发明内容
本发明的目的是公开一种罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备方法,该方法工艺简单,成本低;
本发明的另一个目的是要为罗汉果甜苷V特异性抗血清提供一种快捷、准确的检测方法。
本发明所述罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的制备方法,包括如下步骤:
1)制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯-牛血清蛋白复合物(简写为罗汉果甜苷V-HS-BSA),其分子结构式为:
经红外光谱和紫外光谱确定其结合比在25.9~61.7之间;
2)动物免疫:实验动物选用雌性BALB/c 小鼠,实验免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS-BSA的剂量为100μg/只,用PH7.2 PBS溶液稀释抗原,首次免疫加等量弗氏佐剂,制成乳化剂,腹腔注射,2周后追加免疫加等量弗氏不完全佐剂,制成乳化剂,腹腔注射,以后每隔2周腹腔注射上述浓度为200μg/ml的人工抗原0.5ml,共加强免疫3次;
3)抗血清的制备:末次免疫后3天摘除眼球采血,3000rpm离心5分钟,收集血清-20℃保存即成。
所述罗汉果苷V-HS-BSA,采用如下方法制成:
1)取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中,加入新蒸馏吡啶,搅拌溶解,加入适量的4-二甲基氨基吡啶,于室温下反应;
2)用TLC监测反应进度,反应结束,得到反应液;
3) 取步骤2)的反应液,不分离,加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺,搅拌反应;
4)搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液(10mgBSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液),加完后继续反应,反应中用碳酸缓冲液调pH值为9,于室温反应5小时;
5)反应液过滤,滤液装入透析袋,用超纯水于4℃透析,每5小时换水一次,透析3天,经冷冻干燥,得偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原,置于-20℃下保存。
一种罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的检测方法,包括如下步骤:
1)制备包被用的人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯-人血清蛋白复合物(简写为罗汉果甜苷V-HS-HSA),其分子结构式为:
经红外光谱和紫外光谱确定其结合比在38.1~90.3之间;
2)采用间接酶联免疫吸附分析法,按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价;
将罗汉果甜苷V-HS-HSA用碳酸缓冲液稀释为1μg/ml,每孔加100ml,4℃过夜,用PBST溶液洗涤三次,每次3min,每孔加5%脱脂牛奶封闭液300μl,37℃温箱lh,洗涤同上,将阳性血清作不同浓度的稀释后顺序加入,每孔100μl ,每块板同时设空白对照,阴性对照,37 ℃ 温箱1h,洗涤同上,用PBST溶液将HRP标记羊抗鼠IgG稀释到1︰1000倍,每孔加入100μl,37 ℃ 温箱1h,洗涤同上,每孔加新鲜配制的ABTS底物显色剂100 μl,37℃温箱25min,测定OD 值;
3)检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应:用罗汉果甜苷V的标准品溶液系列稀释罗汉果甜苷V抗血清,用竞争ELISA法 测OD 值,并与同稀释度的抗血清的OD 值比较;
4)以罗汉果甜苷V-HS-HSA作包被原进行筛选:分别以罗汉果甜苷V-HS-HSA、BSA 、HSA 包被酶联反应板,在同一稀释度下,观察血清对罗汉果甜苷V-HS-HSA、BSA、HAS的反应。
所述罗汉果甜苷V-HS-HSA,采用如下方法制成:
1)取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中,加入新蒸馏吡啶,搅拌溶解,加入适量的4-二甲基氨基吡啶,于室温下反应;
2)用TLC监测反应进度,反应结束,得到反应液;
3) 取步骤2)的反应液,不分离,加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺,搅拌反应10min;
4)搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液(10mgHSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液),加完后继续反应,反应中用碳酸缓冲液调pH值为9,于室温反应5小时;
5)反应液过滤,滤液装入透析袋,用超纯水于4℃透析,每5小时换水一次,透析3天,经冷冻干燥,得罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原,置于-20℃下保存。
本发明的优点是:
1、罗汉果甜苷V特异性抗血清制备方法简单;
2、检测罗汉果甜苷V特异性抗血清的方法可靠。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明,应该理解的是,这些实施例仅用于例证的目的,绝不限制本发明的范围。实施例中的主要试剂:
罗汉果甜苷V-HS-BSA,结合比在25.9~61.7之间
罗汉果甜苷V-HS-HSA,结合比在38.1~90.3之间
弗氏完全佐剂,Sigma公司生产
弗氏不完全佐剂,Sigma公司生产
牛血清蛋白,Sigma公司生产
人血清蛋白,Sigma公司生产
HRP标记羊抗鼠IgG,北京博奥森生物技术有限公司生产
ABTS,Sigma公司生产
碳酸缓冲液:Na2CO33.18g,NaHCO35.8g加蒸馏水至1000ml
PBS溶液:NaCL8g,KCL0.2g,Na2HPO4 1.44g,KH2PO40.24g加蒸馏水至1000ml
PBST溶液:PBS溶液1000ml,吐温20试剂0.5ml
实施例1:
罗汉果甜苷V抗血清的制备方法,包括如下步骤:
(1)制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS-BSA:
1)称取罗汉果甜苷V30.5mg(0.024mmol)、丁二酸酐23.6mg(0.236mmol)投入反应瓶中,加入新蒸吡啶3ml,搅拌溶解,加入适量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP),于常温下反应3天;
2)用TLC监测反应进度,反应结束,得到反应液;
3)取反应液,不分离,加入适量(具体量)N,N-二环己基碳二酰亚胺,搅拌反应10min;
4)搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液(10mgBSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液),加完后继续反应,反应中用碳酸缓冲液调PH值为9,于常温反应5小时;
5)反应液过滤,滤液装入透析袋,用纯净水于4℃透析,每5小时换水一次,透析3天,经冷冻干燥,得15.20mg 偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原,置于-20℃下保存备用;
(2)动物免疫:取300μg罗汉果甜苷V-HS-BSA,用PBS溶液稀释为3ml,加等量弗氏佐剂,制成乳化剂,腹腔注射免疫14-16g雌性BALB/c 小鼠3只。两周后取300μg罗汉果甜苷V-HS-BSA,加等量弗氏不完全佐剂,制成乳化剂,腹腔注射追加免疫。以后每隔两周腹腔注射200μg/ml罗汉果甜苷V-HS-BSA0.5ml,共注射3次。
(3)抗血清的制备:最后一次免疫后3天摘除眼球采血,3000rpm离心5分钟,收集血清-20℃保存。
如图1、3所示,步骤5)所述得罗汉果甜苷V-HS-BSA抗原用红外光谱(IR)和紫外光谱(UV)鉴定。分别测得BSA、罗汉果甜苷V-HS、罗汉果甜苷V-HS与BSA的偶联物(罗汉果甜甙V-HS-BSA人工抗原)的紫外光谱,罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原的紫外光谱最大吸收峰与BSA和罗汉果甜苷V-HS相比均发生了变化,初步说明人工抗原合成获得成功。以KBr压片,测出罗汉果甜苷V-HS、BSA、罗汉果甜甙V-HS-BSA人工抗原的红外光谱。从红外光谱中可以看出,罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原及BSA的红外光谱在3600~3200cm-1区域具有相似的吸收,这是蛋白质中氨基酸产生的特征峰,说明合成的偶联产物具有BSA的特征官能团。BSA在800~1000cm-1处没有吸收峰存在,而偶联产物的红外光谱在1067.4cm-1、1163.3cm-1处有较中强吸收峰存在,具有罗汉果甜苷V-HS的部分吸收峰特征,说明偶联产物有罗汉果甜苷V结构部分;进一步比较偶联产物与罗汉果甜苷V-HS的红外光谱,偶联产物结构中仍有1740.7cm-1峰(酯C=O伸缩振动峰),而-COOH羰基峰消失,推测-COOH与BSA中的氨基反应,据此进一步说明罗汉果甜苷V-HS与BSA偶联成功。
结合比的计算:
准确称取罗汉果甜苷V-HS(A)、BSA(B)、罗汉果甜苷V-HS与BSA的偶联物(C),用同一碳酸盐缓冲液配成确切的浓度。然后分别测定3种溶液在A物质和B物质最大吸收峰波长处(紫外扫描得)吸收值,即AAam、AAbm、ABam、ABbm、ACam、ACbm。计算出A物质和B物质吸收峰波长处的摩尔吸光系数,即KAam、KAbm;以及B物质在A和B吸收峰波长处的摩尔吸光系数,即KBam、KBbm。按以下公式计算A物质和B物质的摩尔分子比:
结合比=(ACam×KBbm-ACbm×KBam)/( ACbm×KAam-ACam×KAbm)
结合比=25.9~61.7
实施例2
罗汉果甜苷V特异性抗血清检测方法,包括如下步骤:
(1)制备包被用的人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯-人血清蛋白复合物:
1)称取罗汉果甜苷V30.5mg(0.024mmol)、丁二酸酐23.6mg(0.236mmol)投入反应瓶中,加入新蒸吡啶3ml,搅拌溶解,加入适量的4-二甲基氨基吡啶(DMAP),于常温下反应3天;
2)用TLC监测反应进度,反应结束,得到反应液;
3)取反应液,不分离,加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺,搅拌反应10min;
4)搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液(10mgHSA溶于1mlNa2CO3-NaHCO3缓冲液),加完后继续反应,反应中用碳酸缓冲液调PH值为9,于常温反应5小时;
5)反应液过滤,滤液装入透析袋,用纯净水于4℃透析,每5小时换水一次,透析3天,经冷冻干燥,得14.5mg 罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原,置于-20℃下保存;
(2)采用间接酶联免疫吸附分析法(间接ELISA 法),按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价:
将罗汉果甜苷V-HS-HSA用碳酸缓冲液稀释为1μg/ml,每孔加100ml,4℃过夜,用PBST溶液洗涤三次,每次3min;每孔加5%脱脂牛奶封闭液300μl,37℃温箱lh,洗涤同上,将阳性血清用PBST溶液作1:1000 、l:2000 、l:4000 、1:5000 、l:16000、1:32000、1:64000、1:128000 稀释后顺序加入,每孔100μl ,将未免疫BALB/c 小鼠血清按以上稀释方法稀释后顺序加入,每孔100μl作为阴性对照,将PBST溶液每孔加入100μl作为空白对照, 37 ℃ 温箱1h,洗涤同上,用PBST溶液将HRP标记羊抗鼠IgG稀释到1:1000倍,每孔加入100μl,37 ℃ 温箱1h,洗涤同上,每孔加新鲜配制的ABTS底物显色剂100 μl,37℃温箱25min,测定OD 值;
判定标准:阳性血清OD 值在1.0 左右,同时与阴性血清OD 值差距最大的抗体稀释度为最佳工作浓度,以空白孔调零,待测孔OD 值大于或等于阴性对照孔的2.1 倍为阳性,阳性值中对应的最大稀释倍数即为血清效价; 试验结果如表1所示:根据方阵法确定ELISA 方法的最佳阳性血清的最佳稀释度为1:8000,血清效价为1:32000;
表1 血清最佳稀释度和效价测定结果
注:1-3加阳性鼠血清;4加阴性鼠血清;5加空白溶剂
2.2检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应的效果:将罗汉果甜苷V-HS-HSA用碳酸缓冲液稀释为1μg/ml,每孔加100ml,4℃过夜,用PBST溶液洗涤三次,每次3min,每孔加5%脱脂牛奶封闭液300μl,37℃温箱lh,洗涤同上,将1号小鼠罗汉果甜苷V抗血清用50μg/ml罗汉果甜苷V的标准品PBST溶液作1:1000 、l:2000 、l:4000 、1:5000 、l:16000、1:32000、1:64000、1:128000 稀释后顺序加入,每孔100μl ,将未免疫BALB/c 小鼠血清按以上稀释方法稀释后顺序加入,每孔100μl作为阴性对照,将PBST溶液每孔加入100μl作为空白对照, 37 ℃ 温箱1h,洗涤同上;用PBST溶液将HRP标记羊抗鼠IgG稀释到1:1000倍,每孔加入100μl,37 ℃ 温箱1h,洗涤同上;每孔加新鲜配制的ABTS底物显色剂100 μl,37℃温箱25min,测定OD 值,并与同稀释度的用PBST溶液稀释的1号小鼠抗血清的OD 值比较,OD 值降低,表明罗汉果甜苷V 对罗汉果甜苷V抗体有明显的抑制反应(见表2 );从而证实免疫抗原的偶联反应是成功的;
表2 罗汉果甜苷苷V对抗体的抑制反应
2.3检测可行性分析方法的建立 分别以罗汉果甜苷V-HS-HSA、BSA 、HSA 包被酶联反应板,在同一稀释度下,血清对罗汉果甜苷V-HS-HSA、BSA呈阳性反应(OD 值大于或等于阴性对照孔的2.1 倍),而对HSA 则呈阴性反应,说明BSA 、HAS交叉反应性低,即用罗汉果甜苷丁二酸酯-BSA 作免疫原免疫小鼠,而用罗汉果甜苷V-HS-HSA作为包被原建立筛选方法是可行的(见表3 );
表3 筛选方法的可行性分析
如图2、4所示,步骤5)所得的罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原经用红外光谱和紫外光谱鉴定,结合比=38.1~90.3之间,鉴定方法同实施例1的罗汉果苷V-HS-BSA人工抗原。