CN108120831A - 一种基于链置换及纳米金检测汞离子的比色生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于链置换及纳米金检测汞离子的比色生物传感器，包括a）含3条探针Probe1、Probe2和Probe3，核酸外切酶Ⅲ，核酸外切酶Ⅲ的缓冲液，和b）探针Probe4修饰的纳米金（Probe4‑AuNPs）溶液；所述探针Probe1、Probe2、Probe3和Probe4的序列如SEQ No.1、SEQ No.2、SEQ No.3和SEQ No.4所示；所述Probe4的5’端修饰巯基（‑SH）；上述比色生物传感器在检测汞离子（Hg2+）的浓度为1nM到5μM。本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，利用“T‑Hg2+‑T”的错配结构实现链置换等温放大特性构建了适体生物传感器，该传感器具有检测速度快，检测限低，灵敏度高等优点，可以弥补汞离子现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速，准确的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于核酸适配体检测汞离子的生物传感器，具体涉及一种基于链置换及纳米金检测汞离子的比色生物传感器，属于生物传感器技术领域。
背景技术
由于一些重金属离子的存在对水环境以及人类的健康有着不利的影响，对水生生态系统中的重金属离子的监测开始受到人们的广泛重视。汞离子是有毒重金属污染物，广泛存在与水，土壤甚至食物中。汞离子可以损伤大脑，心脏，胃，肠和肾脏。微量的汞可以通过食物链累积在人体内，造成慢性汞中毒。目前报道的汞离子的检测方法包括原子发射光谱法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质量光谱法，电化学方法等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，对于汞离子检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求已难以适应。因此，目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测汞离子的残留。
发明内容
为了解决现有技术中检测汞离子的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高、检测周期长的问题，本发明目的在于提供一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于链置换以及纳米金检测汞离子的比色生物传感器。
本发明另一目的在于提供一种上述比色生物传感器的制备方法和在检测汞离子中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种基于链置换及纳米金检测汞离子的比色生物传感器，包括
a）含3条探针Probe1、Probe2和Probe3，核酸外切酶III；
和b）探针Probe4修饰的纳米金（Probe4-AuNPs）。
所述探针Probe1、Probe2、Probe3和Probe4的序列如SEQ No. 1、SEQ No. 2、SEQNo. 3和SEQ No. 4所示；所述Probe4的5’端修饰巯基（-SH）。
所述核酸外切酶III在反应体系中的终浓度优选为5U/μL。
可选地，Probe1、Probe2和Probe3在组分a）中的浓度分别为8-20 μM、8-20 μM和0.8-2.0 μM。
可选地，组分b）中修饰在纳米金上的Probe4的浓度为8-20 μM。
一种上述比色生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）分别配制探针Probe1、Probe2、Probe3和Probe4溶液；
（2）配制含3条探针Probe1、Probe2和Probe3，核酸外切酶Ⅲ的组分a）的溶液；
（3）制备纳米金；
（4）制备Probe4修饰的纳米金溶液，即组分b）的溶液。
可选地，纳米金的制备可以采用HAuCl4还原的方法制备获得；还原剂可选用常用还原剂，如柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷或硼氢化钠；优选地，纳米金采用HAuCl4经柠檬酸钠还原获得。
优选地，纳米金的粒径为20nm。
一种利用上述比色生物传感器在检测汞离子（Hg2+）中的方法，采用以下步骤：
（a）将组分a）与不同浓度的汞离子标准溶液和待测溶液分别混合均匀，37℃保温孵育30min；
（b）将组分b）加入到上述溶液混合均匀，37℃保温孵育30min；
（c）从水浴锅中取出混合溶液，测定各混合溶液的吸光度值；
（d）根据不同浓度的汞离子标准溶液的吸光度值，作汞离子浓度对数-吸光度值的标准曲线计算回归方程，再根据待测样品中的吸光度值计算所含汞离子浓度。
优选地，吸光度值测定波长为400-800nm。
上述方法中，优选的汞离子检测浓度为0nM-10μM。
本发明具有以下优点：
本发明构建的比色生物传感器，利用了核酸适配体的特异型识别，利用“T-Hg2+-T”的特异性结合实现了对目标物汞离子的高特异性检测；利用链置换循环放大功能，实现了Probe2和Probe3的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度，实现对目标物汞离子的超灵敏性检测；反应条件温和，反应速度快；由于使用纳米金比色法，其检测方法操作简便、检测周期短、易携带；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制备方法简单，性能稳定，纳米金比色的重复性好，适用于食品及水体中汞离子的检测和生物传感器产业化的实际应用；制作该生物传感器的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为本发明构建的比色生物传感器的工作原理图；
图2为实施例4中不同汞离子浓度的吸光度；
图3为实施例5中汞离子浓度对数-吸光度标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 纳米金（AuNPs）的制备
三口烧瓶中加入200mL超纯水，500μL浓度为0.04g/mL的HAuCl4，水浴搅拌加热至沸，搅拌速度450rpm；在搅拌的条件下，取3mL浓度为1%的柠檬酸三钠溶液快速加入溶液中，几分钟内，溶液颜色由浅黄色变为酒红色，继续加热15min后，撤去热源，慢慢冷却至室温，置于4℃保存备用。
经测定，纳米金溶液的浓度约为0.3nM。
实施例2 Probe4修饰的纳米金（Probe4-AuNPs）的制备
（1）取1 mL纳米金溶液于离心管中，15 000rpm离心10 min，离心至上清液无色透明，去除上清液，加入300 μL灭菌水使纳米金溶液浓度为3 nM，移入1 mL玻璃瓶中，用锡箔纸封口备用；
（2）室温放置30 min后，向上述纳米金溶液中加入150 μL浓度为30 μM的Probe4，混合均匀后，4 ℃下放置24 h。
（3）向上述溶液中多次缓慢加入共50 μL PB缓冲液（含磷酸二氢钠和磷酸氢二钠），加入磁子搅拌10 min后，继续加入27 μL PBS缓冲液（含磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，氯化钠），取出磁子，4 ℃放置48 h。
（4）向上述溶液中缓慢加入62 μLPBS缓冲液（此时溶液中氯化钠终浓度为0.3M），4℃放置24h。
（5）将标记好的纳米金溶液转移至离心管中，加入灭菌水至1 mL，离心10 min，去除上清液，重复此过程两次，洗脱未标记上的DNA链，即得Probe4-AuNPs。
经测定，Probe4-AuNPs溶液的浓度约为3nM。
实施例3 生物传感器的制备
（1）将核酸外切酶Ⅲ，核酸外切酶Ⅲ缓冲液及合成的Probe1，Probe2，Probe3溶于灭菌水中，配制成组分a）。
（2）实施例2中制备的Probe4-AuNPs与灭菌水混合，配置Probe4浓度为20μM的溶液，即组分b）。
两组分混合后，Probe1，Probe2，Probe3，Probe4的终浓度分别为10μM，10μM，1μM，10μM，核酸外切酶Ⅲ终浓度为5U/μL。
本比色生物传感器的工作原理如图1所示：
其中Probe1的5’端一部分序列与Probe2的5’端一部分序列碱基互补形成两端的3’端均突出的局部双链，此双链不能被ExoIII水解；在汞离子存在的情况下，Probe3的5’端碱基与Probe1的3’端碱基形成“T-Hg2+-T”结构；接着引发Probe3的后面的序列与Probe1后面的序列碱基互补配对，这部分序列是原来与Probe2的5’端互补配对的，从而释放出Probe2，最终形成一端平齐，一端3’端突出的“双链”，完成链置换过程；此时ExoIII识别平齐端“双链”，按照3’到5’的顺序水解Probe1，释放出Probe3，完成第一个循环；然后体系中继续重复上述循环过程，不断释放出Probe2，实现信号放大。
由于Probe4通过Au-S共价键修饰到纳米金表面，使得金纳米颗粒之间的距离较远不会聚沉；而Probe4的3’端一部分序列与Probe2的5’端一部分序列碱基互补，当体系中存在游离Probe2时，会形成一端平齐，一端3’端突出的双链，ExoIII识别平齐端“双链”，按照3’到5’的顺序水解Probe4，释放Probe2，完成第一个循环；释放出的Probe2又可继续同Probe4杂交实现后续循环信号放大；失去Probe4长臂的金纳米粒间的距离减小，彼此靠近从而聚沉，通过测量纳米金溶液的吸光度即可定量检测汞离子。
实施例4 生物传感器的检测限
采用实施例3中的生物传感器检测不同浓度的汞离子标准溶液，确定其检测限，步骤如下：
（1）将27μL组分a）与3μL不同浓度的汞离子标准溶液（终浓度为0 nM，1 nM，5 nM，10nM，50 nM，100 nM，500 nM，1 μM，5 μM，10μM）分别加入不同离心管中，震荡30s混合均匀，37℃保温孵育30min；
（2）将上述溶液分别加入30μL组分b）混合均匀，37℃保温孵育30min；
（3）从水浴锅中取出混合溶液，测定各混合溶液在400-800nm的吸光度值；
（4）根据不同浓度的汞离子标准溶液的吸光度值，以汞离子浓度对数为横坐标，以吸光度值为纵坐标作图，如图2所示，由图2可知，本发明的生物传感器对Hg2+的线性检测范围为1nM-5μM。
实施例5 对汞离子的检测
采用实施例3中的生物传感器检测待测样品中汞离子含量，步骤如下：
（1）将27μL组分a）与3μL不同浓度的汞离子标准溶液（终浓度为0 nM，1 nM，5 nM，10nM，50 nM，100 nM，500 nM，1 μM，5 μM，10μM）和待测溶液分别加入11支离心管中，震荡30s混合均匀，37℃保温孵育30min；
（2）将上述溶液分别加入30μL组分b）混合均匀，37℃保温孵育30min；
（3）从水浴锅中取出混合溶液，测定各混合溶液在400-800nm的吸光度值；
（4）根据不同浓度的汞离子标准溶液的吸光度值，作汞离子浓度对数-吸光度值的标准曲线计算回归方程，在根据待测样品中的吸光度值计算所含汞离子浓度。
标准曲线如图3所示；标准曲线的方程为A = 0.6267-0.092*logC，其中A是紫外吸收峰值，C是汞离子的浓度。待测样品中的吸光度值为0.452nm，所含汞离子浓度约为80nM。
<110> 济南大学
<120> 一种基于链置换及纳米金检测汞离子的比色生物传感器
<130> 20171013
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<400> 4
tttcacgctt tc 12
Claims (9)
1.一种基于链置换及纳米金检测汞离子的比色生物传感器，其特征在于，包括a）含3条探针Probe1、Probe2和Probe3，核酸外切酶III；
和b）探针Probe4修饰的纳米金；
所述探针Probe1、Probe2、Probe3和Probe4的序列如SEQ No. 1、SEQ No. 2、SEQ No. 3和SEQ No. 4所示；所述Probe4的5’端修饰巯基（-SH）。
2.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，核酸外切酶III在反应体系中的终浓度为5U/μL。
3.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，Probe1、Probe2和Probe3在组分a）中的浓度分别为8-20 μM、8-20 μM和0.8-2.0 μM。
4.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，组分b）中修饰在纳米金上的Probe4的浓度为8-20 μM。
5.一种如权利要求1-4任一所述比色生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分别配制探针Probe1、Probe2、Probe3和Probe4溶液；
（2）配制含3条探针Probe1、Probe2和Probe3，核酸外切酶Ⅲ的组分a）的溶液；
（3）制备纳米金；
（4）制备Probe4修饰的纳米金溶液，即组分b）的溶液。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，纳米金的粒径为20nm。
7.一种利用如权利要求1-4任一所述的比色生物传感器检测汞离子的方法，其特征在于，采用以下步骤：
（a）将组分a）与不同浓度的汞离子标准溶液和待测溶液分别混合均匀，37℃保温孵育30min；
（b）将组分b）加入到上述溶液混合均匀，37℃保温孵育30min；
（c）从水浴锅中取出混合溶液，测定各混合溶液的吸光度值；
（d）根据不同浓度的汞离子标准溶液的吸光度值，作汞离子浓度对数-吸光度值的标准曲线计算回归方程，再根据待测样品中的吸光度值计算所含汞离子浓度。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，吸光度值测定波长为400-800nm。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，汞离子检测浓度为0nM-10μM。
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