CN101759800A - 二鼠李糖脂人工抗原、抗体的制备和基于该抗体的酶联免疫试纸及其制备、检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种二鼠李糖脂人工抗原及抗体的制备，该人工抗原是以二鼠李糖脂为半抗原，以牛血清蛋白为载体，利用碳化二亚胺法将二者进行交联后制得；该抗体是用人工抗原免疫动物后分离抗血清制备得到。本发明还公开了一种酶联免疫试纸，其是以硝酸纤维素膜为载体，载体上的加样孔中附着二鼠李糖脂人工抗原，牛血清蛋白溶液封闭载体上剩余的蛋白质结合位点。通过将二鼠李糖脂稀释液与含有该抗体的抗血清混合预培育，然后滴加到试纸的加样孔中，通过竞争免疫反应后洗涤，酶联显色，根据酶联免疫试纸上斑点颜色深浅可确定出稀释液中二鼠李糖脂浓度大小。本发明的方法简便快捷，可低成本、大批量地检测，且检测结果的特异性高、可重复性好。

Description

二鼠李糖脂人工抗原、抗体的制备和基于该抗体的酶联免疫试纸及其制备、检测方法

技术领域

本发明涉及一种表面活性剂的人工抗原、抗体的制备和基于该抗体的酶联免疫试纸及其制备、检测方法，尤其涉及一种鼠李糖脂类生物表面活性剂的人工抗原、抗体的制备和基于该抗体的酶联免疫试纸及其制备、检测方法。

背景技术

生物表面活性剂是由微生物代谢过程中产生的一类表面活性剂，其疏水端与有机分子结合，亲水端与水结合，使水在有机物周围形成稳定的液膜，显著降低物质的表面张力，稳定乳化液和增加泡沫，与化学表面活性剂相比，具有高效、低毒和环境友好等特性，在环境、化工、医药和食品工业等领域得到了广泛的应用。生物表面活性剂能改变有机物在固/液相中的分配，增大微生物与有机物的接触面积，提高传质效率，为微生物本身提供良好的表面环境，从而刺激微生物的繁殖，使许多难降解的物质(如石油烃、有机农药以及多环芳烃等)得以顺利降解。

鼠李糖脂是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginose)发酵代谢产生的一种生物表面活性剂。铜绿假单胞菌在自然界分布广泛，为上壤中存在的最常见的细菌之一，也是堆肥等环境工程中普遍应用的一种有机物降解菌，其在堆肥过程中产生的鼠李糖脂能减少堆肥有机质表面水的表面张力，加强氧的传质效率，促进微生物胞外酶的分泌，显著改善堆肥过程中的微环境，加快有机污染物的降解。适量的鼠李糖脂还能结合重金属离子，形成鼠李糖脂-金属离子复合物。鼠李糖脂对微生物没有毒害作用，而且最终被微生物降解。因此，对鼠李糖脂产量进行快速定量分析，研究环境中鼠李糖脂的浓度与分布，对于监测微生物活性、改进生物表面活性剂以及促进微生物降解污染物的工艺具有重要意义。

目前，鼠李糖脂的定量分析方法主要包括分光光度法、界面张力仪(环法)、薄层层析法等方法，但这些方法往往容易受到复杂介质组分或者其他表面活性物质的干扰，而具有高精确度的色质联用法成本较高，需要配备大型仪器。免疫检测是利用动物体内抗原、抗体能发生特异性的吸附反应的性质来选择性识别具有免疫原性的待测物，在识别较大分子之间的微小差异方面具有很强的专一性，已被越来越多地用于分析从复杂的病毒、微生物、生物毒素到简单的农药分子、工业有机污染物、重金属离子等多种物质，成为环境中痕量物质检测方法的研究热点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供了一种二鼠李糖脂人工抗原的制备方法以及利用该抗原制备二鼠李糖脂多克隆抗体的方法，在此基础上，本发明进一步提供了基于二鼠李糖脂多克隆抗体的酶联免疫试纸及该酶联免疫试纸的制备方法，通过该酶联免疫试纸及本发明提供的检测方法可以实现对生物表面活性剂二鼠李糖脂浓度的简便、快捷、低成本、大批量地检测，而且检测结果的特异性高、可重复性良好。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种二鼠李糖脂人工抗原的制备方法，包括以下步骤：以二鼠李糖脂为半抗原，以牛血清蛋白(BSA)为人工抗原载体，利用碳化二亚胺(EDC)法将所述二鼠李糖脂与牛血清蛋白进行交联，所述碳化二亚胺、二鼠李糖脂和牛血清蛋白的质量比为1∶(5～7)∶(15～20)，交联完成后制得二鼠李糖脂人工抗原。自然界中的蛋白质等大分子经过一定方法纯化后即可直接作为免疫原制备抗体，而小分子量物质(分子量＜1000，如农药、重金属离子等)本身不具有诱导产生抗体的能力，必须与蛋白质载体偶联制备出人工抗原，才能再通过诱导得到相应抗体。偶联方法的选择因半抗原的结构而异，在本发明中，考虑到是以二鼠李糖脂作为半抗原，经过我们的反复实验及优化，将EDC、二鼠李糖脂、BSA三者以1∶(5～7)∶(15～20)的质量配比进行交联，成功制备出本发明的二鼠李糖脂人工抗原，冷冻干燥后，肉眼可见由BSA白色粉末变成了由细小结晶组成的白色晶体样物质(即二鼠李糖脂人工抗原)。

作为优选的技术方案，上述二鼠李糖脂人工抗原的制备方法具体包括以下步骤：将所述5～7质量份的二鼠李糖脂、1质量份的碳化二亚胺溶解于N，N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲液(PBS)的混合液中，超声混合，然后将溶解有15～20质量份牛血清蛋白的PBS缓冲液添加到所述超声混合后的溶液中，在无光条件下进行搅拌，搅拌过程中通惰性气体保护，然后静置，再将静置后的溶液与生理盐水混合并反复进行透析，最后冷冻干燥得到二鼠李糖脂人工抗原。

作为一个总的技术构思，本发明还相应地提供一种二鼠李糖脂多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将上述各制备方法制得的二鼠李糖脂人工抗原乳化，再免疫动物，然后利用免疫扩散方法测定该动物抗血清的效价，当效价达到1∶16以上的稀释倍数值时采血，分离抗血清，得到二鼠李糖脂多克隆抗体。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种基于上述的二鼠李糖脂多克隆抗体的酶联免疫试纸，所述酶联免疫试纸是以硝酸纤维素膜为载体，所述载体上设有一个以上的加样孔，每个加样孔(以通常4mm直径的加样孔计)中附着有0.24～0.5μg的上述制备方法制得的二鼠李糖脂人工抗原，所述加样孔周围的蛋白质结合位点附着有牛血清蛋白。

作为一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述酶联免疫试纸的制备方法，包括以下步骤：以硝酸纤维素膜为载体，在所述载体上压印加样孔，用空白样本稀释液浸泡所述载体后干燥，然后在所述加样孔中固定所述的二鼠李糖脂人工抗原，再用牛血清蛋白溶液封闭所述载体上剩余的蛋白质结合位点，洗涤、干燥后制得酶联免疫试纸。

上述酶联免疫试纸的制备方法中，在所述加样孔中固定所述的二鼠李糖脂人工抗原优选是指：在单个加样孔中滴加3～5μL浓度为80～100mg·L^-1的二鼠李糖脂人工抗原溶液，再于35℃～40℃下干燥10～30min，完成固定。

上述酶联免疫试纸的制备方法中，用牛血清蛋白溶液封闭所述载体上剩余的蛋白质结合位点优选是指：将固定有二鼠李糖脂人工抗原后的载体浸泡于质量浓度为1％～2％的牛血清蛋白溶液中，于35℃～40℃下孵育1～2h，完成封闭。

作为一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述酶联免疫试纸的检测方法，包括以下步骤：将不同浓度的二鼠李糖脂样本稀释液分别与含有上述二鼠李糖脂多克隆抗体的抗血清混合预培育，将预培育后的混合液滴加到所述酶联免疫试纸的加样孔中，加样孔中固定的二鼠李糖脂人工抗原、待测二鼠李糖脂样本稀释液中的二鼠李糖脂和所述二鼠李糖脂多克隆抗体之间进行竞争免疫反应，反应完成后洗涤，酶联显色，根据所述酶联免疫试纸上斑点颜色深浅与所述二鼠李糖脂样本稀释液浓度的负相关特性，确定出二鼠李糖脂样本稀释液中的二鼠李糖脂浓度大小。采用本发明的酶联免疫试纸及检测方法，可以通过目测该试纸斑点上的颜色变化，测定铜绿假单胞菌发酵代谢产生的二鼠李糖脂浓度，操作简便易行，效果明显。

上述酶联免疫试纸的检测方法中，所述抗血清优选是指按1∶(500～600)的稀释度稀释后的抗血清，所述抗血清与二鼠李糖脂样本稀释液优选是等体积混合，所述混合预培育的时间优选为40～60min。通过实验发现，优选的抗血清稀释度能更好地保持其中抗体的反应活性，不至于因过量稀释而使抗体活性大大衰减，或者因稀释度不够使所述酶联免疫试纸对样本稀释液中的二鼠李糖脂的细微浓度变化不敏感。优选的预培育时间可以使样本稀释液中的二鼠李糖脂和抗血清中的抗体充分接触反应，并使样本稀释液中的微量二鼠李糖脂尽可能优先与抗体发生免疫结合。

上述酶联免疫试纸的检测方法中，所述酶联免疫试纸的单个加样孔中，混合液的滴加量优选为3～5μL，所述竞争免疫反应的时间优选为40～60min，竞争免疫反应的温度优选为35℃～40℃。优选的滴加量可以更好地保证加样孔中含有足够的免疫分子参与竞争免疫反应并且不发生溢出，优选的免疫反应时间、反应温度能够提高免疫结合效率，提高免疫试纸的灵敏度。

上述酶联免疫试纸的检测方法中，所述酶联显色优选是指：将洗涤后的酶联免疫试纸浸泡于按1∶(800～1000)稀释度稀释后的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G(简称HRP-G anti-RIgG)溶液中，35℃～40℃温度下孵育20～30min，漂洗干净后再将所述酶联免疫试纸置于新鲜配制的显色剂中，室温下避光10～15min，再用蒸馏水漂洗，自然干燥，完成酶联显色。上述HRP-G anti-RigG的稀释度和孵育时间等均是经过酶联免疫试纸的棋盘实验进行优化，适当的稀释度、孵育时间对HRP-G anti-RIgG的活性、二抗结合效率及免疫试纸的灵敏度都会产生积极影响。

与现有技术相比，本发明的优点在于：将生物表面活性剂研究和免疫技术相结合，研制出一种生物表面活性剂二鼠李糖脂人工抗原及多克隆抗体，该二鼠李糖脂人工抗原是采用碳化二亚胺法将二鼠李糖脂与BSA交联制备得到，并用核磁共振氢谱(¹H NMR)对该人工抗原进行了验证，采用琼脂免疫扩散方法考察了免疫动物后的抗血清的效价和特异性，这项技术为后续开展生物表面活性剂的免疫检测提供了保证和支持。

此外，与以往的仪器检测分析方法不同，本发明还开发了一种基于上述的二鼠李糖脂多克隆抗体的二鼠李糖脂斑点酶联免疫试纸及相应的制备、检测方法，通过本发明的酶联免疫试纸可用于肉眼检测微量的二鼠李糖脂浓度(本发明可用于肉眼检测浓度低至0.05mg·L^-1的二鼠李糖脂)。该检测方法不仅操作简便、快速，而且特异性高、可重复性良好，成本低，有利于对大量样品进行快速检测，有望成为微生物降解代谢系统中快速、简便的生物表面活性剂定量分析方法。

附图说明

图1为本发明实施例2中免疫第8周时免疫抗血清免疫扩散分析图；其中，中心孔滴加二鼠李糖脂人工抗原溶液(15μL，40μg/mL)，周边孔分别滴加稀释比为1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32的15μL抗血清和生理盐水。

图2为本发明实施例2中免疫第8周时免疫抗血清对二鼠李糖脂的特异性图；其中第一排各孔中均滴加抗血清(稀释比1∶50)，第二排中的A孔滴加二鼠李糖脂人工抗原溶液(40μg·mL^-1)，B孔滴加二鼠李糖脂人工抗原溶液(40μg·mL^-1)和二鼠李糖脂溶液(500μg·mL^-1)的混合液，C孔滴加二鼠李糖脂人工抗原溶液(40μg mL^-1)和单鼠李糖脂溶液(500μg mL^-1)的混合液，D孔滴加空白样本稀释液。

图3为本发明实施例3中的酶联免疫试纸敏感性试验图。

具体实施方式

实施例1：

二鼠李糖脂人工抗原的制备

1、铜绿假单胞菌发酵

本实施例是从铜绿假单胞菌发酵液中提取纯化鼠李糖脂，该铜绿假单胞菌(保藏号为CCTCC AB93066)购自中国典型培养物保藏中心(武汉)，在冷冻干燥的脱脂奶粉上于-20℃保藏。

将冷藏的铜绿假单胞菌菌种由保藏基质转移到新鲜斜面(含牛肉膏2.0g·L^-1、蛋白胨5.0g·L^-1、NaCl 5.0g·L^-1和琼脂20.0g·L^-1，pH值为7.0)上，并于37℃温度下活化24h；然后从斜面上接种铜绿假单胞菌至灭菌的种子培养液(含牛肉膏2.0g·L^-1、蛋白胨5.0g·L^-1和NaCl 5.0g·L^-1，pH值为7.0)中，于振荡培养箱中37℃、200r·min^-1条件下振荡培养18～24h；再以5％的接种量将铜绿假单胞菌种子培养液接种至发酵液(含葡萄糖18.0g·L^-1、NaNO₃2.0g·L^-1、KH₂PO₄1.5g·L^-1、Na₂HPO₄·12H₂O 1.5g·L^-1、MgSO₄·7H₂O 0.1g·L^-1和FeSO₄·7H₂O 0.01g·L^-1)中，于振荡培养箱中37℃、200r·min^-1条件下振荡培养60h，发酵完成。

2、鼠李糖脂粗产品提取

将上述发酵完成后的发酵液的pH值调至8.0，并在8000r·min^-1离心20min除去菌体，收集上清液并将pH值调至2.0，用2∶1(v/v)的氯仿和甲醇萃取液等体积萃取，静置分层，取下层萃取液置于旋转蒸发器中，在低压、40℃条件下蒸干溶剂，得到鼠李糖脂粗产品。

3、鼠李糖脂纯化

将填充物硅胶130g在105℃下活化24h，加入200mL氯仿混合均匀，在层析柱中加入10cm高度的氯仿，填装入硅胶-氯仿混合物使之在氯仿溶液中沉降，始终使硅胶上保持1～3cm的液面，并排尽残留气泡。将上述提取得到的鼠李糖脂粗产品1.41g溶于15mL的氯仿中，沿层析柱内壁壁周注入到层析柱的顶部，打开柱阀，使鼠李糖脂吸附到顶部硅胶上。接下来采用500mL的氯仿对硅胶柱进行淋洗以除去非极性的中性脂，然后再依次用100mL 10∶1(v/v)、200mL 2∶1(v/v)、100mL 1∶1(v/v)和200mL 1∶2(v/v)的氯仿和甲醇的混合液对硅胶柱进行淋洗，淋洗液的流速控制在2mL·min^-1，每10mL淋洗液用

10×150mm试管收集。

4、薄层色谱分析

用1μL的微量注射器在薄层板上点样，每个点3μL(点3次)。以65∶15∶1的氯仿/甲醇/乙酸混合液(v/v/v)作为展层剂，将3g苯酚和5mL浓硫酸溶于95mL乙醇中作为显色剂。显色后，薄层板上出现有规律的两组斑点，其薄层色谱比移值R_f分别为0.89和0.55，前者为柱层析中首先被洗脱出来的极性较弱的二鼠李糖脂，后者为随后被洗脱出来的极性较强的单鼠李糖脂。将二鼠李糖脂和单鼠李糖脂的洗出液分别于40℃真空旋转蒸发，除去溶剂后得到纯化的二鼠李糖脂产品。

5、二鼠李糖脂人工抗原的制备

取纯化的二鼠李糖脂60mg、EDC 10mg相继溶解于0.5mL 50％N，N-二甲基甲酰胺(DMF，N，N-Dimethylformamide)和50mM PBS(pH值为5.8)的混合液中，超声混合5min；再将200mg BSA溶解于1.5mL的PBS缓冲液(pH值为6.5)中，并与超声混合后的溶液混合，在无光条件下轻轻搅拌该混合物4h，搅拌过程中通氮气2h保护，搅拌完成后于4℃条件下静置24h，再将静置后所得溶液与1.8mL生理盐水混合，混合后置于500mL的PBS缓冲液(10mM，pH值为7.4)中于4℃温度下透析48h，其间更换三次透析液，最后冷冻干燥60h，得到由细小结晶组成的白色晶体样物质(初步确定为二鼠李糖脂-BSA偶联体)。采用核磁共振氢谱(¹H NMR)对该白色晶体样物质进行结构分析，发现有特征峰，证明二鼠李糖脂-BSA偶联成功，得到了本发明的二鼠李糖脂人工抗原。

实施例2：

二鼠李糖脂多克隆抗体的制备

1、免疫动物实验

将上述实施例1制得的二鼠李糖脂人工抗原5.0mg溶解于2.5mL灭菌的生理盐水中并加入等体积的弗氏完全佐剂乳化，皮下注射到新西兰大白兔体内，每只注射2mL。初次注射后，第2、4、6周分别重复注射，只是用弗氏不完全佐剂替代弗氏完全佐剂进行乳化。第二次加强注射之后，每次注射后1周从兔耳缘静脉采集血样，在室温下静置1h，然后在4℃温度下以5000r·min^-1转速离心10min，分离得到抗血清，用免疫扩散的方法测定抗血清效价。

2、免疫扩散实验评价抗体效价

为评价上述制得的二鼠李糖脂多克隆抗体和二鼠李糖脂的免疫反应活性，每个血样都采用免疫扩散方法测定其效价。将琼脂(2g)加热溶解于200mL生理盐水中，并在65℃时加入叠氮化钠(最终浓度为0.1％)。当混合物温度降低到50℃时，取3mL滴到30mm×90mm的灭菌玻片上，并冷却凝固形成一层3mm厚的琼脂膜。如图1所示，在琼脂膜上吸出百合花状分布的七个小孔，将上述的抗血清按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32的比例进行稀释，每个稀释液取15μL依次滴在周边的五个孔中，第六孔为生理盐水对照孔，将实施例1制得的二鼠李糖脂人工抗原(15μL，40μg/mL)滴加到中心孔(即第七孔)中。将玻片置于密封的湿盒中，37℃培养24h，观察形成的沉淀线。当二鼠李糖脂多克隆抗体在凝胶基底中向其特定抗原扩散时，能够在最佳浓度处形成肉眼可见的沉淀线，和中心孔间有沉淀线的周边小孔中具有的最高稀释度即为效价。实验中我们发现，抗血清的效价随着免疫进程而升高，免疫第8周时免疫抗血清免疫扩散分析图如图1所示，由图1可见1∶16的小孔和中心孔间有沉淀线(而1∶32的孔间没有)，因此在距首次注射第8周时免疫扩散反应测定的抗血清效价达到1∶16。

3、采血分离抗血清

当免疫扩散实验评价的抗体效价达到1∶16时，从兔颈动脉一次性放血采集60mL兔血，按照上述方法分离血清即得到本发明的二鼠李糖脂多克隆抗体，加入0.1％的叠氮化钠于-20℃温度下贮存。

4、免疫扩散实验考察抗血清对于二鼠李糖脂的特异性

由于本实施例实际发酵样品中的铜绿假单胞菌能够产生结构相似的单鼠李糖脂和二鼠李糖脂，能够高度精确地识别出不同分子结构之间的差异是免疫分析的优势。为证明本发明的二鼠李糖脂多克隆抗体对于二鼠李糖脂的高度特异性，我们采用自行设计的琼脂双向免疫扩散实验考察抗血清对于二鼠李糖脂的特异性。其中琼脂膜样品孔布局为：二排孔，每排四个，孔径为2.5mm，排距4mm。第一排孔各加15μL稀释度为1∶50的免疫第8周时的抗血清，第二排孔分别加15μL的二鼠李糖脂人工抗原溶液(40μg mL^-1)、15μL的二鼠李糖脂人工抗原溶液(40μg mL^-1)与二鼠李糖脂溶液(500μg mL^-1)的混合液、15μL的二鼠李糖脂人工抗原溶液(40μg mL^-1)与单鼠李糖脂溶液(500μg mL^-1)的混合液及15μL的空白样本稀释液。将玻片置于密封的湿盒中，37℃培养24h，观察形成的沉淀线，结果如图2所示。由图2可见，A和C列孔间的沉淀线较弱，而B列孔间沉淀线较强，说明当二鼠李糖脂人工抗原溶液中二鼠李糖脂的加入使抗原-抗体沉淀量增加。这可能是因为抗血清中的抗体为多克隆抗体，可以和抗原的多个位点结合；二鼠李糖脂虽然本身分子量较小，但可以和偶联体一起使抗原抗体相互交联而形成沉淀。抗血清中的抗体不能识别单鼠李糖脂，因此其沉淀量没有增加。以上免疫扩散实验结果证明，抗血清中的抗体不能识别单鼠李糖脂，对二鼠李糖脂具有特异性。单鼠李糖脂不会干扰该抗体对二鼠李糖脂的检测。

实施例3：

酶联免疫试纸及其制备和检测

1、酶联免疫试纸的制备

剪取适当大小的两条硝酸纤维素膜条(条状，宽度10mm)，用直径4mm的打孔器于每条硝酸纤维素膜条的光面间隔压环印得到五个加样孔，用空白样本稀释液(本实施例中的样本稀释液为pH值7.4的PBS缓冲液)浸泡10min，取出后甩干，自然干燥。在每个加样孔的中央点加3μL、浓度为100mg·L^-1的二鼠李糖脂人工抗原溶液，于37℃条件下固定10～30min(至完全干燥)，使二鼠李糖脂人工抗原与硝酸纤维素膜条充分结合。再将该膜条浸泡于50mL的封闭液(质量浓度为1％的BSA溶液)中，37℃条件下孵育2h，期间摇动3～4次，以封闭膜条上剩余的蛋白质结合位点，用洗涤液漂洗三次，每次3min，自然干燥，制成酶联免疫试纸，于4℃或-20℃下保存。本实施例的优选工艺参数是通过酶联免疫试纸的棋盘实验得到。

通过上述方法制得的本发明的酶联免疫试纸是以硝酸纤维素膜为载体(条状，宽度10mm)，该载体上设有五个加样孔，每个加样孔(4mm直径)中附着有0.3μg的二鼠李糖脂人工抗原，加样孔周围的蛋白质结合位点附着有牛血清蛋白。

2、用酶联免疫试纸检测二鼠李糖脂

检测样品时，将含有不同浓度二鼠李糖脂的样本稀释液分别与按1∶500稀释度进行稀释后的抗血清等体积混合，振荡均匀，37℃条件下预培育40min，于本实施例步骤1制得的酶联免疫试纸上，每个加样孔中滴加3μL的混合液，37℃条件下竞争免疫反应40min，然后用洗涤液漂洗四次，每次5min，洗涤液为PBST缓冲液(含有0.05％吐温80的PBS缓冲液，pH值为7.4)。将漂洗后的酶联免疫试纸浸泡于按1∶800稀释度进行稀释后的HRP-Ganti-RIgG溶液中，37℃孵育30min后，用洗涤液(同上)漂洗四次，每次5min。将漂洗后的酶联免疫试纸置于新鲜配制的显色剂中，室温下避光15min，蒸馏水漂洗3次终止反应。然后取出试纸置于干净的滤纸上自然干燥，记录试验结果，避光保存。本实施例的优选工艺参数是通过酶联免疫试纸的棋盘实验得到，试纸条上的阳性斑点显色清晰、深浅适宜，效果较好。

本实施例用到的显色剂组分为Tris-HCl缓冲液(含有二氨基联苯胺四盐酸(DAB)1g·L^-1，H₂O₂0.03％，pH值为7.5)。

3、检测分析及检测结果

目测试纸结果，阴性反应试纸不显色，如出现明显、规则的棕色斑点者判定为阳性，并且斑点颜色的深浅随样品中二鼠李糖脂浓度的高低而变化。采用上述酶联免疫试纸检测不同浓度的二鼠李糖脂样本稀释液的结果如图3所示。由图3可见，当待测样本稀释液中二鼠李糖脂浓度为0时，酶联免疫试纸上的抗原和抗血清反应，显示较强的阳性；当待测样本稀释液中二鼠李糖脂浓度为0.05mg·L^-1时，斑点颜色变化明显，随着待测样本稀释液中二鼠李糖脂浓度的增加，阳性逐渐减弱，斑点颜色变浅，其斑点颜色深浅和待测样本稀释液中二鼠李糖脂浓度呈现负相关性。同一次实验中相同稀释度的待测样本稀释液设立重复组，不同实验日对相同样本稀释液进行重复试验，结果完全一致。因此，本发明研制的酶联免疫试纸对二鼠李糖脂浓度的测定简便易行且准确有效。

由图3也可看出，本发明的酶联免疫试纸可用于肉眼检测浓度低至0.05mg·L^-1的二鼠李糖脂，可重复性良好，有望成为快速、简便的测定环境中微生物代谢产生的二鼠李糖脂的方法，有利于对大量样品进行快速检测，为定量分析微生物降解代谢系统中的生物表面活性剂提供了更方便快捷的新途径。

Claims (10)

1.一种二鼠李糖脂人工抗原的制备方法，包括以下步骤：以二鼠李糖脂为半抗原，以牛血清蛋白为人工抗原载体，利用碳化二亚胺法将所述二鼠李糖脂与牛血清蛋白进行交联，所述碳化二亚胺、二鼠李糖脂和牛血清蛋白的质量比为1∶(5～7)∶(15～20)，交联完成后制得二鼠李糖脂人工抗原。

2.根据权利要求1所述的二鼠李糖脂人工抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：将所述5～7质量份的二鼠李糖脂、1质量份的碳化二亚胺溶解于N，N-二甲基甲酰胺和磷酸盐缓冲液的混合液中，超声混合，然后将溶解有15～20质量份牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液添加到所述超声混合后的溶液中，在无光条件下进行搅拌，搅拌过程中通惰性气体保护，然后静置，再将静置后的溶液与生理盐水混合并反复进行透析，最后冷冻干燥得到二鼠李糖脂人工抗原。

3.一种二鼠李糖脂多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：将权利要求1或2所述制备方法制得的二鼠李糖脂人工抗原乳化，再免疫动物，然后利用免疫扩散方法测定该动物抗血清的效价，当效价达到1∶16以上的稀释倍数值时采血，分离抗血清，得到二鼠李糖脂多克隆抗体。

4.一种基于二鼠李糖脂多克隆抗体的酶联免疫试纸，其特征在于，所述酶联免疫试纸是以硝酸纤维素膜为载体，所述载体上设有一个以上的加样孔，每个加样孔中附着有0.24～0.5μg的权利要求1或2所述制备方法制得的二鼠李糖脂人工抗原，所述加样孔周围的蛋白质结合位点附着有牛血清蛋白。

5.一种如权利要求4所述的酶联免疫试纸的制备方法，包括以下步骤：以硝酸纤维素膜为载体，在所述载体上压印加样孔，用空白样本稀释液浸泡所述载体后干燥，然后在所述加样孔中固定所述的二鼠李糖脂人工抗原，再用牛血清蛋白溶液封闭所述载体上剩余的蛋白质结合位点，洗涤、干燥后制得酶联免疫试纸。

6.根据权利要求5所述的酶联免疫试纸的制备方法，其特征在于，在所述加样孔中固定所述的二鼠李糖脂人工抗原是指：在单个加样孔中滴加3～5μL浓度为80～100mg·L^-1的二鼠李糖脂人工抗原溶液，再于35℃～40℃下干燥10～30min，完成固定。

7.根据权利要求5或6所述的酶联免疫试纸的制备方法，其特征在于，用牛血清蛋白溶液封闭所述载体上剩余的蛋白质结合位点是指：将固定有二鼠李糖脂人工抗原后的载体浸泡于质量浓度为1％～2％的牛血清蛋白溶液中，于35℃～40℃下孵育1～2h，完成封闭。

8.一种如权利要求4所述的酶联免疫试纸的检测方法，包括以下步骤：将不同浓度的二鼠李糖脂样本稀释液分别与含有权利要求3所述二鼠李糖脂多克隆抗体的抗血清混合预培育，将预培育后的混合液滴加到所述酶联免疫试纸的加样孔中，加样孔中固定的二鼠李糖脂人工抗原、待测二鼠李糖脂样本稀释液中的二鼠李糖脂和所述二鼠李糖脂多克隆抗体之间进行竞争免疫反应，反应完成后洗涤，酶联显色，根据所述酶联免疫试纸上斑点颜色深浅与所述二鼠李糖脂样本稀释液浓度的负相关特性，确定出二鼠李糖脂样本稀释液中的二鼠李糖脂浓度大小。

9.根据权利要求8所述的酶联免疫试纸的检测方法，其特征在于，所述抗血清是指按1∶(500～600)的稀释度稀释后的抗血清，所述抗血清与二鼠李糖脂样本稀释液是等体积混合，所述混合预培育的时间为40～60min；所述酶联显色是指：将洗涤后的酶联免疫试纸浸泡于按1∶(800～1000)稀释度稀释后的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G溶液中，35℃～40℃温度下孵育20～30min，漂洗干净后再将所述酶联免疫试纸置于新鲜配制的显色剂中，室温下避光10～15min，再用蒸馏水漂洗，自然干燥，完成酶联显色。

10.根据权利要求8或9所述的酶联免疫试纸的检测方法，其特征在于，所述酶联免疫试纸的单个加样孔中，混合液的滴加量为3μL～5μL，所述竞争免疫反应的时间为40～60min，竞争免疫反应的温度为35℃～40℃。

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