CN111778244B - 一种结合金纳米球的DNA探针及其在基于固态纳米孔检测Hg2+中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以金纳米球为载体的探针及其在基于固态纳米孔检测Hg²⁺中的应用，属于重金属检测技术领域。提供了一种金纳米球结合探针通过固态纳米孔传感器对Hg²⁺进行识别，实现了固态纳米孔传感器对汞离子的高灵敏检测。本发明克服了固态纳米孔信号识别中孔径过大难以直接检测离子的困难，通过金纳米颗粒为载体，进行信号放大，实现了固态纳米孔对Hg²⁺的高灵敏检测，扩展了固态纳米孔在单分子检测领域的应用。

Description

一种结合金纳米球的DNA探针及其在基于固态纳米孔检测Hg2+ 中的应用

技术领域

本发明属于重金属检测技术领域，具体涉及一种结合金纳米球的DNA探针及其在基于固态纳米孔检测Hg²⁺中的应用。

背景技术

随着人类工业化进程的加剧，环境中重金属的含量不断增加，污染日益恶化，其中汞离子对环境的污染尤为严重，它是最常见和毒性最强的重金属之一，不仅危害环境，还可以通过食物链的影响对人的生命安全造成威胁。金属汞主要以蒸气形式进入人体的呼吸道，汞化物可以通过消化道、呼吸道以及皮肤进入人体。由此可见，汞离子很容易影响到我们的生命健康安全，所以发展有效的汞离子检测方式，实现环境中汞离子的简单快速检测，对环境监测，人民的生命安全具有重大意义。目前，对汞离子的检测主要有原子荧光法，质谱法以及高效液相色谱法等，这些方法具有一定的准确度，但是过程繁琐，成本也比较高昂，不符合简单快速检测。因此有必要发展一种高灵敏、高特异性，可靠而经济的检测分析方法，满足生产生活中对汞离子的精密检测需求。

作为一种新型的传感器，凭着简单快速，无需标记，无需扩增的优势，纳米孔逐渐成为一种高通量，低成本的检测平台。随着微加工技术的发展，固态纳米孔因其与现代微加工技术兼容及可实现器件高度集成而尤其受到关注。固态纳米孔具有优良的机械稳定性、化学稳定性和热稳定性，适合多种检测环境(酸碱、浓度)，极大地扩展了纳米孔的应用范围，使其成为环境监测和食品安全卫生的有力监测工具。

综上所述，基于固态纳米孔平台，我们设计了一套简单可行，高灵敏，高选择性的Hg²⁺离子检测方案。通过纳米组装技术，为Hg²⁺设定一个特定的纳米载体，产生高信噪比的电流信号，同时降低了检测物分子在固态纳米孔通道中的易位速度，提高信号的分辨率，实现了对Hg²⁺金属离子的高特异、高灵敏检测，具有十分重要的研究价值，同时对其他重金属离子的监测具有重要的借鉴意义。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种基于固态纳米孔检测Hg²⁺的方法，以解决现有技术中Hg²⁺检测过程繁琐、成本高昂的问题。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种结合金纳米球的DNA探针，以金纳米球为载体，载体上修饰DNA探针，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过使用金纳米球载体修饰DNA分子探针来捕获Hg²⁺，当捕获链与Hg²⁺识别后，诱导金纳米颗粒形成二聚体，然后进行纳米孔易位行为研究，从而实现Hg²⁺的检测。本发明使用的金纳米球形成的组装结构在纳米孔传感器检测过程中会形成高信噪比，差异性的检测信号，提高了整个检测的灵敏性，打破了固态纳米孔对离子、小分子检测的瓶颈。其中，所述的纳米孔传感器是氮化硅纳米孔传感器，可以很灵敏的检测易位颗粒结构尺寸变化，具有明显差异性的阻塞电流信号。

其中，所述的金纳米球为于上海南科生物科技有限公司所购买的Gold Colloids。所述的DNA探针具有两段式功能，一端结合链为多聚A碱基polyA序列，便于和金纳米颗粒吸附包裹，另一端识别链为富含T碱基的序列，易于和Hg²⁺形成T-Hg²⁺-T的复合结构，同时识别链序列中掺杂少量A碱基，A碱基可以有效避免探针的自我杂交。

上述结合金纳米球的DNA探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)将SEQ ID NO.1所示DNA序列溶解在TE缓冲液中(DNA序列的浓度是1-10μmol/L)；

(2)将粒径4-6nm的金纳米球加入步骤(1)得到的DNA探针溶液中，DNA探针与金纳米球的比例为10:1，充分震荡摇匀，以200-400rpm转速在23-27℃的培养箱培养12-18h；

(3)向步骤(2)得到的混合物中加入PBS缓冲溶液，终溶液中PBS浓度为0.075-0.125mol/L，于23-27℃、200-400rpm环境下培养12-18h；PBS缓冲溶液分5次，每次间隔15-20min加入，每次加完充分震荡摇匀，待全部加入后，在培养箱于原培养条件下培养12-18h。

(4)对步骤(3)得到的混合溶液离心处理，去除上清液，得到修饰DNA探针的金纳米球颗粒。

上述修饰DNA探针的金纳米球在基于固态纳米孔检测Hg²⁺中的应用。

具体方法如下：

(S1)取修饰DNA探针的金纳米球溶于0.075-0.125mol/L的PBS缓冲溶液，加入待测样品，充分震荡摇匀后，于23-27℃、200-400rpm的培养箱中培养；并通过透射电子显微镜观测，可以看到在加入含有Hg²⁺的溶液前后，单体和二聚体的数量变化很大，证明设计的探针对Hg²⁺具有良好的捕获作用；

(S2)使用孔径40-60nm的氮化硅纳米孔传感器，对组装产物进行检测；将溶液注入流体装置的一侧，利用电压驱动其中小分子通过纳米孔，通过检测到阻塞信号的幅值和时间来区分二聚体的存在，从而实现对Hg²⁺的检测。

步骤(S1)中，修饰DNA探针的金纳米球在PBS缓冲溶液中的浓度为0.1-1nmol/L

有益效果：

(1)本发明以金纳米球为载体，大小可控，便于探针修饰，在纳米孔易位过程中放大信号，减慢速度，产生高分辨的检测信号。

(2)本发明设计的两段式DNA探针，既能够稳定的与金纳米球结合，进行单颗粒探针修饰，同时对Hg²⁺高度灵敏特异性，实现对Hg²⁺的精准检测。

(3)本发明设计的结合金纳米球的DNA探针将Hg²⁺的存在转化为纳米颗粒的单体和组装体结构变化，使所使用的纳米孔传感器摆脱对检测分子、离子尺寸的依赖性，实现了大孔径，多孔径的固态纳米孔传感器对金属离子的检测。

(4)本发明以固态纳米孔为检测工具，不仅具有单分子单颗粒的高灵敏度，操作简单，快速高效，提供了低成本，高灵敏的检测平台。

附图说明

图1为本发明所述的结合金纳米球的DNA探针的设计原理图和纳米颗粒经过纳米孔检测时的实验设计图；

图2为本发明用到的金纳米球TEM图，和加入Hg²⁺后，金纳米颗粒聚集形成二聚体的TEM表征图；

图3为本发明加入Hg²⁺前后，结合金纳米球的DNA探针溶液在纳米孔传感器检测过程中产生的特异性电流信号；

图4为本发明中探针捕获Hg²⁺前,金纳米颗粒及组装体在纳米孔传感器中检测到的阻塞信号的柱状统计分析图；

图5为本发明中探针捕获Hg²⁺后，金纳米颗粒及组装体在纳米孔传感器中检测到的阻塞信号的柱状统计分析图；

图6为本发明金纳米颗粒二聚体产物比率和溶液中Hg²⁺检测浓度的线性关系图；

图7为本发明Hg²⁺和溶液中其他金属离子在纳米孔中检测到的信号增强结果对比图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例来对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1：

本实施例中修饰DNA探针的金纳米球载体制作方法，该方法包括以下步骤：

步骤1：设计和制备DNA探针序列，如下：

(5’aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactgcccattattattta3’)。其中一端结合链为多聚A碱基polyA序列，便于和金纳米颗粒吸附包裹。另一端识别链为富含T碱基的序列，易于和Hg²⁺形成T-Hg²⁺-T的复合结构，同时识别链序列中掺杂少量A碱基，A碱基可以有效避免探针的自我杂交。

步骤2：取适量DNA探针溶液与粒径4-6nm左右的金纳米球，按一定比例混合，充分震荡摇匀，以200-400rpm转速在23-27℃的培养箱培养过夜。

步骤3：取一定体积1mol/L的PBS缓冲溶液加入混合液，终溶液中PBS浓度约为0.1mol/L。PBS缓冲溶液分5次，每次间隔20-30分钟加入，每次加完充分震荡摇匀，待全部加入后，在培养箱培养过夜23-27℃,200-400rpm)。

步骤4：将样品置于高速控温离心机中，以15000rpm转速，保持25℃进行高速离心。离心后样品分离，底部沉淀为修饰DNA探针的金纳米球颗粒，多余DNA浮于上清液中。去除上清液后，用浓度0.1mol/L的PBS缓冲溶液复溶。重复此步骤3次后，充分震荡摇匀，在培养箱培养过夜(23-27℃,200-400rpm)。培养完后取出，金球上修饰探针即制备完成，将得到的修饰探针的纳米球样品放置到4℃冰箱保存，加入待测溶液即可检测。

图1为基于纳米孔传感平台，修饰DNA探针的金纳米颗粒载体用于捕获Hg²⁺的实验原理图。金纳米球是通过种子生长法合成，尺寸分布均匀，直径约为5nm，便于DNA探针修饰。该DNA探针具有两段式功能，一端多聚A碱基polyA，包覆在金球表面，进行单颗粒修饰，一端富含T碱基的识别链，捕获Hg²⁺，形成T-Hg²⁺-T的复合结构，引起金纳米颗粒组装。当组装后产物经过纳米孔传感器，是因纳米颗粒结构尺寸变化，产生具有明显差异性的阻塞电流信号，从而实现Hg²⁺的高灵敏检测。

图2为使用的金纳米颗粒以及经过Hg²⁺识别后形成的纳米及经过，通过电镜观测结果可以看出，制备的金纳米球具有良好的分散性，经过组装形成二聚体，适用于氮化硅纳米孔传感器的检测。

图3为加入Hg²⁺前后，制备好的修饰DNA探针的金纳米球载体溶液在纳米孔传感器检测过程中产生的特异性电流信号。Hg²⁺加入前，修饰探针的金纳米球主要以单体形式存在，在纳米孔中易位时，产生一些小的电流阻塞信号。当加入Hg²⁺后，探针与Hg²⁺形成复合结构，引起金纳米颗粒组装，溶液中主要以二聚体形式存在，当通过纳米孔道时，产生更大的阻塞信号，阻塞信号的幅值和滞留时间都发生了变化。

实施例2：

本实施例中加入Hg²⁺前后，不同金纳米球溶液在纳米孔传感器检测，具体方法如下：

步骤1：取适量上述制备的探针样品，加入不同浓度Hg²⁺溶液，充分震荡摇匀后，于23-27℃，200-400rpm的培养箱培养不同的时间，培养后的样品，进行离心分离，并通过透射电子显微镜观测，可以看到在加入含有Hg²⁺的溶液前后，单体和二聚体的数量变化很大，证明设计的探针对Hg²⁺具有良好的捕获作用。

步骤2：将组装后的金纳米球溶液在纳米孔内进行易位实验。根据金纳米球大小使用孔径40-60nm的纳米孔传感器，对组装产物进行检测。将溶液注入流体装置的一侧，利用电压驱动纳米颗粒通过纳米孔。从图中可以看出Hg²⁺加入后，可以明显的看出引起更大的阻塞信号，阻塞信号的幅值和滞留时间都发生了变化，表明纳米孔传感器检测到Hg²⁺后，金纳米球形成了二聚体结构。

图4为探针捕获Hg²⁺前后,金纳米颗粒及组装体在纳米孔传感器中检测到的阻塞信号数量的柱状统计分布图。从图中可以看出加入Hg²⁺前，检测到电流信号统计分析后出现一个高峰，服从正态分布，主要为金纳米颗粒单体信号。当加入Hg²⁺后，检测到的电流信号经过统计，出现两个高峰，二者幅值接近两倍关系，主要为金纳米颗粒二聚体。

图5为在不同浓度的Hg²⁺溶液加入到金纳米球载体溶液中，通过纳米孔传感器检测到的金纳米球二聚体颗粒的比例和溶液中Hg²⁺浓度线性关系图。从图中可以看出随着Hg²⁺浓度的增加，溶液中二聚体的比例线性提高，二聚体的产量和Hg²⁺的浓度成线性关系，可以进行定量分析。

图6是溶液中其他金属离子和探针结合后，测得电流信号增强比例的对比图。从图中可以看出，该案例设计的探针和Cu²⁺,Ca²⁺,Mg²⁺,Fe³⁺识别效率远远低于Hg²⁺，进一步说明了探针和Hg²⁺的高效特异性。

所有的测试结果表明，本发明所设计的修饰DNA探针的金纳米球载体在氮化硅纳米孔传感器领域可以实现对Hg²⁺的高灵敏检测，并对易位信号进行定量分析，解决了氮化硅纳米孔传感器对溶液中离子，小分子检测的局限性与不足。此研究对于固态纳米孔实现对环境中重金属离子的检测应用有着十分重要的借鉴意义。

序列表

<110> 南京邮电大学

<120> 一种结合金纳米球的DNA探针及其在基于固态纳米孔检测Hg2+中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctgcccatta ttattta 57

Claims (1)

1. 结合金纳米球的DNA探针在基于固态纳米孔检测Hg²⁺中的应用，所述结合金纳米球的DNA探针以金纳米球为载体，载体上修饰DNA探针，所述DNA探针的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的金纳米球的粒径为粒径4-6 nm；

所述以金纳米球为载体的DNA探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）将SEQ ID NO.1所示DNA序列溶解在TE缓冲液中，所述DNA序列的浓度为1-10 μmol/L；

（2）将粒径4-6 nm的金纳米球加入步骤（1）得到的DNA探针溶液中，DNA探针与金纳米球的比例为10:1，震荡摇匀，以200-400 rpm转速在23-27 ℃的培养箱培养12-18 h；

（3）向步骤（2）得到的混合物中加入PBS缓冲溶液，终溶液中PBS浓度为0.075-0.125mol/L，于23-27 ℃、200-400 rpm环境下培养12-18 h；

（4）对步骤（3）得到的混合溶液离心处理，去除上清液，得到结合金纳米球的DNA探针；

（S1）取修饰DNA探针的金纳米球溶于0.1 mol/L的PBS缓冲溶液，加入待测样品，震荡摇匀后，于23-27 ℃，200-400 rpm的培养箱中培养；

（S2）使用孔径40-60 nm的氮化硅纳米孔传感器，对步骤（S1）培养后的混合物进行检测；将混合物注入流体装置的一侧，利用电压驱动其中小分子通过纳米孔，通过检测到阻塞信号的幅值和时间来区分二聚体的存在，从而实现对Hg²⁺的检测。