JP2023549229A - トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）に特異的な二環式ペプチドリガンド - Google Patents

トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）に特異的な二環式ペプチドリガンド Download PDF

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Abstract

本発明は、2以上のペプチドループがスキャフォールドへの取付点の間に内在するように、分子スキャフォールドに共有結合しているポリペプチドに関する。特に、本発明は、TfR1に結合するペプチドを記載している。本発明はまた、該二環式ペプチドリガンドのうちの少なくとも2つを含む多量体結合複合体に関する。本発明はまた、該ペプチドリガンド及び多量体結合複合体を含む医薬組成物、並びにTfR1によって媒介される治療剤の送達による疾患又は障害の予防、抑制、又は治療における該ペプチドリガンド、及び多量体結合複合体及び医薬組成物の使用を含む。【選択図】図１

Description

(発明の分野)
本発明は、2以上のペプチドループがスキャフォールドへの取付点の間に内在するように、分子スキャフォールドに共有結合しているポリペプチドに関する。特に、本発明は、TfR1に結合するペプチドを記載している。本発明はまた、該二環式ペプチドリガンドのうちの少なくとも2つを含む多量体結合複合体に関する。本発明はまた、該ペプチドリガンド及び多量体結合複合体を含む医薬組成物、並びにTfR1によって媒介される治療剤の送達による疾患又は障害の予防、抑制、又は治療における該ペプチドリガンド、及び多量体結合複合体及び医薬組成物の使用を含む。
(発明の背景)
環状ペプチドは、高い親和性及び特異性でタンパク質標的に結合することができ、それゆえ、治療薬の開発のための魅力的な分子クラスである。実際、いくつかの環状ペプチドは、例えば、抗菌ペプチドのバンコマイシン、免疫抑制薬のシクロスポリン、又は抗癌薬のオクトレオチドのように、診療所で使用されるのに既に成功している(Driggersらの文献(2008), Nat Rev Drug Discov 7(7), 608-24)。優れた結合特性は、ペプチドと標的との間で形成される比較的大きな相互作用表面だけでなく、環状構造の立体構造可撓性の低下にも起因する。通常、大環状分子は、例えば環状ペプチドCXCR4アンタゴニストCVX15(400Å2; Wuらの文献(2007), Science 330, 1066-71)、インテグリンαVb3に結合するArg-Gly-Aspモチーフを有する環状ペプチド(355Å2)(Xiongらの文献(2002), Science 296(5565), 151-5)、又はウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子に結合する環状ペプチド阻害剤ウパイン-1(603Å2; Zhaoらの文献(2007), J Struct Biol 160(1), 1-10)のように、数百平方オングストロームの表面に結合する。
その環状立体配置のために、ペプチド大環状分子は、直鎖状ペプチドよりも可撓性が低く、標的に結合したときのエントロピー損失がより小さくなり、結果的に、より高い結合親和性が生じる。可撓性の低下はまた、標的特異的立体構造の固定をもたらし、直鎖状ペプチドと比較して結合特異性を増加させる。この効果は、その環が開いたときに、他のMMPに対するその選択性を失うマトリックスメタロプロテイナーゼ8(MMP-8)の強力かつ選択的な阻害剤によって例証されている(Cherneyらの文献(1998), J Med Chem 41(11), 1749-51)。大環状化によって達成される有利な結合特性は、例えば、バンコマイシン、ナイシン、及びアクチノマイシンのような、複数のペプチド環を有する多環性ペプチドにおいてさらにより顕著である。
様々な研究チームが、以前に、システイン残基を有するポリペプチドを合成分子構造に繋いでいる(Kemp及びMcNamaraの文献(1985), J. Org. Chem; Timmermanらの文献(2005), ChemBioChem)。Meloen及び共同研究者らは、トリス(ブロモメチル)ベンゼン及び関連分子をタンパク質表面の構造的模倣用の合成スキャフォールド上での複数のペプチドループの迅速かつ定量的な環化に使用した(Timmermanらの文献(2005), ChemBioChem)。候補薬物化合物(ここで、該化合物は、システイン含有ポリペプチドを、例えば、1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)のような分子スキャフォールドに連結させることにより作製される)の作製方法(Heinisらの文献(2014) Angewandte Chemie, International Edition 53(6) 1602-1606)。
対象となる標的に対する二環式ペプチドの大型ライブラリーを作製及びスクリーニングするためのファージディスプレイに基づくコンビナトリアルアプローチが開発されている(Heinisらの文献(2009), Nat Chem Biol 5(7), 502-7及びWO 2009/098450号)。簡潔に述べると、3つのシステイン残基及び2つのランダムな6アミノ酸領域を含有する直鎖状ペプチド(Cys-(Xaa)6-Cys-(Xaa)6-Cys)のコンビナトリアルライブラリをファージ上に提示させ、システイン側鎖を低分子スキャフォールドに共有結合させることにより環化させた。
(発明の概要)
本発明の第一の態様によれば、少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つの反応基を含むポリペプチド及び該ポリペプチドの反応基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、その結果、少なくとも2つのポリペプチドループが該分子スキャフォールド上に形成される、トランスフェリン受容体1(TfR1)に特異的なペプチドリガンドが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも2つの二環式ペプチドリガンドを含む多量体結合複合体であって、該ペプチドリガンドが同じであっても異なっていてもよく、これらの各々が少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つの反応基を含むポリペプチド及び該ポリペプチドの反応基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、その結果、少なくとも2つのポリペプチドループが該分子スキャフォールド上に形成される、トランスフェリン受容体1(TfR1)に特異的なペプチドリガンドを含む、多量体結合複合体が提供される。
本発明のまたさらなる態様によれば、本明細書で定義されるペプチドリガンド又は多量体結合複合体を1以上の医薬として許容し得る賦形剤との組合せで含む医薬組成物が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、TfR1によって媒介される治療剤の送達によって疾患又は障害を予防、抑制、又は治療する際に使用するための本明細書で定義されるペプチドリガンド又は多量体結合複合体又は医薬組成物が提供される。
(図面の簡単な説明)
図1:ヒト近位尿細管細胞の初代培養物を用いるBCY17986によるトランスサイトーシスアッセイの結果 図2:ヒト近位尿細管細胞の初代培養物を用いるBCY17988によるトランスサイトーシスアッセイの結果 図3:ヒト近位尿細管細胞の初代培養物を用いるBCY17989によるトランスサイトーシスアッセイの結果 図4:ヒト近位尿細管細胞の初代培養物を用いるBCY17994によるトランスサイトーシスアッセイの結果
(発明の詳細な説明)
本発明は、「単量体」二環式ペプチド、すなわち、単一(単量体)の二環式ペプチドリガンドを含有するものと「多量体」二環式ペプチド、すなわち、1以上のリンカーを介してコンジュゲートされた複数の二環式ペプチド(例えば、2つ、3つ、又は4つ)を含有するものの両方に関するものであることが理解されるであろう。
(単量体二環式ペプチドリガンド)
本発明の第一の態様によれば、少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つの反応基を含むポリペプチド及び該ポリペプチドの反応基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、その結果、少なくとも2つのポリペプチドループが該分子スキャフォールド上に形成される、トランスフェリン受容体1(TfR1)に特異的なペプチドリガンドが提供される。
一実施態様において、該反応基は、システイン残基を含む。
「TfR1に特異的な」という用語は、トランスフェリン受容体1(TfR1)に結合するペプチドリガンドの能力を指すことが理解されるであろう。該ペプチドリガンドは、結合の正確なエピトープに応じて、TfR1に異なる影響を及ぼすことも理解されるであろう。例えば、該影響は、阻害性(すなわち、ペプチドリガンドは、トランスフェリンとTfR1との結合を妨害/阻害する)又は非阻害性(すなわち、ペプチドリガンドは、トランスフェリンとTfR1との結合を妨害/阻害しない)のいずれかである。
(阻害性ペプチドリガンド)
一実施態様において、ペプチドリガンドはTfR1に特異的であり、かつトランスフェリンとTfR1との結合を妨害/阻害する様式でTfR1に結合する。
さらなる実施態様において、該ループ配列は、2、3、6、8、又は9つのアミノ酸を含む。
一実施態様において、該ループ配列は、その第一のものが2つのアミノ酸からなり、かつその第二のものが9つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む。
一実施態様において、該ループ配列は、その両方が6つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む。
一実施態様において、該ループ配列は、その第一のものが3つのアミノ酸からなり、かつその第二のものが8つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む。
一実施態様において、ペプチドリガンドは、
Figure 2023549229000002
 (ここで、Ci、Cii、及びCiiiは、それぞれ、第一、第二、及び第三のシステイン残基を表す)
:のアミノ酸配列、又はその医薬として許容し得る塩を含む。
さらなる実施態様において、分子スキャフォールドは、1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)であり、ペプチドリガンドは、N-及び/又はC-末端付加を含み、かつ
A-(配列番号1)-A(本明細書において、BCY12455と称される);
A-(配列番号1)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY12652と称される);
A-(配列番号2)-A(本明細書において、BCY12452と称される);
A-(配列番号2)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY12650と称される);
A-(配列番号3)-A(本明細書において、BCY12454と称される);及び
A-(配列番号3)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY12651と称される)
(ここで、Sarは、サルコシンを表し、かつFlは、フルオレセインを表す)
:から選択される。
この説明のために、阻害性二環式ペプチドは、TATAとともに環化され、三置換構造を生じると仮定される。しかしながら、本明細書に提示される本発明の説明から明らかであるように、環化は、少なくとも2つのポリペプチドループが形成されるように、ポリペプチドの反応基との共有結合を形成する任意の好適な分子スキャフォールドで実施されることができる。環化は、Ci、Cii、及びCiii上で起こる。
(非阻害性ペプチドリガンド)
一実施態様において、ペプチドリガンドは、TfR1に特異的であり、かつトランスフェリンとTfR1との結合を妨害/阻害しない様式でTfR1に結合する。
さらなる実施態様において、該ループ配列は、3つ又は7つのアミノ酸を含む。
一実施態様において、該ループ配列は、その第一のものが7つのアミノ酸からなり、かつその第二のものが3つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む。
一実施態様において、ペプチドリガンドは、
Figure 2023549229000003
Figure 2023549229000004
Figure 2023549229000005
(ここで、Abuは、アミノ酪酸を表し、Aibは、アミノイソ酪酸を表し、Azeは、アゼチジンを表し、B-MeIleは、β-メチルイソロイシンを表し、C5gは、シクロペンチルグリシンを表し、Cbaは、β-シクロブチルアラニンを表し、Cbgは、シクロブチルグリシンを表し、Chgは、シクロヘキシルグリシンを表し、Cpgは、シクロプロピルグリシンを表し、EPAは、2-アミノ-3-エチル-ペンタン酸を表し、HyPは、trans-4-ヒドロキシ-L-プロリンを表し、[K(N3)]は、6-アジドリジンを表し、1Nalは、1-ナフチルアラニンを表し、2Nalは、2-ナフチルアラニンを表し、4Palは、4-ピリジルアラニンを表し、tBuAlaは、t-ブチル-アラニンを表し、tBuGlyは、t-ブチル-グリシンを表し、3tBuTyrは、3-t-ブチル-チロシンを表し、かつCi、Cii、及びCiiiは、それぞれ、第一、第二、及び第三のシステイン残基を表す)
:のアミノ酸配列、又はその医薬として許容し得る塩を含む。
さらなる実施態様において、ペプチドリガンドは、
Figure 2023549229000006
 (ここで、Ci、Cii、及びCiiiは、それぞれ、第一、第二、及び第三のシステイン残基を表す)
:のアミノ酸配列、又はその医薬として許容し得る塩を含む。
さらなる実施態様において、分子スキャフォールドは、1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリス(2-ブロモエタノン)(TATB)であり、ペプチドリガンドはN-及び/又はC-末端付加を含み、かつ
A-(配列番号4)-A(本明細書において、BCY13983と称される);
A-(配列番号4)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY14474と称される);
A-(配列番号5)-A(本明細書において、BCY13986と称される);
A-(配列番号5)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY14475と称される);
A-(配列番号6)-A(本明細書において、BCY15466と称される);
Ac-(配列番号6)(本明細書において、BCY15889と称される);
A-(配列番号7)-A(本明細書において、BCY15467と称される);
Ac-(配列番号7)(本明細書において、BCY15890と称される);
A-(配列番号8)-A(本明細書において、BCY13989と称される);
A-(配列番号8)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY14476と称される);
A-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY15468と称される);
A-(配列番号9)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15768と称される);
(配列番号9)-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15934と称される);
Ac-(配列番号9)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15937と称される);
Ac-(配列番号9)-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15938と称される);
[Fl]G[Sar5]-A-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY15940と称される);
N[1Nal]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18030と称される);
Ac-(配列番号9)-E[Pip]W(本明細書において、BCY18039と称される);
Ac-(配列番号9)-EPW(本明細書において、BCY17994と称される);
NWN-(配列番号9)(本明細書において、BCY18029と称される);
NWN-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17109と称される);
Ac-(配列番号9)-E[Aze]W(本明細書において、BCY18037と称される);
Ac-NWN-(配列番号9)(本明細書において、BCY17992と称される);
Ac-(配列番号9)-E[dP]W(本明細書において、BCY18038と称される);
Ac-N[1Nal]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18034と称される);
N[dW]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18031と称される);
Ac-N[dW]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18035と称される);
HWM-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17110と称される);
A-(配列番号9)-PHP(本明細書において、BCY17115と称される);
A-(配列番号9)-EPW(本明細書において、BCY17114と称される);
NEV-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17112と称される);
A-(配列番号9)-PIVH(本明細書において、BCY17120と称される);
Ac-(配列番号9)(本明細書において、BCY15891と称される);
HTS-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17111と称される);
Ac-N[NMeTrp]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18036と称される);
N[NMeTrp]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18032と称される);
Ac-A-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY15939と称される);
A-(配列番号9)-EHQE(本明細書において、BCY17119と称される);
ESF-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17113と称される);
NWN-(配列番号9)-[K(N3)](本明細書において、BCY17870と称される);
Ac-NWN-(配列番号9)-[K(N3)](本明細書において、BCY17871と称される);
[AzPro]-NWN-(配列番号9)(本明細書において、BCY17872と称される);
Ac-(配列番号9)-EPW-[K(N3)](本明細書において、BCY17873と称される);
[AzPro]-(配列番号9)-EPW(本明細書において、BCY17874と称される);
Ac-(配列番号9)-[K(N3)](本明細書において、BCY17868と称される);
[AzPro]-(配列番号9)(本明細書において、BCY17869と称される);
Ac-N[dY]N-(配列番号9)-[K(N3)](本明細書において、BCY17882と称される);
Ac-(配列番号9)-E-[dP]-W-[K(N3)](本明細書において、BCY17890と称される);
Ac-(配列番号9)-E-[Aze]-W-[K(N3)](本明細書において、BCY17892と称される);
Ac-(配列番号9)-E-[Pip]-W-[K(N3)](本明細書において、BCY17894と称される);
Ac-(配列番号9)-[K(N3)(PYA-マレイミド](本明細書において、BCY17906と称される);
Ac-(配列番号9)-EPW-[Peg10]-[K(N3)](本明細書において、BCY19405と称される);
Ac-(配列番号9)-EPW-[Peg24]-[K(N3)](本明細書において、BCY19406と称される);
Ac-(配列番号9)-EPWGGSGGS-[K(N3)](本明細書において、BCY19407と称される);
A-(配列番号10)-A(本明細書において、BCY15469と称される);
Ac-(配列番号10)(本明細書において、BCY15892と称される);
A-(配列番号11)-A(本明細書において、BCY15470と称される);
Ac-(配列番号11)(本明細書において、BCY15893と称される);
A-(配列番号12)-A(本明細書において、BCY15471と称される);
Ac-(配列番号12)(本明細書において、BCY15894と称される);
Ac-(配列番号13)(本明細書において、BCY17991と称される);
Ac-(配列番号13)-EPW(本明細書において、BCY17995と称される);
Ac-NWN-(配列番号13)(本明細書において、BCY17993と称される);
NWN-(配列番号13)(本明細書において、BCY18033と称される);
A-(配列番号13)-A(本明細書において、BCY16754と称される);
Ac-(配列番号13)-[K(N3)](本明細書において、BCY17896と称される);
Ac-NWN-(配列番号13)-[K(N3)](本明細書において、BCY17899と称される);
Ac-(配列番号13)-EPW-[K(N3)](本明細書において、BCY17901と称される);
Ac-(配列番号14)(本明細書において、BCY17990と称される);
Ac-(配列番号14)-[K(N3)](本明細書において、BCY17875と称される);
[AzPro]-(配列番号14)(本明細書において、BCY17876と称される);
Ac-(配列番号15)(本明細書において、BCY17989と称される);
A-(配列番号15)-A(本明細書において、BCY16047と称される);
Ac-(配列番号15)-[K(N3)](本明細書において、BCY17877と称される);
[AzPro]-(配列番号15)(本明細書において、BCY17878と称される);
A-(配列番号16)-A(本明細書において、BCY16962と称される);
TYMN-(配列番号17)-A(本明細書において、BCY17117と称される);
A-(配列番号17)-A(本明細書において、BCY16048と称される);
A-(配列番号18)-A(本明細書において、BCY16963と称される);
Ac-(配列番号19)(本明細書において、BCY17987と称される);
A-(配列番号20)-A(本明細書において、BCY16753と称される);
A-(配列番号21)-A(本明細書において、BCY16046と称される);
A-(配列番号22)-A(本明細書において、BCY16964と称される);
A-(配列番号23)-A(本明細書において、BCY16965と称される);
Ac-(配列番号24)(本明細書において、BCY17986と称される);
A-(配列番号25)-A(本明細書において、BCY16550と称される);
A-(配列番号26)-A(本明細書において、BCY16966と称される);
A-(配列番号27)-A(本明細書において、BCY16051と称される);
IDSN-(配列番号28)-A(本明細書において、BCY17118と称される);
WGKS-(配列番号29)-A(本明細書において、BCY17116と称される);
A-(配列番号30)-A(本明細書において、BCY16053と称される);
A-(配列番号31)-A(本明細書において、BCY16557と称される);
A-(配列番号32)-A(本明細書において、BCY16035と称される);
A-(配列番号33)-A(本明細書において、BCY16043と称される);
A-(配列番号34)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15769と称される);
A-(配列番号35)-A(本明細書において、BCY15648と称される);
A-(配列番号36)-A(本明細書において、BCY16031と称される);
A-(配列番号37)-A(本明細書において、BCY16079と称される);
A-(配列番号38)-A(本明細書において、BCY16036と称される);
A-(配列番号39)-A(本明細書において、BCY16029と称される);
A-(配列番号40)-A(本明細書において、BCY16089と称される);
A-(配列番号41)-A(本明細書において、BCY16088と称される);
A-(配列番号42)-A(本明細書において、BCY16052と称される);
A-(配列番号43)-A(本明細書において、BCY16033と称される);
A-(配列番号44)-A(本明細書において、BCY16039と称される);
Ac-(配列番号44)(本明細書において、BCY17988と称される);
Ac-(配列番号44)-[K(N3)](本明細書において、BCY17879と称される);
[AzPro]-(配列番号44)(本明細書において、BCY17880と称される);
A-(配列番号45)-A(本明細書において、BCY16038と称される);
A-(配列番号46)-A(本明細書において、BCY16050と称される);
A-(配列番号47)-A(本明細書において、BCY16034と称される);
A-(配列番号48)-A(本明細書において、BCY16032と称される);
A-(配列番号49)-A(本明細書において、BCY16049と称される);
A-(配列番号50)-A(本明細書において、BCY16558と称される);
A-(配列番号51)-A(本明細書において、BCY16041と称される);
A-(配列番号52)-A(本明細書において、BCY16042と称される);
A-(配列番号53)-A(本明細書において、BCY16045と称される);
A-(配列番号54)-A(本明細書において、BCY16037と称される);
A-(配列番号55)-A(本明細書において、BCY16044と称される);
A-(配列番号56)-A(本明細書において、BCY16040と称される);
A-(配列番号57)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15771と称される);
A-(配列番号58)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15772と称される);
A-(配列番号59)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15773と称される);
A-(配列番号60)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15774と称される);
A-(配列番号61)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15775と称される);
A-(配列番号62)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15776と称される);
A-(配列番号63)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15777と称される);
A-(配列番号64)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15770と称される);
Ac-(配列番号65)(本明細書において、BCY17903と称される);
Ac-(配列番号66)(本明細書において、BCY17904と称される);及び
Ac-(配列番号67)(本明細書において、BCY17905と称される);
(ここで、AzProは、アジドプロピルを表し、Azeは、アゼチジンを表し、1Nalは、1-ナフチルアラニンを表し、NMeTrpは、N-メチル-トリプトファンを表し、[K(N3)]は、6-アジドリジンを表し、Pegは、ポリエチレングリコールを表し、Pipは、ピペコリン酸を表し、Sarは、サルコシンを表し、Flは、フルオレセインを表し、かつ[K(N3)(PYA-マレイミド)]は、以下の構造:
Figure 2023549229000007
 を有する修飾リジンを表す)
:から選択される。
またさらなる実施態様において、分子スキャフォールドはTATBであり、ペプチドリガンドはN-及び/又はC-末端付加を含み、かつ
A-(配列番号4)-A(本明細書において、BCY13983と称される);
A-(配列番号4)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY14474と称される);
A-(配列番号5)-A(本明細書において、BCY13986と称される);
A-(配列番号5)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY14475と称される);
A-(配列番号6)-A(本明細書において、BCY15466と称される);
A-(配列番号7)-A(本明細書において、BCY15467と称される);
A-(配列番号8)-A(本明細書において、BCY13989と称される);
A-(配列番号8)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY14476と称される);
A-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY15468と称される);
A-(配列番号9)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15768と称される);
(配列番号9)-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15934と称される);
Ac-(配列番号9)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15937と称される);
Ac-(配列番号9)-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15938と称される);
[Fl]G[Sar5]-A-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY15940と称される);
A-(配列番号10)-A(本明細書において、BCY15469と称される);
A-(配列番号11)-A(本明細書において、BCY15470と称される);及び
A-(配列番号12)-A(本明細書において、BCY15471と称される);
(ここで、Sarは、サルコシンを表し、Flは、フルオレセインを表す)
:から選択される。
代わりの実施態様において、分子スキャフォールドは、1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)であり、ペプチドリガンドはN-及び/又はC-末端付加を含み、かつ
Ac-(配列番号13)(本明細書において、BCY20546と称される)
:である。
この説明のために、非阻害性二環式ペプチドは、TATA又はTATBとともに環化され、三置換構造を生じると仮定される。しかしながら、本明細書に提示される本発明の説明から明らかであるように、環化は、少なくとも2つのポリペプチドループが形成されるように、ポリペプチドの反応基との共有結合を形成する任意の好適な分子スキャフォールドで実施されることができる。環化は、Ci、Cii、及びCiii上で起こる。
さらなる実施態様において、医薬として許容し得る塩は、遊離酸又はナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくはアンモニウム塩から選択される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的及び科学的用語は全て、当該分野、例えば、ペプチド化学、細胞培養、及びファージディスプレイ、核酸化学、並びに生化学の分野の専門家によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。標準的な技法が、分子生物学、遺伝学、及び生化学の方法に使用される(引用により本明細書中に組み込まれる、Sambrookらの文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第3版、2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubelらの文献、分子生物学のショートプロトコル(Short Protocols in Molecular Biology)(1999) 第4版、John Wiley & Sons社を参照)。
(多量体二環式ペプチドリガンド)
本発明のさらなる態様によれば、少なくとも2つの二環式ペプチドリガンドを含む多量体結合複合体であって、該ペプチドリガンドが同じであっても異なっていてもよく、これらの各々が少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つの反応基を含むポリペプチド及び該ポリペプチドの反応基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、その結果、少なくとも2つのポリペプチドループが該分子スキャフォールド上に形成される、トランスフェリン受容体1(TfR1)に特異的なペプチドリガンドを含む、多量体結合複合体が提供される。
したがって、本発明のこの態様において、多量体結合複合体は、本明細書で定義される単量体二環式ペプチドリガンドのいずれかの少なくとも2つ(すなわち、2、3、又は4つ)を含む。
本発明のこの態様は、幅広い強度及び効力でTfR1に結合し、かつそれを活性化する該二環式ペプチド内の異なる結合部位を用いて、様々な化学的リンカー並びに様々な長さ及び剛性のヒンジを有する一連の多量体化二環式ペプチドを記載している。
本発明のこの態様は、単一の二環式ペプチドを含有する対応する単量体結合複合体と比較した該多量体結合複合体の結果として生じる特性によって相乗的な利益を提供する多重配置(多量体)二環式ペプチドを提示していることが当業者によって理解されるであろう。例えば、本発明のこの態様の多量体結合複合体は、通常、その単量体対応物よりも大きいレベルの結合強度又は結合力(本明細書ではKd値によって測定される)を有する。さらに、本発明の多量体結合複合体は、腎臓によって除去されるほど十分に小さいように設計される。
理論によって束縛されるものではないが、多量体化二環式ペプチドは、複数の同じ受容体をホモ架橋することにより、受容体を活性化することができると考えられる。したがって、一実施態様において、該二環式ペプチドリガンドは、TfR1内の同じ標的に特異的である。さらなる実施態様において、多量体結合複合体は、少なくとも2つの同一の二環式ペプチドリガンドを含む。「同一の」により、同じアミノ酸配列を有する二環式ペプチドを意味し、最も厳密には、同じアミノ酸配列は、該二環式ペプチドの結合部分を指す(例えば、該配列は、結合位置が様々に異なり得る)。この実施態様において、多量体結合複合体内の二環式ペプチドの各々は、TfR1の同じ標的上の全く同じエピトープに結合し－それゆえ、結果として生じる標的結合複合体は、ホモ二量体(多量体複合体が2つの同一の二環式ペプチドを含む場合)、ホモ三量体(多量体複合体が3つの同一の二環式ペプチドを含む場合)、又はホモ四量体(多量体複合体が4つの同一の二環式ペプチドを含む場合)などを生成する。
代わりの実施態様において、多量体結合複合体は、少なくとも2つの異なる二環式ペプチドリガンドを含む。「異なる」により、異なるアミノ酸配列を有する二環式ペプチドを意味する。この実施態様において、多量体結合複合体内の異なる二環式ペプチドリガンドは、TfR1上の異なるエピトープに結合し－それゆえ、結果として生じる標的結合複合体は、バイパラトピックのもの(多量体複合体が2つの異なる二環式ペプチドを含む場合)、トリパラトピックのもの(多量体複合体が3つの異なる二環式ペプチドを含む場合)、又はテトラパラトピックのもの(多量体複合体が4つの異なる二環式ペプチドを含む場合)などを生成する。
理論によって束縛されるものではないが、多量体化二環式ペプチドは、異なる標的、例えば、TfR1上の異なる標的部位をヘテロ架橋することにより、受容体を活性化することができると考えられる。したがって、一実施態様において、該二環式ペプチドリガンドは、TfR1上の異なる標的に特異的である。この実施態様において、多量体結合複合体は、少なくとも2つの異なる二環式ペプチドリガンド(すなわち、異なるアミノ酸配列を有する二環式ペプチドリガンド)を含むことが理解されるであろう。この実施態様において、多量体結合複合体内の二環式ペプチドの各々は、TfR1上の異なるエピトープに結合し－それゆえ、結果として生じる標的結合複合体は、二重特異性多量体結合複合体(多量体複合体が2つの異なる二環式ペプチドを含む場合)、三重特異性多量体結合複合体(多量体複合体が3つの異なる二環式ペプチドを含む場合)、又は四重特異性多量体結合複合体(多量体複合体が4つの異なる二環式ペプチドを含む場合)などを生成する。
本発明の多量体結合複合体は、TfR1上の様々な異なる標的に結合することができるように設計することができることが理解されるであろう。
本発明の多量体結合複合体内の二環式ペプチドは、いくつかの異なる選択肢によって会合させることができる。例えば、その各々が二環式ペプチドを含有する該ヒンジ又は分岐点から放射状に伸びているスペーサー又はアーム要素を有する中心のヒンジ又は分岐部分が存在していてもよい。或いは、円形の支持部材が内部に又は外部に突き出ているいくつかのペプチドを保持し得ることを想定することができる。
一実施態様において、各々の二環式ペプチドリガンドは、スペーサー基によって中心のヒンジ部分に接続されている。
スペーサー基は線状であり、かつ単一の二環式ペプチドを中心のヒンジ部分と接続させることができることが理解されるであろう。したがって、一実施態様において、多量体結合複合体は、式(I)の化合物:
Figure 2023549229000008
 (式中、CHMは、中心のヒンジ部分を表し;
二環は、本明細書で定義される二環式ペプチドリガンドを表し;かつ
mは、2～10から選択される整数を表す)
を含む。
一実施態様において、mは、2、3、又は4から選択される整数を表す。
さらなる実施態様において、mは2を表す。
mが2を表す場合、中心のヒンジ部分は2つの結合点を必要とすることが理解されるであろう。したがって、一実施態様において、mは2を表し、CHMは、式(A)のモチーフである:
Figure 2023549229000009
 。
(二量体)
一実施態様において、2つの同一の二環式ペプチドを含む多量体結合複合体は、以下の表Aに記載されている二量体結合複合体を含む:
表A:本発明の例示的な二量体結合複合体
Figure 2023549229000010
(付番)
本発明のペプチド内のアミノ酸残基位置に言及する場合、システイン残基(Ci、Cii、及びCiii)は不変であるので、これらは付番から省略され、それゆえ、本発明のペプチド内のアミノ酸残基の付番は、以下のように言及される:
-Ci-A1-L2-Cii-N3-D4-W5-T6-L7-P8-W9-H10-H11-Ciii- (配列番号1)。
(分子フォーマット)
二環コア配列へのN-又はC-末端伸長は、ハイフンによって隔てられた、配列の左側又は右側に付加される。例えば、N-末端ビオチン-G-Sar5テールは:
[Biot]-G-[Sar5]-A-(配列番号X)
(逆向きのペプチド配列)
Nairらの文献(2003) J Immunol 170(3), 1362-1373における開示を考慮して、本明細書に開示されるペプチド配列は、そのレトロ-インベルソ(retro-inverso)形態でも有用性を見出すことが想定される。例えば、配列が逆転し(すなわち、N-末端がC-末端になり、C-末端がN-末端になる)、その立体化学も同様に逆転する(すなわち、D-アミノ酸がL-アミノ酸になり、L-アミノ酸がD-アミノ酸になる)。
(ペプチドリガンドの定義)
本明細書において言及されるペプチドリガンドは、分子スキャフォールドに共有結合したペプチド、ペプチジック、又はペプチドミメティックを指す。典型的には、そのようなペプチド、ペプチジック、又はペプチドミメティックは、天然又は非天然アミノ酸を有するペプチドと、スキャフォールドとの共有結合を形成することができる2以上の反応基(すなわち、システイン残基)と、ペプチド、ペプチジック、又はペプチドミメティックがスキャフォールドに結合するときにループを形成するのでループ配列と呼ばれる、該反応基間に内在する配列とを含む。この場合、ペプチド、ペプチジック、又はペプチドミメティックは、少なくとも3つのシステイン残基(本明細書において、Ci、Cii、及びCiiiと呼ばれる)を含み、かつスキャフォールド上に少なくとも2つのループを形成する。
(ペプチドリガンドの利点)
本発明の特定の二環式ペプチドは、それを注射、吸入、経鼻、眼球、経口、又は局所投与のための好適な薬物様分子とみなすことができるいくつかの有利な特性を有する。そのような有利な特性としては、以下のもの挙げられる:
－種交差反応性。これは、前臨床的な薬力学及び薬物動態評価の典型的な必要条件である;
－プロテアーゼ安定性。二環式ペプチドリガンドは、ほとんどの状況で、血漿プロテアーゼ、上皮(「膜固定型」)プロテアーゼ、胃腸プロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼなどに対する安定性を示すべきである。プロテアーゼ安定性は、二環式ペプチドリード候補を動物モデルで開発するだけでなく、自信を持ってヒトに投与することもできるように、異なる種の間で維持されるべきである;
－望ましい溶解度プロファイル。これは、製剤化及び吸収目的で重要である、荷電残基及び親水性残基と疎水性残基の比率並びに分子内/分子間H-結合の関数である;及び
－循環中での最適な血漿半減期。臨床的適応及び治療レジメンに応じて、慢性疾患状態又は急性疾患状態のいずれかの管理のための短期又は長期のインビボ曝露時間を有する二環式ペプチドを開発する必要があり得る。最適な曝露時間は、薬剤の持続的曝露に起因する毒性学的効果を最小化するための短い曝露時間の要求と比べた(最大の治療効率のための)持続的曝露の要求によって決定される。
(医薬として許容し得る塩)
塩形態は本発明の範囲内であり、ペプチドリガンドへの言及が該リガンドの塩形態を含むことが理解されるであろう。
本発明の塩は、従来の化学的方法、例えば、医薬塩:特性、選択、及び使用(Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use)、P. Heinrich Stahl(編者)、Camille G. Wermuth(編者)、ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388頁、August 2002に記載されている方法によって、塩基性又は酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。通常、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸又は塩基形態を、適切な塩基又は酸と、水中もしくは有機溶媒中で、又はこれら2つの混合物中で反応させることにより調製することができる。
酸付加塩(モノ塩又はジ塩)は、無機と有機の両方の多種多様な酸で形成することができる。酸付加塩の例としては、酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸(例えば、L-アスコルビン酸)、L-アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、4-アセトアミド安息香酸、ブタン酸、(+)カンファー酸、カンファースルホン酸、(+)-(1S)-カンファー-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1，2-ジスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、粘液酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、D-グルコン酸、グルクロン酸(例えば、D-グルクロン酸など)、グルタミン酸(例えば、L-グルタミン酸など)、α-オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸(例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸)、イセチオン酸、乳酸(例えば、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、(-)-L-リンゴ酸、マロン酸、(±)-DL-マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、L-ピログルタミン酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、(+)-L-酒石酸、チオシアン酸、p-トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸、及び吉草酸、並びにアシル化アミノ酸及び陽イオン交換樹脂からなる群から選択される酸で形成されるモノ塩又はジ塩が挙げられる。
塩の1つの特定の群は、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸(メシル酸)、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸、及びラクトビオン酸から形成される塩からなる。1つの特定の塩は、塩酸塩である。別の特定の塩は、酢酸塩である。
化合物がアニオン性であるか、又はアニオン性であり得る官能基を有する(例えば、-COOHが-COO-であり得る)場合、塩を有機又は無機塩基で形成させ、好適なカチオンを生成させることができる。好適な無機カチオンの例としては、Li+、Na+、及びK+などのアルカリ金属イオン、Ca2+及びMg2+などのアルカリ土類金属カチオン、及びAl3+又はZn+などの他のカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。適切な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン(すなわち、NH4 +)及び置換アンモニウムイオン(例えば、NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例としては、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミン、並びにリジン及びアルギニンなどのアミノ酸:に由来するものが挙げられる。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、N(CH3)4 +である。
本発明のペプチドがアミン機能を含有する場合、これらは、例えば、当業者に周知の方法によるアルキル化剤との反応によって、第四級アンモニウム塩を形成し得る。そのような第四級アンモニウム化合物は、本発明のペプチドの範囲内である。
(修飾誘導体)
本明細書で定義されるペプチドリガンドの修飾誘導体は、本発明の範囲内であることが理解されるであろう。そのような好適な修飾誘導体の例としては、N-末端及び/又はC-末端修飾; 1以上のアミノ酸残基の1以上の非天然アミノ酸残基による置換(例えば、1以上の極性アミノ酸残基の1以上の等配電子又は等電子アミノ酸による置換; 1以上の非極性アミノ酸残基の他の非天然等配電子又は等電子アミノ酸による置換);スペーサー基の付加; 1以上の酸化感受性アミノ酸残基の1以上の酸化抵抗性アミノ酸残基による置換; 1以上のアミノ酸残基の1以上の置換アミノ酸、例えば、アラニンによる置換、1以上のL-アミノ酸残基の1以上のD-アミノ酸残基による置換;二環式ペプチドリガンド内の1以上のアミド結合のN-アルキル化; 1以上のペプチド結合の代用結合による置換;ペプチド骨格長の修飾; 1以上のアミノ酸残基のα-炭素上の水素の別の化学基による置換、システイン、リジン、グルタミン酸/アスパラギン酸、及びチロシンなどのアミノ酸を官能基化するような、該アミノ酸の好適なアミン、チオール、カルボン酸、及びフェノール反応性試薬による修飾、並びに官能基化に好適である直交反応性を導入するアミノ酸、例えば、それぞれ、アルキン又はアジドを有する部分による官能基化を可能にするアジド又はアルキン基を有するアミノ酸の導入又は置換:から選択される1以上の修飾が挙げられる。
一実施態様において、修飾誘導体は、N-末端及び/又はC-末端修飾を含む。さらなる実施態様において、ここで、修飾誘導体は、好適なアミノ反応化学を用いるN-末端修飾、及び/又は好適なカルボキシ反応化学を用いるC-末端修飾を含む。さらなる実施態様において、該N-末端又はC-末端修飾は、限定されないが、細胞毒性剤、放射性キレート剤、又は発色団を含む、エフェクター基の付加を含む。
さらなる実施態様において、修飾誘導体は、N-末端修飾を含む。さらなる実施態様において、N-末端修飾は、N-末端アセチル基を含む。この実施態様において、N-末端残基は、ペプチド合成の間に無水酢酸又は他の適切な試薬でキャッピングされ、N-末端がアセチル化された分子をもたらす。この実施態様は、アミノペプチダーゼの潜在的な認識点を除去するという利点を提供し、二環式ペプチドの分解の可能性を回避する。
代わりの実施態様において、N-末端修飾は、エフェクター基のコンジュゲーション及びその標的に対する二環式ペプチドの効力の保持を促進する分子スペーサー基の付加を含む。
さらなる実施態様において、修飾誘導体は、C-末端修飾を含む。さらなる実施態様において、C-末端修飾は、アミド基を含む。この実施態様において、C-末端残基は、ペプチド合成の間にアミドとして合成され、C-末端がアミド化された分子をもたらす。この実施態様は、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認識点を除去するという利点を提供し、二環式ペプチドのタンパク質分解の可能性を低下させる。
一実施態様において、修飾誘導体は、1以上のアミノ酸残基の1以上の非天然アミノ酸残基による置換を含む。この実施態様においては、分解性プロテアーゼによって認識されることも、標的効力に何らかの有害作用を有することもない等配電子/等電子側鎖を有する非天然アミノ酸を選択してもよい。
或いは、近くのペプチド結合のタンパク質分解性加水分解が立体構造的に及び立体的に妨害されるように、拘束されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸を使用してもよい。特に、これらは、プロリン類似体、嵩高い側鎖、Cα-二置換誘導体(例えば、アミノイソ酪酸、Aib)、及びアミノ-シクロプロピルカルボン酸の単純な誘導体であるシクロアミノ酸に関する。
一実施態様において、修飾誘導体は、スペーサー基の付加を含む。さらなる実施態様において、修飾誘導体は、N-末端システイン(Ci)及び/又はC-末端システイン(Ciii)へのスペーサー基の付加を含む。
一実施態様において、修飾誘導体は、1以上の酸化感受性アミノ酸残基の1以上の酸化抵抗性アミノ酸残基による置換を含む。さらなる実施態様において、修飾誘導体は、トリプトファン残基のナフチルアラニン又はアラニン残基による置換を含む。この実施態様は、得られる二環式ペプチドリガンドに医薬安定性プロファイルを改善するという利点を提供する。
一実施態様において、修飾誘導体は、1以上の荷電アミノ酸残基の1以上の疎水性アミノ酸残基による置換を含む。代わりの実施態様において、修飾誘導体は、1以上の疎水性アミノ酸残基の1以上の荷電アミノ酸残基による置換を含む。荷電アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基の正しいバランスは、二環式ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度、したがって、血漿中の利用可能な遊離画分の濃度に影響を及ぼし、一方、荷電アミノ酸残基(特に、アルギニン)は、ペプチドと細胞表面のリン脂質膜との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。この2つの組合せは、ペプチド薬の半減期、分布容積、及び曝露に影響を及ぼす可能性があり、臨床的なエンドポイントに応じて調整することができる。さらに、荷電アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基の正しい組合せ及び数は、注射部位(ペプチド薬が皮下投与された場合)での刺激を軽減することができる。
一実施態様において、修飾誘導体は、1以上のL-アミノ酸残基の1以上のD-アミノ酸残基による置換を含む。この実施態様は、立体障害により及びβ-ターン立体構造を安定化させるD-アミノ酸の傾向により、タンパク質分解の安定性を高めると考えられる(Tugyiらの文献(2005) PNAS, 102(2), 413-418)。
一実施態様において、修飾誘導体は、任意のアミノ酸残基の除去及びD-アラニンなどのアラニンによる置換を含む。この実施態様は、重要な結合残基を同定し、潜在的なタンパク質分解攻撃部位を除去するという利点を有する。
上述の修飾の各々は、ペプチドの効力又は安定性を意図的に向上させる役割を果たすことに留意すべきである。修飾に基づくさらなる効力向上は、以下の機序によって達成することができる:
－より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を利用し、より低い解離速度をもたらす疎水性部位を組み込むこと;
－長距離イオン相互作用を利用し、より速い会合速度をもたらし、より高い親和性をもたらす荷電基を組み込むこと(例えば、Schreiberらの文献、タンパク質の急速静電アシスト会合(Rapid, electrostatically assisted association of proteins)(1996)、Nature Struct. Biol. 3, 427-31を参照);並びに
－例えば、エントロピーの損失が標的結合時に最小になるように、アミノ酸の側鎖を正しく拘束すること、エントロピーの損失が標的結合時に最小になるように、骨格のねじれ角度を拘束すること、及び同一の理由で分子内にさらなる環化を導入することにより、さらなる拘束性をペプチドに組み込むこと
(総説については、Gentilucciらの文献、Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203、及びNestorらの文献、Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418を参照)。
(同位体バリエーション)
本発明は、1以上の原子が、同じ原子番号を有するが、天然に通常見られる原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子によって置き換えられている、本発明の医薬として許容し得る全ての(放射性)同位体標識ペプチドリガンド、並びに関連する(放射性)同位体を保持することができる金属キレート基が取り付けられている本発明のペプチドリガンド(「エフェクター」と呼ばれる)、並びに特定の官能基が関連する(放射性)同位体又は同位体標識された官能基で共有結合的に置き換えられている本発明のペプチドリガンドを含む。
本発明のペプチドリガンドに含めるために好適な同位体の例は、水素の同位体、例えば、2H(D)及び3H(T)、炭素の同位体、例えば、11C、13C及び14C、塩素の同位体、例えば、36Cl、フッ素の同位体、例えば、18F、ヨウ素の同位体、例えば、123I、125I、及び131I、窒素の同位体、例えば、13N及び15N、酸素の同位体、例えば、15O、17O、及び18O、リンの同位体、例えば、32P、硫黄の同位体、例えば、S、銅の同位体、例えば、64Cu、ガリウムの同位体、例えば、67Ga又は68Ga、イットリウムの同位体、例えば、90Y、並びにルテチウムの同位体、例えば、177Lu、並びにビスマスの同位体、例えば、213Biを含む。
本発明の特定の同位体標識ペプチドリガンド、例えば、放射性同位体を組み込んでいるものは、薬物及び/又は基質の組織分布研究において、並びに罹患組織上の標的の存在及び/又は不在を臨床的に評価するために有用である。本発明のペプチドリガンドは、標識化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素、又は受容体との間の複合体の形成を検出又は同定するために使用することができるという点で、価値ある診断特性をさらに有することができる。検出又は同定方法は、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質(例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、イクオリン、及びルシフェラーゼ)などの標識剤で標識されている化合物を使用することができる。放射性同位体のトリチウム、すなわち、3H(T)及び炭素-14、すなわち、14Cは、その組込みの容易さ及び検出の手段が用意されていることを考慮して、この目的のために特に有用である。
重水素、すなわち、2H(D)などのより重い同位体による置換は、より大きい代謝安定性、例えば、増加したインビボ半減期又は低下した必要投薬量の結果として得られる、特定の治療的利点をもたらす場合があり、それゆえ、いくつかの状況では、好ましい場合がある。
11C、18F、15O、及び13Nなどの陽電子放出同位体による置換は、標的占有率を調べるための陽電子放出トポグラフィー(PET)試験において有用であり得る。
本発明のペプチドリガンドの同位体標識化合物は、通常、当業者に公知の従来の技法によるか、又は以前に利用されていた非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用する添付の実施例に記載されているものと類似のプロセスによって調製することができる。
(分子スキャフォールド)
一実施態様において、分子スキャフォールドは、非芳香族分子スキャフォールドを含む。「非芳香族分子スキャフォールド」への本明細書における言及は、芳香族(すなわち、不飽和)炭素環式又はヘテロ環式環系を含有しない本明細書で定義される任意の分子スキャフォールドを指す。
非芳香族分子スキャフォールドの好適な例は、Heinisらの文献(2014) Angewandte Chemie, International Edition 53(6) 1602-1606に記載されている。
前述の文書に記載されているように、分子スキャフォールドは、低有機分子などの低分子であってもよい。
一実施態様において、分子スキャフォールドは、高分子であってもよい。一実施態様において、分子スキャフォールドは、アミノ酸、ヌクレオチド、又は炭水化物から構成される高分子である。
一実施態様において、分子スキャフォールドは、ポリペプチドの官能基と反応して、共有結合を形成することができる反応基を含む。
分子スキャフォールドは、ペプチドとの連結を形成する化学基、例えば、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、スクシンイミド、マレイミド、ハロゲン化アルキル、及びハロゲン化アシルを含み得る。
一実施態様において、分子スキャフォールドは、1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(トリアクリロイルヘキサヒドロ-s-トリアジン(TATA)としても知られる):
Figure 2023549229000011
 である。
したがって、Ci、Cii、及びCiiiシステイン残基上での本発明の二環式ペプチドとの環化の後、分子スキャフォールドは、以下の構造:
Figure 2023549229000012
 (ここで、*は、3つのシステイン残基の結合点を表す)
を有するTATAの三置換1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパン-1-オン誘導体を形成する。
代わりの実施態様において、分子スキャフォールドは、1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリス(2-ブロモエタノン)(TATB)である。
したがって、Ci、Cii、及びCiiiシステイン残基上での本発明の二環式ペプチドとの環化の後、分子スキャフォールドは、以下の構造:
Figure 2023549229000013
 を有するTATBの三置換誘導体を形成する。
(合成)
本発明のペプチドは、標準的な技法によって合成的に製造した後、インビトロで分子スキャフォールドと反応させることができる。これを実施する場合、標準的な化学を使用することができる。これにより、さらなる下流での実験又は検証のための可溶性材料の迅速な大規模調製が可能になる。そのような方法は、Timmermanらの文献(上記)に開示されているもののような従来の化学を用いて達成され得る。
したがって、本発明はまた、本明細書に記載されているように選択されるポリペプチド又はコンジュゲートの製造に関するものであり、ここで、該製造は、以下に説明されるような任意のさらなる工程を含む。一実施態様において、これらの工程は、化学合成によって作られた最終生成物のポリペプチド/コンジュゲートに対して実施される。
任意に、対象となるポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲート又は複合体を製造するときに置換されてもよい。
ペプチドを伸長させて、例えば、別のループを組み込み、それゆえ、複数の特異性を導入することもできる。
ペプチドを伸長させるために、それは、単純に、標準的な固相又は液相化学を用いて、直交保護されたリジン(及び類似体)を用いて、そのN-末端もしくはC-末端で又はループ内で化学的に伸長されてもよい。標準的な(バイオ)コンジュゲーション技法を用いて、活性化された又は活性化可能なN-又はC-末端を導入してもよい。或いは、付加は、例えば、(Dawsonらの文献、1994、ネイティブケミカルライゲーションによるタンパク質の合成(Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation). Science 266:776-779)に記載されている断片縮合もしくはネイティブケミカルライゲーションによるか、又は例えば(Changらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20; 91(26):12544-8もしくはHikariらの文献、Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters、第18巻、第22号、2008年11月15日、6000～6003頁)に記載されているサブチリガーゼを用いて、酵素により行われてもよい。
或いは、ペプチドは、ジスルフィド結合を介するさらなるコンジュゲーションによって伸長又は修飾されてもよい。これは、第一及び第二のペプチドが細胞の還元環境内で互いに解離することを可能にするという追加の利点を有する。この場合、分子スキャフォールド(例えば、TATA又はTATB)は、3つのシステイン基と反応するように第一のペプチドの化学合成の間に付加されることができ;その後、さらなるシステイン又はチオールが第一のペプチドのN又はC-末端に付加されることができ、その結果、このシステイン又はチオールが第二のペプチドの遊離のシステイン又はチオールとのみ反応して、ジスルフィド結合した二環式ペプチド-ペプチドコンジュゲートを形成した。
さらに、他の官能基又はエフェクター基の付加は、適切な化学を用いて、N-もしくはC-末端で、又は側鎖を介してカップリングさせて、同じ方法で達成されてもよい。一実施態様において、カップリングは、いずれかの実体の活性を遮断しないような方法で実行される。
(医薬組成物)
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義されるペプチドリガンドを1以上の医薬として許容し得る賦形剤との組合せで含む医薬組成物が提供される。
通常、本ペプチドリガンドは、薬理学的に適切な賦形剤又は担体と一緒に精製された形態で利用される。典型的には、これらの賦形剤又は担体は、生理食塩水及び/又は緩衝化媒体を含む、水性もしくはアルコール/水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、並びに乳酸加リンガーが挙げられる。生理的に許容し得る好適なアジュバントは、ポリペプチド複合体を懸濁状態に保つために必要な場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、及びアルギネートなどの増粘剤から選択されてもよい。
静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補充液及び電解質補充液、例えば、リンガーデキストロースに基づくものが挙げられる。また、防腐剤並びに他の添加物、例えば、抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスが存在してもよい(Mackの文献(1982)、レミントンの医薬品化学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第16版)。
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物として、又は他の薬剤と併せて使用されてもよい。これらとしては、抗体、抗体断片、並びに様々な免疫療法薬、例えば、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシン、又はシスプラチン、及び免疫毒素を挙げることができる。別々に又は本発明のペプチドリガンドと併せて投与され得る他の薬剤のさらなる例としては、サイトカイン、リンホカイン、他の造血因子、血栓溶解因子、及び抗血栓因子が挙げられる。医薬組成物は、本発明のタンパク質リガンドと併せた様々な細胞毒性剤もしくは他の薬剤の「カクテル」、又は投与前にプールされているか、プールされていないかを問わず、異なる標的リガンドを用いて選択されたポリペプチドなどの、異なる特異性を有する本発明による選択されたポリペプチドの組合せさえも含むことができる。
本発明による医薬組成物の投与の経路は、当業者に一般的に知られているもののうちのいずれかであってもよい。療法のために、本発明のペプチドリガンドは、標準的な技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、肺経路を介するもの、又は同じく適切に、カテーテルを用いる直接注入によるものを含め、任意の適切な様式によるものであることができる。好ましくは、本発明による医薬組成物は、静脈内投与される。投薬量及び投与の頻度は、患者の年齢、性別、及び状態、他の薬物の同時的な投与、禁忌、並びに臨床医によって考慮される他のパラメーターによって決まる。
本発明のペプチドリガンドは、保存用に凍結乾燥し、使用前に好適な担体中で再構成することができる。この技法は、効果的であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥及び再構成技法を利用することができる。凍結乾燥及び再構成は様々な程度の活性損失をもたらし得ること、及び補償するために、レベルを上方に調整する必要があり得ることが当業者によって理解されるであろう。
本発明のペプチドリガンド又はそのカクテルを含有する組成物は、予防的及び/又は治療的処置のために投与することができる。特定の治療用途において、選択される細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅化、又は何らかの他の測定可能なパラメーターを達成するために十分な量は、「治療有効用量」として定義される。この投薬量を達成するために必要とされる量は、疾患の重症度によって決まるが、概ね、体重1キログラム当たり0.005～5.0mgの選択されたペプチドリガンドの範囲であり、0.05～2.0mg/kg/の用量がより一般的に使用される。予防用途のために、本ペプチドリガンド又はそのカクテルを含有する組成物はまた、同様の又はわずかに少ない投薬量で投与されてもよい。
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物を予防的及び治療的な設定で利用して、哺乳動物における選択標的細胞集団の変化、不活性化、死滅化、又は除去を助けることができる。さらに、本明細書に記載されるペプチドリガンドを体外で又はインビトロで選択的に用いて、細胞の不均質な集合体由来の標的細胞集団を死滅させるか、枯渇させるか、又は他の形で効果的に除去することができる。哺乳動物由来の血液を選択されたペプチドリガンドと体外で組み合わせることができ、それにより、標準的な技法に従って哺乳動物に戻すために、望ましくない細胞を死滅させるか、又は別の形で血液から除去する。
(治療的使用)
本発明の二環式ペプチドは、トランスフェリン受容体1(TfR1)結合剤としての具体的な有用性を有する。本発明のさらなる態様によれば、TfR1によって媒介される治療剤の送達によって疾患又は障害を予防、抑制、又は治療する際に使用するための本明細書で定義されるペプチドリガンド又は医薬組成物が提供される。
トランスフェリンは、鉄(Fe)に結合し、結果として、血液血漿からの鉄(Fe)の輸送を媒介する脊椎動物に見られる糖タンパク質である。これは、肝臓で産生され、2つのFe3+原子の結合部位を含有する。ヒトトランスフェリンは、TF遺伝子によってコードされ、76kDaの糖タンパク質として産生される。
トランスフェリン糖タンパク質は、強固にではあるが、可逆的に、鉄に結合する。トランスフェリンに結合した鉄は、全身の鉄の0.1％未満(4mg)であるが、それは、最も高いターンオーバー(25mg/24時間)を有する、最も生命維持に重要な鉄プールを形成する。トランスフェリンは、約80kDaの分子量を有し、2つの特異的な高親和性Fe(III)結合部位を含有する。Fe(III)に対するトランスフェリンの親和性は極めて高い(会合定数はpH 7.4で1020M-1である)が、pHを中性未満に減少させるとともに累減する。トランスフェリンは、鉄への結合に限定されるだけでなく、様々な金属イオンにも結合する。これらの糖タンパク質は、脊椎動物の様々な体液中にある。鉄に結合していない場合、トランスフェリンは、「アポトランスフェリン」として知られる。
一実施態様において、トランスフェリンは、哺乳動物トランスフェリンである。さらなる実施態様において、哺乳動物トランスフェリンは、ヒトトランスフェリンである。一実施態様において、ヒトトランスフェリンは、ヒトトランスフェリン受容体1(TfR1; CD71としても知られる)である。
TfR1結合ペプチドは、神経学的障害の治療において有用であり得ることが理解されるであろう。そのような神経学的障害の例としては、ニューロパチー障害、神経変性疾患、癌、眼疾患障害、発作性障害、リソソーム蓄積症、アミロイド症、ウイルス又は微生物疾患、虚血、行動障害、及びCNS炎症:が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施態様において、神経学的障害は、ヒト対象におけるものである。投与量及び/又は投与頻度は、赤血球が曝露されるペプチドリガンドの濃度を低下させるために調節されることが理解されるであろう。さらなる実施態様において、治療は、ヒト対象を赤血球の除去についてモニタリングする工程をさらに含む。
「予防」という用語への本明細書における言及は、疾患の誘導前の防御的組成物の投与を含む。「抑制」は、誘導性事象の後であるが、疾患の臨床的出現の前の組成物の投与を指す。「治療」は、疾患症状が顕在化した後の防御的組成物の投与を含む。
疾患からの防御又は疾患の治療におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用することができる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、本発明によって促進され、それにより、ヒト及び動物標的と交差反応することができるポリペプチドリガンドの開発が可能になり、動物モデルの使用が可能になる。
トランスフェリン受容体1(TfR1)は、広く研究されているモデル受容体-リガンド系であり、細胞特性並びに栄養素/スカベンジャー受容体カーゴ内在化及びエンドサイトーシス選別のメカニズムについてのかなりの洞察を提供している(Qianらの文献(2002) Pharmacological Reviews 54(4), 561-587)。TfR1は、構成的エンドサイトーシス及び血漿膜へのリサイクリングを受けることが知られており、エンドサイトーシスされたカーゴの適切な選別を可能にするためのpH依存性リガンド結合を有する。抗TfR1抗体は、これまで、オリゴヌクレオチド治療薬のTfR1標的化のための主要な薬剤であると考えられてきたが、本発明の本Tfr1結合ペプチドリガンドは、TfR1-二環式ペプチド-siRNAコンジュゲートの全身送達を介する骨格筋及び心筋における遺伝子発現の効率的かつ重大なノックダウンを示す可能性がある。
したがって、このメカニズムを考慮して、本発明のペプチドリガンドは、組織送達複合体、例えば、組織細胞、特に、筋肉細胞へのTfr1-ペプチドリガンド-ペイロード(すなわち、siRNA)複合体の送達としての有用性を見出し得ると考えられる。
したがって、本発明のさらなる態様によれば、TfR1に結合した本発明のペプチドリガンドを、別のペプチド、小分子薬物、又はオリゴヌクレオチド、特に、siRNAなどのペイロードとの組合せで含む組織送達複合体が提供される。
それゆえ、該組織送達複合体は、筋骨格障害の治療における有用性を見出す。好適な筋骨格障害の例としては、
12q14微小欠失症候群
2q37欠失症候群
3M症候群
脛骨の欠如
多指症を伴う脛骨の欠如
膝蓋骨欠如
無手無足症
軟骨無発生症1A型－軟骨無発生症を参照
軟骨無発生症1B型－軟骨無発生症を参照
軟骨無発生症2型－軟骨無発生症を参照
軟骨無形成症
先端・胸部・腎野欠損
先端脳梁症候群、シンツェル型
先端大腿骨頭異形成症
先端多指症
先端異骨症
先端異形成性側弯症
先端顔面異骨症、カターニア型
先端顔面異骨症、パラゴニーア型
先端顔面異骨症、ロドリゲス型
先端前頭顔面鼻形成不全症候群
先端短縮姓前頭鼻異骨症
先端中部短縮性異形成症
先端中部短縮性異形成症、ハンター・トンプソン型
先端中部短縮性異形成症、マロトー型
先端短肢異形成症
先端骨溶解症、優性型
先端胸症候群
先端胸部脊椎骨異形成、F型
急性熱性好中球性皮膚症
片側性無指症
アダムズ・オリバー症候群
アデノシンデアミナーゼ2欠損症
ADULT症候群
成人発症スティル病
エカルディ・グティエール症候群
アルガザリ・サブリナタンナイル症候群
アラン・バビン・デマルケス症候群
α-マンノシドーシス
肩甲腓骨型神経原性筋萎縮症、ニューイングランド型
無肥大異形成症
天使形指節骨骨端異形成症
眼瞼癒着・外胚葉欠陥・口唇口蓋裂症候群
強直性脊椎炎－希少疾患ではない
胼胝を伴う強直性脊椎骨化過剰症
遠位指骨の低形成又は欠如を伴う無爪症・爪異栄養症
アントレー・ビクスラー症候群
アペール症候群
先天性多発性関節拘縮症
アーツ症候群
アスパルチルグルコサミン尿症
骨発生不全症1型
骨発生不全症2型
骨発生不全症3型
耳頭合指症
耳介顆症候群
耳介骨異形成症
常染色体優性遅発性脊椎骨端異形成症
常染色体劣性早期発症型炎症性腸疾患
常染色体劣性プロテインC欠乏症
軸性骨軟化症
軸性脊椎骨幹端異形成症
ベビーラトル骨盤異形成症
ボーラー・ジェロルド症候群
バンキ症候群
ベーレ・スティーブンソン脳回状頭皮症候群
ベーチェット病
ベナレグ・ラセテ症候群
ベスレムミオパチー
ビュークス家族性股関節異形成症
ブラウ症候群
ブラウント病
BOD症候群
骨異形成症、アズーズ型
骨異形成症、致死性ホルムグレン型
ブーメラン異形成症
小人症を伴う前方への脚の湾曲
短頭前頭鼻異形成症
短指性小人症、ムセレニ型
短指肘手首異形成症
短指症、長母指型
短指症、モノネン型
短指症A1型
短指症A2型
短指症A4型
短指症A5型
短指症A6型
短指症A7型
短指症B型
短指症C型
短指症E型
短指症B及びE混合型
短体幹症3型
鰓弓症候群、X連鎖
ブロディーミオパチー
ブルック症候群1
ブシュケ・オレンドルフ症候群
C症候群
カフィー病
屈曲肢症、カミング型
屈曲肢異形成症
屈短指症
屈指・関節症・内反股・心膜炎症候群
屈指症候群、グアダラハラ2型
屈指症、高身長症、及び難聴症候群
カムラティ・エンゲルマン病
カントゥ症候群
カーペンター症候群
手根足根骨軟骨腫症
軟骨毛髪低形成症
カテル・マンズケ症候群
骨内膜硬化症を伴う小脳低形成症
脳・肋骨・下顎症候群
頸部ジストニア
チャーリー・M症候群
ケルビム症
CHILD症候群
小児低ホスファターゼ症
軟骨石灰化症2
軟骨異形成症、ブロムストランド型
点状軟骨異形成症1、X連鎖劣性
点状軟骨異形成症、シェフィールド型
関節脱臼を伴う軟骨異形成症、GPAPP型
軟骨異形成症、グリーブ型
軟骨肉腫
脊索腫
脂肪異栄養症及び体温上昇を伴う慢性非定型好中球性皮膚病
慢性再発性多巣性骨髄炎
脛骨欠損裂手症
鎖骨頭蓋異形成症
鎖骨頭蓋異形成症、劣性型
鎖骨四肢根部症候群
CLOVES症候群
尾骨痛
CODAS症候群
コフィン・シリス症候群
COG1-CDG(CDG-IIg)
コール・カーペンター症候群
コラーゲン異常症2α1型
鎖骨の凝縮性骨炎
チトクロムP450オキシドレダクターゼ欠損による先天性副腎過形成
先天性拘縮性クモ指症
先天性大腿骨欠損症
先天性原発性無水晶体症
先天性橈尺骨癒合症
コルネリア・デランゲ症候群
カズン症候群
頭蓋骨幹異形成症
頭蓋外胚葉異形成症
骨幹過形成を伴う頭蓋顔面異骨症
頭蓋顔面異癒合症
頭蓋前頭鼻異形成症
頭蓋骨幹端骨異形成症、常染色体優性型
頭蓋骨幹端骨異形成症、常染色体劣性型
頭蓋骨癒合症、肛門異常、及び汗孔角化症
頭蓋終脳異形成症
クルーゾン症候群
カラー・ジョーンズ症候群
クラリーノ三徴
カリー・ジョーンズ症候群
チェコ異形成症、中足骨型
軸後性多指症を伴うダンディ・ウォーカー奇形
矢状頭蓋骨癒合症及び水頭症を伴うダンディ・ウォーカー奇形
インターロイキン-1受容体アンタゴニストの欠損
遅発性膜性頭蓋骨化症
歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮
デビュクオア症候群
デスモステロール症
悪性線維性組織球腫を伴う骨幹髄質狭窄
捻曲性骨異形成症
ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ欠損症－希少疾患ではない
ディグベ・メルヒオール・クラウゼン症候群
軟骨骨形成不全腎炎
ジスフェルリン異常症
異骨性骨硬化症
片肢性骨端異形成症
分節異常異形成症、ローランド・デビュクオア型
分節異常異形成症、シルバーマン・ハンドメーカー型
DYT-GNAL
EEC症候群
EEM症候群
エリス・ファンクレフェルト症候群
腱付着部炎関連の若年性特発性関節炎
筋ジストロフィーを伴う単純型表皮水疱症
早期発症糖尿病を伴う多発性骨端異形成症
エルドハイム・チェスター病
ユーイング肉腫
大腿骨頭の家族性無血管性壊死
家族性寒冷自己炎症性症候群
家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症1型
家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症2型
家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症3型
家族性地中海熱
家族性離断性骨軟骨症
家族性腫瘍状石灰沈着症
ファンコニ貧血
ファインゴールド症候群
フェルティ症候群
大腿骨・顔面症候群
単指性外指症を伴う二分大腿骨
大腿骨・腓骨・尺骨症候群
胎児性サリドマイド症候群
線維軟骨形成症
進行性骨化性線維異形成症
腓骨無形成外指症
腓骨無形成、脛骨弯曲、及び乏合指症症候群
腓骨欠損
腓骨低形成症及び複雑短指症
フィリッピ症候群
フィッツシモンズ・ギルバート症候群
巣状分節性糸球体硬化症
フランク・ター・ハール症候群
フライバーグ病
前頭顔鼻異形成症
前頭骨幹端異形成症
前頭鼻異形成症
脱毛症及び性器異常を伴う前頭鼻異形成症－前頭鼻異形成症を参照
前頭鼻異形成症・重度小眼球症・重度顔面裂症候群－前頭鼻異形成症を参照
フロントリニー(Frontorhiny)－前頭鼻異形成症を参照
フリンズ・ホフケンズ・ファブリー症候群
フコシドーシス
フールマン症候群
ガラクトシアリドーシス
ゴーシェ病1型
ゴーシェ病3型
多幸小人症
性器膝蓋骨症候群
ジェノヴァ症候群
遺伝性軟骨腫症
骨異形成性老人性皮膚症
ゴーサル血液骨幹異形成症候群
骨巨細胞腫
GM1ガングリオシドーシス1型
GM1ガングリオシドーシス2型
GM1ガングリオシドーシス3型
ゴールデンハー病
ゴーハム病
薄骨異形成症
グラント症候群
グリーンバーグ異形成症
グレイグ頭多合指症候群
グッリエーリ症候群
ハーラマン・ストライフ症候群
手足子宮症候群
ハンハルト症候群
心手症候群、スロベニア型
心手症候群、スペイン型
片側顔面矮小症
片側顔筋過形成
遺伝性アンチトロンビン欠乏症
遺伝性多発性骨軟骨腫
ホルト・オーラム症候群
ハンター・マッカルパイン症候群
ハーラー症候群
ハーラー・シャイエ症候群
硝子化線維腫症症候群
高IgD症候群
全身性皮質性骨化過剰症
高リン血症性家族性腫瘍状石灰沈着症
軟骨低形成症
低ホスファターゼ症
低リン血症性くる病
I細胞病
IMAGe症候群
無穿孔性中咽頭・肋椎異常
封入体ミオパチー3
早期発症パジェット病及び前頭側頭型認知症を伴う封入体ミオパチー
封入体筋炎
知的障害・痙縮・外指症候群
虹彩隅角異発生1型
IVIC症候群
ジャクソン・ワイス症候群
ヤンセン型骨幹端軟骨異形成症
ジューン症候群
ジョンソン・マンソン症候群
若年性皮膚筋炎
若年性骨粗鬆症
若年性パジェット病
カプラン・プラウチュ・フィッチ症候群
ケニー・キャフェイ症候群1型
ケニー・キャフェイ症候群2型
ケウテル症候群
キーンボック病
クライナー・ホームズ症候群
クリッペル・ファイル症候群
クリッペル・トレノネー症候群
クニースト異形成症
クニースト様異形成症、致死性
ケーラー病
後弯肢異形成症
涙骨・耳介・歯・指症候群
ラムダ型骨癒合症
ランバート・イートン筋無力症候群
ランガー中部短縮性異形成症
ラーセン症候群
側方髄膜瘤症候群
ラウリン・サンドロウ症候群
レッグ・カルベ・ペルテス病
レンツ・マジュースキ過骨性小人症
レリ過剰骨化症
レリ・ワイル軟骨骨形成異常症
致死性軟骨異形成症、モアマン型
致死性軟骨異形成症、セラー型
挙筋症候群
肢帯筋ジストロフィー1A型
肢帯筋ジストロフィー2A型
肢帯筋ジストロフィー2B型
肢帯筋ジストロフィー2E型
肢帯筋ジストロフィー2F型
肢帯筋ジストロフィー2H型
肢帯筋ジストロフィー、2C型
肢帯筋ジストロフィー、2D型
四肢乳房症候群
ロイス・ディーツ症候群
ローリー・マクリーン症候群
ローリー・ウッド症候群
マクロファージ筋膜炎
マフッチ症候群
MAGIC症候群
マジード症候群
A型脂肪異栄養症を伴う下顎先端異形成症
B型脂肪異栄養症を伴う下顎先端異形成症
小頭症を伴う下顎顔面異骨症
マンノシドーシス、βA、リソソーム型
マーシャル症候群
マーシャル・スミス症候群
マッキューン・オルブライト症候群
メッケル症候群
顔面皮膚及び鼻粘膜のポリープを伴う正中上唇裂
マイヤー・ゴーリン症候群
メルニック・ニードルス症候群
流蝋骨症
骨斑紋症を伴う流蝋骨症
中部短縮・骨癒合症候群
中部短縮性小人症・口蓋裂・屈曲指症
中部短縮性異形成症、カンタプトラ型
中部短縮性異形成症、サヴァラヤン型
第4及び第5中手骨癒合症
中軟骨腫症
骨幹端骨端異形成症
骨幹端軟骨異形成症、シュミット型
骨端軟骨異形成症、スパー型
骨幹端軟骨異形成症・知的障害・伝音性難聴症候群
骨幹端異形成症・小上顎症・短指症
減毛症を伴わない骨幹端異形成症
変容性骨異形成症
メバロン酸尿症
小頭症性骨異形成性原始性小人症1型
小頭症性骨異形成性原始性小人症2型
小頭症性原始性小人症、トリエリョ型
片側顔面矮小症・橈骨欠損
ミラー症候群
外眼筋麻痺を伴うミニコアミオパチー
単量体筋萎縮症
マックル・ウェルズ症候群
ムコリピドーシスIIIα/β
ムコリピドーシス4型
ムコ多糖症III型
ムコ多糖症IIIA型
ムコ多糖症IIIB型
ムコ多糖症IIIC型
ムコ多糖症IIID型
ムコ多糖症IV型
ムコ多糖症IVA型
ムコ多糖症VII型
ムエンケ症候群
多中心性手根足根骨溶解症候群
多発性骨端異形成症
多発性骨端異形成症2
多発性スルファターゼ欠損症
多発性骨癒合症症候群1
多系統萎縮症
筋ジストロフィー
筋ジストロフィー、先天性、巨円錐型
MYH7関連肩甲腓骨ミオパチー
マイアー症候群
ミオシノパチー
ミオスタチン関連筋肥大
筋強直性ジストロフィー
筋強直性ジストロフィー2型
ナジェール先端顔面異骨症
爪膝蓋骨症候群
中條・西村症候群
新生児発症多系統炎症性疾患
新生児重度副甲状腺機能亢進症
ネストル・ギレルモ早老症症候群
神経線維腫症1型
ニーベルゲルト症候群
正常リン血症性家族性腫瘍状石灰沈着症
後頭角症候群
眼耳前頭鼻症候群
眼歯指異形成症
眼顎顔面異骨症
眼咽頭筋ジストロフィー
オリバー症候群
オリエール病
骨格異形成症1
骨格異形成症2
成熟遅延骨異形成症
口顔指症候群1
口顔指症候群10
口顔指症候群11
口顔指症候群2
口顔指症候群3
口顔指症候群4
口顔指症候群5
口顔指症候群6
口顔指症候群8
口顔指症候群9
オスラム症候群
OSMED症候群
脊椎の後縦靱帯の骨化－希少疾患ではない
家族性指骨関節症
離断性骨軟骨症
家族性骨異形成症、アンダーソン型
ダンクス・メイン及びコズロフスキーの早発性骨異形成症
骨線維性異形成症
骨発生不全症I型
骨発生不全症II型
骨発生不全症III型
骨発生不全症IV型
骨発生不全症V型
骨発生不全症VI型
骨空洞骨異形成症
骨中間濃化症
頭蓋骨硬化症を伴う線条性骨症
骨減少症及び薄毛
大理石骨病、常染色体優性1型
大理石骨病、常染色体優性2型
大理石骨病、常染色体劣性3
大理石骨病、常染色体劣性4
大理石骨病、常染色体劣性7
骨斑紋症及び涙嚢炎
骨粗鬆症・眼皮膚低色素沈着症候群
骨粗鬆症・偽神経膠腫症候群
骨肉腫
耳・口蓋・指症候群1型
耳・口蓋・指症候群2型
肥厚性皮膚骨膜症
パックマン異形成症
パリスター・ホール症候群
先天性パラミオトニア
パラストレンマ性小人症
PARC症候群
パークス・ウェーバ症候群
パターソン・スティーブンソン・フォンテーン症候群
骨盤異形成症・下肢の関節拘縮症
周期性発熱、アフタ性口内炎、咽頭炎、及び腺炎
ファイファー型心頭蓋症候群
アザラシ肢症・外指症・難聴・洞性不整脈
色素性絨毛性結節性滑膜炎
梨状筋症候群
扁平脊椎性致死性骨格異形成症、トーランス型
塩分渇望を伴う多円錐型ミオパチー
ポーランド症候群
多嚢胞性骨疾患
硬化性白質脳症を伴う多嚢胞性脂肪膜性骨異形成症
多指症・近視症候群
多骨性骨溶解性異形成症、遺伝性拡大性
カリウム惹起性ミオトニア
軸前性欠損、軸後性多指症、及び尿道下裂
軸前性多指症1型
軸前性多指症2型
軸前性多指症3型
軸前性多指症4型
早老症
進行性骨別形成
進行性偽リウマチ性異形成症
プロテインC欠乏症－希少疾患ではない
プロテウス症候群
近位指節癒合症
偽性軟骨無形成症
偽性アミノプテリン症候群
偽性捻曲性骨異形成症
偽性副甲状腺機能低下症1A型
偽性副甲状腺機能低下症1C型
偽性偽性副甲状腺機能低下症
乾癬性若年性特発性関節炎
濃化異骨症
濃化軟骨無形成症
パイル病
壊疽性膿皮症
化膿性関節炎、壊疽性膿皮症、及びざ瘡
橈尺骨癒合症1型－先天性橈尺骨癒合症を参照
橈尺骨癒合症2型－先天性橈尺骨癒合症を参照
橈尺骨癒合症・小頭症・脊柱側弯症候群
レイン症候群
ラモン症候群
ラパデリノ症候群
反応性関節炎
腎異形成症、網膜色素ジストロフィー、小脳性運動失調症、及び骨格異形成症
全身症状を伴う脳白質ジストロフィーを伴う網膜血管障害
四肢根部点状軟骨異形成症1型
四肢根部異形成症、パターソン・ローリー型
四肢根部症候群
リキエリ・コスタ・ダ・シルバ症候群
強直性脊椎症候群
ロバーツ症候群
ゼーツレ・コッツェン症候群
サラ病－遊離シアル酸蓄積症を参照
SAPHO症候群
サルコイドーシス－希少疾患ではない
セイ・マイヤー症候群
セイ・フィールド・コールドウェル症候群
頭皮欠損・軸後性多指症
SCARF症候群
シャイエ症候群
ショイエルマン病
シムケ免疫骨異形成症
シンツェル・ギーディオン症候群
シンツェル型アザラシ肢症
蝸牛様骨盤異形成症
シュニッツラー症候群
シュワルツ・ヤンペル症候群
硬結性骨化症
セッケル症候群
セピアプテリン還元酵素欠損症
短肋骨多指症候群3型
短肋骨多指症候群1型
短肋骨多指症候群4型
短肋骨多指症候群、マジュースキー型
低身長症候群、ブリュッセル型
シュプリンツェン・ゴールドバーグ頭蓋骨癒合症症候群
シュワッハマン・ダイアモンド症候群
鎌状βサラセミア
鎌状赤血球貧血
シレンス症候群
シングルトン・メルテン症候群
大腿骨頭すべり症－希少疾患ではない
小膝蓋骨症候群
スミス・マッコート異形成症
スミス・レムリ・オピッツ症候群
ソトス症候群
スフェロイド小体ミオパチー
脊髄性筋萎縮症、琉球人型
先天性骨折を伴う脊髄性筋萎縮症1型
脊髄性筋萎縮症3型
脊髄性筋萎縮症4型
呼吸困難を伴う脊髄性筋萎縮症1
脾臓腺融合・四肢欠損・小顎症
裂手裂足奇形
裂手裂足・眼振
脊椎屈指症
脊椎手根足根骨癒合症候群
脊椎肋骨異骨症1－脊椎肋骨異骨症を参照
脊椎肋骨異骨症2－脊椎肋骨異骨症を参照
脊椎肋骨異骨症3－脊椎肋骨異骨症を参照
脊椎肋骨異骨症4－脊椎肋骨異骨症を参照
脊椎肋骨異骨症5－脊椎肋骨異骨症を参照
脊椎肋骨異骨症6－脊椎肋骨異骨症を参照
脊椎異形成型エーラス・ダンロス症候群
免疫調節不全を伴う脊椎内軟骨異形成症
脊椎骨端骨幹端異形成症、ジュヌビエーブ型
脊椎骨端骨幹端異形成症、関節弛緩
脊椎骨端骨幹端異形成症、マトリリン-3関連
脊椎骨端骨幹端異形成症、ミズーリ型
脊椎骨端骨幹端異形成症、ショハット型
脊椎骨端骨幹端異形成症、スポナストリム型
脊椎骨端骨幹端異形成症、ストラドウィック型
減毛症を伴う脊椎骨端骨幹端異形成症
多発性脱臼を伴う脊椎骨端骨幹端異形成症
脊椎骨端骨幹端異形成症、X連鎖型
脊椎骨端骨幹端異形成症、アグリカン型
先天性脊椎骨端異形成症
脊椎骨端異形成症、マロトー型
遅発性脊椎骨端異形成症、X-連鎖型
脊椎骨端異形成症・短指症及び特徴的発話
脊椎骨端骨幹端異形成症、短肢・手型
脊椎骨幹端異形成症、アルジェリア型
脊椎骨幹端異形成症、角骨折型
脊椎骨幹端異形成症、セダガティアン型
脊椎骨幹端異形成症、A4型
錐体・桿体ジストロフィーを伴う脊椎骨幹端異形成症
象牙質形成不全症を伴う脊椎骨幹端異形成症
脊椎骨幹端異形成症、X連鎖型
脊椎骨幹端異形成症、コズロウスキー型
脊椎周囲異形成症
脊椎胸部異骨症
シュプレンゲル変形
STAR症候群
スティッフパーソン症候群
ステューブ・ウィーデマン症候群
手足の多発異常を伴う指節癒合症
合指症、セナーニ・レンツ型
合指症3型
合指症5型
合指症9型
合指症・多指症・耳たぶ症候群
顎癒合症・多発異常
滑膜軟骨腫
全身発症性若年性特発性関節炎
TAR症候群
TARP症候群
足根手根連合症候群
足根管症候群
テトラ・アメリア症候群
テトラ・アメリア-多発奇形症候群
四肢単指症
致死性骨異形成症1型
致死性骨異形成症2型
胸郭異形成症・水頭症症候群
胸郭喉頭骨盤異形成症
脛骨欠損・多指症・クモ膜嚢胞
ティーツェ症候群
TMEM165-CDG(CDG-IIk)
タウンズ・ブロックス症候群
トリーチャー・コリンズ症候群
毛髪・歯・骨症候群
毛髪肝腸症候群
毛髪鼻指節骨症候群1型
毛髪鼻指節骨症候群2型
毛髪鼻指節骨症候群3型
三角腕頭症、球状鼻裂、小顎症、及び手足の異常
三指節母指・短欠指症
上腕骨滑車無形成症
滑車異形成症
トロイヤー症候群
管状凝集体ミオパチー
腫瘍壊死因子関連周期熱症候群
尺骨及び腓骨の低形成症
尺骨低形成症・知的障害症候群
尺骨骨幹端異形成症候群
尺骨低形成症・足のエビはさみ奇形
尺骨・乳房症候群
未分化多形肉腫
アピントン病
ヴェルロ・ブルギニョン症候群
ヴィリョエン・カリス・ヴォージュ症候群
ワーマン・マリケン・ヘイワード症候群
ウィーバー症候群
ヴェイユ・マルケザーニ症候群
ワイセンバッハー・ツウェイミュラー症候群
ウェイヤーズ型先端顔面異骨症
ウィルダーヴァンク症候群
ワース型常染色体優性骨硬化症
しわしわ皮膚症候群
X連鎖優性点状軟骨異形成症2
X連鎖優性肩甲腓骨ミオパチー
X連鎖低リン血症
X連鎖知的障害-斜頭症症候群
X連鎖骨格異形成症-知的障害症候群
ユニス・バロン症候群
:が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明を、以下の実施例を参照して、以下でさらに説明する。
(実施例)
(材料及び方法)
(二環式ペプチドリガンドの調製(一般的方法))
二環式ペプチドを、手動カップリングによるか(大規模の場合)又はBiotage SyroII自動ペプチド合成装置を使用するか(小規模の場合)のいずれかで、標準的なFmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)固相ペプチド合成を用いて、Rinkアミド樹脂上で合成した。TFAに基づく樹脂からの切断の後、ペプチドをジエチルエーテルで沈殿させ、50:50のアセトニトリル/水に溶解させた。その後、粗ペプチド(～1mM濃度)を、重炭酸アンモニウム(100mM)を塩基として用いて、1.3当量のスキャフォールドで環化させた。環化の終了は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)又はLC-MSによって決定した。終了したら、環化反応を、N-アセチルシステイン(ペプチドに対して10当量)を用いてクエンチし、溶液を凍結乾燥させた。残渣を適当な溶媒に溶解させ、RP-HPLCにより精製した。十分な純度及び正確な分子量(MALDI-TOFとHPLC又はLC-MSのいずれかによって確認されたもの)のペプチド画分をプールし、凍結乾燥させた。濃度を、Trp/Tyr含有量に基づく280nmでの減衰係数を用いるUV吸収によって決定した。
別途特記しない限り、アミノ酸は全て、L-立体配置で使用した。
(生物学的データ)
(1.TfR1直接結合アッセイ)
ヒト又はカニクイザルTfR1に対する本発明のペプチドの親和性(Kd)を、以下の方法に従って、蛍光偏光アッセイを用いて決定した。本発明のペプチドを蛍光タグ(フルオレセイン)で標識し、100mM NaCl、4mM CaCl2、及び0.005％P20を含む25mM HEPES、pH 7.4に2.5nMまで希釈した。TfR1タンパク質(ヒト: R&D Systems、2474-TR又はAcro Biosystems, CD1-H5243;カニクイザル: Acro Biosystems、TFR-C524a)を、該ペプチドと同じアッセイバッファー中、1～5μMから始めて力価測定して、黒色壁かつ黒色底の低結合低容量384ウェルプレート中、25μLの合計容量で1nMペプチドをアッセイした。このアッセイは、通常、5μLのアッセイバッファー、10μLのTfR1タンパク質、その後、10μLの蛍光ペプチドを添加することにより準備した。TfR1タンパク質の濃度を2分の1で連続希釈して、1～5μMから始まる12種の異なる濃度を生じさせた。測定は、FP 485 520 520光モジュールを備えたBMG PHERAstar FSで、ウェル当たり200フラッシュ及び0.1秒の位置決め遅延で、25℃で行った。各々のウェルを5分毎に60分間測定した。解析に使用されるゲインを、ウェル中にタンパク質が存在しない60分の終了時に、各々のトレーサーについて決定した。mPを、二次方程式を用いる標準的な1:1結合モデルに当てはめて、Kd値を出した。本発明の選択されたペプチドを上述のアッセイで試験した。結果は、表1に示されている:
表1:本発明の選択されたペプチドリガンドのFP直接結合
Figure 2023549229000014
 nd=未決定
(2.TfR1SPR結合アッセイ)
Biacore実験を行って、TfR1に対する様々なペプチド結合のka(M-1s-1)、kd(s-1)、KD(nM)値を決定した。
組換えヒト及びカニクイザルTfR1をHis6-タグ化TfR1(a.a.89～760)(ACRO Biosystems、CD1-H5243及びTFR-C524a)として二環から受け取った。
TfR1ペプチド結合の解析のために、Biacore T200又はS200装置を、25mM HEPES、0.1M NaCl、0.05％Tween 20 pH 7.4を泳動バッファーとして用いて、25℃でCytiva NTAチップを用いる捕捉/カップリングアプローチを利用した。固相化を次のように実施した。5mM NiSO4による活性化の前に、チップを500mM EDTA(pH 8)の注入により予め平衡化した。その後、標準的なアミンカップリング化学を用いて、表面を活性化した。簡潔に述べると、カルボキシメチルデキストラン表面を1:1の比の0.4M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)/0.1M N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化した。その後、泳動バッファーに入れて、それぞれ、200nM及び250nMまで希釈した後、TfR1タンパク質(ヒト又はカニクイザル)を活性化表面に捕捉させた。残存する活性基を7分間の1Mエタノールアミン(pH 8.5):HBS-N(1:1)の注入でブロッキングした。参照表面を活性化し、上記のようにブロッキングすると、TfR1タンパク質捕捉はなかった。捕捉レベルは、個々の試験によって、1,500～5,000RUの範囲であった。バッファーを25mM HEPES、0.1M NaCl、0.05％Tween 20 pH 7.4、1％DMSOに交換した。
試験ペプチドの希釈系列を、5μMの最大ペプチド濃度及び6つのさらなる2倍希釈を用いて、このバッファー中で調製した。SPR解析を、160秒の会合と700～800秒の解離にして、25℃で、30μl/分の流量で実行した。データをDMSO排除体積効果について補正した。全てのデータを、標準的な処理手順を用いて、ブランク注入及び基準面について二重参照し、データ処理及び動力学的フィッティングを、Scrubberソフトウェア、バージョン2.0c(BioLogic Software)を用いて実施した。単純な1:1結合モデルを用いて、適宜、質量移動効果を考慮に入れて、データをフィッティングした。
本発明の選択されたペプチドを上述のアッセイで試験した。結果は、表2に示されている:
表2:本発明の選択されたペプチドリガンドのSPR結合
Figure 2023549229000015
本発明のさらに選択されたペプチドを上述のアッセイで試験した。結果は、表3に示されている:
表3:本発明の選択されたペプチドリガンドのSPR結合
Figure 2023549229000016
Figure 2023549229000017
Figure 2023549229000018
nd=未決定
NB=未結合
(3.TfR1阻害アッセイ)
本発明のペプチドのTfR1阻害活性(IC50)を、以下の方法に従って、アルファアッセイを用いて決定した。タンパク質、ペプチド、及びアルファ試薬を5×濃度に調製し、各々の試薬のうちの5μlを、白色384-ウェルOptiplate中、25μlの全容量まで添加して、1×最終濃度にした。蛍光標識ヒトトランスフェリン(Invitrogen, T2871)を100mM NaCl、4mM CaCl2、0.5％BSA、及び0.05％P20を含む25mM HEPES、pH 7.4中で2.5nMに希釈した。ヒト又はカニクイザルTfR1タンパク質を50nMに希釈し、未標識ヒトトランスフェリン(R&D Systems, 2914-HT)を同じバッファーアッセイ中で500nMに希釈した。DMSOストックからの非標識ペプチドを同じバッファーアッセイ中で20倍希釈し、その後、5％DMSOを含有するバッファーアッセイ中で3分の1連続希釈して、11の異なる濃度を得た。5μlの蛍光標識トランスフェリン、5μlのヒト又はカニクイザルTfR1、5μlの非標識ペプチド又は無標識ヒトトランスフェリン(R&D Systems, 2914-HT)を白色384-ウェルOptiplateに添加し、30分間インキュベートした。抗FITCアクセプター(PerkinElmer, AL127)をアッセイバッファーに50倍希釈し、5μlをアッセイプレートに添加し、30分間インキュベートした。ニッケルキレートドナー(PerkinElmer, AS101)をアッセイバッファーに50倍希釈し、5μlをアッセイプレートに添加し、180分間インキュベートした。発光測定を、680nmでの励起の後、AlphaScreen 520-620モジュールを備えたBMG PHERAstar FS又はFSXで、25℃で行った。生データを100nMの未標識トランスフェリン及びバッファーに対して正規化した。データを100nMの未標識トランスフェリン及びバッファー対照に対して標準化し、標準的な4パラメータフィットに当てはめて、IC50値を出した。
本発明の選択されたペプチドを上述のアッセイで試験した。結果は、表4に示されている:
表4:本発明の選択されたペプチドリガンドのトランスフェリン阻害アッセイ
Figure 2023549229000019
 nd=未決定
(4.TfR1競合結合アッセイ)
蛍光タグを有さないペプチドを、蛍光タグ及び既知のKdを有する1nMのペプチド(BCY15768)と競合させて試験した。ペプチドを100％DMSOにまず希釈し、その後、最大2.5％DMSOで、直接結合アッセイに記載されている通りに、アッセイバッファー中に適当な濃度まで希釈し、その後、2分の1で連続希釈した。10μLの希釈したペプチドをプレートに添加し、その後、10μLのヒトTfR1を直接結合アッセイに記載されている通りに一定濃度(200nM)で添加した。その後、5μLの蛍光ペプチドを添加した。測定は、直接結合アッセイと同様に実施したが、ゲインは最初の測定の前に決定した。データ解析は、等式をCheng-Prusoffに当てはめるDotmaticsで行った。
本発明の選択されたペプチドを上述のアッセイで試験した。結果は、表5に示されている:
表5:本発明の選択されたペプチドリガンドのTfR1競合結合アッセイ
Figure 2023549229000020
Figure 2023549229000021
Figure 2023549229000022
本発明の選択されたペプチドを、ヒト及び/又はカニクイザルTfR1を用いて、上述のアッセイで試験した。結果は、表6に示されている:
表6:本発明の選択されたペプチドリガンドのTfR1競合結合アッセイ
Figure 2023549229000023
Figure 2023549229000024
Figure 2023549229000025
Figure 2023549229000026
nd=未決定
(5.ヒト近位尿細管細胞の初代培養物におけるTfR1結合二環式ペプチドを用いるトランスサイトーシスアッセイ)
TfR1結合二環式ペプチドの処理を理解するために、経上皮フラックスをヒト近位尿細管細胞単層の分極単層にわたって測定した。JAB(吸収方向のフラックス)及びJBA(分泌方向のフラックス)という2つのフラックスを180分のフラックス期間にわたって測定した。これらのフラックスから、TAフラックスの正味の方向(吸収又は分泌)及び大きさを決定した。実験の詳細を以下に概説する:
・化合物をコンフルエントな単層の頂端側又は側底側のいずれかに適用し、この2区画間の基質の時間分解分布をモニタリングすることにより、TAのフラックスである吸収フラックス(JAB)及び分泌フラックス(JBA)を決定した。これらから、正味フラックス(Jnet)を計算した。二環式ペプチドを0.1、1、及び10μMという3つの濃度で試験した。
・吸収フラックス(JAB)及び分泌フラックス(JBA)の測定に使用される単層が同様のTEER値を有するように、コンフルエントな単層をペアにした。
・インサートを約100mlの温かい改変クレブスバッファーの3つのビーカーに連続的に移す前に、培養培地をインサートウェルから吸引した。
・ヒト近位尿細管細胞単層を含むインサートを、pH 7.4の800μlの温かい改変クレブスバッファーを各々含有する新しい24-ウェルプレートに入れ、pH 7.4の200μlの改変クレブスバッファーをインサートの上部チャンバー(頂端チャンバー)に添加した。実験の温度を37℃で維持した。
・試験品のフラックスの開始前に、単層をクレブスバッファーのみ又はクレブスバッファー＋ビヒクルとともにプレインキュベートした。単層を、適宜、頂端膜又は側底膜のいずれかにおいて、pH7.4のクレブスとともにインキュベートした。
・改変クレブスバッファーを頂端又は側底チャンバーから吸引し、適切なpHで等量の所要試験濃度の二環式ペプチドと交換したとき、フラックスが開始された。
・このチャンバーは、ドナーチャンバーと呼ばれる。二環式ペプチドに加えて、同じ濃度の二環式ペプチドを含むルシファーイエローも共投与して、傍細胞フラックスを決定した。
・その後、実験開始後の所定の時点での反対側のチャンバー(レシーバーチャンバーと呼ばれる)からの50μlの試料採取を実施した。穏やかに2回ピペッティングして、バッファーを混合した後、試料を回収した。
・各々の試料採取の後、適切なpH及び基質を有する等量の新鮮なクレブスを交換した。最後の試料採取時に、インサートを氷冷クレブスバッファーの3つのビーカーに連続的に移すことにより、反応を終結させ、乾燥するまで放置した。
・50μlの試料を96-ウェルPCRプレート中に保存し、5.6μlの0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)を添加して、0.01％TFAの最終濃度を得た後、保存用にドライアイス中で瞬間凍結させた。
・単層を50μlの0.01％TFAで溶解させて、二環式ペプチドの細胞内量を決定し、上記のように瞬間凍結させた。
・全ての試料を-80℃で保存した。試料を二環式ペプチド濃度のLC-MS/MS決定に供した。
(6. LC-MS/MSによる二環式ペプチド検出)
合計648の試料をLC-MS/MS解析のために受け取った。
BCY17986、BCY17988、BCY17989、及びBCY17994は、DMSO中の1mg/mL溶液として個別に提供された。これらをアセトニトリル/DMSO(50/50、v/v)中でさらに希釈して、ワーキング溶液を作製した。
1.00～1000nmol/Lの範囲のマトリックス濃度を有する、トランスポーター培地(改変クレブスバッファー)中のBCY17986、BCY17988、BCY17989、及びBCY17994のバルク較正標準は、適切な量のBCY17986、BCY17988、BCY17989、及びBCY17994ワーキング溶液でトランスポーター培地を強化することにより調製した。
ドナーチャンバー、レシーバーチャンバー、及び溶解された腎臓細胞試料を、バルク較正標準を用いて全て定量し、QC試料をトランスポーター培地中で調製した。初期分析でULOQを上回ると予想される試料はいずれも、再分析前に20倍にまで希釈した。用量投与後、BCY17986、BCY17988、BCY17989、及びBCY17994を、トランスポーター培地、並びに試験品が投与された全てのインビトロ腎臓単層由来の溶解された腎臓細胞試料中で検出した。
各々のチャンバーの全体的な二環式ペプチド含有量を分析濃度から計算し、ルシファーイエローの漏出率を用いて傍細胞漏出について補正して、各々の方向における各々の二環式ペプチド濃度での真の正味フラックスを導き出した。正味フラックスをpmol/cm2として表し、頂端から側底(A-B)方向及び側底から頂端(B-A)方向について、時間に対してプロットした。
上の第5節及び第6節における分析の結果は、図1～4に示されており、これらの図において、試験された4つ全ての二環式ペプチドが、A-B方向とB-A方向の両方で濃度及び時間依存的なトランスサイトーシスを示したことが分かる。これは、FITCトランスフェリンと両方の膜上に局在するTfR1との結合を示した同時並行の試験と一致している。概して、側底から頂端へのフラックスは、頂端から側底よりも大きかった。以前の研究により、これらの二環式ペプチドの内在化が示されている。このデータは、TfR1を発現するヒト初代培養物におけるTfR1結合性二環式ペプチドのトランスサイトーシスを示しており、極性細胞の横断は、末梢及び脳血管系の内皮細胞を横断する輸送の可能性を示すものである。

Claims (21)

  1. 少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つの反応基を含むポリペプチド及び該ポリペプチドの反応基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、その結果、少なくとも2つのポリペプチドループが該分子スキャフォールド上に形成される、トランスフェリン受容体1(TfR1)に特異的なペプチドリガンド。
  2. 前記反応基がシステイン残基を含む、請求項1記載のペプチドリガンド。
  3. 前記ペプチドリガンドがトランスフェリンとTfR1との結合を阻害する、請求項1又は請求項2記載のペプチドリガンド。
  4. 前記ループ配列が、2、3、6、8、又は9つのアミノ酸を含む、請求項1～3のいずれか一項記載のペプチドリガンド。
  5. 前記ループ配列が、その第一のものが2つのアミノ酸からなり、かつその第二のものが9つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む、請求項4記載のペプチドリガンド。
  6. 前記ループ配列が、その両方が6つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む、請求項4記載のペプチドリガンド。
  7. 前記ループ配列が、その第一のものが3つのアミノ酸からなり、かつその第二のものが8つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む、請求項4記載のペプチドリガンド。
  8. 前記ペプチドリガンドが、
    Figure 2023549229000027
     (ここで、Ci、Cii、及びCiiiは、それぞれ、第一、第二、及び第三のシステイン残基を表す)
    :のアミノ酸配列、又はその医薬として許容し得る塩を含み、例えば、ここで、前記分子スキャフォールドが1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)であり、該ペプチドリガンドがN-及び/又はC-末端付加を含み、かつ
    A-(配列番号1)-A(本明細書において、BCY12455と称される);
    A-(配列番号1)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY12652と称される);
    A-(配列番号2)-A(本明細書において、BCY12452と称される);
    A-(配列番号2)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY12650と称される);
    A-(配列番号3)-A(本明細書において、BCY12454と称される);及び
    A-(配列番号3)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY12651と称される).
    (ここで、Sarはサルコシンを表し、Flはフルオレセインを表す)
    :から選択される、請求項4記載のペプチドリガンド。
  9. 前記ペプチドリガンドがトランスフェリンとTfR1との結合を阻害しない、請求項1又は請求項2記載のペプチドリガンド。
  10. 前記ループ配列が3つ又は7つのアミノ酸を含む、請求項9記載のペプチドリガンド。
  11. 前記ループ配列が、その第一のものが7つのアミノ酸からなり、かつその第二のものが3つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む、請求項10記載のペプチドリガンド。
  12. 前記ペプチドリガンドが、
    Figure 2023549229000028
    Figure 2023549229000029
    Figure 2023549229000030
    (ここで、Abuは、アミノ酪酸を表し、Aibは、アミノイソ酪酸を表し、Azeは、アゼチジンを表し、B-MeIleは、β-メチルイソロイシンを表し、C5gは、シクロペンチルグリシンを表し、Cbaは、β-シクロブチルアラニンを表し、Cbgは、シクロブチルグリシンを表し、Chgは、シクロヘキシルグリシンを表し、Cpgは、シクロプロピルグリシンを表し、EPAは、2-アミノ-3-エチル-ペンタン酸を表し、HyPは、trans-4-ヒドロキシ-L-プロリンを表し、[K(N3)]は、6-アジドリジンを表し、1Nalは、1-ナフチルアラニンを表し、2Nalは、2-ナフチルアラニンを表し、4Palは、4-ピリジルアラニンを表し、tBuAlaは、t-ブチル-アラニンを表し、tBuGlyは、t-ブチル-グリシンを表し、3tBuTyrは、3-t-ブチル-チロシンを表し、かつCi、Cii、及びCiiiは、それぞれ、第一、第二、及び第三のシステイン残基を表す)
    :のアミノ酸配列、又はその医薬として許容し得る塩を含み、
    例えば、ここで、前記分子スキャフォールドが1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリス(2-ブロモエタノン)(TATB)であり、かつ該ペプチドリガンドがN-及び/もしくはC-末端付加を含み、かつ
    A-(配列番号4)-A(本明細書において、BCY13983と称される);
    A-(配列番号4)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY14474と称される);
    A-(配列番号5)-A(本明細書において、BCY13986と称される);
    A-(配列番号5)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY14475と称される);
    A-(配列番号6)-A(本明細書において、BCY15466と称される);
    Ac-(配列番号6)(本明細書において、BCY15889と称される);
    A-(配列番号7)-A(本明細書において、BCY15467と称される);
    Ac-(配列番号7)(本明細書において、BCY15890と称される);
    A-(配列番号8)-A(本明細書において、BCY13989と称される);
    A-(配列番号8)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY14476と称される);
    A-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY15468と称される);
    A-(配列番号9)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15768と称される);
    (配列番号9)-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15934と称される);
    Ac-(配列番号9)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15937と称される);
    Ac-(配列番号9)-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15938と称される);
    [Fl]G[Sar5]-A-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY15940と称される);
    N[1Nal]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18030と称される);
    Ac-(配列番号9)-E[Pip]W(本明細書において、BCY18039と称される);
    Ac-(配列番号9)-EPW(本明細書において、BCY17994と称される);
    NWN-(配列番号9)(本明細書において、BCY18029と称される);
    NWN-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17109と称される);
    Ac-(配列番号9)-E[Aze]W(本明細書において、BCY18037と称される);
    Ac-NWN-(配列番号9)(本明細書において、BCY17992と称される);
    Ac-(配列番号9)-E[dP]W(本明細書において、BCY18038と称される);
    Ac-N[1Nal]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18034と称される);
    N[dW]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18031と称される);
    Ac-N[dW]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18035と称される);
    HWM-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17110と称される);
    A-(配列番号9)-PHP(本明細書において、BCY17115と称される);
    A-(配列番号9)-EPW(本明細書において、BCY17114と称される);
    NEV-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17112と称される);
    A-(配列番号9)-PIVH(本明細書において、BCY17120と称される);
    Ac-(配列番号9)(本明細書において、BCY15891と称される);
    HTS-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17111と称される);
    Ac-N[NMeTrp]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18036と称される);
    N[NMeTrp]N-(配列番号9)(本明細書において、BCY18032と称される);
    Ac-A-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY15939と称される);
    A-(配列番号9)-EHQE(本明細書において、BCY17119と称される);
    ESF-(配列番号9)-A(本明細書において、BCY17113と称される);
    NWN-(配列番号9)-[K(N3)](本明細書において、BCY17870と称される);
    Ac-NWN-(配列番号9)-[K(N3)](本明細書において、BCY17871と称される);
    [AzPro]-NWN-(配列番号9)(本明細書において、BCY17872と称される);
    Ac-(配列番号9)-EPW-[K(N3)](本明細書において、BCY17873と称される);
    [AzPro]-(配列番号9)-EPW(本明細書において、BCY17874と称される);
    Ac-(配列番号9)-[K(N3)](本明細書において、BCY17868と称される);
    [AzPro]-(配列番号9)(本明細書において、BCY17869と称される);
    Ac-N[dY]N-(配列番号9)-[K(N3)](本明細書において、BCY17882と称される);
    Ac-(配列番号9)-E-[dP]-W-[K(N3)](本明細書において、BCY17890と称される);
    Ac-(配列番号9)-E-[Aze]-W-[K(N3)](本明細書において、BCY17892と称される);
    Ac-(配列番号9)-E-[Pip]-W-[K(N3)](本明細書において、BCY17894と称される);
    Ac-(配列番号9)-[K(N3)(PYA-マレイミド](本明細書において、BCY17906と称される);
    Ac-(配列番号9)-EPW-[Peg10]-[K(N3)](本明細書において、BCY19405と称される);
    Ac-(配列番号9)-EPW-[Peg24]-[K(N3)](本明細書において、BCY19406と称される);
    Ac-(配列番号9)-EPWGGSGGS-[K(N3)](本明細書において、BCY19407と称される);
    A-(配列番号10)-A(本明細書において、BCY15469と称される);
    Ac-(配列番号10)(本明細書において、BCY15892と称される);
    A-(配列番号11)-A(本明細書において、BCY15470と称される);
    Ac-(配列番号11)(本明細書において、BCY15893と称される);
    A-(配列番号12)-A(本明細書において、BCY15471と称される);
    Ac-(配列番号12)(本明細書において、BCY15894と称される);
    Ac-(配列番号13)(本明細書において、BCY17991と称される);
    Ac-(配列番号13)-EPW(本明細書において、BCY17995と称される);
    Ac-NWN-(配列番号13)(本明細書において、BCY17993と称される);
    NWN-(配列番号13)(本明細書において、BCY18033と称される);
    A-(配列番号13)-A(本明細書において、BCY16754と称される);
    Ac-(配列番号13)-[K(N3)](本明細書において、BCY17896と称される);
    Ac-NWN-(配列番号13)-[K(N3)](本明細書において、BCY17899と称される);
    Ac-(配列番号13)-EPW-[K(N3)](本明細書において、BCY17901と称される);
    Ac-(配列番号14)(本明細書において、BCY17990と称される);
    Ac-(配列番号14)-[K(N3)](本明細書において、BCY17875と称される);
    [AzPro]-(配列番号14)(本明細書において、BCY17876と称される);
    Ac-(配列番号15)(本明細書において、BCY17989と称される);
    A-(配列番号15)-A(本明細書において、BCY16047と称される);
    Ac-(配列番号15)-[K(N3)](本明細書において、BCY17877と称される);
    [AzPro]-(配列番号15)(本明細書において、BCY17878と称される);
    A-(配列番号16)-A(本明細書において、BCY16962と称される);
    TYMN-(配列番号17)-A(本明細書において、BCY17117と称される);
    A-(配列番号17)-A(本明細書において、BCY16048と称される);
    A-(配列番号18)-A(本明細書において、BCY16963と称される);
    Ac-(配列番号19)(本明細書において、BCY17987と称される);
    A-(配列番号20)-A(本明細書において、BCY16753と称される);
    A-(配列番号21)-A(本明細書において、BCY16046と称される);
    A-(配列番号22)-A(本明細書において、BCY16964と称される);
    A-(配列番号23)-A(本明細書において、BCY16965と称される);
    Ac-(配列番号24)(本明細書において、BCY17986と称される);
    A-(配列番号25)-A(本明細書において、BCY16550と称される);
    A-(配列番号26)-A(本明細書において、BCY16966と称される);
    A-(配列番号27)-A(本明細書において、BCY16051と称される);
    IDSN-(配列番号28)-A(本明細書において、BCY17118と称される);
    WGKS-(配列番号29)-A(本明細書において、BCY17116と称される);
    A-(配列番号30)-A(本明細書において、BCY16053と称される);
    A-(配列番号31)-A(本明細書において、BCY16557と称される);
    A-(配列番号32)-A(本明細書において、BCY16035と称される);
    A-(配列番号33)-A(本明細書において、BCY16043と称される);
    A-(配列番号34)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15769と称される);
    A-(配列番号35)-A(本明細書において、BCY15648と称される);
    A-(配列番号36)-A(本明細書において、BCY16031と称される);
    A-(配列番号37)-A(本明細書において、BCY16079と称される);
    A-(配列番号38)-A(本明細書において、BCY16036と称される);
    A-(配列番号39)-A(本明細書において、BCY16029と称される);
    A-(配列番号40)-A(本明細書において、BCY16089と称される);
    A-(配列番号41)-A(本明細書において、BCY16088と称される);
    A-(配列番号42)-A(本明細書において、BCY16052と称される);
    A-(配列番号43)-A(本明細書において、BCY16033と称される);
    A-(配列番号44)-A(本明細書において、BCY16039と称される);
    Ac-(配列番号44)(本明細書において、BCY17988と称される);
    Ac-(配列番号44)-[K(N3)](本明細書において、BCY17879と称される);
    [AzPro]-(配列番号44)(本明細書において、BCY17880と称される);
    A-(配列番号45)-A(本明細書において、BCY16038と称される);
    A-(配列番号46)-A(本明細書において、BCY16050と称される);
    A-(配列番号47)-A(本明細書において、BCY16034と称される);
    A-(配列番号48)-A(本明細書において、BCY16032と称される);
    A-(配列番号49)-A(本明細書において、BCY16049と称される);
    A-(配列番号50)-A(本明細書において、BCY16558と称される);
    A-(配列番号51)-A(本明細書において、BCY16041と称される);
    A-(配列番号52)-A(本明細書において、BCY16042と称される);
    A-(配列番号53)-A(本明細書において、BCY16045と称される);
    A-(配列番号54)-A(本明細書において、BCY16037と称される);
    A-(配列番号55)-A(本明細書において、BCY16044と称される);
    A-(配列番号56)-A(本明細書において、BCY16040と称される);
    A-(配列番号57)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15771と称される);
    A-(配列番号58)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15772と称される);
    A-(配列番号59)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15773と称される);
    A-(配列番号60)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15774と称される);
    A-(配列番号61)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15775と称される);
    A-(配列番号62)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15776と称される);
    A-(配列番号63)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15777と称される);
    A-(配列番号64)-A-[Sar6]-[K-Fl](本明細書において、BCY15770と称される);
    Ac-(配列番号65)(本明細書において、BCY17903と称される);
    Ac-(配列番号66)(本明細書において、BCY17904と称される);及び
    Ac-(配列番号67)(本明細書において、BCY17905と称される);
    (ここで、AzProは、アジドプロピルを表し、Azeは、アゼチジンを表し、1Nalは、1-ナフチルアラニンを表し、NMeTrpは、N-メチル-トリプトファンを表し、[K(N3)]は、6-アジドリジンを表し、Pegは、ポリエチレングリコールを表し、Pipは、ピペコリン酸を表し、Sarは、サルコシンを表し、Flは、フルオレセインを表し、[K(N3)(PYA-マレイミド)]は、以下の構造:
    Figure 2023549229000031
     を有する修飾リジンを表す)
    :から選択されるか、又はここで、該分子スキャフォールドが1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)であり、該ペプチドリガンドがN-及び/もしくはC-末端付加を含み、かつ
    Ac-(配列番号13)(本明細書において、BCY20546と称される)
    :である、請求項9～11のいずれか一項記載のペプチドリガンド。
  13. 前記医薬として許容し得る塩が、遊離酸又はナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくはアンモニウム塩から選択される、請求項1～12のいずれか一項記載のペプチドリガンド。
  14. 請求項1～13のいずれか一項記載のペプチドリガンドのうちの少なくとも2つを含む多量体結合複合体。
  15. 式(I)の化合物:
    Figure 2023549229000032
     (式中、CHMは、中心のヒンジ部分を表し;
    二環は、請求項1～13のいずれか一項記載の二環式ペプチドリガンドを表し;かつ
    mは、2～10から選択される整数、例えば、2、3、又は4を表す)
    を含む、請求項14記載の多量体結合複合体。
  16. mが2を表し、かつCHMが式(A):
    Figure 2023549229000033
     例えば、BCY19409
    のモチーフである、請求項15記載の多量体結合複合体。
  17. 請求項1～13のいずれか一項記載のペプチドリガンド又は請求項14～16のいずれか一項記載の多量体結合複合体を、1以上の医薬として許容し得る賦形剤との組合せで含む、医薬組成物。
  18. TfR1によって媒介される治療剤の送達によって疾患又は障害を予防、抑制、又は治療する際に使用するための、請求項1～13のいずれか一項記載のペプチドリガンド、又は請求項14～16のいずれか一項記載の多量体結合複合体、又は請求項17記載の医薬組成物。
  19. Tfr1に結合した、請求項1～13のいずれか一項記載のペプチドリガンド又は請求項14～16のいずれか一項記載の多量体結合複合体を、ペイロード、例えば、オリゴヌクレオチド、特に、siRNAとの組合せで含む、組織送達複合体。
  20. 筋組織送達複合体である、請求項19記載の組織送達複合体。
  21. 筋骨格障害の治療における使用のための、請求項19又は請求項20記載の組織送達複合体。
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