las posiciones N terminal y/o C terminal pueden experimentar una etapa de extensión, con lo que la longitud de la secuencia de unión al núcleo madurada se extiende adicionalmente para incrementar la especificidad y la afinidad por la molécula diana.
De acuerdo con diversos modos de realización de la extensión N terminal de la presente divulgación, una vez que se identifica la secuencia de unión al núcleo madurada a través del proceso de maduración, se puede añadir (o sintetizar en) el extremo N terminal de una secuencia de unión al núcleo madurada cualquier aminoácido específico, por ejemplo. Del mismo modo, de acuerdo con diversos modos de realización de la extensión C terminal de la presente divulgación, una vez que se identifica la secuencia de unión al núcleo madurada a través del proceso de maduración, se puede añadir (o sintetizar en) en el extremo C terminal de una secuencia de unión al núcleo madurada cualquier aminoácido específico. De acuerdo con algunos modos de realización de la presente divulgación, la secuencia de unión al núcleo madurada usada en la extensión C terminal y la extensión N terminal puede incluir también una, o ambas, de una secuencia de aminoácidos con titubeo N terminal y C terminal. Las secuencias de aminoácidos con titubeo N terminal y C terminal pueden comprender tan solo 1 aminoácido o hasta 15 o 20 aminoácidos (o más), y la secuencia de aminoácidos con titubeo N terminal puede tener la misma longitud que, ser más larga o más corta que la secuencia de aminoácidos con titubeo C terminal. Además, las secuencias de aminoácidos con titubeo N terminal y C terminal pueden comprender cualquier grupo definido de aminoácidos en cualquier proporción dada (por ejemplo, glicina y serina en una proporción 3:1). Las extensiones descritas anteriormente pueden dar como resultado un péptido de secuencia de unión al núcleo extendido y maduro.
En uso, una matriz de extensión se puede exponer a una molécula diana purificada concentrada, con lo que la molécula diana se puede unir a cualquier péptido de interés (por ejemplo, un péptido cíclico), independiente de los otros péptidos que comprenden las poblaciones. Después de la exposición a la molécula diana, se puede someter a ensayo la unión o actividad, por ejemplo, de la molécula diana. Como se conoce la secuencia peptídica para cada localización en la matriz, es posible trazar/cuantificar/comparar/contrastar las secuencias (y las fuerzas de unión o la actividad, por ejemplo) de la molécula diana en relación con el péptido específico que comprende el péptido de secuencia de unión al núcleo extendido y madurado. Un procedimiento ejemplar es revisar la fuerza de unión en un agrupamiento basado en la distribución de análisis por principios, tal como se describe en Standardizing and Simplifying Analysis of Peptide Library Data, Andrew D White et al., J Chem Inf Model, 2013, 53(2), pp 493-499, incorporado en el presente documento por referencia. El agrupamiento de la unión a los péptidos respectivos mostrado en un agrupamiento basado en la distribución de análisis por principios indica péptidos que tienen secuencias peptídicas superpuestas. Como se demuestra con mayor detalle a continuación, a partir de las secuencias peptídicas superpuestas (de cada grupo), se puede identificar y construir un péptido de secuencia de unión al núcleo extendido y madurado para una evaluación
adicional. En algunos modos de realización de la presente solicitud, un péptido de secuencia de unión al núcleo extendido y madurado experimenta un proceso de maduración posterior.
Después de la identificación de una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada, se puede realizar un análisis de especificidad de acuerdo con algunos modos de realización de la presente divulgación. Un ejemplo de un análisis de especificidad incluye un análisis del sistema "Biacore™" que se usa para caracterizar péptidos de interés (por ejemplo, péptidos cíclicos) en términos de la interacción específicamente con una molécula diana, las tasas cinéticas (de "aso", unión, y "dis", disociación) y afinidad (fuerza de unión). Biacore™ es una marca de General Electric Company. En www.biacore.com/lifesciences/introduction/index.html está disponible una visión general del sistema y el proceso Biacore™. Un beneficio de "Biacore™" es la capacidad de realizar los análisis de cinética, especificidad y afinidad de una manera sin marcadores.
EJEMPLO 2
Diseño de un polipéptido de andamio CDR H3 de anticuerpo de vaca para presentación en ARNm
Las CDR H3 bovinas ultralargas tienen determinadas regiones consenso que definen el límite del dominio "tallo" y el "botón" de estos polipéptidos. Por ejemplo, muchos anticuerpos (tales como BLV1H12 y BLV5B8) tienen un motivo “T(T/S)VHQ” (SEQ ID NO: 312) en la base de sus hebras ascendentes. En cuanto a las hebras descendentes del tallo, tienen aromáticos alternos (por ejemplo, YXYXY) que forman una escalera a través de interacciones de apilamiento. Como resultado, se determinaron las siguientes secuencias para un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca para su uso en la presentación en ARNm: MGCTSVHQETKKYQS(X)ioSYTYNYF.HVDVWGCGSADYKDDDDKKK (SEQ ID NO:313). Como se muestra en la figura 1, las bases N terminales, la hebra beta ascendente, la hebra beta descendente y las bases C terminales forman la región del tallo. La región de botón del polipéptido que se produjo contiene 10 residuos aleatorios X10, donde X puede ser cualquiera de los veinte aminoácidos naturales (véase la figura 1). Se anexó una marca FLAG en el extremo C para una fácil recuperación de las moléculas de fusión durante el proceso de selección. Teóricamente, el número de secuencias de aminoácidos excepcionales que podrían aparecer en una colección usando este polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca es ~1013 (2010).
EJEMPLO 3
Construcción de una colección de ADN sintético que codifica la colección de péptidos combinatorios
Para codificar la colección de péptidos de longitud completa mencionada anteriormente, se preparó un ADN molde que contenía más de doscientas bases. Con esta longitud, la fidelidad a menudo se compensaba con la síntesis química. Por lo tanto, en primer lugar se creó un ADN molde que codificaba parte de la colección (encargada a través de IDT). A continuación se llevó a cabo una PCR de alta fidelidad para extender la colección a su longitud completa. Todos los miembros de la colección de ADN resultante contenían un promotor de la ARN polimerasa T7, una secuencia potenciadora, una secuencia de codificación de la marca FLAG C terminal y un casete aleatorio que codificaba los diez codones aleatorios consecutivos (véase la figura 1). La región aleatoria usó la secuencia NNS (SEQ ID NO: 314) (NNCíSFQIDN0:3I5) o \ j \ j t ¡ (SEQ ID NO: 316)) para minimizar la aparición de los codones de parada. Para un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que presenta un único péptido, el péptido de unión a trombina, el casete de secuencia de aminoácidos aleatorio se reemplazó con la siguiente secuencia:
TGCATTATCAAAAAGAGCCGCGATCCGGGCCGCTGC (SEQ ID NO: 317), que codificaba el péptido CIIKKSRDPORC (SEQ ID NO: 318).
EJEMPLO 4
Expresión de un péptido de unión a trombina y una colección de péptidos
El ADN que codificaba el péptido de unión a trombina o la colección de péptidos se usó como molde en la síntesis de proteínas in vitro PURExpress según las instrucciones del fabricante. La mezcla de reacción resultante se comprobó en un gel de SDS page desnaturalizante y se visualizó mediante tinción con plata (véase la figura 2). La banda que correspondía al fragmento de péptido de unión a trombina se cortó adicionalmente, se digirió en gel y se envió para un análisis por espectrometría de masas (UW Biotechnology Center), que confirmó adicionalmente la síntesis satisfactoria del péptido como se diseñó (véase a continuación).
EJEMPLO 5
Construcción de una colección de presentación en ARNm con estructuras de tallo y botón y selección de proteínas de unión diana de alta afinidad (trombina)
1) Elementos de secuencia de la colección de presentación en ARNm propuesta
Se creó una colección de presentación en ARNm novedosa que codificaba la cadena polipeptídica CTSVHQETKKYQS(Xio)SYTYNYEHVDVW (SEQ ID NO: 319). La secuencia de aminoácidos “CTSVHQETKKYQS...SYTYNYEHVDVW” (SEQ ID NOS: 320 y 370, respectivamente) se adoptó a partir de la estructura de tallo y botón de la región CDR H3 de anticuerpos de vaca. X10 se refiere a diez aminoácidos aleatorios que se presentan en la parte superior de la región de botón durante la selección. Se espera que la parte peptídica de la colección de presentación en ARNm tenga las siguientes secuencias si están en su longitud completa:
MGCTSVHQETKKYQS(X10)SYTYNYEHVDVWGCGSADYKDDDDICKK (SEQ ID NO:321)
“ DYKDDDDK” (SEQ ID NO: 322) es una marca FLAG que se incorporó para permitir una purificación eficaz de las moléculas de fusión péptido/ARNm durante la selección.
La colección de ARNm que codifica las secuencias peptídicas mencionadas anteriormente tenía las siguientes secuencias:
G G G U U A A C U U U A G U A A G G A G G A C A G C U A A A U G GGUUGC AC C AG C G U G C AU C AG G AG AC C AAG AAAU AC C AG AG C N N SN N SN NSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSAG CUACACCUACAACUACG AA C AU G U G G AU G U AU G G G G UU G C G G CU C C G C UG AC U AC AAAG AU G A C G A C G A U A A G A A A A A A (SEQ ID NO:323)
donde “AUG” (SEQ ID NO: 324) es el codón de iniciación. La colección de ADN correspondiente tenía las siguientes secuencias:
TA A TA C G A C T C A C T A T A G G G TTAAC TTTA G TA A G G A G G A C A G C TA A A TG G G TTG C AC C AG C G TG C ATC AG G AG A C C A AG A AA TA C C AG AG CNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SAGCTACAC CTACAACTACG AACATG TG G ATG TATG G G G TTG CG G CTCCG CTG A C T A C A A A G (SEQ ID NO:325)
ATGACGACGATAAGAAAAAA (SEQ ID NO: 326)
donde “ TAATACGACTCACTATAGGO” (SEQ ID NO: 327) es el sitio del promotor T7.
2) Amplificación por PCR de la colección 300-53-N10
300-53-N10:
TAAG G AG G AC AG CTAAATG G G TTG C AC C AG C G TG C ATC AG G AG
ACC A A G A A A T AC C AG AG C N N SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SNN SN N SAG C TAC AC C TAC AAC TAC G AAC ATG TG G ATG TATG G G G TT G C G G C TC C G C TG AC TAC AAAG ATG AC G AC G A (SEQ ID NO:328)
300-48-1:
TAA TA C G A C TC A C TA TA G G G TTA A C TTTA G TA A G G A G G A C A G C T A A A T G (SEQ ID NO:329)
300-22-2: TTTTTTCTTATCGTCGTCATCTTTGTAGTC (SEQ ID NO: 330)
Para sintetizar la colección de ADN descrita anteriormente, se encargaron de IDT una colección de ADN inicial de 162 nucleótidos 300-53-N10 y dos cebadores 300-48-1 y 300-22-2. La siguiente reacción de PCR se llevó a cabo además para amplificar y lograr una colección de ADN de longitud completa:
Mezcla de PCR
Tampón HF 5X (NEB) 200 ul
300-48-1 100 uM 10 ul 1000 pmol
300-22-2 100 uM 10 ul 1000 pmol
Molde sintético 300-53-N10 10 uM 10 ul, 100 pmol.
dNTP 10 mM 20 ul
Agua 745 ul
Polimerasa Phusion Inicio en caliente (NEB) 5 ul
La mezcla se amplificó por PCR durante 6 ciclos
98 °C 30"->(98 °C 20"->64 °C 30"->72 °C 30") 6 ciclos->72 °C 2'
El producto de la PCR se purificó con dos columnas QIAgen, eluidas con 26 ul de H2O cada una para un total de 52 ul. A continuación se midió la concentración de ADN y fue de 244,5 ng/ul.
3) Transcripción de la colección de ADN generada anteriormente
Transcripción de T7 RiboMax (Promega) en 50 ul.
Tampón T75X 10 ul
rNTP 25 mM cada uno 12,5 ul
Colección de ADN 244,5 ng/ul 22,5 ul
Mezcla de enzimas T7 5 ul
Se incubó la mezcla de reacción a 37 0C durante 3 h.
A continuación se le añadió 5 ul de RQ1 DNasa directamente a la mezcla de reacción, 37 0C durante 30 min.
Se purificaron los transcritos con RNeasy mini (Qiagen) y se eluyeron en 32 ul de H2O, 2939,6 ng/ul.
4) Fijación del espaciador de puromicina
Tampón ARN ligasa T4 10X (NEB) 5 ul
ATP 10 mM 1,5 ul
Colección de ARNm 2939,6 ng/ul 10 ul
Espaciador de puromicina 100 uM 20 ul
ARN ligasa T4 (NEB) 10 ul
H2O 3,5 ul
Se calentó el ARNm a 75 0C durante 1 min antes de ensamblar la reacción de la ligasa, que a continuación se incubó a 15 0C durante 2 h. Se purificó el ARNm usando una columna RNeasy (QIAgen) y se eluyó en 30 ul de H2O, 647,4 ng/ul, y a continuación se usó para la traducción con PURExpress.
5) Traducción con PURExpress deltaRF123 (NEB) del espaciador de ARNm
Solución A 20 ul
Solución B (menos RF123) 15 ul
RNasin 1 ul
Espaciador de ARNm (647,4 ng/ul) 15 ul
Se incubó la mezcla a 37 0C durante 1,5 h. A continuación se le añadió al 2 % 5 ul de SDS al 20 %.
Las siguientes etapas usaron microesferas anti-FLAG para capturar las moléculas de fusión y permitieron el lavado y la recuperación en las microesferas
Se lavaron 50 ul de microesferas magnéticas anti-FLAG M2 (Sigma) con TBSTE BSA al 2 % 1X. Se mezcló la reacción de traducción con 350 ul de TBSTE BSA al 2 % 1X y microesferas bloqueadas. A continuación se incubó la reacción a 4 0C durante 30 min y se lavó 3X en TE+ Tween 20 al 0,2 %.
6) Se realizó la extensión del cebador RT en las microesferas y se eluyeron los conjugados de fusión como sigue: Resuspendidos en 40 ul:
Cebador inverso 300-22-2 100 uM 1 ul
dNTP 10 mM 2 ul
H2O sin RNasa 23,5 ul
Tampón RT 5X (Invitrogen) 8 ul
DTT 0,1 M 4 ul
RNasin (Promega) 0,5 ul
Superscript III (Invitrogen) 1 ul
Se incubó la mezcla a 50 0C durante 30 min, se lavó 3X en TE Tween 20 al 0,2 % y se transfirió a un nuevo tubo. A continuación se eluyó la mezcla 2X con 50 ul de HCl de guanidina 6 M en TE, 1 ul de 10 mg/ml de ARNt, precipitado de etanol, 30' a -20 0C.
A continuación se centrifugó la mezcla y se resuspendió en 100 ul de 1xTE, y se le añadió 1xTBSTE/Tween al 0,2 % a 1 ml.
7) Preselección
Se añadió 1 ml de las fusiones de la etapa previa a 50 ul de microesferas M270 SA bloqueadas con TBSTE BSA al 2 % a temperatura ambiente, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min, y se retiró el sobrenadante para la unión con trombina biotinilada.
8) Se unieron fusiones preseleccionadas a 3 ul de trombina humana biotinilada a 1 U/ul a 4 0C durante 1 h con rotación 9) Captura de microesferas M270
Se lavaron 25 ul de suspensión de microesferas M270 SA y se bloquearon con TBSTE BSA al 2 %. A continuación se recogieron las microesferas, se mezclaron con 1 ml de cada complejo de fusión/diana y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. La mezcla se lavó 3X en TBSTE, se transfirió a un nuevo tubo y se eluyó el ADNc con 50 ul de NaOH 0,1 N a temperatura ambiente durante 3 min. A continuación, 2,5 ul de NaAc 3 M, pH 5,5. Se le añadió la columna de centrifugación BioRad y se ajustó el volumen a 147 ul con H2O.
10) Amplificar la colección por PCR con Phusion
Esta etapa de PCR se llevó a cabo para amplificar la colección para la siguiente ronda de selección y también para ayudar a determinar cómo de satisfactoria fue la selección
Se preparó mezcla de PCR (200 ul):
Tampón HF 5X (NEB) 40 ul
Cebador directo 300-48-1 10 uM 4 ul
Cebador inverso 300-22-2 10 uM 4 ul
dNTP 10 mM 4 ul
ADNc 147 ul
Polimerasa Phusion 1 ul
Se sometieron a prueba diversos ciclos de PCR y se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa para ayudar a determinar los números de ciclos más apropiados donde se pueden detectar suficientes productos de amplificación sin sobreamplificación. Como se ilustra en la figura 3, en este caso particular, se sometieron a prueba los números de ciclo 15, 19, 24, 27 y 30, y el número de ciclo 24 se usó para amplificación adicional por PCR.
11) Rondas iterativas de selecciones -
Las siguientes rondas de selecciones (3-5) se llevaron a cabo siguiendo el procedimiento anterior con restricción incrementada (por ejemplo, menores cantidades de entrada de moléculas de fusión y número incrementado de etapas de lavado). Después de cada ronda de selección, se realizó una amplificación por PCR similar para preparar la colección de ADN para la siguiente ronda de selección.
En resumen, por ejemplo, una ronda de presentación en ARNm consistió en las siguientes etapas: transcripción in vitro, digestión con DNasa, conjugación con el conector oligonucleotídico de puromicina, traducción in vitro/formación de fusión, purificación de la molécula de fusión FLAG, retrotranscripción, preselección o selección funcional y regeneración de las secuencias seleccionadas. En resumen, se transcribió in vitro la colección de ADNc usando ARN polimerasa T7, se generaron los moldes de ARNm con puromicina en los extremos 3' mediante reticulación con un oligonucleótido que contenía un residuo de psoraleno y un residuo de puromicina en sus extremos 5' y 3', respectivamente, y se realizó la traducción in vitro usando un kit NEB Purexpress A123. A continuación, las fusiones de proteína-ARNm deseadas se aislaron de la mezcla de reacción de traducción usando microesferas magnéticas anti-FLAG. A continuación, las moléculas de fusión se convirtieron en híbridos de ADN/ARN a través de retrotranscripción. Esta etapa eliminó estructuras de ARNm secundarias que podrían interferir con la selección posterior. A continuación, la colección resultante de péptidos sintéticos presentados en ARNm se usó para la selección.
12) Resultados y análisis
Para analizar los resultados de la selección, las colecciones de ADN se amplificaron después de cada ronda de selección usando cebadores de secuenciación especialmente diseñados que albergaban adaptadores de secuenciación de nueva generación de Illumina. Se mezclaron las colecciones, se purificaron adicionalmente y se realizó la secuenciación de nueva generación. Las secuencias peptídicas recuperadas después de cada ronda de selección se identificaron de acuerdo con su código de barras de secuenciación excepcional y se realizó una comparación y análisis adicionales. La secuenciación de nueva generación proporcionó las ventajas de un alto rendimiento y una visión general más completa de las especies seleccionadas.
Ejemplo 6
Progreso de la selección contra la trombina y secuencias de péptidos seleccionados
Cuando se usó trombina como diana, se llevaron a cabo un total de tres rondas de selecciones. La presión de selección se incrementó incrementando la restricción del lavado (de tres a cinco veces y a continuación a diez veces para la ronda de selección 1, 2 y 3). La tabla 1 ilustra las proteínas de unión principales (clasificadas de acuerdo con su frecuencia) después de cada ronda de selección. Después de la ronda de selección 3, más de un 30 % de los péptidos seleccionados contenían el motivo “ RDPGR” (SEQ ID NO: 331) conservado. El péptido RIJPGRI 1I;QS" (SEQIDNO: 332) más abundante se eligió para su análisis adicional.
Ejemplo 7
Características de unión de proteínas de unión de trombina seleccionadas
Se encargó ADN molde 300-53-C lineal que codifica el péptido MGCTSVHQETKKYQSRDPGRLIFQSSYTYNYEHVDVWGCGSAWSHPQFE KGS (SEQ ID NO: 363) como ADN monocatenario sintético purificado (ADNmc) de IDT.com como sigue:
5’-ATGGGTTGCACCAGCGTGCATCAGGAGACCAAGAAATACCAG
AGCAGAGATCCTGGTAGATTAATATTTCAATCTAGCTACACCTACAACT ACGAACATGTGGATGTATGGGGTTGCGGCTCCGCTTGGAGCCATCCGCA GTTCGAAAAGGGTAGT -3TSEQ ID NO:364).
Cebador PC1:
5 ’ -T AAT ACG ACT C ACTAT AGGGTTAACTTT AGT AAGGAGG AC AGCT AAA
TGGGTTGCACCAG-3'íSEQ SD NO:36J¡,
Cebador PC2: 5’-TTAACTACCCTTTTCGAACTGCGGATGGCTCCA - 3'(SEQ ID NO:366).
El ADNmc (SEQ ID NO: 363) se amplificó adicionalmente y se convirtió en ADN bicatenario (ADNbc) por PCR con una polimerasa de alta fidelidad de acuerdo con el siguiente protocolo
Tampón HF 5X (NEB) 200 ul
PC 1100 uM 10 ul 1000 pmol
PC2 100 uM 10 ul 1000 pmol
Molde sintético 10 uM 10 ul 100 pmol
dNTP 10 mM 20 ul
Agua 745 ul
Polimerasa Phusion Inicio en caliente 5 ul
La mezcla se amplificó por PCR durante 6 ciclos: 98 0C 30"->(98 0C 20"->64 0C 60"->72 0C 30") 6 ciclos ->72 0C 2'. A continuación, el producto de la PCR se purificó con dos columnas QIAGEN y se eluyó con 25 ul de H2O cada una para un total de 50 ul. A continuación se midió la concentración de ADN y se ajustó a una concentración final de 250 ng/ul. A continuación, se ensambló en hielo una reacción de traducción in vitro usando PURExpress (NEB, E6800) en el siguiente orden:
Solución A: 10 pl
Solución B: 7,5 pl
Inhibidor de la ribonucleasa RNAsin: 1 pl
H2O sin nucleasa: 4,5 pl
ADNbc molde: 2 pl, 250 ng/ul
Se incubaron las muestras a 37 0C durante 3 horas. A continuación se detuvo la reacción colocando el/los tubo(s) en hielo, y las muestras se almacenaron a -20 0C para su uso futuro.
Se determinó la cinética de unión de los péptidos brutos de la mezcla de traducción midiendo la resonancia de plasmón superficial en un BIAcore X100. En resumen, se inmovilizaron 50 ug/ml de strepMAB-Immo (anticuerpo monoclonal específico Strep-tag® II de IBA) en NaAc 10 mM sobre un chip sensor CM5 que se activó previamente con NHS/EDC. Después de desactivación con etanolamina, se inyectó una mezcla de traducción bruta (10 ul diluidos en 113 ul de 1xHBS/EP tampón de migración). Los péptidos expresados en la mezcla contenían una marca de strep II y, por tanto, se capturaron por la superficie modificada por StrepMAB-Immo. A continuación, se hizo fluir por la superficie trombina con un intervalo de diferentes concentraciones (0 nM, 3,125 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM y 50 nM) de acuerdo con el protocolo estándar de cinética de un único ciclo, consistiendo cada etapa en una fase de asociación de inyección de 120 segundos y una fase de disociación de 800 segundos. Se registró el sensograma (véase la figura
4) y se derivaron las constantes cinéticas mediante ajuste global a un modelo de unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático de evaluación BIAcore X100.
Se prepararon adicionalmente dos péptidos (se sintetizaron y purificaron mediante Peptide 2.0) con las siguientes secuencias: a) Biotina - GCTSVHQETKKYQSRDPGRI.IFQSSYTYNYEHVDVW GCG (SEQ ID NO: 367) y b) Biotina -GGGGSGGGGSRDPGRLIFQS (SEQ ID NO: 368). Las afinidades de unión de cada péptido hacia la trombina se sometieron a prueba en un sistema Biacore X100.
En resumen, se inmovilizaron 50 ul de 100 ug/ml de estreptavidina (en NaAc 10 mM, EDTA 0,1 mM, NaCl 1 mM, DTT 1 mM, pH 4,6) en un chip sensor CM5 que se activó previamente con NHS/EDC a un caudal de 5 pl/min. Después de desactivación con etanolamina, se inyectaron y capturaron péptidos biotinilados (10 ng/ml). Siguiendo el protocolo estándar para cinética de ciclos múltiples, se realizaron a continuación una serie de inyecciones de trombina a 0 nM, 3,125 nM, 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM y 50 nM. Después de cada inyección, se regeneró la superficie del sensor durante 2 min con glicina-HCl 10 mM, pH 1,7 (de GE). Se registró el sensograma (véase la figura 5) y se derivaron las constantes cinéticas mediante ajuste global a un modelo de unión de Langmuir 1:1 usando el programa informático de evaluación BIAcore X100.
Como se puede observar en los datos, cuando la secuencia del núcleo conservada seleccionada se coloca en el contexto del andamio de anticuerpo de vaca, su rendimiento de unión hacia la trombina se potenciaba enormemente, como se demuestra por un incremento de más de cuarenta veces en los valores de Kd cuando se compara con el péptido lineal sin secuencias de andamio de anticuerpos de vaca. El andamio de anticuerpo de vaca puede proporcionar una conformación ciclada (debido a la existencia de su "tallo" de hebra p), lo que a su vez incrementa la afinidad del péptido por su diana al disminuir el coste entrópico de la unión.
*) Página 2a, línea suplementaria 10
En este contexto, un experto en la técnica antes de que se realizara la invención conocía la siguiente técnica anterior: FENG WANG ETAL.: "Reshaping Antibody Diversity", CELL, vol. 153, n.° 6, 1 de junio de 2013 (2013-06-01), páginas 1379-1393,
"World ADC Cow Antibodies: A New Structural Class of Antibody Using Ultra long CDR3s", Scripps Res Inst, Dept Integrat Struct and Computat Biol, La Jolla, CA 92037 EE. UU.;
"In vitro evolution of single-chain antibodies using mRNA display", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, OXFORD UNIVERSITY PRESS, GB, vol. 34, n.° 19, 1 de noviembre de 2006
"Directed evolution of high-affinity antibody mimics using mRNA display", CHEMISTRY AND BIOLOGY, CURRENT BIOLOGY, LONDRES, GB, vol. 9, n.° 8, 1 de agosto de 2002
Documento WO 2010/039852 A2
Documento EP 2 647 704 A1
Documento EP 2 615455 A1
Claims (13)
1. Un procedimiento para seleccionar un péptido de interés, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
a) preparar una colección de péptidos usando un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende el péptido de interés que se va a identificar;
b) seleccionar el péptido de interés de la colección de péptidos poniendo en contacto una molécula diana con el péptido de interés en el que la molécula diana se inmoviliza sobre un soporte sólido o está en solución; e
c) identificar la secuencia de aminoácidos del péptido de interés,
en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende la secuencia MGCTSVHQETK.KYQS(X*)cSYTYNYEHVDV\VGCGSADYKDDDDKKK (SEQ ID NO: 3)
en la que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en la que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de preparación de la colección de péptidos comprende la etapa de transcripción in vitro de una colección de ADN para formar una colección de ARNm.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que los miembros de la colección de ADN comprenden una secuencia promotora de ARN polimerasa, una secuencia potenciadora y una secuencia de marca de purificación.
4. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprende además la etapa de traducir in vitro el ARNm de la colección de ARNm para formar conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm que comprenden el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca comprende una marca de purificación.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende además la etapa de purificar los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm usando la marca de purificación.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, que comprende además la etapa de retrotranscribir el ARNm de la colección de ARNm para formar híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la etapa de selección comprende poner en contacto los híbridos de ARNm-ADN de los conjugados de fusión de polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca-ARNm con la molécula diana.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además uno de:
i) sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende el péptido de interés en una micromatriz de péptidos para al menos uno de madurar y extender el péptido de interés; y
ii) sintetizar el péptido de interés en una micromatriz de péptidos para madurar y/o extender el péptido de interés.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, que comprende las etapas de:
a) sintetizar el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca que comprende el péptido de interés, o derivados del péptido de interés, en una primera micromatriz de péptidos, en el que los derivados del péptido de interés incluyen al menos una alteración en la secuencia del péptido de interés seleccionada de una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos, y una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos;
b) formar a partir de los péptidos funcionalizados, en los que los péptidos funcionalizados están en forma lineal, péptidos cíclicos de fórmula VIII
en la que cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R5 y R6 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido
cada R7 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector N terminal;
R8 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector; cada X e Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z;
Z es un grupo que comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida, un enlace disulfuro, un enlace isopeptídico, un 1,2,3-triazol y una 1,2-quinona opcionalmente sustituida;
L' es un grupo de unión bivalente opcional o un enlace;
m es un número entero de 0 a 6;
n es 0 o 1;
p es 0 o 1;
q es un número entero de 0 a 50;
r es un número entero de 0 a 50;
s es un número entero de 0 a 50;
t es un número entero de 0 a 50;
u es un número entero de 0 a 50; y * es un punto de conexión que conecta el péptido cíclico a un soporte de matriz que tiene una superficie reactiva;
comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un péptido funcionalizado de fórmula IX en condiciones que hacen que se forme Z
en la que R1, R2 R3, R4, R5, R6, R7 y R8, m, n, p, q, r, s, t, u, L' y * son como se define para la fórmula VIII;
X' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
Y' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z' y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z'; y
cada Z' y Z" se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, -OH, hidrógeno, un tiol, una amina, un ácido carboxílico, una amida, un alquino, una acida, un aminofenol opcionalmente sustituido, una cadena lateral de aminoácido natural, una cadena lateral de aminoácido no natural, un grupo protector N terminal y un grupo protector C terminal, siempre que Z' y Z" sean grupos complementarios que se combinen para formar Z;
en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos se inmovilizan en la superficie reactiva;
c) exponer los péptidos cíclicos a la molécula diana, con lo que la molécula diana se une a al menos un péptido cíclico; d) identificar uno o más de los péptidos cíclicos que demuestran una fuerte unión a la molécula diana, con lo que se determina una secuencia de unión al núcleo madurada;
e) realizar al menos una de la extensión N terminal y C terminal de la secuencia de unión al núcleo madurada determinada en la etapa d para proporcionar una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada en una segunda micromatriz de péptidos;
f) exponer la molécula diana a la segunda micromatriz de péptidos que comprende una población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada generados en la etapa e en la que la población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada comprende péptidos cíclicos formados como en la etapa b; e g) identificar un péptido cíclico extendido y madurado con una fuerte unión a la molécula diana.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, que comprende además las etapas de:
a) sintetizar el péptido de interés, o derivados del mismo, en una primera micromatriz de péptidos, en el que los derivados del péptido de interés incluyen al menos una alteración en la secuencia del péptido de interés seleccionada de una única sustitución aminoacídica, una doble sustitución aminoacídica, una deleción de uno o más aminoácidos, y una inserción de uno o más aminoácidos, con lo que se generan péptidos funcionalizados en la primera micromatriz de péptidos;
b) formar a partir de los péptidos funcionalizados, en los que los péptidos funcionalizados están en forma lineal, péptidos cíclicos de fórmula I
en la que cada R1, R2, R3 y R4 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada R5 y R6 se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, un grupo de caperuza N terminal y un grupo protector N terminal;
R7 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal, un grupo protector C terminal, y
cada R8 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
R9 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal y un grupo protector C terminal; Q se selecciona del grupo que consiste en un enlace, un carbonilo, una cadena lateral de aminoácido natural y una cadena lateral de aminoácido no natural;
cada X e Y se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z;
Z es un grupo que comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en un enlace amida, un enlace disulfuro, un enlace isopeptídico, un 1,2,3-triazol y una 1,2-quinona opcionalmente sustituida;
cada L' y L" es independientemente un grupo de unión bivalente opcional o un enlace;
b es un número entero de 0 a 50;
m es un número entero de 0 a 6;
n es 0 o 1;
p es 0 o 1;
q es un número entero de 0 a 6;
r es 0 o 1;
s es un número entero de 0 a 100;
t es 0 o 1;
u es 0 o 1;
v es un número entero de 0 a 100;
w es 0 o 1; y * es un punto de conexión que conecta el péptido cíclico a un soporte de matriz que tiene una superficie reactiva; y *** es un punto de conexión con el resto del péptido funcionalizado;
comprendiendo el procedimiento la etapa de hacer reaccionar un péptido funcionalizado de fórmula II en condiciones que hacen que se forme Z
en la que R1, R2 R3, R4, R5, R6, m, n, p, q, r, s, t, v, w, L', L", * y *** son como se define para la fórmula I;
R10 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal, un grupo protector C terminal, y
cada R11 es independientemente una cadena lateral de aminoácido natural o una cadena lateral de aminoácido no natural;
R12 se selecciona del grupo que consiste en -OH, un grupo de caperuza C terminal y un grupo protector C terminal; Q' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, un carbonilo, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
X' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z" y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z";
Y' se selecciona del grupo que consiste en un enlace, una cadena lateral de aminoácido natural unida covalentemente a Z' y una cadena lateral de aminoácido no natural unida covalentemente a Z';
cada Z' y Z" se selecciona independientemente del grupo que consiste en un enlace, -OH, hidrógeno, un tiol, una amina, un ácido carboxílico, una amida, un alquino, una acida, un aminofenol opcionalmente sustituido, una cadena lateral de aminoácido natural, una cadena lateral de aminoácido no natural, un grupo protector N terminal y un grupo protector C terminal, siempre que Z' y Z" sean grupos complementarios que se combinen para formar Z;
g es un número entero de 0 a 50; e
y es 0 o 1;
en el que los péptidos funcionalizados y los péptidos cíclicos se inmovilizan en la superficie reactiva;
c) exponer los péptidos cíclicos a la molécula diana, con lo que la molécula diana se une a al menos un péptido cíclico;
d) identificar uno o más de los péptidos cíclicos que demuestran una fuerte unión a la molécula diana, con lo que se determina una secuencia de unión al núcleo madurada;
e) realizar al menos una de la extensión N terminal y C terminal de la secuencia de unión al núcleo madurada determinada en la etapa d para proporcionar una secuencia de unión al núcleo extendida y madurada en una segunda micromatriz de péptidos;
f) exponer la molécula diana a la segunda micromatriz de péptidos que comprende una población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada generados en la etapa e en la que la población de péptidos de la secuencia de unión al núcleo extendida y madurada comprende péptidos cíclicos formados como en la etapa b; e
g) identificar un péptido cíclico extendido y madurado con una fuerte unión a la molécula diana.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que Z comprende un resto seleccionado del grupo que consiste en
A.
en el que d es un número entero de 0 a 6, e es un número entero de 0 a 6 y f es un número entero de 0 a 6, y ** es un punto de conexión con el resto del péptido cíclico.
13. Un polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende un péptido de interés, en el que el polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca presentado en ARNm que comprende la secuencia MGCTSVHQF.TKKYQS(X*XSYTYNYF.HVDVWGCGSADYKDDDDKKK (SEQ ID NO: 3) en la que (X*)c es una secuencia de aminoácidos aleatoria, y en la que X* es una secuencia de aminoácidos y c es el número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos aleatoria.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201562152004P | 2015-04-23 | 2015-04-23 | |
PCT/EP2016/058989 WO2016170101A1 (en) | 2015-04-23 | 2016-04-22 | Cow antibody scaffold polypeptide method and composition |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2743448T3 true ES2743448T3 (es) | 2020-02-19 |
Family
ID=55809105
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES16718650T Active ES2743448T3 (es) | 2015-04-23 | 2016-04-22 | Procedimiento y composición del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20160312212A1 (es) |
EP (1) | EP3286314B1 (es) |
ES (1) | ES2743448T3 (es) |
WO (1) | WO2016170101A1 (es) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PL2257624T3 (pl) * | 2008-02-05 | 2012-09-28 | Medical Res Council | Sposoby i kompozycje |
KR20110061629A (ko) * | 2008-09-30 | 2011-06-09 | 아보트 러보러터리즈 | 개선된 항체 라이브러리 |
JP5818237B2 (ja) * | 2010-09-09 | 2015-11-18 | 国立大学法人 東京大学 | N−メチルアミノ酸およびその他の特殊アミノ酸を含む特殊ペプチド化合物ライブラリーの翻訳構築と活性種探索法 |
JP5920835B2 (ja) * | 2010-12-01 | 2016-05-18 | 田辺三菱製薬株式会社 | 無細胞翻訳系でFabを提示しうるポリヌクレオチド構築物ならびにそれを用いたFabの製造方法およびスクリーニング方法 |
-
2016
- 2016-04-22 US US15/136,025 patent/US20160312212A1/en not_active Abandoned
- 2016-04-22 EP EP16718650.1A patent/EP3286314B1/en active Active
- 2016-04-22 WO PCT/EP2016/058989 patent/WO2016170101A1/en active Application Filing
- 2016-04-22 ES ES16718650T patent/ES2743448T3/es active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016170101A1 (en) | 2016-10-27 |
EP3286314B1 (en) | 2019-06-26 |
EP3286314A1 (en) | 2018-02-28 |
US20160312212A1 (en) | 2016-10-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6911248B2 (ja) | エンコードライブラリの合成方法及び組成物 | |
JP4870870B2 (ja) | Rna−タンパク質融合体を用いたタンパク質の選別 | |
KR19990067102A (ko) | 리버스-턴 모사체 및 이와 관련된 방법 | |
AU2016251857B2 (en) | Method and composition for peptide cyclization and protease treatment | |
JP5379187B2 (ja) | 百日咳毒素を精製する方法およびそれに有用なペプチド | |
JP2022526939A (ja) | 修飾された切断酵素、その使用、および関連キット | |
CA2971246C (en) | Identification of transglutaminase substrates and uses therefor | |
Carter et al. | Coupling Strategies for the Synthesis of Peptide‐Oligonucleotide Conjugates for Patterned Synthetic Biomineralization | |
AU2015230180B2 (en) | Purification of DNA-conjugate products | |
ES2743448T3 (es) | Procedimiento y composición del polipéptido de andamio de anticuerpo de vaca | |
US20230193248A1 (en) | Methods for protein identification based on encoding reactions | |
JP2013518558A (ja) | 構造化されたペプチドプロセシング | |
US11237156B2 (en) | Method and composition for detection of peptide cyclization using protein tags | |
EP3286569B1 (en) | Specific peptide binders to proteins identified via systemic discovery, maturation and extension process | |
US12038443B2 (en) | Determination of protein information by recoding amino acid polymers into DNA polymers | |
US20240053350A1 (en) | High throughput peptide identification using conjugated binders and kinetic encoding | |
WO2022193902A1 (zh) | 环状化合物库及其构建方法 | |
Murakami et al. | High-affinity mirror-image monobody targeting MCP-1 generated via TRAP display and chemical protein synthesis | |
WO2024209857A1 (ja) | 核酸ディスプレイライブラリの作製方法、スクリーニング方法、及びポリペプチドの作製方法 | |
JPWO2005012902A1 (ja) | 有用タンパク質のスクリーニング方法 | |
Hayakawa et al. | Complementary DNA display selection of high‐affinity peptides binding the vacuolating toxin (VacA) of Helicobacter pylori | |
AU2012200892B2 (en) | Methods for purifying pertussis toxin and peptides useful therefor | |
de Koning et al. | Reactivity of PNA thioesters in chemical ligation reactions |