CN1611942A - Cmv云南分离物tas-elisa检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
Cmv云南分离物tas-elisa检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1611942A CN1611942A CN 200410033664 CN200410033664A CN1611942A CN 1611942 A CN1611942 A CN 1611942A CN 200410033664 CN200410033664 CN 200410033664 CN 200410033664 A CN200410033664 A CN 200410033664A CN 1611942 A CN1611942 A CN 1611942A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cmv
- kit
- add
- antibody
- pbst
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 11
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 claims abstract description 74
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 42
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 19
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 43
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 42
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 36
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 35
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 35
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 32
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 27
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 25
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 21
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 claims description 20
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 17
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 16
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 16
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 13
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 11
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 9
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 8
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 8
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical group OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000208296 Datura Species 0.000 claims description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 4
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 4
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 4
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 4
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 3
- 239000000779 smoke Substances 0.000 claims description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims 2
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 claims 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 claims 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 abstract 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000008676 import Effects 0.000 description 4
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 241000709992 Potato virus X Species 0.000 description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 2
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 2
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 2
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 241000702463 Geminiviridae Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- -1 nti-control Species 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaicvirus,CMV)云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒及其制备方法,属于酶学或生物学装置领域。本发明试剂盒包含阳性对照、阴性对照、CMV多克隆抗体、CMV单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品,其中,CMV多克隆抗体在分离提纯CMV云南分离物后,通过家兔免疫分离血清得到;CMV单克隆抗体在分离提纯CMV云南分离物后,通过小鼠免疫、细胞融合、克隆纯化得到。本发明制备的TAS-ELISA检测试剂盒试剂成本仅2元人民币/样次,最低检出浓度达到0.01ng/ml,在性价比上具有明显的市场竞争力。
Description
技术领域:
本发明涉及一种黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒及其制备方法,属于酶学或生物学装置领域。
背景技术:
植物病毒是农作物病毒病害的重要病原,随着植物脱病毒种苗产业化的发展和现代设施农业的兴起,植物病毒的检测与防控技术日益受到重视。目前植物病毒的检测技术有血清学技术、指示植物测定、电子显微镜检测、分子检测(包括对病毒核酸及蛋白的检测)4个方面的方法。各种方法相互印证,同时又存在检测的灵敏度、专化性、设备设施条件及成本等因素的局限。各国都在探索简便、快速、准确而又经济的检测办法,其中以血清学反应原理为基础的酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked immunosorbent assay,ELISA)是被广泛改进和应用的方法。
1969年,Avrameas将酶联抗体应用于血清学技术中,1971年,Engvall和Perlmann将该方法进一步完善发明了ELISA方法。1974年,Voller等将ELISA技术应用于人和动物的抗体检测,Voller等和Clark、Adams分别于1976年和1977年将ELISA方法应用于植物病毒的检测。之后,ELISA方法得到进一步发展,并广泛应用于人和动植物病毒的检测中。与其它检测方法相比,ELISA方法具有成本显著降低,检测的设备设施简单,快速高效的特点,并始终在不断被改进中,有直接ELISA、间接ELISA(I-ELISA)、单抗体ELISA(SPA-ELISA)、微波ELISA、双抗体夹心ELISA(Double-antibody sandwich-ELISA,DAS-ELISA)等。目前市售的ELISA检测试剂盒主要有I-ELISA和DAS-ELISA。如美国的Agdia公司,英国的PD公司、意大利的Agritest公司、德国的Loewe生物技术公司、瑞士的BIOREBA公司是植物病毒检测试剂盒的主要营销公司。我国的植物病毒检测试剂盒销售公司大多为这些公司的代理或进口试剂盒分装销售,也有自行研制的报道,但涉及植物病毒种类较少。
目前市售的ELISA检测试剂盒可用于脱毒种苗和植物病毒样品的批量化检测,但同时也存在非特异性反应(即假阳性或假阴性反应)、检测灵敏度不够高(一般为1ng/ml-10ng/ml病毒浓度)。尤其在我国,许多种类的植物病毒抗体依赖于进口,一方面受到进口血液制品的限制,难以稳定供应,另一方面国外的抗体生产成本高而导致价格昂贵,未能满足生产的需求。近年来国外的相关公司对植物病毒检测试剂盒进行了改进,进一步简化了操作程序,如英国PD公司的试纸条检测方法已实现商品化生产,但价格高昂,每样次的检测需100多元人民币。国内外生产中规模化应用的仍然是I-ELISA和DAS-ELISA检测试剂盒,根据病毒种类的不同,每样次的试剂成本约10-30元人民币不等。
Roggero和Ogliara等1996年在DAS-ELISA基础上,加入单克隆抗体,开展了番茄班萎病毒(TSWV)的三抗体夹心ELISA(Triple-antibody sandwich ELISA,TAS-ELISA)检测,继承了DAS-ELISA简便快速的优势,同时结合了单克隆抗体专化性强、灵敏度高的特点,可高效、快速和灵敏地检测待测样中的病毒抗原。
近年来,已经用TAS-ELISA检测了双生病毒云南分离物,郭兴启等(2003)应用TAS-ELISA检测了马铃薯X病毒(PVX)和马铃薯Y病毒(PVY)、美国和我国台湾分别报道了TAS-ELISA检测康乃馨蚀环病毒(CarERV)和坏死病毒(LNV),Franconi(2002)报道了TAS-ELISA检测PVX,Bowman等(2002)应用该办法检测黄瓜花叶病毒(CMV),Tavert等(2002)应用TAS-ELISA检测烟草花叶病毒(TMV)运动蛋白。
迄今为止,TAS-ELISA方法研究植物病毒的报道近年有所增加,但专门研制TAS-ELISA检测试剂盒应用于植物病毒的规模化检测尚未见报道,而且市场上尚无TAS-ELISA检测试剂盒。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)云南分离物三抗体夹心酶联免疫吸附测定(TAS-ELISA)检测试剂盒的制备方法。
本发明试剂盒包含阳性对照、阴性对照、CMV多克隆抗体、CMV单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品,将阳性对照、阴性对照、CMV多克隆抗体、CMV单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品组装,得到试剂盒;其它材料和药品包括包被缓冲液、PBST、病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、5块酶标板及20个一次性滴管;其中,CMV多克隆抗体在分离提纯CMV云南分离物后,通过家兔免疫分离血清得到;CMV单克隆抗体在分离提纯CMV云南分离物后,通过小鼠免疫、细胞融合、克隆纯化得到。
CMV云南分离物通过采集含有CMV样品病株的枯斑、接种后采集病株经提纯得到。
采集病株的过程为:取典型病株样品,经电子显微镜和标准抗体检测含有大量CMV,采集后接种曼陀罗,含CMV样品产生枯斑,取枯斑加缓冲液接种无病毒种苗,7-15天表现出典型症状后采集放入-70℃冰箱中保存备用。
同时,制备抽提缓冲液,为0.2M的柠檬酸缓冲液(pH7.2,含0.2%巯基乙醇)。
提纯过程为:
1)取病叶,加1-3倍体积单位的抽提缓冲液(W∶V,即1mg病叶加1-3mL抽提缓冲液),电动搅拌机充分匀浆,双层纱布过滤。滤液中加入30%氯仿,4℃,搅拌30min,3000rpm离心15min,收集上清;
2)上清中加入7%PEG,0.15M NaCl,溶解后在4℃下放置4h或过夜,然后在4℃下进行离心,离心转速10000rpm,离心时间为20min,收集沉淀:
3)将沉淀用0.02M柠檬酸缓冲液(pH7.4)悬浮,然后在4℃下离心,转速10000rpm,时间为10min,取上清液;
将上清液在110000rpm下离心,时间为2h;沉淀用0.02M柠檬酸缓冲液(pH7.4)悬浮过夜;使用分子筛过滤,在254nm峰处收集,将收集液离心,转速110000rpm,离心时间为2h,得到上清液,即病毒提纯液。
对病毒纯度及含量进行检测。具体内容如下:
电镜负染法检测病毒的纯度:病毒提纯液上置电镜铜网吸附3min,2%钼酸铵染色3min,放置5min,置于JEM100CX-II型透射电子显微镜下观察。
紫外分光光度仪检测病毒的纯度及含量:病毒提纯液用PBS缓冲液稀释10倍于BECKMANDU640型紫外分光光度仪上测定190nm-450nm全波长扫描图、260nm和280nm吸收值。
病毒提纯液为乳白色液体,电镜下观察含较大量的CMV病毒粒子,未见杂质,经紫外分光光度仪检测,190nm-450nm全波长扫描图显示为典型病毒扫描图,提纯样品稀释100倍液中A260=0.495,A280=0.424,A260/A280=0.858,病毒浓度=A260/A0.1% 260=4.087mg/ml。
CMV多克隆抗体的制备:
1)选用2公斤以上健康雄性家兔作为免疫动物,将CMV病毒提纯液稀释至1mg/ml,作为免疫抗原,4℃下保存;
2)进行免疫注射,将1ml CMV抗原加1ml福氏完全佐剂,充分混合,在家兔背部皮下多点注射,每点0.2ml;一周后,将1mlCMV抗原加1ml福氏完全佐剂,充分混合,家兔双后足足垫注射,每点1ml;一周后,将1mlCMV抗原耳静脉注射;一周后,取2ml CMV抗原,耳静脉注射;7-10天后,心脏全采血,分离血清,加入0.1%NaN3,-70℃保存,得CMV多克隆抗体。
CMV多克隆抗体效价测定:稀释病毒提纯液至0.01mg/ml,备用;将上述抗血清倍比稀释为:1/10、1/20、1/40......1/20480,以间接ELISA法测定抗体效价为1∶2560。
CMV多克隆抗体灵敏度测定:稀释抗血清至1mg/ml,备用。将病毒提纯液稀释为:1mg/ml、0.1mg/ml 0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml、0.000001mg/ml,以间接ELISA法测定抗体灵敏度,即最低检出浓度达0.01ng/ml。
CMV单克隆抗体的制备:
1)选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫,并取它们的脾细胞作细胞融合,将CMV提纯病毒稀释至1mg/ml,作为免疫抗原,4℃下保存;
2)CMV单克隆抗体制备,提纯病毒液免疫雌性小鼠,经细胞融合、ELISA筛选、克隆,生产和贮存,单克隆抗体亚类鉴定,纯化,真空冷冻干燥,得CMV单克隆抗体。
CMV单克隆抗体效价测定:筛选出一个CMV广谱单克隆抗体细胞株,间接ELISA测定抗体效价为1∶10000。
试剂盒的组装:
1)选择每个试剂盒可检测500个样次的抗体及药品试剂量进行组装;
2)阳性对照:采用温室中盆栽保存的病株采集病叶,加入病毒抽提缓冲液研磨,2000g离心10min,取上清在冷冻干燥机中制备成粉末状,作为阳性对照,分装为1000mg/每管,-20℃保存,使用时向管中加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释;
3)阴性对照:应用试管苗保存的无病毒烟叶作为阴性对照,制备方法同阳性对照;分装为1000mg/每管,-20℃保存,使用时向管中加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释;
4)CMV多克隆抗体:上述制备的抗血清中加0.1%叠氮化钠(NaN3),作为防腐,无菌分装后,密封、冷贮(-70℃)、备用。使用单位购买后,可保存于4℃中,不宜反复冻融,有效期2年。每个试剂盒中100ul(按1∶500稀释);
5)单克隆抗体:上述制备的抗体中加0.1%叠氮化钠(NaN3),作为防腐,无菌分装后,密封,4℃保存,备用。每个试剂盒中100ul(按1∶500稀释);
6)酶标抗体:Sigma公司购买,分装,4℃保存,备用。每个试剂盒中5ul(按1∶10000稀释);
7)其他材料及药品:按溶液体积称量分装,常温下保存。具体用量如下:
①包被缓冲液:每个试剂盒中4.52g(1.59g Na2CO3+2.93g NaHCO3);使用时,加1000ml双蒸水,将1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶解于1000ml双蒸水中,调pH值为9.6;
②PBST:每个试剂盒中90.4g或124.8g,使用时加8000ml双蒸水,加入0.5%的tween20;每1000mlPBST含有(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、0.2g KCl、2.9g Na2HPO4·2H2O)或者(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、0.2g KCl、7.2g Na2HPO4·12H2O);
③病毒抽提缓冲液:每个试剂盒中10ml(10ml PBST中溶解1.3g Na2SO3和0.2gNaN3),按1∶100使用;使用时,加入1000ml PBST,调pH值为7.4;
④封闭缓冲液:PBST中加入5%的脱脂奶粉,溶解,即用即配;
⑤底物缓冲液:每个试剂盒中10ml(10ml的10%乙二醇胺(pH=9.8)溶解500mg底物),按1∶10使用;使用时用100ml的10%乙二醇胺(pH=9.8)稀释;底物为硝基苯磷酸盐(p-NPP),500mg/试剂盒;
⑥酶标板5块,一次性滴管20个。
CMV云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒的检测规程:
A.CMV多抗血清(1∶500)加入酶标板(包被缓冲液稀释),每孔100ul,37℃下放置3h。
B.PBST洗板6次,快速3次,慢速3次(3min/次),拍干。
C.样品加入病毒抽提缓冲液(约5-10倍)研磨样品,加入加入酶标板,每孔100ul,4℃下放置过夜。
D.同上洗板。
E.每孔加入150ul封闭缓冲液,37℃下放置30min。
F.抛弃孔中液体,拍干。
G.CMV单抗(1∶500)(PBST稀释),加入酶标板,每孔100ul,37℃下放置3h。
H.同上洗板。
I.羊抗鼠AP-IgG(1∶10000)(PBST稀释),加入酶标板,每孔100ul,37℃下放置3h。
J.同上洗板。
K.用底物缓冲液溶解底物(1mg/ml),加入酶标板,每孔100ul,室温(25℃)下至充分显色(每孔加入50ul 1N NaOH终止显色)。肉眼或酶标仪读数。
应用酶标仪进行检测结果判别时,记录酶标仪在405nm波长下酶标板每孔的OD数值,首先进行空白孔系统调零,若空白孔出现明显的颜色反应,或经空白孔调零后,系统检测出现大量的负值时,整个系统测定无效;每一样品测定双孔的OD值应基本一致,若两孔测定值差别较大(一般指同一样品相同稀释度两孔的OD值超过其均值的0.5-1.5倍范围),该酶标板测定无效。若阳性对照OD值低于或接近阴性对照OD值时,测定也无效。待测样品OD值与阴性对照OD值检测之比大于等于2.1时,待测样品为阳性,否则为阴性。
肉眼判别检测结果时,首先也是观察空白孔、阴性孔、阳性孔的颜色,若空白孔、阴性孔颜色较深或阳性孔无颜色或颜色较浅时,则本块酶标板测定无效。目测待测样品颜色反应与阴性对照颜色反应深浅对比,较深则为阳性,较浅则为阴性。
检测灵敏度达到0.001ng/ml,与电镜检测结果比较准确率相符,比间接ELISA和DAS-ELISA检测灵敏度提高1000倍。
本发明制备的TAS-ELISA检测试剂盒试剂成本仅2元人民币/样次,最低检出浓度(检测灵敏度)达到0.01ng/ml,准确度通过了电子显微镜和多聚酶链式反应(PCR)以及同类病毒进口的DAS-ELISA检测试剂盒的印证试验,在性价比上具有明显的市场竞争力。
附图说明:
图1:CMV多克隆抗体的免疫流程图
图2:CMV单克隆抗体的制备流程图
具体实施方式:
采集病株的过程为:取典型病株样品,经电子显微镜和标准抗体检测含有大量CMV,采集后接种曼陀罗,含CMV样品产生枯斑,取枯斑加缓冲液接种无病毒烟苗,7-15天表现出典型症状后采集放入-70℃冰箱中保存备用。
同时,制备抽提缓冲液,为0.2M的柠檬酸缓冲液(pH7.2,含0.2%巯基乙醇)。
提纯过程为:
1)取病叶50g,加100mL抽提缓冲液,电动搅拌机充分匀浆,双层纱布过滤。滤液中加入30%氯仿,4℃,搅拌30min,3000rpm离心15min,收集上清;
2)上清中加入7%PEG,0.15M NaCl,溶解后在4℃下放置4h或过夜,然后在4℃下进行离心,离心转速10000rpm,离心时间为20min,收集沉淀;
3)将沉淀用0.02M柠檬酸缓冲液(pH7.4)悬浮,然后在4℃下离心,转速10000rpm,时间为10min,取上清液;
4)将上清液在110000rpm下离心,时间为2h;沉淀用0.02M柠檬酸缓冲液(pH7.4)悬浮过夜;使用分子筛过滤,在254nm峰处收集,将收集液离心,转速110000rpm,离心时间为2h,得到上清液,即病毒提纯液。
对病毒纯度及含量进行检测。具体内容如下:
电镜负染法检测病毒的纯度:病毒提纯液上置电镜铜网吸附3min,2%钼酸铵染色3min,放置5min,置于JEM100CX-II型透射电子显微镜下观察。
病毒提纯液为乳白色液体,电镜下观察含较大量的CMV病毒粒子,未见杂质,经紫外分光光度仪检测,190nm-450nm全波长扫描图显示为典型病毒扫描图,提纯样品稀释100倍液中A260=0.495,A280=0.424,A260/A280=0.858,病毒浓度=A260/A0.1% 260=4.087mg/ml。
CMV多克隆抗体的制备:
1)选用2公斤以上健康雄性家兔作为免疫动物,将CMV病毒提纯液稀释至1mg/ml,作为免疫抗原,4℃下保存;
2)进行免疫注射,将1ml CMV抗原加1ml福氏完全佐剂,充分混合,在家兔背部皮下多点注射,每点0.2ml;一周后,将1mlCMV抗原加1ml福氏完全佐剂,充分混合,家兔双后足足垫注射,每点1ml;一周后,将1mlCMV抗原耳静脉注射;一周后,取2ml CMV抗原,耳静脉注射;7-10天后,心脏全采血,分离血清,加入0.1%NaN3,-70℃保存,得CMV多克隆抗体。
CMV多克隆抗体效价测定:稀释病毒提纯液至0.01mg/ml,备用;将上述抗血清倍比稀释为:1/10、1/20、1/40......1/20480,以间接ELISA法测定抗体效价为1∶2560。
CMV多克隆抗体灵敏度测定:稀释抗血清至1mg/ml,备用。将病毒提纯液稀释为:1mg/ml、0.1mg/ml 0.01mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml、0.00001mg/ml、0.000001mg/ml,以间接ELISA法测定抗体灵敏度,即最低检出浓度达0.01ng/ml。
CMV单克隆抗体的制备:
1)选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫,并取它们的脾细胞作细胞融合,将CMV提纯病毒稀释至1mg/ml,作为免疫抗原,4℃下保存;
2)CMV单克隆抗体制备,提纯病毒液免疫雌性小鼠,经细胞融合、ELISA筛选、克隆,生产和贮存,单克隆抗体亚类鉴定,纯化,真空冷冻干燥,得CMV单克隆抗体。
CMV单克隆抗体效价测定:筛选出一个CMV广谱单克隆抗体细胞株,间接ELISA测定抗体效价为1∶10000。
试剂盒的组装:
1)选择每个试剂盒可检测500个样次的抗体及药品试剂量进行组装;
2)阳性对照:采用温室中盆栽保存的病株采集病叶,加入病毒抽提缓冲液研磨,2000g离心10min,取上清在冷冻干燥机中制备成粉末状,作为阳性对照,分装为1000mg/每管,-20℃保存,使用时向管中加入2mlPBST或蒸馏水溶解、稀释;
3)阴性对照:应用试管苗保存的无病毒烟叶作为阴性对照,制备方法同阳性对照;分装为1000mg/每管,-20℃保存,使用时向管中加入2ml PBST或蒸馏水溶解、稀释;
4)CMV多克隆抗体:上述制备的抗血清中加0.1%叠氮化钠(NaN3),作为防腐,无菌分装后,密封、冷贮(-70℃)、备用。使用单位购买后,可保存于4℃中,不宜反复冻融,有效期2年。每个试剂盒中100ul(按1∶500稀释)。
5)单克隆抗体:上述制备的抗体中加0.1%叠氮化钠(NaN3),作为防腐,无菌分装后,密封,4℃保存,备用。每个试剂盒中100ul(按1∶500稀释)。
6)酶标抗体:Sigma公司购买,分装,4℃保存,备用。每个试剂盒中5ul(按1∶10000稀释)。
7)其他材料及药品:按溶液体积称量分装,常温下保存。具体用量如下:
①包被缓冲液:每个试剂盒中4.52g(1.59g Na2CO3+2.93g NaHCO3);使用时,加1000ml双蒸水,将1.59gNa2CO3和2.93gNaHCO3溶解于1000ml双蒸水中,调pH值为9.6;
②PBST:每个试剂盒中90.4g或124.8g,使用时加8000ml双蒸水,加入0.5%的tween20;每1000mlPBST含有(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、0.2g KCl、2.9gNa2HPO4·2H2O)或者(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、0.2g KCl、7.2g Na2HPO4·12H2O);
③病毒抽提缓冲液:每个试剂盒中10ml(10ml PBST中溶解1.3gNa2SO3和0.2g NaN3),按1∶100使用;使用时,加入1000ml PBST,调pH值为7.4。
④封闭缓冲液:PBST中加入5%的脱脂奶粉,溶解,即用即配;
⑤底物缓冲液:每个试剂盒中10ml(10ml的10%乙二醇胺(pH=9.8)溶解500mg底物),按1∶10使用;使用时用100ml的10%乙二醇胺(pH=9.8)稀释;底物为硝基苯磷酸盐(p-NPP),500mg/试剂盒;
⑥酶标板5块,一次性滴管20个。
CMV云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒的检测规程:
A.CMV多抗血清(1∶500)加入酶标板(包被缓冲液稀释),每孔100ul,37℃下放置3h。
B.PBST洗板6次,快速3次,慢速3次(3min/次),拍干。
C.样品加入病毒抽提缓冲液(约5-10倍)研磨样品,加入加入酶标板,每孔100ul,4℃下放置过夜。
D.同上洗板。
E.每孔加入150ul封闭缓冲液,37℃下放置30min。
F.抛弃孔中液体,拍干。
G.CMV单抗(1∶500)(PBST稀释),加入酶标板,每孔100ul,37℃下放置3h。
H.同上洗板。
I.羊抗鼠AP-IgG(1∶10000)(PBST稀释),加入酶标板,每孔100ul,37℃下放置3h。
J.同上洗板。
K.用底物缓冲液溶解底物(1mg/ml),加入酶标板,每孔100ul,室温(25℃)下至充分显色(每孔加入50ul 1N NaOH终止显色)。肉眼或酶标仪读数。
Claims (10)
1、一种CMV云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒,包含阳性对照、阴性对照、CMV多克隆抗体、CMV单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品,通过将阳性对照、阴性对照、CMV多克隆抗体、CMV单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品组装,得到试剂盒;其它材料和药品包括包被缓冲液、PBST、病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、5块酶标板及20个一次性滴管,其特征在于,CMV多克隆抗体在分离提纯CMV云南分离物后,通过家兔免疫分离血清得到;CMV单克隆抗体在分离提纯CMV云南分离物后,通过小鼠免疫、细胞融合、克隆纯化得到。
2、根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述的CMV多克隆抗体由以下制备过程得到:
1)选用2公斤以上健康雄性家兔作为免疫动物,将CMV病毒提纯液稀释至
1mg/ml,作为免疫抗原,4℃下保存;
2)进行免疫注射,将1ml CMV抗原加1ml福氏完全佐剂,充分混合,在家兔
背部皮下多点注射,每点0.2m1;一周后,将1ml CMV抗原加1ml福氏完全
佐剂,充分混合,家兔双后足足垫注射,每点1ml;一周后,将1mlCMV抗
原耳静脉注射;一周后,取2ml CMV抗原,耳静脉注射;7-10天后,心脏
全采血,分离血清,加入0.1%NaN3,-70℃保存,得CMV多克隆抗体。
3、根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述的CMV单克隆抗体由以下制备过程得到:
1)选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫,并取它们的脾细胞作
细胞融合,将CMV提纯病毒稀释至1mg/ml,作为免疫抗原,4℃下保存;
2)CMV单克隆抗体制备,提纯病毒液免疫雌性小鼠,经细胞融合、ELISA筛
选、克隆,生产和贮存,单克隆抗体亚类鉴定,纯化,真空冷冻干燥,得
CMV单克隆抗体。
4、根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述的分离提纯CMV云南分离物通过采集含有CMV样品病株的枯斑、接种后采集病株经提纯得到。
5、根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于所述的采集病株的过程为:取典型病株样品,经电子显微镜和标准抗体检测含有大量CMV,采集后接种曼陀罗,含CMV样品产生枯斑,取枯斑加缓冲液接种无病毒烟苗,7-15天表现出典型症状后采集放入-70℃冰箱中保存备用。
6、根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于所述的提纯过程为:
1)取病叶,加1-3倍体积单位的抽提缓冲液,电动搅拌机充分匀浆,双层纱布
过滤。滤液中加入30%氯仿,4℃,搅拌30min,3000rpm离心15min,收集
上清;
2)上清中加入7%PEG,0.15M NaCl,溶解后在4℃下放置4h或过夜,然后在4
℃下进行离心,离心转速10000rpm,离心时间为20min,收集沉淀;
3)将沉淀用0.02M柠檬酸缓冲液(pH7.4)悬浮,然后在4℃下离心,转速
10000rpm,时间为10min,取上清液;
4)将上清液在110000rpm下离心,时间为2h;沉淀用0.02M柠檬酸缓冲液
(pH7.4)悬浮过夜;使用分子筛过滤,在254nm峰处收集,将收集液离心,
转速110000rpm,离心时间为2h,得到上清液,即病毒提纯液。
7、根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述的试剂盒的组装为:
1)选择每个试剂盒可检测500个样次的抗体及药品试剂量进行组装;
2)阳性对照:采用温室中盆栽保存的病株采集病叶,加入病毒抽提缓冲液研磨,
2000g离心10min,取上清在冷冻干燥机中制备成粉末状,作为阳性对照,分
装为1000mg/每管,-20℃保存,使用时向管中加入2ml PBST或蒸馏水溶解、
稀释;
3)阴性对照:应用试管苗保存的无病毒烟叶作为阴性对照,制备方法同阳性对照;
分装为1000mg/每管,-20℃保存,使用时向管中加入2ml PBST或蒸馏水溶解、
稀释;
4)CMV多克隆抗体:上述制备的抗血清中加0.1%叠氮化钠(NaN3),作为防腐,
无菌分装后,密封、冷贮(-70℃)、备用。使用单位购买后,可保存于4℃中,
不宜反复冻融,有效期2年。每个试剂盒中100ul(按1∶500稀释)。
5)单克隆抗体:上述制备的抗体中加0.1%叠氮化钠(NaN3),作为防腐,无菌分
装后,密封,4℃保存,备用。每个试剂盒中100ul(按1∶500稀释)。
6)酶标抗体:Sigma公司购买,分装,4℃保存,备用。每个试剂盒中5ul(按1∶
10000稀释)。
7)其他主要材料及药品:按溶液体积称量分装,常温下保存。
8、根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于所述的其他主要材料及药品具体用量如下:
①包被缓冲液:每个试剂盒中4.52g(1.59g Na2CO3+2.93g NaHCO3);使用
时,加1000ml双蒸水,将1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶解于1000ml
双蒸水中,调pH值为9.6;
②PBST:每个试剂盒中90.4g或124.8g,使用时加8000ml双蒸水,加入0.5%
的tween20;每1000mlPBST含有(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、0.2g KCl、
2.9g Na2HPO4·2H2O)或者(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、0.2g KCl、7.2g
Na2HPO4·12H2O);
③病毒抽提缓冲液:每个试剂盒中10ml(10ml PBST中溶解1.3g Na2SO3和
0.2g NaN3),按1∶100使用;使用时,加入1000ml PBST,调pH值为7.4。
④封闭缓冲液:PBST中加入5%的脱脂奶粉,溶解,即用即配;
⑤底物缓冲液:每个试剂盒中10ml(10ml的10%乙二醇胺(pH=9.8)溶解
500mg底物),按1∶10使用;使用时用100ml的10%乙二醇胺(pH=9.8)
稀释;底物为硝基苯磷酸盐(p-NPP),500mg/试剂盒;
⑥酶标板5块,一次性滴管20个。
9、一种CMV云南分离物TAS-ELISA检测试剂盒的制备方法,通过将阳性对照、阴性对照、CMV多克隆抗体、CMV单克隆抗体、酶标抗体及其它材料和药品组装,得到试剂盒,其它材料和药品包括包被缓冲液、PBST、病毒抽提缓冲液、封闭缓冲液、底物缓冲液、底物、5块酶标板及20个一次性滴管,其特征在于,CMV多克隆抗体在分离提纯CMV云南分离物后,通过家兔免疫分离血清得到;CMV单克隆抗体在分离提纯CMV云南分离物后,通过小鼠免疫、细胞融合、克隆纯化得到。
10、根据权利要求9所述的试剂盒的制备方法,其特征在于所述的CMV多克隆抗体由以下制备过程得到:
1)选用2公斤以上健康雄性家兔作为免疫动物,将CMV病毒提纯液稀释至
1mg/ml,作为免疫抗原,4℃下保存;
2)进行免疫注射,将1ml CMV抗原加1ml福氏完全佐剂,充分混合,在家兔
背部皮下多点注射,每点0.2ml;一周后,将1mlCMV抗原加1ml福氏完全
佐剂,充分混合,家兔双后足足垫注射,每点1ml;一周后,将1mlCMV抗
原耳静脉注射;一周后,取2ml CMV抗原,耳静脉注射;7-10天后,心脏
全采血,分离血清,加入0.1% NaN3,-70℃保存,得CMV多克隆抗体;
所述的CMV单克隆抗体由以下制备过程得到:
1)选用Bal b/c小白鼠STU系3月龄雌鼠用作病毒免疫,并取它们的脾细胞作
细胞融合,将CMV提纯病毒稀释至1mg/ml,作为免疫抗原,4℃下保存;
2)CMV单克隆抗体制备,提纯病毒液免疫雌性小鼠,经细胞融合、ELISA筛
选、克隆,生产和贮存,单克隆抗体亚类鉴定,纯化,真空冷冻干燥,得
CMV单克隆抗体;
所述的分离提纯CMV云南分离物通过采集含有CMV样品病株的枯斑、接种后采集病株经提纯得到;
所述的采集病株的过程为:取典型病株样品,经电子显微镜和标准抗体检测含有大量CMV,采集后接种曼陀罗,含CMV样品产生枯斑,取枯斑加缓冲液接种无病毒烟苗,7-15天表现出典型症状后采集放入-70℃冰箱中保存备用;
所述的提纯过程为:
1)取病叶,加2倍体积抽提缓冲液,电动搅拌机充分匀浆,双层纱布过滤。滤
液中加入30%氯仿,4℃,搅拌30min,3000rpm离心15min,收集上清;
2)上清中加入7%PEG,0.15M NaCl,溶解后在4℃下放置4h或过夜,然后在4
℃下进行离心,离心转速10000rpm,离心时间为20min,收集沉淀;
3)将沉淀用0.02M柠檬酸缓冲液(pH7.4)悬浮,然后在4℃下离心,转速
10000rpm,时间为10min,取上清液;
4)将上清液在110000rpm下离心,时间为2h;沉淀用0.02M柠檬酸缓冲液
(pH7.4)悬浮过夜;使用分子筛过滤,在254nm峰处收集,将收集液离心,
转速110000rpm,离心时间为2h,得到上清液,即病毒提纯液;
所述的试剂盒的组装为:
1)选择每个试剂盒可检测500个样次的抗体及药品试剂量进行组装;
2)阳性对照:采用温室中盆栽保存的病株采集病叶,加入病毒抽提缓冲液研
磨,2000g离心10min,取上清在冷冻干燥机中制备成粉末状,作为阳性对
照,分装为1000mg/每管,-20℃保存,使用时向管中加入2ml PBST或蒸馏
水溶解、稀释;
3)阴性对照:应用试管苗保存的无病毒烟叶作为阴性对照,制备方法同阳性
对照;分装为1000mg/每管,-20℃保存,使用时向管中加入2ml PBST或蒸
馏水溶解、稀释;
4)CMV多克隆抗体:上述制备的抗血清中加0.1%叠氮化钠(NaN3),作为防
腐,无菌分装后,密封、冷贮(-70℃)、备用。使用单位购买后,可保存于
4℃中,不宜反复冻融,有效期2年。每个试剂盒中100ul(按1∶500稀释);
5)单克隆抗体:上述制备的抗体中加0.1%叠氮化钠(NaN3),作为防腐,无
菌分装后,密封,4℃保存,备用。每个试剂盒中100ul(按1∶500稀释);
6)酶标抗体:Sigma公司购买,分装,4℃保存,备用。每个试剂盒中5ul(按
1∶10000稀释);
7)其他主要材料及药品:按溶液体积称量分装,常温下保存;
所述的其他主要材料及药品具体用量如下:
①包被缓冲液:每个试剂盒中4.52g(1.59g Na2CO3+2.93g NaHCO3);使用时,
加1000ml双蒸水,将1.59g Na2CO3和2.93g NaHCO3溶解于1000ml双蒸水
中,调pH值为9.6;
②PBST:每个试剂盒中90.4g或124.8g,使用时加8000ml双蒸水,加入0.5%
的tween20;每1000mlPBST含有(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、0.2g KCl、2.9g
Na2HPO4·2H2O)或者(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、0.2g KCl、7.2g
Na2HPO4·12H2O);
③病毒抽提缓冲液:每个试剂盒中10ml(10ml PBST中溶解1.3g Na2SO3和0.2g
NaN3),按1∶100使用;使用时,加入1000ml PBST,调pH值为7.4。
④封闭缓冲液:PBST中加入5%的脱脂奶粉,溶解,即用即配;
⑤底物缓冲液:每个试剂盒中10ml(10ml的10%乙二醇胺(pH=9.8)溶解500mg
底物),按1∶10使用;使用时用100ml的10%乙二醇胺(pH=9.8)稀释;底
物为硝基苯磷酸盐(p-NPP),500mg/试剂盒;
⑥酶标板5块,一次性滴管20个。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2004100336644A CN1303424C (zh) | 2004-04-15 | 2004-04-15 | Cmv云南分离物tas-elisa检测试剂盒及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2004100336644A CN1303424C (zh) | 2004-04-15 | 2004-04-15 | Cmv云南分离物tas-elisa检测试剂盒及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1611942A true CN1611942A (zh) | 2005-05-04 |
CN1303424C CN1303424C (zh) | 2007-03-07 |
Family
ID=34763419
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB2004100336644A Expired - Fee Related CN1303424C (zh) | 2004-04-15 | 2004-04-15 | Cmv云南分离物tas-elisa检测试剂盒及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1303424C (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102297967A (zh) * | 2010-06-22 | 2011-12-28 | 河南农业大学 | 一种pvy/cmv表面等离子体共振检测方法 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2044784B1 (es) * | 1992-06-12 | 1994-09-01 | Inia | Procedimiento para la deteccion e identificacion de patogenos virales y subvirales. |
US5695928A (en) * | 1993-12-10 | 1997-12-09 | Novartis Corporation | Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction |
CN1114105C (zh) * | 1999-11-01 | 2003-07-09 | 扬州大学 | 酶免疫试剂盒及其生产工艺方法 |
CN1382989A (zh) * | 2001-04-24 | 2002-12-04 | 杜凤鸣 | 柯萨奇病毒b抗原酶免试剂盒及制备方法 |
CN1424326A (zh) * | 2002-12-24 | 2003-06-18 | 浙江大学 | 八种植物病毒的单克隆抗体及其检测方法 |
-
2004
- 2004-04-15 CN CNB2004100336644A patent/CN1303424C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102297967A (zh) * | 2010-06-22 | 2011-12-28 | 河南农业大学 | 一种pvy/cmv表面等离子体共振检测方法 |
CN102297967B (zh) * | 2010-06-22 | 2014-01-01 | 河南农业大学 | 一种pvy/cmv表面等离子体共振检测方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1303424C (zh) | 2007-03-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106282125B (zh) | 一株分泌抗磺胺类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株NaN-1及其应用 | |
CN101852807A (zh) | 高粱花叶病毒三抗夹心酶联免疫吸附检测试剂盒 | |
CN101928346A (zh) | 一种抗人组织激肽释放酶单克隆抗体及其制备 | |
CN102621329B (zh) | 燕窝酶联免疫试剂盒的检测方法 | |
Dheepa et al. | Transmission of Cucumber Mosaic Virus (CMV) infecting banana by aphid and mechanical methods | |
CN109187967A (zh) | 一种检测并区分o型、a型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法 | |
CN102099375B (zh) | 抗对虾白斑症病毒囊膜蛋白vp28独特型单克隆抗体及其制备方法 | |
CN108251381A (zh) | 一种百草枯单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN107722110A (zh) | 一种新型的猪轮状病毒疫苗的vp6抗原 | |
CN104991069B (zh) | 果斑病菌免疫胶体金检测试纸条及其单抗和杂交瘤细胞株 | |
CN102533664B (zh) | 分泌抗水稻黑条矮缩病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
CN1303422C (zh) | Pvx云南分离物tas-elisa检测试剂盒及其制备方法 | |
CN1303424C (zh) | Cmv云南分离物tas-elisa检测试剂盒及其制备方法 | |
CN102559603B (zh) | 分泌抗番茄黄化曲叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
CN1303423C (zh) | Pvy云南分离物tas-elisa检测试剂盒及其制备方法 | |
CN1424326A (zh) | 八种植物病毒的单克隆抗体及其检测方法 | |
CN105671001B (zh) | 分泌抗南方菜豆花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
CN1775809A (zh) | 一种Bt Cry1A抗体及其制备方法与专用抗原及应用 | |
CN101498724A (zh) | 玉米细菌性萎蔫病菌生物素-亲和素酶联免疫检测方法 | |
CN108165533B (zh) | 分泌抗水稻条纹花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
CN110204616A (zh) | 一种抗白色念珠菌烯醇化酶特异性单克隆抗体的制备方法及其应用 | |
CN1281958C (zh) | 甘蔗花叶病毒云南分离物tas-elisa检测试剂盒及其制备方法 | |
CN105567646B (zh) | 分泌抗甘蔗花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用 | |
CN102749450B (zh) | 西瓜花叶病毒的单克隆抗体 | |
Uda et al. | Comparison Study of Two Different Isolation and Purification Method for Rice Tungro Bacilliform Virus (RTBV) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070307 Termination date: 20130415 |