CN102146116A - 罗汉果甜苷v特异性抗血清的制备及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备及检测方法，该方法用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－牛血清蛋白复合物免疫BALB/c小鼠，末次免疫后3天摘除眼球采血，3000rpm离心5分钟，收集血清-20℃保存制得罗汉果甜苷V抗血清；用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－人血清蛋白复合物为包被抗原，采用间接酶联免疫吸附分析法和按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价，检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应，筛选确定罗汉果甜苷V特异性抗血清。本发明的优点是：罗汉果甜苷V特异性抗血清制备方法简单；检测罗汉果甜苷V特异性抗血清的方法可靠。

Description

罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备及检测方法

技术领域

本发明涉及小分子化合物免疫化学和免疫分析技术，具体是一种罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备及检测方法。

背景技术

利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的特性，定量地检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。目标分析物分子免疫学特性以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性是该领域极为重要的研究内容。我国是中药饮片和中药提取物使用大国，传统的药物分析方法主要是依靠气相色谱（GC )、液相色谱（HPLC ）或质谱等物化分析手段，定性定量分析中药材和中药提取物有效成分的含量。由于传统的理化分析方法通常繁琐复杂，样品前处理过程复杂、工作量大、仪器昂贵、要求有熟练的技术人员及较长的分析周期，因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及价廉的检测技术能在实验室内和野外进行大批量的检测。免疫分析法正具备这些优点，将开创药物分析的新纪元。

发明内容

本发明的目的是公开一种罗汉果甜苷V特异性抗血清的制备方法，该方法工艺简单，成本低；

本发明的另一个目的是要为罗汉果甜苷V特异性抗血清提供一种快捷、准确的检测方法。

本发明所述罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的制备方法，包括如下步骤：

1）制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－牛血清蛋白复合物（简写为罗汉果甜苷V-HS-BSA），其分子结构式为：

经红外光谱和紫外光谱确定其结合比在25.9~61.7之间；

2）动物免疫：实验动物选用雌性BALB/c 小鼠，实验免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS－BSA的剂量为100μg/只，用PH7.2 PBS溶液稀释抗原，首次免疫加等量弗氏佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，2周后追加免疫加等量弗氏不完全佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，以后每隔2周腹腔注射上述浓度为200μg/ml的人工抗原0.5ml，共加强免疫3次；

3）抗血清的制备：末次免疫后3天摘除眼球采血，3000rpm离心5分钟，收集血清-20℃保存即成。

所述罗汉果苷V-HS-BSA，采用如下方法制成：

1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；

2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；

3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应；

4）搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液（10mgBSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液），加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；

5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存。

一种罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的检测方法，包括如下步骤：

1）制备包被用的人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－人血清蛋白复合物（简写为罗汉果甜苷V-HS-HSA），其分子结构式为：

经红外光谱和紫外光谱确定其结合比在38.1~90.3之间；

2）采用间接酶联免疫吸附分析法，按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价；

将罗汉果甜苷V-HS-HSA用碳酸缓冲液稀释为1μg/ml，每孔加100ml,4℃过夜，用PBST溶液洗涤三次，每次3min，每孔加5%脱脂牛奶封闭液300μl,37℃温箱lh，洗涤同上，将阳性血清作不同浓度的稀释后顺序加入，每孔100μl ，每块板同时设空白对照，阴性对照，37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，用PBST溶液将HRP标记羊抗鼠IgG稀释到1︰1000倍，每孔加入100μl,37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，每孔加新鲜配制的ABTS底物显色剂100 μl,37℃温箱25min,测定OD 值；

3）检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应：用罗汉果甜苷V的标准品溶液系列稀释罗汉果甜苷V抗血清，用竞争ELISA法 测OD 值，并与同稀释度的抗血清的OD 值比较；

4）以罗汉果甜苷V-HS-HSA作包被原进行筛选：分别以罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA 、HSA 包被酶联反应板，在同一稀释度下，观察血清对罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA、HAS的反应。

所述罗汉果甜苷V-HS-HSA，采用如下方法制成：

1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；

2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；

3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应10min；

4）搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液（10mgHSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液），加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；

5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，置于-20℃下保存。

本发明的优点是：

1、罗汉果甜苷V特异性抗血清制备方法简单；

2、检测罗汉果甜苷V特异性抗血清的方法可靠。

附图说明

图1为BSA、罗汉果甜苷V-HS和罗汉果甜苷V-HS-BSA抗原紫外扫描光谱图；

图2为HSA、罗汉果甜苷V-HS和罗汉果甜苷V-HS-HSA抗原紫外扫描光谱图；

图3为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原红外光谱图；

图4为罗汉果甜苷V-HS-HAS人工抗原红外光谱图。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。实施例中的主要试剂：

罗汉果甜苷V-HS-BSA，结合比在25.9~61.7之间

罗汉果甜苷V-HS-HSA，结合比在38.1~90.3之间

弗氏完全佐剂，Sigma公司生产

弗氏不完全佐剂，Sigma公司生产

牛血清蛋白，Sigma公司生产

人血清蛋白，Sigma公司生产

HRP标记羊抗鼠IgG，北京博奥森生物技术有限公司生产

ABTS，Sigma公司生产

碳酸缓冲液：Na₂CO₃3.18g，NaHCO₃5.8g加蒸馏水至1000ml

PBS溶液：NaCL8g，KCL0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄0.24g加蒸馏水至1000ml

PBST溶液：PBS溶液1000ml，吐温20试剂0.5ml

实施例1：

罗汉果甜苷V抗血清的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS－BSA：

1）称取罗汉果甜苷V30.5mg（0.024mmol）、丁二酸酐23.6mg（0.236mmol）投入反应瓶中，加入新蒸吡啶3ml，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于常温下反应3天；

2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；

3）取反应液，不分离，加入适量（具体量）N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应10min；

4）搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液（10mgBSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液），加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调PH值为9，于常温反应5小时；

5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用纯净水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得15.20mg 偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存备用；

（2）动物免疫：取300μg罗汉果甜苷V-HS-BSA，用PBS溶液稀释为3ml，加等量弗氏佐剂，制成乳化剂，腹腔注射免疫14-16g雌性BALB/c 小鼠3只。两周后取300μg罗汉果甜苷V-HS-BSA，加等量弗氏不完全佐剂，制成乳化剂，腹腔注射追加免疫。以后每隔两周腹腔注射200μg/ml罗汉果甜苷V-HS-BSA0.5ml，共注射3次。

（3）抗血清的制备：最后一次免疫后3天摘除眼球采血，3000rpm离心5分钟，收集血清-20℃保存。

如图1、3所示，步骤5）所述得罗汉果甜苷V-HS-BSA抗原用红外光谱（IR）和紫外光谱（UV）鉴定。分别测得BSA、罗汉果甜苷V-HS、罗汉果甜苷V-HS与BSA的偶联物（罗汉果甜甙V-HS-BSA人工抗原）的紫外光谱，罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原的紫外光谱最大吸收峰与BSA和罗汉果甜苷V-HS相比均发生了变化，初步说明人工抗原合成获得成功。以KBr压片，测出罗汉果甜苷V-HS、BSA、罗汉果甜甙V-HS-BSA人工抗原的红外光谱。从红外光谱中可以看出，罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原及BSA的红外光谱在3600～3200cm^-1区域具有相似的吸收，这是蛋白质中氨基酸产生的特征峰，说明合成的偶联产物具有BSA的特征官能团。BSA在800～1000cm^-1处没有吸收峰存在，而偶联产物的红外光谱在1067.4cm^-1、1163.3cm^-1处有较中强吸收峰存在，具有罗汉果甜苷V-HS的部分吸收峰特征，说明偶联产物有罗汉果甜苷V结构部分；进一步比较偶联产物与罗汉果甜苷V-HS的红外光谱，偶联产物结构中仍有1740.7cm^-1峰（酯C=O伸缩振动峰），而-COOH羰基峰消失，推测-COOH与BSA中的氨基反应，据此进一步说明罗汉果甜苷V-HS与BSA偶联成功。

结合比的计算：

准确称取罗汉果甜苷V-HS（A）、BSA（B）、罗汉果甜苷V-HS与BSA的偶联物（C），用同一碳酸盐缓冲液配成确切的浓度。然后分别测定3种溶液在A物质和B物质最大吸收峰波长处（紫外扫描得）吸收值，即AA_am、AA_bm、AB_am、AB_bm、AC_am、AC_bm。计算出A物质和B物质吸收峰波长处的摩尔吸光系数，即KA_am、KA_bm；以及B物质在A和B吸收峰波长处的摩尔吸光系数，即KB_am、KB_bm。按以下公式计算A物质和B物质的摩尔分子比：

结合比=（AC_am×KB_bm－AC_bm×KB_am）/( AC_bm×KA_am－AC_am×KA_bm)

结合比=25.9~61.7

实施例2

罗汉果甜苷V特异性抗血清检测方法，包括如下步骤：

（1）制备包被用的人工抗原罗汉果甜苷V-丁二酸酯－人血清蛋白复合物：

1）称取罗汉果甜苷V30.5mg（0.024mmol）、丁二酸酐23.6mg（0.236mmol）投入反应瓶中，加入新蒸吡啶3ml，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶（DMAP），于常温下反应3天；

2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；

3）取反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应10min；

4）搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液（10mgHSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液），加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调PH值为9，于常温反应5小时；

5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用纯净水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得14.5mg 罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，置于-20℃下保存；

（2）采用间接酶联免疫吸附分析法（间接ELISA 法），按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价：

将罗汉果甜苷V-HS-HSA用碳酸缓冲液稀释为1μg/ml，每孔加100ml,4℃过夜，用PBST溶液洗涤三次，每次3min；每孔加5%脱脂牛奶封闭液300μl,37℃温箱lh，洗涤同上，将阳性血清用PBST溶液作1:1000 、l:2000 、l:4000 、1:5000 、l:16000、1：32000、1:64000、1:128000 稀释后顺序加入，每孔100μl ，将未免疫BALB/c 小鼠血清按以上稀释方法稀释后顺序加入，每孔100μl作为阴性对照，将PBST溶液每孔加入100μl作为空白对照， 37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，用PBST溶液将HRP标记羊抗鼠IgG稀释到1:1000倍，每孔加入100μl,37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，每孔加新鲜配制的ABTS底物显色剂100 μl,37℃温箱25min,测定OD 值；

判定标准：阳性血清OD 值在1.0 左右，同时与阴性血清OD 值差距最大的抗体稀释度为最佳工作浓度，以空白孔调零，待测孔OD 值大于或等于阴性对照孔的2.1 倍为阳性，阳性值中对应的最大稀释倍数即为血清效价；     试验结果如表1所示：根据方阵法确定ELISA 方法的最佳阳性血清的最佳稀释度为1:8000,血清效价为1:32000；

表1   血清最佳稀释度和效价测定结果

注：1-3加阳性鼠血清；4加阴性鼠血清；5加空白溶剂

2.2检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应的效果：将罗汉果甜苷V-HS-HSA用碳酸缓冲液稀释为1μg/ml，每孔加100ml,4℃过夜，用PBST溶液洗涤三次，每次3min，每孔加5%脱脂牛奶封闭液300μl,37℃温箱lh，洗涤同上，将1号小鼠罗汉果甜苷V抗血清用50μg/ml罗汉果甜苷V的标准品PBST溶液作1:1000 、l:2000 、l:4000 、1:5000 、l:16000、1：32000、1:64000、1:128000 稀释后顺序加入，每孔100μl ，将未免疫BALB/c 小鼠血清按以上稀释方法稀释后顺序加入，每孔100μl作为阴性对照，将PBST溶液每孔加入100μl作为空白对照， 37 ℃ 温箱1h，洗涤同上；用PBST溶液将HRP标记羊抗鼠IgG稀释到1:1000倍，每孔加入100μl,37 ℃ 温箱1h，洗涤同上；每孔加新鲜配制的ABTS底物显色剂100 μl,37℃温箱25min,测定OD 值，并与同稀释度的用PBST溶液稀释的1号小鼠抗血清的OD 值比较，OD 值降低，表明罗汉果甜苷V 对罗汉果甜苷V抗体有明显的抑制反应（见表2 ）；从而证实免疫抗原的偶联反应是成功的；

表2   罗汉果甜苷苷V对抗体的抑制反应

2.3检测可行性分析方法的建立     分别以罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA 、HSA 包被酶联反应板，在同一稀释度下，血清对罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA呈阳性反应（OD 值大于或等于阴性对照孔的2.1 倍），而对HSA 则呈阴性反应，说明BSA 、HAS交叉反应性低，即用罗汉果甜苷丁二酸酯-BSA 作免疫原免疫小鼠，而用罗汉果甜苷V-HS－HSA作为包被原建立筛选方法是可行的（见表3 ）；

表3  筛选方法的可行性分析

如图2、4所示，步骤5）所得的罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原经用红外光谱和紫外光谱鉴定，结合比=38.1~90.3之间，鉴定方法同实施例1的罗汉果苷V-HS-BSA人工抗原。

Claims (7)

1.罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的制备方法，包括如下步骤：

  1）制备免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS－BSA，其分子结构式为：

经红外光谱和紫外光谱确定其结合比比在25.9~61.7之间；

2）动物免疫：实验动物选用雌性BALB/c 小鼠，实验免疫用人工抗原罗汉果甜苷V-HS－BSA的剂量为100μg/只，用PH7.2 PBS溶液稀释抗原，首次免疫加等量弗氏佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，2周后追加免疫加等量弗氏不完全佐剂，制成乳化剂，腹腔注射，以后每隔2周腹腔注射上述浓度为200μg/ml的人工抗原0.5ml，共加强免疫3次；

3）抗血清的制备：末次免疫后3天摘除眼球采血，3000rpm离心5分钟，收集血清-20℃保存即成。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述罗汉果苷V-HS-BSA，采用如下方法制成：

1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；

2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；

3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应；

4）搅拌下滴加BSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；

5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得偶联产物为罗汉果甜苷V-HS-BSA人工抗原，置于-20℃下保存。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述的BSA-碳酸缓冲液为10mgBSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。

4.用权利要求1所述制备方法制备的罗汉果甜苷V的特异性抗体血清。

5.一种罗汉果甜苷V的特异性抗体血清的检测方法，包括如下步骤：

1）制备包被用的人工抗原罗汉果甜苷V-HS－HSA，其分子结构式为：

经红外光谱和紫外光谱确定其结合比在38.1~90.3之间；

2）采用间接酶联免疫吸附分析法，按方阵法确定抗血清的最适工作浓度、效价；

将罗汉果甜苷V-HS-HSA用碳酸缓冲液稀释为1μg/ml，每孔加100ml,4℃过夜，用PBST溶液洗涤三次，每次3min，每孔加5%脱脂牛奶封闭液300μl,37℃温箱lh，洗涤同上，将阳性血清作不同浓度的稀释后顺序加入，每孔100μl ，每块板同时设空白对照，阴性对照，37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，用PBST溶液将HRP标记羊抗鼠IgG稀释到1︰1000倍，每孔加入100μl,37 ℃ 温箱1h，洗涤同上，每孔加新鲜配制的ABTS底物显色剂100 μl,37℃温箱25min,测定OD 值；

3）检测罗汉果甜苷V对抗体的抑制反应：用罗汉果甜苷V的标准品溶液系列稀释罗汉果甜苷V抗血清，用竞争ELISA法 测OD 值，并与同稀释度的抗血清的OD 值比较；

4）以罗汉果甜苷V-HS-HSA作包被原进行筛选：分别以罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA 、HSA 包被酶联反应板，在同一稀释度下，观察血清对罗汉果甜苷V-HS－HSA、BSA、HAS的反应。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是：所述罗汉果甜苷V-HS-HSA，采用如下方法制成：

1）取罗汉果甜苷V、丁二酸酐投入反应瓶中，加入新蒸馏吡啶，搅拌溶解，加入适量的4-二甲基氨基吡啶，于室温下反应；

2）用TLC监测反应进度，反应结束，得到反应液；

3） 取步骤2）的反应液，不分离，加入适量N,N-二环己基碳二酰亚胺，搅拌反应10min；

4）搅拌下滴加HSA-碳酸缓冲液，加完后继续反应，反应中用碳酸缓冲液调pH值为9，于室温反应5小时；

5）反应液过滤，滤液装入透析袋，用超纯水于4℃透析，每5小时换水一次，透析3天，经冷冻干燥，得罗汉果甜苷V-HS-HSA人工抗原，置于-20℃下保存。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征是：所述的HSA-碳酸缓冲液为10mgHSA溶于1mlNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液。

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