CN104020023A - 一种生物样本的保存和分析前预处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物样本的保存和分析前预处理方法,该方法是把生物样本加入到样本管的样本室中,所述的样本管管内中部填充有填充段将样本管分隔成上部的样本室和下部的溶出液接收室;冷冻干燥使生物样本吸附在填充段的填充材料表面,再在样品管内充氮气或抽真空进行密封保存;生物样本处理时,直接在样本室中加入含内标的有机溶剂,有机溶剂从样本室流经填充段对生物样本进行溶出后,流入溶出液接收室,对所得的溶出液进样进行分析测试;该方法使生物样保存的稳定性提高,降低样本保存条件要求,并且该方法操作简单,流程短,同时还可以提高样本前处理的富集和纯化效率,提高方法灵敏度、精密度和准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物样本的保存和分析前预处理方法;属于药物领域。
背景技术
药物动力学研究(包含生物等效性和生物利用度研究)无论在临床前研究、临床研究还是在上市后临床应用研究中都十分重要,可以揭示药物在不同种属动物、不同人群中的经时变化规律。药物动力学研究中的生物样本是指在研究过程中采集的血样、尿样、粪样及其他体液和组织样本。这些样本需要在低温冷冻条件下保存,以确保在完成分析测试前及以后一段时间内的稳定性。有些样本甚至在-80℃的条件下仍不够稳定。这种方法不经需要昂贵的设备和大量的能量消耗,还无法保证样本的稳定性。这些冷冻保存的样本,在分析测试前,需要解冻后进行前处理。前处理的目的是除去生物样本中的蛋白质等生物杂质,保留待测物。目前的方法有蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法等。这些方法不或多或少存在纯化效率不高,操作复杂繁琐、无法制定标准操作的缺点。寻找一种既可以保证样本稳定性,又节能环保,既有利于提高后期前处理纯化效率,又有可以制定标准操作的样本处理方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能在温和条件下稳定保存生物样本和简化生物样本检测前预处理流程,提高前处理时生物样本的富集和纯化效率的方法。
本发明提供了一种生物样本的保存和分析前预处理方法,该方法是把定量的生物样本加入到样本管的样本室中,所述的样本管管内中部填充有一段由玻璃纤维、硅胶、键合硅胶或纤维素填充材料构成的填充段,所述填充段将样本管分隔成上部的样本室和下部的溶出液接收室;进行冷冻干燥使生物样本吸附在填充段的填充材料表面,再在样品管内充氮气或抽真空,进行密封保存;进行生物样本处理时,直接在样本室中加入含内标的有机溶剂,有机溶剂从样本室流经填充段对吸附在填充材料表面的生物样本进行溶出后,流入溶出液接收室,溶出液接收室所得的溶出液采取直接进样或者吹干后定容进样进行分析测试;所述的有机溶剂不溶解填充材料和生物样本中的生物杂质。
本发明的生物样本的保存和分析前预处理方法还包括以下优选技术方案:
优选的有机溶剂为甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿中的一种或几种。
所述的填充材料与生物样本的质量之比为1:0.2~1:3。
所述的冷冻干燥是在-50~-20℃下真空干燥。
所述的冷冻干燥时间为10~30h。
所述的有机溶剂的用量为0.2~3mL。
所述的分析测试所用的仪器为高效液相色谱仪、气相色谱仪或高效液相色谱质谱联用仪中的一种。
所述的生物样本为含药生物样本,如血样、尿样、生物组织或唾液中的一种。
所述的保存可以根据实际情况采用冷冻、冷藏或室温保存。
所述的有机溶剂流经填充段时可以采用超声辅助溶出。
所述的填充段中填充材料具有大量可供溶液自由通过的微孔,也可以通过离心加快溶液流经填充段的速率。
所述的生物样本加入到样本管的样本室中后可以采用超声分散处理,使生物样本更好地分散吸附在填充材料表面。
本发明的有益技术效果:本发明通过发明人的反复研究,最终确定一种不但能稳定保存生物样本,而且能通过简单操作、较短流程,提高生物样本分析前预处理时的富集和纯化效率的方法,特别是含药生物样本如血样、尿样、唾液或生物组织等的保存和快速分析前处理方法。本发明方法采用特殊的PE样品管(如附图1)填装玻璃纤维、硅胶、凝胶或纤维素等吸附剂,在结合本发明的冷冻干燥和密封保存处理,对生物样本进行隔绝空气和吸附水的双重保护;样本分析前处理时,利用生物样本中蛋白质等生物杂质不溶于所选择的有机溶剂的特点,直接加入含内标的有机溶剂,进行溶解提取,溶出液直接进样测定或者挥干定容后进样测定;并且在溶剂溶出过程中将血浆中蛋白等物质固定于载体上从而减少测试样本中杂质干扰,达到纯化的目的。综上所述,本发明方法可以使生物样本在干燥、隔绝氧气的条件下保存,大大提供稳定性,降低样本保存条件要求;该方法还可以大大简化样本处理的流程,使样本处理操作标准化,同时还可以提高富集纯化效率,提高方法灵敏度、精密度和准确性。
附图说明
【图1】是本发明中的样本管;1为样本室,2为填充材料,3为溶出液接收室。
具体实施方式
以下实施例是对本发明内容的进一步说明,而不是对本发明保护范围的限制。
本发明的研究目的是探索一种生物样本常温保存方法,以及进一步简化生物样本处理方法。血浆样本中存在人体血液中的各种酶,在血浆的水环境中,酶催化药物降解,导致血浆中药物减少,无法达到长期保存的目的;虽然将血浆样本置于低温保存箱中可以减缓此过程,但是没有解决根本问题。通过血浆加入载体(硅胶或玻璃纤维)中冷冻干燥的方法,血浆中水不再存在,酶无法催化药物发生各种反应,可以达到长期保存血浆样本的目的,甚至可以实现常温保存。加入载体可使冻干过程更加迅速,并且在甲醇等溶剂洗脱过程中将血浆中蛋白等物质固定于载体上从而减少测试样本中杂质干扰,达到纯化的目的。
实施例1
冷冻干燥方法:分别选用麦考酚酸酯、莫达非尼、左乙拉西坦、烟酸作为模型药物,配制含药血浆。吸取200μL含药血浆,置于中部填充有15层玻璃纤维材料的过滤管上部的样本室中,超声混匀。于-40℃下真空冷冻干燥28h,密封阴凉处保存待测。
样本测试方法:在离心管上部的样本室中加入500μL含内标的甲醇,放置2分钟,超声5分钟,离心,从溶出液接收室接收溶出液;再在离心管样本室加入500μL含内标的甲醇,同法处理。合并溶出液。吹干,200μL流动性定容,进样测定。对照液处理:配制待测物及内标理论浓度相同的对照溶液,直接进样。每个样本处理并测试3份。
实施结果如表1:
表1.本发明方法冷冻干燥后直接溶解处理样本的测试结果
实施例2
以匹多莫德、麦考酚酸、左乙拉西坦、泮托拉唑、阿那曲唑、奥美沙坦、烟酸血样为模型样本研究新型生物样本保存及处理方法,与蛋白沉淀、液液萃取法、固相萃取法等常规方法进行对比研究,比较操作的简便性、纯化效率等。
将匹多莫德、麦考酚酸、左乙拉西坦、泮托拉唑、阿那曲唑、奥美沙坦、烟酸的血样按下面方法操作:
冷冻干燥方法:在中部填充有250mg300~400目硅胶的离心管上部的样本室中,加入200μL血浆,混匀后,在-40℃下冷冻干燥24小时。
样本处理方法:在离心管上部的样本室中加入1mL甲醇,浸泡并超声20min,离心(450g,5min),从溶出液接受室内取出滤液700μL1.5mLEP管,氮气挥干后,100μL流动相定容,进样。
另取含相同浓度的匹多莫德、麦考酚酸、左乙拉西坦、泮托拉唑、阿那曲唑、奥美沙坦等生物样本,分别采用常规的蛋白沉淀法、液液萃取法、固相萃取法等测定,以进行对比研究。
采用本发明方法对匹多莫德、麦考酚酸、左乙拉西坦、泮托拉唑、阿那曲唑、奥美沙坦等生物样本的保存和分析前预处理。测试结果如表1~6所示:
表1.匹多莫德蛋白沉淀处理样本与冷冻干燥后直接溶解处理样本测试结果
表1所示为匹多莫德生物样本采用甲醇(1:3)蛋白沉淀法测定蛋白,再稀释一倍与直接溶出法处理样本后进行分析测试。从表1可以看出,以本发明方法测得的峰相应为蛋白沉淀法的2倍,重现性好于蛋白沉淀法。考虑到直接溶解法溶出液吹干定容过程,浓缩了5倍左右,直接溶出法绝对回收率仅为蛋白沉淀法的20%。考虑到后加入的内标与待测物响应相同,推测硅胶吸附影响了绝对回收率。
表2.麦考酚酸蛋白沉淀处理样本与冷冻干燥后直接溶解处理样本测试结果
表2所示为麦考酚酸生物样本采用蛋白沉淀法与直接溶出法处理样本后进行分析测试结果。结果显示,本发明方法测得的峰相应为蛋白沉淀法的2倍,重现性好于蛋白沉淀法。考虑到直接溶解法溶出液吹干定容过程,浓缩了5倍左右,直接溶出法绝对回收率仅为蛋白沉淀法的30%左右。考虑到后加入的内标与待测物响应相同,推测硅胶吸附影响了绝对回收率。
表3.左乙拉西坦样本液液萃取处理与冷冻干燥后直接溶解处理样本测试结果
表3所示为左乙拉西坦生物样本采用乙酸乙酯进行液液萃取与直接溶出法处理样本后进行分析测试结果。结果显示,本发明方法测得的峰响应、重现性与液液萃取相当,绝对回收率低于液液萃取。考虑到后加入的内标与待测物响应相同,推测硅胶吸附影响了绝对回收率。
表4.泮托拉唑蛋白沉淀处理样本与冷冻干燥后直接溶解处理样本测试结果
表4所示为泮托拉唑生物样本采用碱化后乙酸乙酯进行液液萃取与直接溶出法处理样本后进行分析测试结果。结果显示,本发明方法测得峰响应低于液液萃取,重现性与液液萃取相当。考虑到后加入的内标与待测物响应相同,推测硅胶吸附影响了绝对回收率。
表5.阿那曲唑样本液液萃取处理与冷冻干燥后直接溶解处理样本测试结果
表5所示为阿那曲唑生物样本采用甲基叔丁基醚进行液液萃取与直接溶出法处理样本后进行分析测试结果。结果显示,本发明方法测得的峰响应与液液萃取相当,重现性好于液液萃取。绝对回收率与液液萃取相当。
表6.奥美沙坦固相萃取处理样本与冷冻干燥后直接溶解处理样本测试结果
表6所示为奥美沙坦生物样本采用固相萃取法与直接溶出法处理样本后进行分析测试结果。结果显示,本发明方法测得的峰响应大大高于固相萃取,重现性略差,但符合要求,绝对回收率显著提高。
结论:
冷冻干燥后生物样本处理方法比常规方法相比有所简化,测试结果显示药物响应、峰形及精密度有所改善,可以达到生物样本测试要求。与液液萃取相比,杂质较多,有待于优化溶剂系统。使用玻璃纤维为吸附剂时,绝对回收率均大于50%且稳定,通过适当调整溶出溶剂,绝对回收率达到80%可行性强。后续研究工作继续优选吸附剂和有机溶剂的种类、用量等。
Claims (7)
1.一种生物样本的保存和分析前预处理方法,其特征在于,把定量的生物样本加入到样本管的样本室中,所述的样本管管内中部填充有一段由玻璃纤维、硅胶、键合硅胶或纤维素填充材料构成的填充段,所述填充段将样本管分隔成上部的样本室和下部的溶出液接收室;进行冷冻干燥使生物样本吸附在填充段的填充材料表面,再在样品管内充氮气或抽真空进行密封保存;进行生物样本处理时,直接在样本室中加入含内标的有机溶剂,有机溶剂从样本室流经填充段对吸附在填充材料表面的生物样本进行溶出后,流入溶出液接收室,溶出液接收室所得的溶出液采取直接进样或者吹干后定容进样进行分析测试;所述的有机溶剂不溶解填充材料和生物样本中的生物杂质。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的有机溶剂为甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的填充材料与生物样本的质量之比为1:0.2~3。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的冷冻干燥是在-50~-20℃下真空干燥。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的有机溶剂的用量为0.2~3mL。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的分析测试所用的仪器为高效液相色谱仪、气相色谱仪或高效液相色谱质谱联用仪中的一种。
7.根据权利要求1~6任一项所述的方法,其特征在于,所述的生物样本为血样、尿样、生物组织或唾液中的一种。
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