CN104865225A - 一种检测橡胶植物中的小橡胶粒子蛋白含量的方法以及使用该方法筛选橡胶植物品系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于表面等离子共振的检测橡胶植物中的SRPP含量的方法以及使用该检测方法筛选高SRPP含量橡胶植物品系的方法。本发明还涉及一种用于检测SRPP的SRP传感器。

Description

一种检测橡胶植物中的小橡胶粒子蛋白含量的方法以及使用该方法筛选橡胶植物品系的方法

技术领域

本发明涉及一种使用表面等离子共振技术检测橡胶植物乳液中的小橡胶粒子蛋白的方法以及利用该方法进行橡胶植物品系筛选的技术。同时，本发明还提供一种基于表面等离子共振技术检测橡胶植物乳液中的小橡胶粒子蛋白的传感器芯片。

背景技术

世界上约有2000种不同的植物可生产类似天然橡胶的聚合物，人们已从其中500种橡胶植物中得到了不同种类的橡胶。不同的橡胶植物中含胶量有很大差异。天然橡胶在橡胶粒子上合成，很多蛋白、酶等与橡胶的合成有关。其中，小橡胶粒子蛋白(small rubber particle protein(简称为SRPP))是一种关键蛋白，与橡胶的合成紧密相关。橡胶植物的含胶量取决于植物中的小橡胶粒子蛋白含量(参见Oh,S.K.；Kang,H.；Shin,D.H.；Yang,J.；Chow,K.S.；Yeang,H.Y.；Wagner,B.；Breiteneder,H.；Han,K.H.J.Biol.Chem.1999,274,17132–17138.)。通过检测一种橡胶植物中的SRPP含量，可以推测该橡胶植物的产胶量。

另外，目前市场上的天然橡胶来自从橡胶树上采集的天然橡胶乳液。但传统的天然橡胶产量低。橡胶树生长在亚热带、热带地区。中国亚热带地区面积较小，自产天然橡胶远远不能满足日益增长需求量。再者，天然橡胶主要被东南亚国家所垄断。在复杂的国际形势下，天然橡胶依赖于从东南亚国家进口严重影响了我国的橡胶安全。

橡胶草是多年生草本植物，包括菊科蒲公英等。橡胶草含有天然橡胶乳液，能制造天然橡胶。我国面积广大，从温带到亚热带种都可种植橡胶草。因此，中国研究机构已开始研究从橡胶草上采集天然胶乳，以制备天然橡胶。

但是，橡胶草中含胶量普遍较低。需要从野生的橡胶草中筛选出天然乳胶含量高的橡胶草品系和植株，进行人工培育，以大规模推广种植。天然乳胶含量取决于SRPP的含量。通过检测一种品系的橡胶草中的SRPP含量便可知其产胶潜力，便可筛选出高产胶量的橡胶草品系。因此，急需一种低成本、可定量、灵敏、快速、能够在现场进行检测的橡胶草品中的SRPP的检测方法。

但是，在本发明之前，尚没有公开一种能够检测SRPP含量的技术手段，特别是没有人报道过一种同时满足低成本、特异性、可定量、快速、灵敏、可现场进行检测等要求的检测植物乳液中的SRPP的技术手段。

表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance technology，简称为SPR)发展于20世纪90年代，是基于检测生物传感芯片上配位体(ligand)与分析物相互作用的先进技术，可快捷简便地检测蛋白质分子间及药物与蛋白质、抗原与抗体、核酸与核酸等生物分子间的相互作用，在医疗检测、食品检测、环境监测、法医鉴定等领域具有广泛应用前景。

对SPR技术的原理说明如下：当光线在棱镜与金膜表面上发生全反射现象时，一部分光会被光疏介质吸收，从而在金属膜中产生消逝波。而若把金属的价电子看成在均匀正电荷之下不断运动的电子气体，那么它实际上也是一种等离子体。当金属被电磁干扰时，金属中将产生不均匀分布的电子密度。此时消逝波与金膜表面的等离子波将发生共振，若检测反射光，将发现较大程度的减弱现象。因能量已从光子转移到表面等离子，表面等离子波吸收了入射光的大部分能量，这样就造成反射光的能量加剧减少。因此，在反射光强的响应曲线可以看到一个最小的尖峰，这时所对应的入射光波长称为共振波长，对应的入射角称为共振角，即SPR角。SPR角因金表面折射率变化而变化，又因折射率的变化与金表面结合的分子质量是成正比关系。通过这种对应关系便可实现对目标物质的快速检测。

本发明的基于SPR的检测方法和免疫传感器解决了上述技术难题，首次为橡胶草品系的筛选和进一步培育提供科学依据，无论从经济意义还是我国的橡胶安全的角度来说具有重大意义。

发明内容

【发明所要解决的课题】

本发明所要解决的课题在于提供一种橡胶植物中的SRPP含量检测方法，该检测方法利用表面等离子共振技术，特异性地识别橡胶草胶乳中橡胶粒子的表面膜蛋白SRPP(小橡胶粒子蛋白)，并通过收集SRPP与其抗体的结合所产生的信号，得到SRPP的含量。

本发明还提供一种高SRPP含量橡胶草品系的筛选技术，该筛选技术利用表面等离子共振技术，特异性地识别橡胶草胶乳中橡胶粒子的表面膜蛋白SRPP(小橡胶粒子蛋白)，并通过收集SRPP与其抗体的结合所产生的信号，得到SRPP的含量。

本发明的目的之一即利用SPR检测SRPP含量，借此筛选出SRPP含量接近或超过巴西橡胶树的橡胶草品系。

本发明还提供一种SPR免疫传感器，其包括芯片和固定于芯片上的SRPP抗体，所述抗体优选为SRPP单克隆抗体。所述芯片上具有金膜和羧甲基葡聚糖。

【发明的效果】

本发明利用表面等离子共振技术，借助抗原与抗体的特异性结合技术来识别橡胶树、橡胶草等橡胶植物胶乳中橡胶粒子的表面膜蛋白SRPP(小橡胶粒子蛋白)，并通过收集SRPP与其抗体的结合所产生的信号，得到SRPP的含量，解决了以往无法检测橡胶植物中SRPP含量的问题，同时解决了产胶橡胶草品系筛查的关键性技术问题。同时本发明具有快速、准确、灵敏、低成本、简便、可现场实施、不破坏植物等显著优点。

具体地说，本发明的检测方法和筛选方法的优点包括：

1)快速，抗体固定好后每个样品的检测只需要几分钟；

2)前处理简便，样品不需要复杂的前处理，只需要过膜或离心即可。

3)特异性强，利用抗SRPP抗体尤其是单克隆抗体作为识别分子，可特异性识别SRPP。

4)可实现SRPP含量的定量，例如，以某种常见天然橡胶植物的乳液中SRPP的SPR信号值为基准，再通过SPR测其他样品中的SRPP的SPR信号值，计算出其他样品的信号值与基准的比值，以该比值定量其他样品中的SRPP含量。

5)成本低，芯片可以再生后反复使用。

6)采集乳液后可以现场测定。

7)灵敏，即使将橡胶乳液稀释到0.5体积％，也能获得明确的信号。

最重要的是，目前尚未有检测天然橡胶乳液中的SRPP技术。

本发明可以实现特异性橡胶粒子膜蛋白识别，并快速判断橡胶粒子膜蛋白的相对含量，为有产胶潜力的橡胶草品系的筛选和进一步培育提供科学依据，故依据本发明，将有望建立巴西橡胶树产胶替代方案以良好解决当前天然橡胶产量严重不足问题，因此，本发明具有极为可观的农业经济效果，同时是解决国家天然橡胶战略安全的关键技术之一。

附图说明

图1为SPR免疫传感器示意图。

图2A示出不同pH值下的SPR响应值；图2B示出不同抗体浓度下的SPR响应值。

图3示出不同纯化橡胶乳液浓度(体积％)下的SPR响应值。

图4示出由不同纯化橡胶乳液浓度(体积％)与SPR响应值得到回归方程的一例。

具体实施方式

以下将更详细地说明本发明。

本发明的目的在于提供一种利用SPR检测植物橡胶乳液内的橡胶粒子表面蛋白SRPP的方法，该检测方法包括如下步骤：

1)对植物橡胶乳液进行预处理以除去植物橡胶乳液中的杂质；

2)将SRPP抗体固定化于芯片表面；

3)利用SPR技术检测植物橡胶乳液中的SRPP。

<植物橡胶乳液的预处理>

植物橡胶乳液的预处理包括：自植物采集植物橡胶乳液后对天然橡胶粒子进行纯化来去除杂质，以获得包含橡胶粒子的纯化橡胶乳液，以及任选地对纯化橡胶乳液进行水洗。

需要说明的是，本发明中，植物橡胶乳液采集自含有能够制备橡胶的胶质乳液的植物，例如，橡胶树、橡胶草等产胶植物。

本发明的橡胶树包括巴西橡胶树等。

本发明的橡胶草包括各种蒲公英属植物等，例如俄罗斯品系蒲公英、海南品系蒲公英、新疆品系蒲公英等。优选温带地区生长的蒲公英。

在此需要说明的是，除去杂质的预处理是SPR检测仪使用时所需要的。因为SPR检测仪运行时的通路很细，而且芯片上的各个反应区域也是微米级的反应池等，所以需要物理上的预处理，将大粒度的物质除去。

<植物橡胶乳液的采集>

橡胶草的乳液可以自橡胶草的任意部位，优选采集自根部。对于橡胶树而言，植物橡胶乳液的采集可以采用天然橡胶乳液一般的采集方法。也可以采用下述的毛细管吸取法。

对于橡胶草而言优选的是，优选毛细管吸取法，在不破坏橡胶草的情况下现场提取。毛细管吸取法具体地说，以蒲公英为例，蒲公英植物橡胶乳液的提取可以切开根部，然后用毛细管吸取后，再用注射器打入离心管等收集容器里或过膜过滤。这个步骤的主要优点是对于很少的样品也能最大程度的取出，比破碎之类的方法效率高，而且相比于破碎法，该步骤还能使橡胶草受到的伤害减少到最小的程度，并且可实现多次提取。

当然也可以采用破碎法采集乳液。

<橡胶粒子的纯化>

在步骤1)的纯化过程中，可以对植物橡胶乳液进行离心来去除杂质。离心后的样品在离心管中分为三部分，最上层为橡胶粒子层，橡胶粒子表面是橡胶合成的部位，含有SRPP。第二层为清液，也可能含有少量SRPP。必要时可以将最上层和第二层一起收集。也可在离心后仅将最上层分离出。优选使用低温PBS缓冲液混匀稀释离心得到的最上层和/或第二层物质，以保证包含橡胶粒子的乳液在SPR流道中的流动均一性。

在步骤1)的纯化过程中，离心可以进行1次，也可以进行2次或更多次。每次离心时间不受特别限制，可以是例如10～30分钟。离心速度可以是例如5000～15000rpm，优选10000～13000rpm，更优选12000rpm。离心优选在低温例如4摄氏度左右进行。

步骤1)的纯化也可以采用过膜法来去除杂质。过膜法使用滤膜过滤植物橡胶乳液。过膜法使用针管和滤膜。过膜法可以例如采用如下方式进行：将天然橡胶胶乳抽到针管(例如塑料针管)，取下针头(例如金属针头)，在针管的针头处接上一个孔径为微米级的滤膜(例如，0.22um孔径)，然后将橡胶胶乳推出去，即可达到过滤效果。过膜法具有步骤简单、样品用量少的优点。

当植物橡胶乳液样品量充足的情况下，纯化可以使用离心和过膜两种方式的组合来去除杂质，例如可以采用先离心再过膜的方式来去除杂质。

如果在乳液采集之后采用上述过膜法，则不仅具有简便、快速的优点，还可以省去下述的水洗过程。过膜法更适合野外或现场检测。

过膜法所用膜可以是对溶液和抗体呈惰性的高分子膜，例如，聚四氟乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚醚砜膜等。所述膜的孔径可以是0.45μm以下，优选0.22μm左右。

<水洗过程>

在步骤1)中的可选的水洗过程中，对纯化步骤获得的橡胶粒子反复进行4摄氏度左右的低温PBS缓冲液复溶混匀、离心。每次离心后收集最上层。最上层含有大量的橡胶粒子。因第二层清液中有时可能也会含有SRPP，必要时可以将最上层和第二层一起收集。

步骤2)的水洗过程中的离心条件可以与步骤1)的纯化过程的离心条件相同。离心次数可以是2～10次，优选4～7次，更优选6次。

<抗体的固定化>

在抗体的固定化中，首先活化芯片，然后将抗体固定化，最后将芯片的未反应基团封闭(即，封闭芯片)。抗体在芯片表面的固定化可以采用本领域公知的方法，例如，氨基偶联法，在合适的pH和抗体浓度的条件下，固定抗体。

芯片可以自行制备以使芯片上具有金膜和羧甲基葡聚糖，也可以采用芯片上已有金膜和羧甲基葡聚糖的商业芯片，例如，GE公司制造的CM-5，直接活化后使用即可。

芯片可以使用EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化。

EDC的浓度可以为0.4M。NHS的浓度可以为0.1M。EDC和NHS可以用水、DMF(二甲砜)、乙醇或THF(四氢呋喃)等溶剂稀释。

当EDC为0.4M、NHS为0.1M时，EDC/NHS的体积比可以是5:2～2:5，优选为1:1。

具体地说，例如，可以以如下方式进行：在合适的pH和抗体浓度的条件下，选择SPR检测仪的向导模式，使用金膜上含有羧甲基葡聚糖的芯片。首先用EDC/NHS活化芯片，产生活性酯。然后注入一定浓度的抗体稀释液，抗体上的氨基与活性酯发生取代反应，由此将抗体偶联在羧甲基葡聚糖上，再用乙醇胺水溶液等将未反应的活性酯封闭。

本发明中，抗体可以是SRPP单克隆抗体，也可以是SRPP多克隆抗体，优选SRPP单克隆抗体。

抗体可以用乙酸铵-乙酸缓冲水溶液、乙酸钠-乙酸缓冲水溶液等乙酸盐-乙酸缓冲水溶液稀释。乙酸盐-乙酸缓冲水溶液是以一定浓度(例如，10mM)将乙酸盐溶于水中，然后用乙酸调节目标pH得到的。

固定化所用的抗体浓度(抗体试剂与pH 4.0的10mM乙酸盐-乙酸缓冲水溶液的体积比)可以为1:1000～1:10，优选为1:500～1:50，更优选为1:100左右。

封闭抗体所用的乙醇胺水溶液的浓度为0.5M～1.5M，更优选为0.8M～1.2M，最优选为1M左右。封闭步骤的时间为几分钟即可，例如7分钟。

抗体固定化步骤中，抗体稀释液的pH为3.8～5.5，优选为4.0～5.0，更优选为4.0左右。

<通过SPR检测植物橡胶乳液中的SRPP>

在上述步骤3)中，将纯化后的橡胶粒子乳液稀释后或直接通入已固定好抗体的芯片上的SPR流通通道即抗体通道中，进行检测。

由于植物橡胶乳液样品中成分复杂，为了避免引起非特异性吸附，可以优选用任选地含有牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20等的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)稀释植物橡胶乳液样品。所述磷酸盐缓冲液中的牛血清白蛋白(BSA)浓度优选为0.1质量/体积％左右，Tween-20浓度优选为0.05体积/体积％左右，但是并不限定于该浓度。

每次进样检测完成后用NaOH水溶液洗脱，以洗去与芯片结合的抗体，对芯片进行再生。整个检测过程中，缓冲液一直在流动，该缓冲液例如可以为pH7.2的10mM PBS缓冲液。最终的特异性信号增加由抗体通道和参比通道两者之差得到。其中，抗体通道和参比通道均是芯片的一部分。抗体通道固定有抗体。参比通道未固定抗体，但要与抗体通道同样地通入SRPP样品。

SRPP的检测10分钟即可，更优选7分钟左右即可。检测时间可以在SPR检测仪上设置。

PBS(磷酸盐缓冲液)可以为中性，优选为pH7.2左右，PBS的浓度为5～15mM，优选为10mM。

检测过程在室温下进行即可，例如25℃左右。

SPR检测系统可以使用商用系统，例如，Biacore系统。在Biacore系统中，由于SRPP与抗体结合后，芯片表面的RI和共振角发生变化，Biacore平台随后将这种变化转变为共振单位RU，1000RU相当于0.1°的变化。1000RU代表1ng/mm²蛋白质，即1RU约对应于1pg/mm²。CM5芯片的面积约可以例如为1.2mm²。故在12000rpm离心20分钟后被稀释至50体积％(用PBS缓冲溶液稀释)的纯化橡胶乳液(即实施例1的乳液)注入后，约有78.72pg SRPP可被芯片上的抗体捕获。

<SPR免疫传感器>

本发明还提供一种生物芯片——SPR免疫传感器，其包括芯片和固定于芯片上的SRPP抗体。在该芯片上固定SRPP抗体之前，该芯片按照上述方法经EDC/NHS活化。该抗体芯片优选具有金膜和羧甲基葡聚糖。

所述抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。但是出于特异性的考虑，优选为SRPP单克隆抗体。

本发明的SPR免疫传感器的一个例子如图1所示。

实施例

下面通过实施例对本发明进行更详细的说明，但只要不超出其要点，本发明并不限于这些实施例。

<材料与仪器>

巴西橡胶树(别名，三叶橡胶树(Hevea brasiliensis))乳液由中国热带农业科学院湛江试验站提供。该巴西橡胶树乳液是从巴西橡胶树上采集后未经任何处理的橡胶乳液。

蒲公英橡胶草由黑龙江省科学院提供。其中k445是一种蒲公英的品系名称，是来自俄罗斯的一种蒲公英。

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、乙酸铵、乙醇胺购自Sigma公司。

SRPP单克隆抗体试剂(商品名Mouse Monoclonal Antibody)购自IcosagenAS(Tartu,Estonia)公司，以下有时称为SRPP单克隆抗体或抗体。

所有溶液均用超纯水配制并在使用前用孔径0.22μm的下述滤膜过滤。

SPR实验在GE公司生产的Biacore T200操作平台上实现。

芯片型号是CM5，购自GE公司。

滤膜是天津津腾公司生产的水系膜，材料是PES(聚醚砜)，原材料膜是德国MEMBRANA公司进口膜，孔径是0.22um。

BSA(牛血清蛋白)购自Sigma公司。

OVA(卵清蛋白)购自Sigma公司。

KLH(血蓝蛋白)购自Sigma公司。

SA(链霉亲和素)购自Sigma公司。

磷酸盐(PBS)缓冲液购自Sigma公司。

NaOH购自Sigma公司。

其他试剂亦购自Sigma公司。

<实验>

1)橡胶树乳液的采集和纯化

蒲公英植物橡胶乳液的提取采用如下步骤：切开蒲公英橡胶草的根部，然后用毛细管吸取乳液后，再用一次性注射器将乳液打入0.22um孔径的膜过滤器，进行过膜过滤。

2)芯片的准备

将芯片插入仪器，通入PBS缓冲液，流速10μL/分钟，待基线稳定后，进行实验。

3)<条件优化>

芯片活化之前，以pH4.010mM乙酸钠-乙酸缓冲水溶液稀释SRPP单克隆抗体。分别将SRPP单克隆抗体稀释成1:1000、1:500、1:100、1:10(SRPP单克隆抗体试剂与上述乙酸钠-乙酸缓冲水溶液的体积比)。对各浓度的抗体稀释液样品以10μL/分钟流速检测2分钟，并在检测各浓度的抗体稀释液样品之后用50mM NaOH水溶液洗脱，以再生芯片。洗脱时，NaOH水溶液流速为10μL/分钟，洗脱时间为1分钟。结果抗体稀释液浓度为1:100时引起的信号尖锐、较大且未饱和。在条件优化过程中，SPR检测仪选择向导模式。

选择1:100稀释的抗体，优化pH。用pH分别为4.0，4.5，5.0，5.5的10mM乙酸钠-乙酸缓冲水溶液稀释以上述的1:100(抗体试剂:缓冲液)稀释SRPP单克隆抗体试剂。选择能引起最大信号的pH，以该pH为最优pH。每个样品检测后以10μL/mL流速通入1分钟50mM的NaOH水溶液，使芯片再生。结果pH4.0能引起最大信号。

4)抗体固定化

(4.1)活化芯片

等体积的0.4M EDC和0.1M NHS以体积比1:1混合活化，流速为10μL/分钟，SPR检测仪上设定芯片活化时间为7分钟。

(4.2)抗体固定化

根据上述优化实验步骤1)至3)，用pH4.010mM的乙酸钠-乙酸以1:100的比例稀释SRPP单克隆抗体试剂，10μL/分钟，SPR检测仪设定为7分钟。在抗体固定化过程中，SPR检测仪选择向导模式。

(4.3)封闭

使用1M pH8.5的乙醇胺流过芯片表面，流速为5μL/分钟、7分钟，对芯片进行封闭。结果使抗体偶联于芯片表面，芯片上未偶联抗体的活性基团被封闭。

(4.4)检测

以10μL/分钟的流速通入pH 7.2的10mM含有0.1质量/体积％BSA、0.05体积/体积％Tween-20的PBS缓冲液，待基线稳定后进样检测，将样品注入SPR的抗体通道。整个检测过程中一直使该PBS缓冲液流动。其中，进样流速为5μL/分钟，进样检测时间为7分钟。含有SRPP的样品溶液通过芯片表面，SPR检测仪得到了SRPP与芯片上抗体的结合信号。SPR检测仪自动将信号换算共振单位RU(响应值)。在检测过程中，SPR检测仪选择手动模式。

(4.5)再生

任选地以10μL/分钟的流速通入1分钟50mM的NaOH水溶液再生芯片，以待下一个样品检测使用。

<免疫传感器>

通过上述实验(4.1)～(4.3)的步骤，制作出本发明的传感器。该传感器可用于本发明的SRPP检测。

<实施例1>

自巴西橡胶树采集乳液，12000rpm离心20分钟后。将离心后收集最上层的包含大量纯化橡胶粒子的乳液，得到纯化橡胶粒子乳液。所得到的纯化橡胶粒子乳液用含有0.1质量/体积％BSA、0.05体积/体积％Tween-20的10mM PBS缓冲液稀释成50体积％(50体积％指的是1体积份纯化橡胶乳液/(1体积份纯化橡胶乳液+1体积份磷酸盐缓冲液)×100％，即，1体积/(1体积+1体积)×100％＝50体积％))的稀释乳液，以该稀释乳液为样品。除此以外，采用上述实验4)的步骤(即，条件为，抗体稀释液中的抗体体积浓度1:100，抗体稀释液的pH为4.5)检测样品中的SRPP。平行检测3次。所得到的信号平均为65.6RU。

需要说明的是，实施例1中，所得到的信号平均为65.6RU，相当于约4ng/mL的浓度。

<实施例2>

将样品改为蒲公英橡胶草k445乳液。将该乳液过膜后不经稀释直接进样，除此以外，采用与实验4)的步骤利用SPR检测SRPP。所得到的信号平均为50.5RU。

<实施例3>

将样品改为蒲公英橡胶草新疆品系，除此以外，采用与实施例2同样的步骤利用SPR检测SRPP。所得到的信号平均为6.7RU。

<实施例4>

将样品改为蒲公英橡胶草海南品系，除此以外，采用与实施例2同样的步骤利用SPR检测SRPP。所得到的信号均为0RU。

<可重复性>

实施例1～4的结果列于下表1A～D。

[表1A]巴西橡胶树(实施例1)

第一次平行检测	第二次平行检测	第三次平行检测	平均值	SD(标准偏差)
					65.2	62.6	69	65.6	3.218695

[表1B]蒲公英橡胶草k445(实施例2)

第一次平行检测	第二次平行检测	第三次平行检测	平均值	SD
					51.2	52.6	47.7	50.5	2.523886

[表1C]蒲公英橡胶草新疆品系(实施例3)

第一次平行检测	第二次平行检测	第三次平行检测	平均值	SD
					6.2	6.9	7.1	6.7	0.472582

[表1D]蒲公英橡胶草海南品系(实施例4)

第一次平行检测	第二次平行检测	第三次平行检测	平均值	SD
					0	0	0	0	0

如上表1A～D可知，本发明的传感器以及本发明的检测方法针对各种橡胶树、橡胶草可检测其乳液中的SRPP，具有重复性好的优点。通过上述实验，发明人找到了产自亚热带的海南品系的蒲公英橡胶草无法制天然橡胶的原因。因此温带大陆地区的橡胶草为发明人的研究重点。

<特异性>

为了验证本发明的检测方法的特异性，发明人选用了与SRPP接近且可能含有在植物橡胶乳液中的蛋白进行对比检测。具体地说，为了与实施例1比较，用含有0.1质量/体积％BSA、0.05体积/体积％Tween-20的10mM磷酸盐缓冲液将表3所示的各蛋白稀释成4ng/mL，制成检测样品。除此以外，与实施例1相同地进行检测。各样品分别平行检测三次。结果列于下表2。

[表2]

*)除将样品变为直接采集得到的巴西橡胶树乳液以外，与实施例2相同地处理、检测。

由表2可知，BSA、OVA、KLH、SA均没有明显信号，而浓度相同的巴西橡胶树乳液产生了明显信号。由此证明，本发明的传感器以及本发明的使用SRPP抗体的SPR检测方法仅对SRPP有效，具有极强特异性。

<灵敏度>

自巴西橡胶树采集乳液，12000rpm离心20分钟后。将离心后的包含橡胶粒子层的最上层收集，得到纯化橡胶粒子乳液。该乳液用含有0.1质量/体积％BSA、0.05体积/体积％Tween-20的10mM磷酸盐缓冲液稀释成表3所示浓度。除此以外，分别与实施例1同样地进行SPR检测。各浓度平行检测三次。结果列于表3。

表3 巴西橡胶树的不同稀释度的乳液的SPR检测结果

*表3中所示的稀释乳液浓度为纯化橡胶乳液的体积/(含有0.1质量/体积％BSA、0.05体积/体积％Tween-20的10mM磷酸盐缓冲液的体积+纯化橡胶乳液的体积)

由表3可见，在橡胶粒子层被稀释到0.5体积％时，仍可检测到信号增加为6.7RU。本发明的传感器和本发明的检测方法具有良好的分析灵敏度和稀释宽容度。

将上述乳液稀释浓度与对应的信号平均值做成相关性曲线，可将该曲线作为其他产胶植物(例如，蒲公英)品系中SRPP含量的参考定量基准。由此实现了其他产胶植物品系中SRPP含量的定量。

巴西橡胶树早已为世界上大规模种植产胶树种，产业上早已用巴西橡胶树乳液制备天然橡胶。因此将蒲公英橡胶草中的SRPP的SPR信号与巴西橡胶树中的SRPP的SPR信号比较，即可相对地定量蒲公英橡胶草中的SRPP相对含量，即，蒲公英橡胶草中的SRPP含量为巴西橡胶树中的SRPP含量的百分比例。以该百分数作为筛选巴西橡胶树的替代植物品种(例如，蒲公英属橡胶草)品系的基准。

本发明的目的之一即利用SPR检测SRPP含量筛选出SRPP含量接近或超过巴西橡胶树的橡胶草品系。

具体地说，可以根据表3不同浓度下的RU值绘制出工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归方程(例如附图4)。然后对于小橡胶粒子蛋白含量未知的植物乳液进行检测，得到共振单位RU值(响应值)，将该共振单位RU值代入回归方程，计算出相对于现有巴西橡胶树乳液的、该植物乳液中的小橡胶粒子蛋白含量。可以以该相对含量作为筛选橡胶草的依据，以期筛选出可替代巴西橡胶树的橡胶草品系。

<比较例1>

除将样品变为本说明书实施例1的纯化后的巴西橡胶树乳液以外，使用公开号CN103792371A的中国专利文献的实施例2的方法检测SRPP。结果，CN103792371A的实施例2列举的各浓度下均显著无信号。

<比较例2>

除将样品变为本说明书实施例1的纯化后的巴西橡胶树乳液以及将抗体变为本发明的SRPP单克隆抗体试剂以外，使用公开号CN103792371A的中国专利文献的实施例2的方法检测SRPP。结果，CN103792371A的实施例2列举的各浓度下均显著无信号。

需要说明的是，利用上述方法检测样品，自抗体固定起仅仅需要几分钟就可得到结果，具有快速的优点。而且上述方法的前处理简单，只需要过膜即可。芯片可反复再生，降低了成本。本发明的方法具有快速、特异性、灵敏性、可重复性强、成本低等优点，本发明的方法可用于橡胶草(例如，蒲公英)的品系筛选，具有很高的实用价值。

Claims (9)

1.一种利用表面等离子共振技术检测植物橡胶乳液中的小橡胶粒子蛋白的方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：

1)对采集自植物的植物橡胶乳液进行预处理以除去植物橡胶乳液中的无法通入表面等离子共振检测仪的大粒度杂质；

2)将小橡胶粒子蛋白抗体固定于表面等离子共振技术检测用芯片上，优选所述小橡胶粒子蛋白抗体为小橡胶粒子蛋白单克隆抗体或小橡胶粒子蛋白多克隆抗体，优选所述芯片上具有金膜和羧甲基葡聚糖；

3)利用表面等离子共振技术检测植物橡胶乳液中的小橡胶粒子蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，在步骤1)中，从植物中采集橡胶乳液优选毛细管吸取法，所述杂质使用过膜法或离心法除去。

3.如权利要求1或2所述的检测方法，在步骤2)中，首先利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化芯片后，将所述抗体固定在所述芯片上，再将芯片封闭。

4.如权利要求1或2所述的方法，抗体固定化之前，所述抗体用稀释溶液稀释，抗体的稀释液的pH为3.8～5.5，优选为3.8～5.0，更优选为4.0左右；抗体的稀释比例以抗体:稀释溶液之体积比计为1:1000～1:10，优选为1:500～1:50，更优选为1:100左右；所述稀释液优选为乙酸盐-乙酸缓冲水溶液；

检测之前使用磷酸盐缓冲液稀释所述乳液，优选使用含有牛血清白蛋白、Tween-20的磷酸盐缓冲液稀释所述乳液。

5.权利要求1或2所述的方法在检测植物橡胶乳液中的小橡胶粒子蛋白含量的应用，所述植物为橡胶树或橡胶草，优选巴西橡胶树或蒲公英属橡胶草。

6.权利要求1或2所述的方法在橡胶草品系筛选中的应用，优选所述橡胶草为蒲公英属橡胶草，更优选为温带大陆地区的蒲公英属橡胶草。

7.一种橡胶草品系筛选方法，该技术使用权利要求1～4的方法进行，所述橡胶草优选为温带大陆地区的蒲公英属橡胶草。

8.一种表面等离子共振技术免疫传感器，该传感器包括芯片和固定于芯片上的小橡胶粒子蛋白单克隆抗体；所述抗体芯片具有金膜和羧甲基葡聚糖。

9.一种利用表面等离子共振技术技术来对植物橡胶乳液中的小橡胶粒子蛋白进行定量检测的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

1)将小橡胶粒子蛋白抗体固定化于表面等离子共振技术检测用芯片上，优选所述小橡胶粒子蛋白抗体为小橡胶粒子蛋白单克隆抗体或小橡胶粒子蛋白多克隆抗体，所述芯片上具有金膜和羧甲基葡聚糖；

2)配制标准溶液：将采集自巴西橡胶树的橡胶乳液以12000rpm离心20分钟后，将包含大量橡胶粒子的最上层收集或者将所述最上层和之下的第二层清液收集合并，得到纯化橡胶乳液，用含有0.1质量/体积％牛血清白蛋白、0.05体积/体积％Tween-20的pH为7.2的10mM磷酸盐缓冲液稀释所述纯化橡胶乳液，制备成浓度分别为50体积％、25体积％、12.5体积％、6体积％、3体积％、1.5体积％、0.5体积％的一系列纯化橡胶乳液标准稀释液，所述标准稀释液的浓度为所述纯化橡胶乳液的体积/(所述纯化橡胶乳液的体积+所述磷酸盐缓冲液的体积)x 100％；

3)建立标准曲线：用SPR检测仪和步骤1)中制备的固定有抗体的芯片对所述一系列纯化橡胶乳液标准稀释液进行检测，记录下所述各浓度下的响应值即共振单位RU值，以浓度为横轴、以各浓度下的RU值为纵轴绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归方程；

4)定量检测：采集待测植物中橡胶乳液，用步骤2、3)同样的方法对待测植物乳液进行纯化和检测，检测其中的小橡胶粒子蛋白的含量，得到共振单位RU值，或者使用毛细管吸取法采集待测植物中橡胶乳液，过膜过滤后，用SPR检测检测其中的小橡胶粒子蛋白的含量，得到共振单位RU值，将所得到的共振单位RU值代入回归方程，计算出相对于步骤2)中的所述采集自巴西橡胶树的橡胶乳液中的小橡胶粒子蛋白的、该待测植物乳液中的小橡胶粒子蛋白的相对含量；

5)每次检测完成后使芯片再生以用于下一次待测植物橡胶乳液的检测，所述再生优选通入NaOH水溶液并冲洗芯片表面来进行。