CN104861037A - 一种损伤dna-纳米金复合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种损伤DNA-纳米金复合物及其制备方法、该损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用以及利用该损伤DNA-纳米金复合物捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法，所述损伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的药物损伤的双链DNA。本发明的损伤DNA-纳米金复合物在仅需要少量细胞裂解液即可实现药物损伤DNA应答蛋白的高特异性捕获。此外，将本发明的损伤DNA-纳米金复合物用于捕获药物损伤DNA应答蛋白时，通过简单的离心步骤即可将捕获的药物损伤DNA应答蛋白与其他蛋白分离，简化了操作。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质富集、分离和检测领域，具体地，涉及一种损伤DNA-纳米金复合物及其制备方法，该损伤DNA-纳米金复合物捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法，以及该损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。
背景技术
以顺铂为代表的铂类抗肿瘤药物是细胞毒性抗肿瘤药物的典型代表。自1969年Rosenberg发现顺铂（Cisplatin）抑制细胞生长的生物活性以来，顺铂已成为临床上使用最为广泛的抗肿瘤药物，第二代铂类药物卡铂、奥沙利铂等也已相继进入临床使用。顺铂进入人体后，可扩散通过带电的细胞膜，进入细胞质内，被转运至细胞核，在染色质内和DNA形成一种链内交联复合物。高迁移率族蛋白1（HMGB1，high mobility group protein1）能特异性地结合顺铂与DNA形成的1,2-d(GpG)链内交联产物，阻止核酸切割酶对DNA的修复，抑制DNA的转录和复制，导致细胞凋亡或坏死。
迄今为止，人们对不同肿瘤细胞对金属抗肿瘤药物DNA损伤的分子应答机制及其差异还知之甚少。所以，从分子水平上研究DNA结合蛋白与损伤DNA-药物复合物的相互识别和相互作用，以及这种分子识别作用对细胞药物应答灵敏度的影响，对深入理解细胞毒性抗肿瘤药物的作用机理，进一步优化它们的分子设计具有非常重要的意义，也是药物发现领域所面临的最具挑战性的课题之一。
目前，捕获铂损伤DNA应答蛋白的方法包括：将含有光捕获基团的铂损伤DNA负载到磁珠表面或者将铂损伤DNA负载到糖球表面与大量的核蛋白溶液孵育以捕获应答蛋白。这些方法的主要不足是：由于磁珠或糖球等材料不溶于水，结合过程为非均相结合，所以需要使用大量的肿瘤细胞裂解液；而且没有设置对照，易将非特异性捕获的蛋白质作为应答蛋白；而且由于引入了光捕获试剂，铂损伤DNA的结构并不是生理条件下的结构，因此捕获的蛋白不一定是生理条件下的应答蛋白。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术需要大量细胞裂解液且特异性较低的缺陷，提供一种使用少量细胞裂解液即可实现捕获且特异性高的损伤DNA-纳米金复合物及其制备方法、该损伤DNA-纳米金复合物捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法以及该损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种损伤DNA-纳米金复合物，该损伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的药物损伤的双链DNA。
第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的损伤DNA-纳米金复合物的方法，该方法包括将药物损伤的双链DNA与纳米金接触，以使药物损伤的双链DNA与纳米金相连。
第三方面，本发明提供了由第二方面所述的方法制得的损伤DNA-纳米金复合物。
第四方面，本发明提供了一种捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将第一方面和/或第三方面所述的损伤DNA-纳米金复合物（也称为阳性探针）、没有被药物损伤的对照DNA-纳米金复合物（也称为对照探针）与细胞裂解液混合，以使损伤DNA-纳米金复合物与药物损伤DNA应答蛋白结合，所述对照DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的双链DNA，所述对照DNA-纳米金复合物中的双链DNA与所述损伤DNA-纳米金复合物中的药物损伤的双链DNA的碱基序列相同；
（2）除去未结合的蛋白，从而分离出捕获的蛋白；
（3）鉴定捕获的蛋白；
（4）应用基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法对捕获的蛋白进行定量比较，排除非特异性的DNA结合蛋白，从而得到特异性识别药物损伤DNA的应答蛋白。
第五方面，本发明提供了第一方面和/或第三方面所述的损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。
通过上述技术方案，本发明的损伤DNA-纳米金复合物仅需要少量细胞裂解液即可实现药物损伤DNA应答蛋白的捕获，且蛋白捕获特异性高。此外，将本发明的损伤DNA-纳米金复合物用于捕获药物损伤DNA应答蛋白时，通过简单的离心步骤即可将捕获的药物损伤DNA应答蛋白与其他蛋白分离，简化了操作。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为按照实施例1的方法制得的顺铂损伤DNA-纳米金复合物探针的透射电镜照片（图1A）及紫外吸收光谱表征图（图1B）；
图2为按照实施例1的方法制得的顺铂损伤DNA-纳米金复合物探针从MCF-7细胞裂解液中捕获到的蛋白HMGB1的胰蛋白酶酶解肽段的二级质谱图；
图3为按照实施例1的方法制得的顺铂损伤DNA-纳米金复合物探针从MCF-7细胞裂解液中捕获到的蛋白HMGB1的Western Blot结果图，从左往右依次是细胞裂解液中的HMGB1（分子量为25KD），阳性探针捕获到的HMGB1；
图4为实施例2中的阳性探针和对照探针从MCF-7细胞裂解液中捕获到的HMGB1的胰蛋白酶酶解肽段的质谱定量结果；
图5为按照实施例3的方法制得的反式铂噻唑化合物（trans-PtTz）损伤DNA-纳米金复合物探针从MCF-7细胞裂解液中捕获到的蛋白TCP4的胰蛋白酶酶解肽段的二级质谱图；
图6为实施例4中的阳性探针和对照探针从MCF-7细胞裂解液中捕获到的TCP4的胰蛋白酶酶解肽段的质谱定量结果。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作特殊说明的情况下，术语“药物损伤的双链DNA”是指双链DNA与能够共价或配位结合DNA的药物接触后，双链DNA中的至少一条链与所述药物相结合而形成的交联产物，即，是共价或配位结合有药物的双链DNA，需要说明的是，结合药物并不会改变双链DNA的碱基序列；“药物损伤DNA应答蛋白”是指能够特异性地结合药物损伤的双链DNA的蛋白质，部分药物损伤DNA应答蛋白可以修复损伤的DNA，导致细胞对药物产生耐受性，也有一部分药物损伤DNA应答蛋白可以阻止损伤DNA被修复，从而增加肿瘤细胞对药物的敏感性。
本发明提供的损伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的药物损伤的双链DNA。
根据本发明，对所述双链DNA没有特别的要求，可以为各种能够与抗肿瘤药物形成链内交联复合物从而抑制肿瘤细胞生长的双链DNA。优选地，所述药物损伤的双链DNA的长度为9-45bp，结合有药物的链中间具有1-2个鸟嘌呤。例如，当抗肿瘤药物为顺铂时，可以使用两条链的碱基序列分别如下所示的双链DNA：
5’-CCTCTCTGGACCTTCC-3’（SEQ ID NO:1）
5’-GGAAGGTCCAGAGAGG-3’（SEQ ID NO:2）
需要说明的是，药物损伤的双链DNA中，各种常规药物与双链DNA的结合方式为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
根据本发明，对所述药物没有特别的限制，可以为能够与双链DNA形成链内交联复合物从而抑制肿瘤细胞生长的药物。优选地，所述药物为铂类抗肿瘤药物，所述铂类抗肿瘤药物的通式更优选为[Pt(Ⅱ)A2X2]，其中，A2为2个单齿氨配体或1个双齿氨配体，更优选为NH3或NH2C2H4NH2；X2为2个单齿阴离子配体或一个双齿阴离子配体，更优选地，单齿阴离子配体为Cl。最优选地，所述药物为cis-[PtCl2(NH3)2]和/或trans-[PtCl2(NH3)(噻唑)]。
根据本发明，对所述纳米金的粒径没有特别的要求，只要能够结合DNA即可，优选情况下，所述纳米金的平均粒径为10-40nm，最优选为10-18nm。
根据本发明，所述纳米金与药物损伤的双链DNA可以通过常规的方式连接，优选地，所述药物损伤的双链DNA与纳米金通过S-Au键相连。例如，可以将巯基修饰到药物损伤的双链DNA中未损伤链的末端（如5’-端），促使药物损伤的双链DNA通过S-Au键与纳米金相连。
本发明提供的制备上述损伤DNA-纳米金复合物的方法包括将药物损伤的双链DNA与纳米金接触，以使药物损伤的双链DNA与纳米金相连。
根据本发明，在接触体系中，药物损伤的双链DNA和纳米金的摩尔比优选为250-500:1。
根据本发明，所述接触的条件可以为常规的将DNA与纳米金相连的条件，优选情况下，所述接触的方式为：在25-38℃下孵育1-2.5h，加入氯化钠并使氯化钠在接触体系中的终浓度为0.05-0.15M，再于3-5℃下静置10-15h。为了更好地抑制裸露的纳米金表面对蛋白的非特异性吸附，本发明的方法还包括往接触体系中添加巯基修饰的聚乙二醇（可商购获得），巯基修饰的聚乙二醇与纳米金的摩尔比可以为50-100:1。
本发明还提供了由上述方法制得的损伤DNA-纳米金复合物。
本发明提供的捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法包括以下步骤：
（1）将上述本发明的损伤DNA-纳米金复合物（也称为阳性探针）、没有被药物损伤的对照DNA-纳米金复合物（也称为对照探针）与细胞裂解液混合，以使损伤DNA-纳米金复合物与药物损伤DNA应答蛋白结合，所述对照DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的双链DNA，所述对照DNA-纳米金复合物中的双链DNA与所述损伤DNA-纳米金复合物中的药物损伤的双链DNA的碱基序列相同；
（2）除去未结合的蛋白，从而分离出捕获的蛋白；
（3）鉴定捕获的蛋白；
（4）应用基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法对捕获的蛋白进行定量比较，排除非特异性的DNA结合蛋白，从而得到特异性识别药物损伤DNA应答蛋白。
步骤（1）中，对照DNA-纳米金复合物与本发明的损伤DNA-纳米金复合物区别仅在于，本发明的损伤DNA-纳米金复合物中的药物损伤的双链DNA上结合有药物，而对照DNA-纳米金复合物中没有。步骤（1）中，考虑到充分捕获细胞裂解液中的药物损伤DNA应答蛋白，所述损伤DNA-纳米金复合物（以纳米金的重量计）与细胞裂解液中总蛋白的重量比优选为0.2-0.4:1。而使用现有商品化材料捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法中，该重量比远大于1，可以看出，本发明只需少量捕获材料及细胞裂解液即可捕获足量的药物损伤DNA应答蛋白。混合的条件可以包括：温度为3-5℃，时间为10-15h。
步骤（2）中，可以通过离心弃上清液的方式除去未结合的蛋白，如16000-17500g离心10-15min。步骤（3）中，可以采用胰蛋白酶酶解蛋白，从而通过LC-MS/MS鉴定捕获的蛋白。此外，还可以通过Western Blot分析的方法鉴定捕获的蛋白，具体操作为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明中，通过步骤（4）可以对捕获的药物损伤DNA应答蛋白进行特异性分析，从而确定使用的损伤DNA-纳米金复合物能够特异性捕获药物损伤DNA应答蛋白，该方法的具体操作步骤为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
本发明还提供了上述本发明的损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，人乳腺癌细胞（MCF-7）细胞购自ATCC，ATCC编号为HTB-22TM；培养MCF-7细胞所用培养基的组成是：DMEM（高糖）中添加抗生素（100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素）和10%的胎牛血清（FBS），其中，DMEM和FBS均购自HyClone公司；裂解细胞使用的RIPA裂解液购自Bioteke公司，裂解液的成分为：50mM Tris（pH7.4），150mM NaCl，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸钠（sodium deoxycholate），0.1%SDS，以及正钒酸钠（sodiumorthovanadate），氟化钠（sodium fluoride），EDTA，亮抑酶肽（leupeptin）；细胞裂解液中总蛋白含量测定使用BCA蛋白质定量试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）进行测定；四条单链DNA委托大连宝生物公司合成；顺铂购自于Alfa Aesar公司；反式铂噻唑化合物（trans-PtTz）按照文献“M.Van Beusichem.Inorganic Chemistry1992,634-639”中的方法合成；磷酸盐缓冲溶液为50mM的PBS缓冲液（pH7.4）；胰蛋白酶（质谱级）购自Promega公司；0.45μm的PVDF膜购自Millipore，HMGB1的Western Blot分析使用的一抗和二抗购自Abcam；ECL试剂盒购自Tiangen公司。
实施例1
本实施例用来说明本发明的顺铂损伤DNA-纳米金复合物的制备与表征。
双链DNA的序列为：5’-CCTCTCTGGACCTTCC-3’（DNA1，SEQ ID NO:1），HS-5’-GGAAGGTCCAGAGAGG-3’（DNA2，SEQ ID NO:2）。
将顺铂和单链DNA1以摩尔比0.8:1在37℃下孵育2天，反应混合液通过HPLC分离得到纯的顺铂交联DNA1，所用色谱柱为C8柱（4.6mm×250mm,5μm，Agilent），流动相为均含有20mM的TEAA的水和乙腈。纯化的顺铂交联DNA1在水溶液中透析（透析袋截留分子量为1kD）5小时以除去乙腈和TEAA，紫外测定顺铂交联DNA1的量，冻干后和等量的互补链DNA2在pH为7.5的含10mM Tris，50mM NaCl，1mM EDTA的缓冲液中退火形成顺铂损伤的双链DNA。直接将DNA1按相同的条件退火得到无损伤的双链DNA，作为对照。
按照文献“Grabar,K.C.Analytical Chemistry1995,735-743”通过柠檬酸钠还原的方法制备10nM的纳米金（平均粒径为10nm）溶液，对于对照DNA-纳米金复合物（对照探针），0.2mL纳米金加入1.0nmol无损伤的双链DNA；对于损伤DNA-纳米金复合物（阳性探针），0.2mL纳米金加入1.0nmol顺铂损伤的双链DNA，另外，阳性探针和对照探针各加入0.2nmol巯基修饰的聚乙二醇（购自Rapp Polymere股份有限公司，德国）。37℃下孵育2h，加入NaCl使终浓度为0.1M，4℃下静置10h。探针用PBS缓冲液洗涤一次并重悬于PBS溶液中（浓度为50mM）。
制备的探针经过透射电镜及动态光散射表征粒径的大小，紫外吸收光谱表征最大吸收波长的变化，结果如图1所示（其中，图1A为透射电镜照片，图1B为紫外吸收光谱图），动态光散射平均粒径（nm）为16.1±1.0。从修饰到纳米金表面的荧光标记的双链DNA的荧光强度可以算出，制得的损伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有10摩尔的药物损伤的双链DNA。
实施例2
本实施例用来说明本发明捕获顺铂损伤DNA应答蛋白的方法。
（1）肿瘤细胞的培养与全蛋白的提取
培养MCF-7，于100mm培养皿中培养至长满培养皿，除去培养基，用胰蛋白酶收集细胞，用于细胞裂解提取蛋白。细胞经PBS缓冲液洗涤后，加入200μL含新加入PMSF的RIPA裂解液，4℃下裂解0.5h，然后于4℃下13000g离心4min，上清即细胞裂解液，经过BCA试剂盒测定蛋白的含量，具体操作还可以参照文献“Akins,R.E.;Tuan,R.S.BioTechniques.1992,12,469-499”。
（2）捕获顺铂损伤DNA应答蛋白
将0.2mL制备的阳性探针（实施例1获得的顺铂损伤的DNA-纳米金复合物）和对照探针分别加入PBS缓冲液稀释至0.4mL，两者分别与等量的细胞裂解液（含100μg总蛋白）混合，在3℃下孵育15h。离心（17000g，10min）去除没有结合的蛋白溶液，PBS缓冲液洗涤两次，捕获的蛋白用20μL非还原型蛋白上样缓冲液洗脱下来用于Western Blot分析；或者直接加入50μL100mM的Tris-HAc缓冲液（pH8.0）溶解蛋白-DNA-纳米金复合物，再加入1μg胰蛋白酶，37℃下酶解过夜。
（3）鉴定捕获的蛋白
将步骤（2）获得的酶解液离心（17000g，5min）获得的上清冻干后经Ziptip除盐，最终2μL进行Nano-LC-MS/MS分析。所用色谱柱为：C18柱（75μm×15cm，3μm,LC Packings）。流动相A：H2O（0.1%FA），流动相B：MeCN（0.1%FA）。梯度：2%B-35%B，120min。胰蛋白酶酶切肽段经C18柱分离后，进入电喷雾质谱（Micromass Q-TOF Ultima Global）检测。喷雾电压+3.3kV，cone电压+35V，源温度80℃，TOF电压9.1kV。Survey scan：350-1600,MS/MS scan：50-2000。选取的母离子电荷数为+2，+3，+4。
用ProteinLynx2.3软件将原始文件转换成pkl文件，同一母离子的所有连续扫描叠加起来。MASCOT v2.4.0搜索引擎用于鉴定捕获的蛋白。质量误差设定为：母离子0.2Da，子离子0.8Da。甲硫氨酸的氧化为可变修饰。胰蛋白酶漏切位点最大设定为1，Expect门槛值设定为0.05，只采用鉴定结果里排名第一的肽段（每个二级质谱图最匹配的结果），只有置信度门槛以内的蛋白（p＜0.05）被认为是鉴定出来的蛋白。
结果显示，按照实施例2的方法捕获的蛋白经过质谱鉴定确定有HMGB1这一已经被其它许多研究证实能结合顺铂损伤的双链DNA的蛋白质，其被鉴定出来的胰蛋白酶酶解肽段的二级质谱图如图2所示。按实施例2的方法捕获到的大部分应答蛋白质的量在纳克级范围，足够常规的nanoLC-MS/MS分析并获得确信可靠的鉴定结果。
另外，通过Western Blot分析（结果如图3所示，从左往右依次是细胞裂解液中的HMGB1和阳性探针捕获到的HMGB1），使用HMGB1的特异性抗体进一步确认了HMGB1的成功捕获。这些结果证实本发明的损伤DNA-纳米金复合物具有较强的捕获铂损伤DNA应答蛋白的能力。
（4）特异性验证
将步骤（2）获得的酶解液离心（17000g，5min）获得上清液，阳性探针和对照探针得到的上清液分别与100倍过量的乙酰化标记试剂在25℃搅拌条件下反应5小时，阳性探针捕获的蛋白经胰蛋白酶酶解的肽段被重同位素（氘代乙酸-N-琥珀酰亚胺酯）标记，对照探针捕获的蛋白经胰蛋白酶酶解的肽段被轻同位素（乙酸-N-琥珀酰亚胺酯）标记。标记结束后，等体积的两份反应液混合，均加入过量的羟胺在pH10-11的条件下反应20分钟以消耗掉过量的标记试剂。将同位素标记的肽段混合液冻干，并用Ziptip C18除盐。得到的肽段溶液进行Nano-LC-MS/MS分析。质谱条件及参数设置同步骤（3）。
定量分析使用Mascot Distiller2.4软件，轻重同位素标记的同一肽段的所有质谱图被叠加以产生一个总质谱图，总质谱图中重同位素标记的肽段和轻同位素标记肽段的比值是通过计算同位素峰的峰高比值得到的。蛋白的定量比值是通过计算同一个蛋白的所有匹配肽段的强度比值平均值得到。
结果显示，本实施例筛选出了特异性识别铂损伤DNA应答蛋白HMGB1，该蛋白能特异性结合顺铂与DNA形成的1,2-链内交联产物，而对相同序列的未损伤的双链DNA结合量很少。HMGB1的定量比值（阳性探针/对照探针）为6:1，其代表性的胰蛋白酶酶解肽段的定量结果如图4所示，说明本发明的捕获方法可以特异性地捕获到铂类药物损伤DNA应答蛋白。
从本实施例可以看出，本发明方法制得的损伤DNA-纳米金复合物能正确而特异地捕获到药物损伤DNA应答蛋白，且需要的细胞裂解液较少。
实施例3
本实施例用来说明本发明的trans-PtTz损伤DNA-纳米金复合物的制备与表征。
双链DNA的序列为：5’-CTCTTGTGTTCTTCT-3’（DNA3，SEQ ID NO:3），HS-5’-AGAAGAACACAAGAG-3’（DNA4，SEQ ID NO:4）。
将反式铂噻唑化合物（trans-PtTz）和单链DNA3以摩尔比0.8:1在37℃下孵育2天，反应混合液通过HPLC分离得到纯的trans-PtTz交联DNA3，所用色谱柱为C8柱（4.6mm×250mm,5μm，Agilent），流动相为均含有20mM的TEAA的水和乙腈。纯化的trans-PtTz交联DNA3在水溶液中透析（透析袋截留分子量为1kD）5小时以除去乙腈和TEAA，紫外测定trans-PtTz交联DNA3的量，冻干后和等量的互补链DNA4在pH为7.5的含10mM Tris，50mM NaCl，1mM EDTA的缓冲液中退火形成trans-PtTz损伤的双链DNA。直接将DNA3按相同的条件退火得到无损伤的双链DNA，作为对照。
按照文献“Grabar,K.C.Analytical Chemistry1995,735-743”通过柠檬酸钠还原的方法制备10nM的纳米金溶液（平均粒径为18nm），对于对照DNA-纳米金复合物（对照探针），0.2mL纳米金加入0.5nmol无损伤的双链DNA；对于损伤DNA-纳米金复合物（阳性探针），0.2mL纳米金加入0.5nmol的trans-PtTz损伤的双链DNA，另外，阳性探针和对照探针各加入0.1nmol巯基修饰的聚乙二醇（购自Rapp Polymere股份有限公司，德国）。25℃下孵育1h，加入NaCl使终浓度为0.05M，5℃下静置15h。探针用PBS缓冲液洗涤一次并重悬于PBS溶液中（浓度为50mM）。
制备的探针经过透射电镜及动态光散射表征粒径的大小，紫外吸收光谱表征最大吸收波长的变化。从修饰到纳米金表面的荧光标记的双链DNA的荧光强度可以算出，制得的trans-PtTz损伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7摩尔的trans-PtTz损伤的双链DNA。
实施例4
本实施例用来说明本发明捕获trans-PtTz损伤DNA应答蛋白的方法。
（1）肿瘤细胞的培养与全蛋白的提取
培养MCF-7，于100mm培养皿中培养至长满培养皿，除去培养基，用胰蛋白酶收集细胞，用于细胞裂解提取蛋白。细胞经PBS缓冲液洗涤后，加入200μL含新加入PMSF的RIPA裂解液，4℃下裂解0.5h，然后于4℃下13000g离心4min，上清即细胞裂解液，经过BCA试剂盒测定蛋白的含量，具体操作还可以参照文献“Akins,R.E.;Tuan,R.S.BioTechniques.1992,12,469-499”。
（2）捕获trans-PtTz损伤DNA应答蛋白
将0.2mL制备的阳性探针（实施例3获得的trans-PtTz损伤的DNA-纳米金复合物）和对照探针分别加入PBS缓冲液稀释至0.4mL，两者分别与等量的细胞裂解液（含200μg总蛋白）混合，在5℃下孵育10h。离心（17500g，15min）去除没有结合的蛋白溶液，PBS缓冲液洗涤两次，加入50μL100mM的Tris-HAc缓冲液（pH8.0）溶解蛋白-DNA-纳米金复合物，再加入1μg胰蛋白酶，37℃下酶解过夜。
（3）鉴定捕获的蛋白
将步骤（2）获得的酶解液离心（17000g，5min）获得的上清冻干后经Ziptip除盐，最终2μL进行Nano-LC-MS/MS分析。所用色谱柱为：C18柱（75μm×15cm，3μm,LC Packings）。流动相A：H2O（0.1%FA），流动相B：MeCN（0.1%FA）。梯度：2%B-35%B，120min。胰蛋白酶酶切肽段经C18柱分离后，进入电喷雾质谱（Micromass Q-TOF Ultima Global）检测。喷雾电压+3.3kV，cone电压+35V，源温度80℃，TOF电压9.1kV。Survey scan：350-1600,MS/MS scan：50-2000。选取的母离子电荷数为+2，+3，+4。
用ProteinLynx2.3软件将原始文件转换成pkl文件，同一母离子的所有连续扫描叠加起来。MASCOT v2.4.0搜索引擎用于鉴定捕获的蛋白。质量误差设定为：母离子0.2Da，子离子0.8Da。甲硫氨酸的氧化为可变修饰。胰蛋白酶漏切位点最大设定为1，Expect门槛值设定为0.05，只采用鉴定结果里排名第一的肽段（每个二级质谱图最匹配的结果），只有置信度门槛以内的蛋白（p＜0.05）被认为是鉴定出来的蛋白。
结果显示，按照实施例4的方法捕获到了TCP4这一已经被证实与DNA化学损伤应答相关的蛋白质，其被鉴定出来的胰蛋白酶酶解肽段的二级质谱图如图5所示。按实施例4的方法捕获到的大部分应答蛋白质的量在纳克级范围，足够常规的nanoLC-MS/MS分析并获得确信可靠的鉴定结果。
（4）特异性验证
将步骤（2）获得的酶解液离心（17000g，5min）获得上清液，阳性探针和对照探针得到的上清液分别与100倍过量的乙酰化标记试剂在25℃搅拌条件下反应5小时，阳性探针捕获的蛋白经胰蛋白酶酶解的肽段被重同位素（氘代乙酸-N-琥珀酰亚胺酯）标记，对照探针捕获的蛋白经胰蛋白酶酶解的肽段被轻同位素（乙酸-N-琥珀酰亚胺酯）标记。标记结束后，等体积的两份反应液混合，均加入过量的羟胺在pH10-11的条件下反应20分钟以消耗掉过量的标记试剂。将同位素标记的肽段混合液冻干，并用Ziptip C18除盐。得到的肽段溶液进行Nano-LC-MS/MS分析。质谱条件及参数设置同步骤（3）。
定量分析使用Mascot Distiller2.4软件，轻重同位素标记的同一肽段的所有质谱图被叠加以产生一个总质谱图，总质谱图中重同位素标记的肽段和轻同位素标记肽段的比值是通过计算同位素峰的峰高比值得到的。蛋白的定量比值是通过计算同一个蛋白的所有匹配肽段的强度比值平均值得到。
结果显示，本实施例筛选出了特异性识别反铂类药物损伤DNA的应答蛋白TCP4，该蛋白能特异性结合反式铂噻唑化合物（trans-PtTz）与DNA形成的1,3-链内交联产物，而对相同序列的未损伤的双链DNA结合量少。TCP4的定量比值（阳性探针/对照探针）为6:1，其代表性的胰蛋白酶酶解肽段的定量结果如图6所示，说明本发明的捕获方法可以特异性地捕获到反铂类药物损伤DNA应答蛋白。
实施例5
本实施例用来说明本发明的trans-PtTz损伤DNA-纳米金复合物的制备方法。
按照实施例3的方法制备trans-PtTz损伤DNA-纳米金复合物，不同的是，0.2mL纳米金加入0.8nmol双链DNA，在30℃下孵育1.5h；加入氯化钠并使氯化钠的终浓度为0.12M，再于3℃下静置13h。
实施例6
本实施例用来说明本发明捕获trans-PtTz损伤DNA应答蛋白的方法。
按照实施例4的方法捕获并鉴定trans-PtTz损伤DNA的应答蛋白，不同的是，将0.2mL制备的阳性探针和对照探针分别与等量的细胞裂解液（含150μg总蛋白）混合，在4℃下孵育13h。离心（16000g，12min）去除没有结合的蛋白溶液。
数据显示，按照实施例5与实施例6的方法能成功的制备trans-PtTz损伤DNA-纳米金复合物并特异地捕获到trans-PtTz损伤DNA的应答蛋白TCP4，说明采用优选的各项参数能够成功的制备损伤DNA-纳米金复合物并能够特异地捕获到损伤DNA应答蛋白。
从上述实施例可以看出，本发明方法制得的损伤DNA-纳米金复合物能正确而特异地捕获到药物损伤DNA应答蛋白，且需要的细胞裂解液较少。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (12)
1.一种损伤DNA-纳米金复合物，其特征在于，该损伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的药物损伤的双链DNA。
2.根据权利要求1所述的损伤DNA-纳米金复合物，其中，所述药物损伤的双链DNA的长度为9-45bp，结合药物的DNA链中间具有1-2个鸟嘌呤。
3.根据权利要求1所述的损伤DNA-纳米金复合物，其中，所述药物为铂类抗肿瘤药物，所述铂类抗肿瘤药物的通式优选为[Pt(Ⅱ)A2X2]，其中，A2为2个单齿氨配体或1个双齿氨配体，更优选为NH3或NH2C2H4NH2；X2为2个单齿阴离子配体或一个双齿阴离子配体，更优选地，单齿阴离子配体为Cl。
4.根据权利要求1所述的损伤DNA-纳米金复合物，其中，所述纳米金的平均粒径为10-40nm。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的损伤DNA-纳米金复合物，其中，所述药物损伤的双链DNA与纳米金通过S-Au键相连。
6.制备权利要求1-5中任意一项所述的损伤DNA-纳米金复合物的方法，其特征在于，该方法包括将药物损伤的双链DNA与纳米金接触，以使药物损伤的双链DNA与纳米金相连。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在接触体系中，药物损伤的双链DNA和纳米金的摩尔比为250-500:1。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述接触的方式为：在25-38℃下孵育1-2.5h，加入氯化钠并使氯化钠在接触体系中的终浓度为0.05-0.15M，再于3-5℃下静置10-15h。
9.权利要求6-8中任意一项所述的方法制得的损伤DNA-纳米金复合物。
10.一种捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）将权利要求1-5和9中任意一项所述的损伤DNA-纳米金复合物、没有被药物损伤的对照DNA-纳米金复合物与细胞裂解液混合，以使损伤DNA-纳米金复合物与药物损伤DNA应答蛋白结合，所述对照DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的双链DNA，所述对照DNA-纳米金复合物中的双链DNA与所述损伤DNA-纳米金复合物中的药物损伤的双链DNA的碱基序列相同；
（2）除去未结合的蛋白，从而分离出捕获的蛋白；
（3）鉴定捕获的蛋白；
（4）应用基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法对捕获的蛋白进行定量比较，排除非特异性的DNA结合蛋白，从而得到特异性识别药物损伤DNA的应答蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，以纳米金的重量计，所述损伤DNA-纳米金复合物与细胞裂解液中总蛋白的重量比为0.2-0.4:1。
12.权利要求1-5和9中任意一项所述的损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN109504734A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-03-22 | 西安交通大学 | 一种活细胞内原位加速的dna马达及其制备方法和应用 |
| CN110389216A (zh) * | 2018-04-20 | 2019-10-29 | 中国科学院化学研究所 | 蛋白质功能化磁珠亲和探针及其制备方法与应用 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103540651A (zh) * | 2012-07-12 | 2014-01-29 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种纳米金复合物及其制备和应用 |
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN103540651A (zh) * | 2012-07-12 | 2014-01-29 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种纳米金复合物及其制备和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| DU Z ET AL.: "Mass spectrometric proteomics reveals that nuclear protein positive cofactor PC4 selectively binds to cross-linked DNA by a trans-platinum anticancer comple", 《J AM CHEM SOC.》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110389216A (zh) * | 2018-04-20 | 2019-10-29 | 中国科学院化学研究所 | 蛋白质功能化磁珠亲和探针及其制备方法与应用 |
| CN109504734A (zh) * | 2018-11-13 | 2019-03-22 | 西安交通大学 | 一种活细胞内原位加速的dna马达及其制备方法和应用 |
| CN109504734B (zh) * | 2018-11-13 | 2020-07-28 | 西安交通大学 | 一种活细胞内原位加速的dna马达及其制备方法和应用 |
| CN111812315A (zh) * | 2019-04-12 | 2020-10-23 | 中国科学院化学研究所 | 药物损伤dna功能化磁性纳米亲和探针及其制备方法和应用 |
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