CN102297967B - 一种pvy/cmv表面等离子体共振检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种PVY/CMV表面等离子体共振检测方法，属于材料检测方法。本发明是通过下述几个步骤实现的：1、制备PVY/CMV抗原和单克隆体；2、制备生物传感器芯片；3、制作标准曲线，得到病毒计算公式；之后利用病毒计算公式测定PVY/CMV的含量。本发明利用表面等离子体波共振方法，灵敏度高，既可以定性、也可以定量的检测PVY/CMV，且操作方便，费用低廉。

Description

一种PVY/CMV表面等离子体共振检测方法
技术领域
本发明属于材料检测方法，具体涉及一种PVY/CMV检测方法
背景技术
CMV(烟草黄瓜花叶病毒)是一种多寄主病毒，除侵染烟草外，还侵染马铃薯、油菜、黄瓜、天仙子、尤葵、假醢浆、三生烟、昆诺尔藜、白肋烟、详酸浆、洋酸浆、心叶烟、苋色藜和蔓陀萝等多种植物。PVY(烟草马铃薯Y病毒)是一种多寄主病毒，除侵染烟草外，还侵染马铃薯、油菜、天仙子、尤葵、红嘴燕、假醢浆、三生烟、白肋烟、洋酸浆、心叶烟、苋色藜和蔓陀萝等多种植物。自1970s在我国发现CMV感染烟草、1980s在我国发现PVY感染烟草以来，CMV、PVY与烟草花叶病毒等一起感染烟草，造成烟草病毒病害和严重经济损失。由于CMV和PVY通过蚜虫传播，更增加了对该病害防治的难度。
CMV与PVY至今没有有效的防治方法，仍然是烟草生产中危害最大的病原。因此，CMV与PVY的防治应突出早检测、早预报、早防治。
检测CMV与PVY的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR检测法、核酸点杂交法、dsRNA法和免疫胶体金检测试纸条等，申请号为“200610160020.0”、专利名称为“烟草黄瓜花叶病毒田间快速检测试纸条的制备方法”介绍了一种快速检测CMV的方法。但是这些方法检测费用高，灵敏度低，只能定性不能定量，难以满足大量样品的快速以及现场检测的需要。
表面等离子体波共振(surface plasmon resonance，SPR)检测方法是基于分子间相互作用的检测技术。其原理是在光学全反射界面上的等离子体的共振吸收与界面上的分子状态有关，表现在入射光的强度、角度和相位发生变化。当全反射发生在固液界面上时，入射光的变化反映出溶液中分子与固体表面分子的吸附或结合。因此，通过在固体表面固化一种可以与溶液中待测物质发生反应的分子，就可以检测溶液中待测物的浓度。自1990年第一台商业化SPR检测仪问世以来，基于SPR原理的传感器及其应用研究有了快速发展。与常规检测技术相比，SPR技术具有高灵敏度、响应快、体积小、机械强度大、检测过程快捷、能够获得实时数据、操作方便、无须标记、可保持分子的生物活性、既可定性也可定量、可再生重复利用、抗电磁干扰能力强和光纤相连可实现数据的远程采集和连续在线监控等突出优点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是PVY/CMV病毒的检测方法费用高、灵敏度低、不能定量检测，提供一种费用低、灵敏度高、可以定量检测的PVY/CMV表面等离子体共振检测方法。
本发明的技术方案是以下述方式实现的：
一种PVY/CMV表面等离子体共振检测方法，是按照以下步骤进行的：
(一)制备PVY/CMV抗原和PVY/CMV单克隆体；
(二)制备生物传感器芯片；
a、芯片的制备
在平整的膜片上镀上40～60nm的金膜后用Piranha溶液清洗，再用纯水和无水乙醇淋洗；
b、基膜的固定
将芯片浸入MUOH的乙醇中12～20h，再用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
c、连接臂分子的固定
用等体积的NaOH和表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液的混合物与芯片上的MUOH反应4h活化羧基，之后将含有NaOH的右旋糖苷溶液加入芯片表面反应20h，再用等体积的NaOH和0.6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液混合物活化右旋糖苷表面4h，用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
d、PVY/CMV单抗体的固定
将芯片放入玻璃管中，加入EDC和NHS等体积的混合液反应10min(8～12min)活化羧基，之后用HEPES冲洗，再将步骤(一)制备的PVY单克隆抗体溶液注入到芯片表面，在25℃孵育16～22min后用乙醇胺-HCl于25℃处理10min以封闭未被活化的羧基，再用HEPES冲洗。
e、玻片的保存
将步骤d中制作好的玻片浸泡在10mM HEPES中在4℃保存。
(三)制作标准曲线，得到PVY/CMV病毒计算公式；
(四)、测定PVY/CMV的含量
I、制取PVY/CMV病毒粗提液；
II、取50μL病毒粗提液用HEPES稀释后注入SPR仪器中，测定其共振响应值RU，代入步骤(三)得到的标准计算公式即可求出样品中病毒的含量。
上述步骤(一)是按照以下步骤进行的：
①制备PVY/CMV抗原
②制备PVY/CMV单克隆体
i、首次免疫
选取4～6周龄雌性清洁级纯系BALV/c小鼠，用步骤①中制备的PVY/CMV抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射；
ii、间隔免疫
首次免疫两周后，用浓度为0.3mg/ml的PVY/CMV与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后注射小鼠，间隔两周后注射同样试剂；
iii、加强免疫
在步骤ii实施两周后，用0.3mg/ml的PVY/CMV对小鼠进行注射；
iv、细胞融合
加强免疫后第三天，取免疫小鼠细胞与骨髓瘤细胞在PEG400溶液下融合；
v、融合细胞的培养
将融合后的细胞在HAT培养基中选择培养7～10天，之后在HT培养基中培养14天，然后在DMEM基中培养；
vi、制备杂交瘤细胞
筛选步骤v中的阳性细胞后亚克隆阳性细胞，之后将细胞扩大培养得到杂交瘤细胞；
vii、获得PVY/CMV单克隆体
给8～10周龄的BALB/c小鼠注射灭菌液体，7天后注射步骤vi中得到的杂交瘤细胞，6～8天后收集小鼠腹水单克隆体，腹水经凝胶过滤或Protein A/G亲和层析法纯化获得PVY单克隆抗体。
上述步骤①是按照以下述步骤进行的：
(1)取感染PVY/CMV的发病烟草叶片，加两倍体积的PBS溶液，研碎、过滤；
(2)在步骤(1)所得滤液中加7～9％正丁醇，搅拌12～18min；
(3)取步骤(2)所得滤液10000g离心30min，弃沉淀得上清液；
(4)将步骤(3)所得上清液中加入3～5％PEG、2～4％NaCl搅拌至溶解，4℃冰箱内保存；
(5)取步骤(4)所得溶液10000g离心12～18min，弃上清液得沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于0.01mol/L PBS缓冲液中，之后离心12～18min，弃沉淀取上清；
(7)将步骤(6)所得上清液按每10ml加入0.4g NaCl及0.4g PEG，搅拌至溶解，然后放置于4℃冰箱内保存；
(8)取步骤(7)所得溶液10000g离心12～18min，弃上清液得沉淀，之后用PBS将沉淀物溶解；
(9)取步骤(8)所得溶液10000g离心12～18min，弃沉淀得到粗提纯病毒液，将粗提纯的病毒液体保存在4℃冰箱内即可；
(10)将1.6ml粗提纯病毒液加入蔗糖梯度柱上，超速离心1.5h，提出上清液中形成的条带后脱糖，脱糖后超速离心1.5h，弃上清，用PBS缓冲液溶解所得的沉淀物，即得到精提纯病毒液。
上述步骤vii中所述的灭菌液体是灭菌石蜡或者降植烷。
本发明利用表面等离子体波共振方法，灵敏度高，既可以定性、也可以定量的检测PVY/CMV，表面等离子体波共振方法检测时候需要制备PVY/CMV生物传感器芯片，之后制作标准曲线，得出计算公式；之后在测取植物中的PVY/CMV病毒的时候，只需提取PVY/CMV病毒粗提液，之后注入SPR仪器测定共振响应值RU，带入标准计算公式即可。当得出标准曲线和计算公式之后，可以多次测量提取的PVY/CMV病毒，操作方便，费用低廉。
附图说明
图1是PVY溶液标准测试曲线；
图2是CMV溶液标准测试曲线。
具体实施方式
实施例1
一种PVY表面等离子体共振检测方法，是按照以下步骤进行的：
(一)制备PVY抗原和PVY单克隆体；
(二)制备生物传感器芯片；
a、芯片的制备
在平整的膜片上镀上40～60nm的金膜后用Piranha(98％的浓硫酸与30％的H2O2按照7∶3的比例得到的混合液)溶液清洗，再用纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
b、基膜的固定
将芯片浸入10mM MUOH(11-11-巯基-1-十一醇)的乙醇中12～20h，再用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
c、连接臂分子的固定
用等体积的0.4M NaOH和0.6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液的混合物与芯片上的单层MUOH反应4h以活化羧基，之后将含有0.1M NaOH的右旋糖苷溶液(0.3g/mL)加入芯片表面反应20h，再用等体积的0.4M NaOH和0.6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液混合物活化右旋糖苷表面4h，用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
d、PVY单抗体的固定
将芯片放入玻璃管中，加入EDC和NHS等体积的混合液(0.4mol/LEDC和0.1mol/L NHS)反应18～12min活化羧基，之后用HEPES冲洗，再将步骤(一)制备的PVY单克隆抗体溶液注入到芯片表面，在25℃孵育16～22min后用乙醇胺-HCl于25℃处理10min以封闭未被活化的羧基，再用HEPES冲洗。
EDC和NHC的用法和作用可参考《华南理工大学学报：自然科学版》，2007年第35卷第12期，王迎军等作者的《EDC/NHS交联对胶原物理化学性能的影响》。
e、玻片的保存
将步骤d中制作好的玻片浸泡在10mM HEPES(PH＝7.4)中在4℃保存。
(三)制作标准曲线，得到PVY病毒计算公式；
取PVY病毒纯化溶液的冻干粉，用10mM HEPES(pH 7.4)配制5个标准溶液，浓度分别是1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、8.0μg/ml、16和32μg/ml。
使用10mM HEPES(pH 7.4)走基线，待基线走稳之后进样，记录曲线平台期数值作为响应值(RU)，每个样品检测3次取平均值。各次检测之间使用0.2M的甘氨酸盐酸盐(PH2.5-3)溶液再生敏感膜，并用10mM HEPES(pH 7.4)走基线。不同浓度的病毒溶液测得的RU值见表1。
表1
Figure BSA00000163906700061
由表1数据制作的标准曲线见图1，可得到标准曲线方程是y＝-7.2338x+356.96。
(四)、测定PVY的含量
I、制取PVY病毒粗提液；
新鲜的烟叶去除叶柄和主脉后取1g，加2mL 10mM HEPES(pH 7.4)，研碎，过滤，上清即为病毒粗提液，将病毒粗提液保存于4℃冰箱内备用。
II、取50μL病毒粗提液用HEPES稀释后注入SPR仪器中，测定其共振响应值RU，代入步骤(三)得到的标准计算公式即可求出样品中病毒的含量。
所述步骤(一)是按照以下步骤进行的：
①制备PVY抗原
②制备PVY单克隆体
i、首次免疫
选取4～6周龄雌性清洁级纯系BALV/c小鼠，用步骤①中制备的PVY抗原(0.3mg/mL)与等量弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射，剂量为0.5ml/只，共注射5只小鼠；
ii、间隔免疫
首次免疫两周后，用浓度为0.3mg/ml的PVY与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后注射小鼠，间隔两周后注射同样试剂，剂量为0.25ml/g；
iii、加强免疫
在步骤ii实施两周后，用0.3mg/ml的PVY对小鼠进行注射；
iv、细胞融合
加强免疫后第三天，取免疫小鼠细胞(1×108个细胞)与骨髓瘤细胞SP2/0(1×107个细胞)在500g/l PEG400溶液作用下融合；
v、融合细胞的培养
将融合后的细胞在HAT培养基(含有黄嘌呤hypoxanti、氨基蝶呤aminopterin和胸腺嘧啶脱氧核苷thymidin的培养基)中选择培养7～10天，之后在HT培养基中(含有黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基)培养14天，然后在DMEM基中培养；
vi、制备杂交瘤细胞
采用间接ELISA法筛选步骤v中的阳性细胞，同时以免疫小鼠血清为阳性对照，以SP2/0细胞培养上清为阴性对照，之后采用有限稀释法对鉴定出来的阳性克隆细胞连续亚克隆，至每株细胞亚克隆阳性率达到100％，细胞扩大培养后得到杂交瘤细胞，液氮冻存；
vii、获得PVY单克隆体
给8～10周龄的BALB/c小鼠注射灭菌液体(灭菌石蜡或者降植烷)，剂量是0.5mL/只，7天后注射步骤vi中得到的杂交瘤细胞，剂量是0.5mL/只，6～8天后收集小鼠腹水单克隆体，腹水经凝胶过滤或Protein A/G亲和层析法纯化获得PVY单克隆抗体。
Protein A亲和层析法可见《大连医科大学学报》，2008年第30卷第2期，李桂新等作者的《应用ProteinA亲和层析法制备及纯化RIJHL单克隆体》；ProteinG亲和层析法可见《苏州大学》，2003年的硕士学位论文《鼠抗人1-1BBL分子功能性单克隆体的研制及其生物学特性的研究》。
所述步骤①是按照以下述步骤进行的：
(1)取感染PVY/CMV的发病烟草叶片，加两倍体积的PBS溶液，研碎、过滤；
(2)在步骤(1)所得滤液中加7～9％正丁醇，搅拌12～18min；
(3)取步骤(2)所得滤液10000g离心30min，弃沉淀得上清液；
(4)将步骤(3)所得上清液中加入3～5％PEG、2～4％NaCl搅拌至溶解，4℃冰箱内保存；
(5)取步骤(4)所得溶液10000g离心12～18min，弃上清液得沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于0.01mol/L PBS缓冲液中，之后离心12～18min，弃沉淀取上清；
(7)将步骤(6)所得上清液按每10ml加入0.4g NaCl及0.4g PEG，搅拌至溶解，然后放置于4℃冰箱内保存；
(8)取步骤(7)所得溶液10000g离心12～18min，弃上清液得沉淀，之后用PBS将沉淀物溶解；
(9)取步骤(8)所得溶液10000g离心12～18min，弃沉淀得到粗提纯病毒液，将粗提纯的病毒液体保存在4℃冰箱内即可；
(10)将1.6ml粗提纯病毒液加入蔗糖梯度柱上，超速离心1.5h，提出上清液中形成的条带后脱糖，脱糖后超速离心1.5h，弃上清，用PBS缓冲液溶解所得的沉淀物，即得到精提纯病毒液。
测试实例：分别取2个来自不同烟区感烟PVY病毒程度不同的烟叶各1g，分别加2mL 10mM HEPES(pH 7.4)，研碎，过滤，取上清液，上清液定容至5mL，分别取1ml稀释至10ml上样，测得的RU值分别是334和209，代入标准曲线方程y＝-7.2338x+356.96，计算得2个稀释液的病毒浓度分别是3.17μg/ml和20.45μg/ml，则2个样品烟叶中PVY的含量分别是0.16mg/g鲜叶和1.02mg/g鲜叶。
实施例2
所述步骤a中，膜片上镀上40～45nm厚的金膜；步骤b中将芯片浸入MUOH的乙醇中12～14h。其他步骤同实施例1。
实施例3
所述步骤a中，膜片上镀上45～50nm厚的金膜；步骤b中将芯片浸入MUOH的乙醇中14～16h。其他步骤同实施例1。
实施例4
所述步骤a中，膜片上镀上50～55nm厚的金膜；步骤b中将芯片浸入MUOH的乙醇中16～18h。其他步骤同实施例1。
实施例5
所述步骤a中，膜片上镀上55～60nm厚的金膜；步骤b中将芯片浸入MUOH的乙醇中18～20h。其他步骤同实施例1。
实施例6
一种CMV表面等离子体共振检测方法，是按照以下步骤进行的：
(一)制备CMV抗原和CMV单克隆体；
(二)制备生物传感器芯片；
a、芯片的制备
在平整的膜片上镀上40～60nm(比如说40、45、50、55或60nm)的金膜后用Piranha(98％的浓硫酸与30％的H2O2按照7∶3的比例得到的混合液)溶液清洗，再用纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
b、基膜的固定
将芯片浸入MUOH的乙醇中12～20h，再用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
c、连接臂分子的固定
用等体积的0.4M NaOH和0.6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液的混合物与芯片上的单层MUOH反应4h以活化羧基，之后将含有0.1M NaOH的右旋糖苷溶液(0.3g/mL)加入芯片表面反应20h，再用等体积的0.4M NaOH和0.6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液混合物活化右旋糖苷表面4h，用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
d、CMV单抗体的固定
将芯片放入玻璃管中，加入EDC和NHS等体积的混合液(0.4mol/LEDC和0.1mol/L NHS)反应18～12min活化羧基，之后用HEPES冲洗，再将步骤(一)制备的CMV单克隆抗体溶液注入到芯片表面，在25℃孵育16～22min后用乙醇胺-HCl于25℃处理10min以封闭未被活化的羧基，再用HEPES冲洗。
e、玻片的保存
将步骤d中制作好的玻片浸泡在10mM HEPES(PH＝7.4)中在4℃保存。
(三)制作标准曲线，得到CMV病毒计算公式；
取CMV病毒纯化溶液的冻干粉，用10mM HEPES(pH 7.4)配制5个标准溶液，浓度分别是1.0μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml、8.0μg/ml、16和32μg/ml。
使用10mM HEPES(pH 7.4)走基线，待基线走稳之后进样，记录曲线平台期数值作为响应值(RU)，每个样品检测3次取平均值。各次检测之间使用0.2M的甘氨酸盐酸盐(PH2.5-3)溶液再生敏感膜，并用10mM HEPES(pH 7.4)走基线。不同浓度的病毒溶液测得的RU值见表2。
表2
Figure BSA00000163906700111
由表2数据制作的标准曲线见图2，标准曲线方程是y＝-5.1997x+365.26。
(四)、测定CMV的含量
I、制取CMV病毒粗提液；
新鲜的烟叶去除叶柄和主脉后取1g，加2mL 10mM HEPES(pH 7.4)，研碎，过滤，上清即为病毒粗提液，将病毒粗提液保存于4℃冰箱内备用。
II、取50μL病毒粗提液用HEPES稀释后注入SPR仪器中，测定其共振响应值RU，代入步骤(三)得到的标准计算公式即可求出样品中病毒的含量。
所述步骤(一)是按照以下步骤进行的：
①制备CMV抗原
②制备CMV单克隆体
i、首次免疫
选取4～6周龄雌性清洁级纯系BALV/c小鼠，用步骤①中制备的CMV抗原(0.3mg/mL)与等量弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射，剂量为0.5ml/只，共注射5只小鼠；
ii、间隔免疫
首次免疫两周后，用浓度为0.3mg/ml的CMV与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后注射小鼠，间隔两周后注射同样试剂，剂量为0.25ml/g；
iii、加强免疫
在步骤ii实施两周后，用0.3mg/ml的CMV对小鼠进行注射；
iv、细胞融合
加强免疫后第三天，取免疫小鼠细胞(1×108个细胞)与骨髓瘤细胞SP2/0(1×107个细胞)在500g/l PEG400溶液作用下融合；
v、融合细胞的培养
将融合后的细胞在HAT培养基(含有黄嘌呤hypoxanti、氨基蝶呤aminopterin和胸腺嘧啶脱氧核苷thymidin的培养基)中选择培养7～10天，之后在HT培养基中(含有黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养基)培养14天，然后在DMEM基中培养；
vi、制备杂交瘤细胞
采用间接ELISA法筛选步骤v中的阳性细胞，同时以免疫小鼠血清为阳性对照，以SP2/0细胞培养上清为阴性对照，之后采用有限稀释法对鉴定出来的阳性克隆细胞连续亚克隆，至每株细胞亚克隆阳性率达到100％，细胞扩大培养后得到杂交瘤细胞，液氮冻存；
vii、获得CMV单克隆体
给8～10周龄的BALB/c小鼠注射灭菌液体(灭菌石蜡或者降植烷)，剂量是0.5mL/只，7天后注射步骤vi中得到的杂交瘤细胞，剂量是0.5mL/只，6～8天后收集小鼠腹水单克隆体，腹水经凝胶过滤或Protein A/G亲和层析法纯化获得CMV单克隆抗体。
所述步骤①是按照以下述步骤进行的：
(1)取感染CMV/CMV的发病烟草叶片，加两倍体积的PBS溶液，研碎、过滤；
(2)在步骤(1)所得滤液中加7～9％正丁醇，搅拌12～18min；
(3)取步骤(2)所得滤液10000g离心30min，弃沉淀得上清液；
(4)将步骤(3)所得上清液中加入3～5％PEG、2～4％NaCl搅拌至溶解，4℃冰箱内保存；
(5)取步骤(4)所得溶液10000g离心12～18min，弃上清液得沉淀；
(6)将步骤(5)所得沉淀物溶于0.01mol/L PBS缓冲液中，之后离心12～18min，弃沉淀取上清；
(7)将步骤(6)所得上清液按每10ml加入0.4g NaCl及0.4g PEG，搅拌至溶解，然后放置于4℃冰箱内保存；
(8)取步骤(7)所得溶液10000g离心12～18min，弃上清液得沉淀，之后用PBS将沉淀物溶解；
(9)取步骤(8)所得溶液10000g离心12～18min，弃沉淀得到粗提纯病毒液，将粗提纯的病毒液体保存在4℃冰箱内即可；
(10)将1.6ml粗提纯病毒液加入蔗糖梯度柱上，超速离心1.5h，提出上清液中形成的条带后脱糖，脱糖后超速离心1.5h，弃上清，用PBS缓冲液溶解所得的沉淀物，即得到精提纯病毒液。
测试实例：分别取2个来自不同烟区感染CMV程度不同的烟叶各1g，分别加2mL 10mM HEPES(pH 7.4)，研碎，过滤，取上清液，上清液定容至5mL，分别取1ml稀释至10ml上样，测得的RU值分别是320和219，代入标准曲线方程y＝-5.1997x+365.26，计算得2个稀释液的病毒浓度分别是8.70μg/ml和20.45μg/ml，则2个样品烟叶中PVY的含量分别是0.43mg/g鲜叶和1.41mg/g鲜叶。
实施例7
所述步骤a中，膜片上镀上40～45nm厚的金膜；步骤b中将芯片浸入MUOH的乙醇中12～14h。其他步骤同实施例6。
实施例8
所述步骤a中，膜片上镀上45～50nm厚的金膜；步骤b中将芯片浸入MUOH的乙醇中14～16h。其他步骤同实施例6。
实施例9
所述步骤a中，膜片上镀上50～55nm厚的金膜；步骤b中将芯片浸入MUOH的乙醇中16～18h。其他步骤同实施例6。
实施例10
所述步骤a中，膜片上镀上55～60nm厚的金膜；步骤b中将芯片浸入MUOH的乙醇中18～20h。其他步骤同实施例6。

Claims (3)

1. 一种PVY/CMV表面等离子体共振检测方法，其特征在于是按照以下步骤进行的：
（一）制备PVY/CMV抗原和PVY/CMV单克隆抗体；所述步骤（一）是按照以下步骤进行的：
① 制备PVY/CMV 抗原
② 制备PVY/CMV 单克隆抗体
ⅰ、首次免疫
选取4-6周龄雌性清洁级纯系BALV/c小鼠，用步骤①中制备的PVY/CMV抗原与等量弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射；
ⅱ、间隔免疫
首次免疫两周后，用浓度为0.3mg/ml 的PVY/CMV 与等量弗氏不完全佐剂充分乳化后注射小鼠，间隔两周后注射同样试剂；
ⅲ、加强免疫
在步骤ⅱ实施两周后，用0.3mg/ml的PVY/CMV对小鼠进行注射；
ⅳ、细胞融合
加强免疫后第三天，取免疫小鼠细胞与骨髓瘤细胞在PEG400 溶液下融合；
ⅴ、融合细胞的培养
将融合后的细胞在HAT培养基中选择培养7-10天，之后在HT 培养基中培养14天，然后在DMEM基中培养；
ⅵ、制备杂交瘤细胞
筛选步骤ⅴ中的阳性细胞后亚克隆阳性细胞，之后将细胞扩大培养得到杂交瘤细胞；
ⅶ、获得PVY/CMV单克隆抗体
给8-10 周龄的BALB/c小鼠注射灭菌液体，7天后注射步骤ⅵ中得到的杂交瘤细胞，6-8天后收集小鼠腹水单克隆抗体，腹水经凝胶过滤或Protein A/G 亲和层析法纯化获得PVY 单克隆抗体；
（二）制备生物传感器芯片
a、芯片的制备
在平整的膜片上镀上40-60nm的金膜后用Piranha溶液清洗，再用纯水和无水乙醇淋洗；
b、基膜的固定
将芯片浸入MUOH 的乙醇中12-20h，再用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
c、连接臂分子的固定
用等体积的NaOH和表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液的混合物与芯片上的MUOH反应4h活化羧基，之后将含有NaOH的右旋糖苷溶液加入芯片表面反应20h，再用等体积的NaOH和0.6M表氯醇的二乙二醇二甲醚溶液混合物活化右旋糖苷表面4h，用超纯水和无水乙醇淋洗，氮气吹干；
d、PVY/CMV 单抗体的固定
将芯片放入玻璃管中，加入EDC和NHS等体积的混合液反应8-12min活化羧基，之后用HEPES冲洗，再将步骤（一）制备的PVY 单克隆抗体溶液注入到芯片表面，在25℃孵育16-22min后用乙醇胺-HCl于25℃处理10min以封闭未被活化的羧基，再用HEPES冲洗；
e、玻片的保存
将步骤d 中制作好的玻片浸泡在10mM HEPES中在4℃保存；
（三）制作标准曲线，得到PVY/CMV病毒计算公式；
（四）、测定PVY/CMV的含量
Ⅰ、制取PVY/CMV病毒粗提液；
II、取50μL病毒粗提液用HEPES 稀释后注入SPR 仪器中，测定其共振响应值RU，代入步骤（三）得到的标准计算公式即可求出样品中病毒的含量。
2.根据权利要求1 所述的PVY 表面等离子体共振检测方法，其特征在于所述步骤①是按照以下述步骤进行的：
（1）取感染PVY/CMV 的发病烟草叶片，加两倍体积的PBS溶液，研碎、过滤；
（2）在步骤（1）所得滤液中加7-9%正丁醇，搅拌12-18min；
（3）取步骤（2）所得滤液10000g离心30min，弃沉淀得上清液；
（4）将步骤（3）所得上清液中加入3-5% PEG、2-4%NaCl搅拌至溶解，4℃冰箱内保存；
（5）取步骤（4）所得溶液10000g离心12-18min，弃上清液得沉淀；
（6）将步骤（5）所得沉淀物溶于0.01mol/LPBS缓冲液中，之后离心12-18min，弃沉淀取上清；
（7）将步骤（6）所得上清液按每10ml加入0.4g NaCl及0.4gPEG，搅拌至溶解，然后放置于4℃冰箱内保存；
（8）取步骤（7）所得溶液10000g离心12-18min，弃上清液得沉淀，之后用PBS 将沉淀物溶解；
（9）取步骤（8）所得溶液10000g离心12-18min，弃沉淀得到粗提纯病毒液，将粗提纯的病毒液体保存在4℃冰箱内即可；
（10）将1.6ml 粗提纯病毒液加入蔗糖梯度柱上，超速离心1.5h，提出上清液中形成的条带后脱糖，脱糖后超速离心1.5h，弃上清，用PBS 缓冲液溶解所得的沉淀物，即得到精提纯病毒液。
3.根据权利要求2 所述的PVY/CMV表面等离子体共振检测方法，其特征在于：步骤ⅶ中所述的灭菌液体是灭菌石蜡或者降植烷。
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