CN100538354C - 一种检测污水中雌激素活性贡献物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测污水中雌激素活性贡献物的方法，属于污水中有机污染物的检测技术领域。本方法将采集好的污水水样用固相萃取柱萃取富集其中的雌激素活性物质后，分别用甲醇、二氯甲烷和正己烷洗脱和硅胶色谱柱分级为极性、中极性和弱极性三种组份，不同极性的分级组份用重组基因酵母生物测试方法测定其雌激素活性，取雌激素活性最大的组份用气相色谱-质谱联机分析其中的雌激素活性物质种类和浓度。该方法可以快速、有效地检测出污水中主要的雌激素活性贡献物，为污水处理工艺的改进提供基础支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种污水中有机污染物的检测技术领域，特别是涉及污水中痕量雌激素活性贡献物的检测方法。
背景技术
当前，水中的内分泌干扰物引起了国内外的广泛关注，其中具有雌激素活性的内分泌干扰物占据主要的地位。这类物质数以百计，已知的主要包括农药(阿特拉津、滴滴涕、毒杀芬等)、天然雌激素(17-β雌二醇、雌酮等)、表面活性剂(烷基酚聚氧乙烯醚及其代谢产物，如壬基酚、辛基酚等)、药物类(己烯雌酚、炔雌醇等)和工业产品(酞酸酯、双酚A等)。随着工农业的高速发展和城市化建设的加速，这类物质混杂在大量的工业污水和生活污水中，未经有效的污水处理，或直接通过地表径流进入到江、河、湖泊等地表水体，甚至渗透到地下水中，致使以地表水和地下水为水源的饮用水源水受到污染，水源水质明显恶化。虽然这类物质及其在环境作用下产生的次生污染物在污水中的存在水平为μg/L、ng/L级或更低，而且它们对化学需氧量、生化需氧量等常规性有机物监测指标的贡献很小，但这类物质的危害性很大，对人体和生态系统的影响具有隐蔽性、潜在性和滞后性。这类物质绝大多数易在人类和其他动物体内长期积累，即使浓度水平是ng/L级也能表现出较强的雌激素活性而干扰生物体正常的内分泌代谢和生殖机能，如：致癌、代谢紊乱、出生缺陷、生长发育障碍等。目前，这类物质在不同国家和地区的污水进出水中已检出具有较高的浓度，严重地威胁着水生生物的安全，因此，从污水及其处理工艺单元中检测出是否存在这些具有雌激素活性的内分泌干扰物、存在浓度以及这类物质带来的危害都是目前人们关心的问题。
近几年来，雌激素活性物质的仪器检测技术有了较大的提高，如气相色谱-质谱联机(GC-MS)、气相色谱-串联质谱联机(GC-MS/MS)、液相色谱-质谱联机(LC-MS/MS)和液相色谱—核磁共振联机(LC-NMR)等层出不穷。这些方法对于分析雌激素活性物质能够提供较高的灵敏度和精确度。然而，仪器检测不能分析水中雌激素活性物质给生物带来的影响，同时由于仪器检测出的雌激素活性物质比较多，要弄清楚其中的哪些物质给生态环境带来的危害最严重是比较困难的事情。因此，和仪器分析相结合的生物测试方法，如重组基因酵母法、生物标记物等得到发展，并能用于污水中进行雌激素活性的检测。然而，由于水中含有大量的雌激素活性物质的激动剂和拮抗剂，不同结构的雌激素活性物质间存在的相互作用(加和、协同或拮抗)在生物检测时能掩盖真实的雌激素活性效应，因而能导致在辨识主要雌激素活性贡献物时容易出现错误。由于目前国内外污水水质监测指标针对有机污染物的控制主要以其种类和浓度作为导向，应用较多的是采用仪器对污水中的雌激素活性物质进行分级，如：高效液相色谱(HPLC)。虽然这类方法测试比较全面，能对污水中每一种检测到的雌激素活性物质进行分离测试，然而其分级步骤往往取决于色谱检出物质的多少，当检出雌激素活性物质较多时采用的生物测试过程较为繁琐，增大了找到污水中主要雌激素活性贡献物的难度。
发明内容
本发明的目的是针对采用仪器测试为导向的分级技术分析污水中主要雌激素活性贡献物步骤繁琐，分析难度大等不足，拟开发一种较为简单的基于生物测试为导向的分级技术来检测污水中雌激素活性物质，实现对污水中主要雌激素活性贡献物的有效测定。
本发明的技术方案如下：
一种检测污水中雌激素活性贡献物的方法，其特征在于该方法包括如下部分：
1)对采集好的污水水样进行预处理：先用玻璃纤维滤膜过滤水样，然后将过滤后的水样经过固相萃取富集其中的雌激素活性物质，之后将固相萃取小柱冷冻干燥；
2)采用不同极性有机溶剂将雌激素活性物质从固相萃取柱上洗脱下来，采用硅胶色谱柱将雌激素活性物质按相似极性分级，得到极性、中极性和弱极性三种组份；
3)将不同极性的分级组份用重组基因酵母测试技术分析分级组份的雌激素活性；
4)利用气相色谱—质谱联机分析雌激素活性最大组份的物质种类和浓度，找到主要的雌激素活性贡献物。
本发明所述的不同极性的有机溶剂分别为正己烷、二氯甲烷和甲醇。
本发明所述的硅胶色谱柱为上层填充硅胶，下层填充氧化铝的两段式。
本发明采用的重组基因酵母测试方法选择的测试时间为16～20h，其中初始酵母菌在培养基中的质量比浓度为5～10％，培养酵母在600nm下的光密度为1.0～1.5时进行测试。
本发明与已有的以仪器测试为导向的分级技术相比较，具有以下优点及突出性效果：①本方法采用生物测试为导向的分级技术流程简单，能有效地消除不同极性物质间的干扰作用，反映生物测试的真实结果；②仪器测试为导向的分级技术导致检出的雌激素活性物质较多，不易判定其中的主要贡献者，本方法采用的基于生物测试为导向的分级技术能直接针对污水中主要产生雌激素活性的物质进行分析；③本方法测试出主要雌激素活性贡献物有助于污水处理工艺有针对性的改进；④目前的重组基因酵母测试时间比较长，一般为48-72h左右，本方法采用的重组基因酵母测试选择快速培养和测试，缩短测试时间为20h，但不改变测试灵敏度。
附图说明
图1为采用本发明测试典型雌激素活性物质的剂量效应曲线。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
采集好污水瞬时水样或24h混合样，取1L经过0.7μm玻璃纤维滤膜，去除水中的悬浮颗粒物的干扰。过滤后的水样用固相萃取小柱萃取其中的雌激素活性物质，为提高萃取小柱的萃取效率，避免其中水分的干扰，萃取小柱需进行冷冻干燥，用正己烷、二氯甲烷和甲醇洗脱萃取小柱中的雌激素活性物质，合并洗脱液，经两段式硅胶—氧化铝色谱柱，其中硅胶10g、氧化铝10g，用正己烷、二氯甲烷和甲醇分别淋洗硅胶—氧化铝色谱柱，淋洗得到弱极性、中极性和极性三种组份。该分级方法对已知的雌激素活性物质，如：雌二醇、雌酮、双酚A、壬基酚等的回收率在85—95％之间。
将初始浓度为5～10％(重量比)的重组基因酵母在30℃，转速为150rpm的生物培养箱中培养2h后提高转速至200rpm培养14～18h，测定酵母菌OD600处于1.0～1.5。取950μL菌悬液与50μL分级后富集样品均匀混合。每个样品至少做3个平行样。取200μL混合液转移到96孔板中在微量振荡器上30℃下暴露培养2h，转速600rpm。每块96孔板上同时设置阳性对照(雌二醇)和阴性对照(二甲基亚砜)。为避免富集样品对酵母的急性毒性的影响，需要测定菌液与富集样品接触2h后的OD600，和接触前相比OD600没有明显变化时可继续测试，否则需要稀释样品重新进行暴露培养。移取50μL接触2h后的混合液加入120μL缓冲溶液，振荡10min，加入20μL三氯甲烷振荡20min，加入40μL显色剂ONPG(4g/L溶于缓冲溶液)启动酶反应。当有明显的黄色生成时加入100μL Na2CO3(1M)终止酶反应，在酶标仪上测定420nm波长下混合液的上清液的光密度(OD420)，通过公式U＝OD420(S)/OD600(S)—OD420(B)/OD600(B)，绘制剂量效应曲线，计算半有效浓度EC50，雌激素活性当量(EEQ)和雌激素活性当量因子(EEF)。其中，OD420(S)和OD600(S)为水样的光密度，OD420(B)和OD600(B)为阴性对照的光密度。表1为典型雌激素活性物质的EC50和EEF。重组基因酵母检测效能如图1所示，检测限达0.1nM EEQ/L。富集后水样的雌激素活性高于这一检测限均可测试。
根据三种组份的重组基因酵母测试结果，选择雌激素活性最大的组份用GC-MS精确测定其中的雌激素活性物质种类和浓度。根据测定到的雌激素活性物质的浓度和该物质的EEF，通过公式EEQ＝∑Ci×EEFi计算测定物质的EEQ，根据仪器测定物质的EEQ对生物测试EEQ的贡献率，找到污水水样中主要的雌激素活性贡献物。其中，Ci为第i个测定的雌激素活性物质的浓度/μg/L，EEFi为第i个测定的雌激素活性物质的雌激素活性当量因子。
本发明可以快速、准确地找到污水中主要的雌激素活性贡献物，有助于污水处理工艺有针对性的改进。
表1.典型雌激素活性物质的EC50，EEF
利用本发明检测某污水中雌激素活性贡献物的实施例：
选一污水处理厂的典型处理工艺单元，现场采集瞬时水样4L，保存在低温冰箱中带回实验室进行处理分析。取1L经过0.7μm玻璃纤维滤膜，过滤后的水样用沃特斯(Waters)固相萃取小柱萃取其中的雌激素活性物质，萃取小柱冷冻干燥12h，分别用正己烷、二氯甲烷和甲醇洗脱萃取小柱中的雌激素活性物质，合并洗脱液，经两段式硅胶—氧化铝色谱柱，其中硅胶10g、氧化铝10g，填充高度为30cm，分别用正己烷、二氯甲烷和甲醇分别淋洗硅胶—氧化铝色谱柱，淋洗得到弱极性、中极性和极性三种组份，浓缩吹干后转移到进样瓶中分别定容于正己烷、二甲基亚砜中用于GC-MS分析和重组基因酵母测试。
将初始浓度为10％(重量比)的重组基因酵母在30℃，转速为150rpm的生物培养箱中培养2h后提高转速至200rpm培养14h，测定酵母菌OD600为1.3。取950μL菌悬液与50μL分级后富集样品均匀混合。每个样品做3个平行样。取200μL混合液转移到96孔板中在微量振荡器上30℃下暴露培养2h，转速600rpm。每块96孔板上同时设置阳性对照(雌二醇)和阴性对照(二甲基亚砜)。测定菌液与富集样品接触2h后的OD600，观测到富集样品对酵母没有急性毒性。移取50μL接触2h后的混合液加入120μL缓冲溶液，振荡10min，加入20μL三氯甲烷振荡20min，加入40μL显色剂ONPG(4g/L溶于缓冲溶液)启动酶反应。反应2h时有明显的黄色生成，加入100μL Na2CO3(1M)终止酶反应，在酶标仪上测定OD420，通过公式U＝OD420(S)/OD600(S)—OD420(B)/OD600(B)，绘制剂量效应曲线，计算半有效浓度EC50，雌激素活性当量(EEQ)。
根据三种组份的重组基因酵母测试结果(表2)，选择雌激素活性最大的极性组份用GC-MS精确测定其中的雌激素活性物质种类和浓度。GC-MS测定到的雌激素活性物质有酞酸酯、双酚A、壬基酚、辛基酚(其它组份检测到滴滴涕和己烯雌酚等)。根据双酚A、壬基酚和辛基酚物质的浓度108.17μg/L、1.98μg/L、11.98μg/L和它们的EEF(表1)，通过公式EEQ＝∑Ci×EEFi计算测定物质的EEQ，根据仪器测定物质的EEQ对生物测试EEQ的贡献率。如表3所示，该污水样品中的双酚A、壬基酚和辛基酚是污水样品中雌激素活性主要贡献物，其中又以双酚A占主导地位，表明该污水处理工艺从去除雌激素活性角度出发可首要考虑采用对双酚A有选择性吸附的吸附剂混凝吸附，或选择双酚A的降解菌强化生物降解。
表2.某污水样品不同极性组份的雌激素活性(ng EEQ/L)
表3.某污水样品中雌激素活性的主要贡献物
Claims (4)
1.一种检测污水中雌激素活性贡献物的方法，其特征在于该方法包括如下部分：
1)对采集好的污水水样进行预处理：先用玻璃纤维滤膜过滤水样，然后将过滤后的水样经过固相萃取富集其中的雌激素活性物质，之后将固相萃取小柱冷冻干燥；
2)采用不同极性有机溶剂将雌激素活性物质从固相萃取柱上洗脱下来，采用硅胶色谱柱将雌激素活性物质按相似极性分级，得到极性、中极性和弱极性三种组份；
3)将不同极性的分级组份用重组基因酵母测试技术分析分级组份的雌激素活性；
4)利用气相色谱—质谱联机分析雌激素活性最大组份的物质种类和浓度，根据雌激素活性物质的浓度和该物质的雌激素活性当量的关系，找到主要的雌激素活性贡献物。
2.按照权利要求1所述的检测污水中雌激素活性贡献物的方法，其特征在于：所述的不同极性的有机溶剂分别为正己烷、二氯甲烷和甲醇。
3.按照权利要求1所述的检测污水中雌激素活性贡献物的方法，其特征在于：所述的硅胶色谱柱为上层填充硅胶，下层填充氧化铝的两段式。
4.按照权利要求1所述的检测污水中雌激素活性贡献物的方法，其特征在于：该方法采用的重组基因酵母测试方法选择的测试时间为16～20h，其中初始酵母菌在培养基中的质量浓度为5～10％；培养酵母在600nm下的光密度为1.0～1.5时进行测试。
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