CN102621088A - 基于特异性寡核苷酸和纳米金的汞离子(ⅱ)检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于汞离子特异性寡核苷酸探针和纳米金的快速比色检测水中汞离子的检测方法和试剂盒,利用T-T碱基对对Hg2+的特异性识别形成稳定的T-Hg2+-T配位化合物,以及纳米金对单双链DNA吸附能力的差异性测实现了Hg2+的特异性检测。该纳米生物传感器在不使用任何特殊仪器条件下就可以实现对Hg2+可视化便捷分析,操作简便,检测时间短,灵敏度较高,特异性强,对很多非特异性金属离子的响应都非常小,特别适合野外现场大批量样本检测,易于推广使用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,涉及利用汞离子特异性寡核苷酸探针和纳米金构建一种快速比色检测水中汞离子的纳米生物传感器方法及其试剂盒。
背景技术
汞离子的检测长期以来一直受到研究人员的高度关注。自工业革命起,汞被运用到生产生活中,环境里的汞含量日益增长,汞污染范围也逐年扩大。据统计,汞在全球水体中的含量比数年前已增加了三倍左右,工业区附近汞的含量则更高。由于汞污染具有高迁移性和持久性,可通过甲基化、生物富集以及食物链放大作用,会对环境以及人类健康造成极大的危害。
传统的汞离子检测方法包括原子吸收光谱、质谱法等,往往需要大型仪器,成本昂贵,操作复杂耗时,且需要熟练人员操作。近年来,国内外已发展了许多汞离子检测方法,其中利用汞离子可使胸腺嘧啶(Thymine,T)之间形成特异的错配结合(T-Hg2+-T)这一特性构建的一系列纳米金方法尤为突出。纳米金是指颗粒尺寸为纳米数量级的金微小颗粒,通常在水溶液中以胶体的形态存在,故又称胶体金。纳米金的最大吸收波长与纳米金的粒径和彼此间距离相关,纳米金粒径从小到大的变化过程中,其颜色由红色变为蓝色;同样地,纳米金的聚集会使吸收峰产生明显的红移而变为蓝色。此外,单链DNA能够以很高的亲和性自发吸附到未加修饰的带负电荷的纳米金颗粒上,而双链DNA的吸附则较弱。因此,在一定浓度的盐离子条件下,有单链DNA吸附的纳米金在单链DNA的保护下较为稳定,在盐溶液中保持良好的分散性而仍然呈红色,而双链 DNA溶液中的纳米金粒子会因为聚集而呈现由红变紫的颜色变化。利用DNA-纳米金这种距离-颜色效应的光学性质,研究者们发展了很多基于纳米金的聚集、分散状态变化的Hg2+检测方法。
2007年初,Mirkin课题组设计了两段寡核苷酸探针,序列分别为5’HS-C10-A10-T-A103’和5’HS-C10-T10-T-T103’。而当溶液中有Hg2+存在时,T-T错配之间因Hg2+而形成特异的键合,使得两探针之间的Tm值明显升高,从而定量分析Hg2+。但该方法需要严格的温度控制,不易于推广使用。Xuejia Xue等人通过改良组装到纳米金表面的寡核苷酸探针,并引入了第三段序列linkerDNA,使linker DNA能与两个探针序列同时杂交。该检测方法在室温下即可进行,但需要三条寡核苷酸探针,其中两条仍需要经过巯基修饰,繁琐耗时且价格昂贵。Lihua Wang等报道利用一条聚T寡核苷酸探针,通过Hg2+特异性稳定T-T错配形成茎环结构,使与聚T寡核苷酸探针结合的纳米金失去保护而在高盐条件下聚集,并产生红色-蓝色的颜色变化,实现对Hg2+的快速便捷分析,但灵敏度有待提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有的汞离子检测方法存在的不足,提供一种利用优化的汞离子特异性寡核苷酸探针和纳米金快速比色检测水中汞离子的纳米生物传感器方法及其试剂盒。
本发明的第一个目的是公开一种新型的纳米生物传感器,以及利用此传感技术进行快速检测汞离子的方法。这种新方法可包括以下步骤:
(1)将待检测水溶液和汞离子寡核苷酸探针混合,室温反应;
(2)将纳米金加入到上述溶液中,室温反应;
(3)最后加入NaNO3,观察颜色变化,并进行可见光光谱检测。
本发明的第二个目的是提供一种基于纳米生物传感器的汞离子快速检测试剂盒,它含有:
(1)纳米金,其粒径约15nm,浓度约为2.97nmol/L;
(2)两种汞离子寡核苷酸探针,最适浓度都为10μmol/L;
(3)NaNO3溶液,最适浓度为0.5mol/L;
(4)阳性对照溶液和阴性对照溶液;
(5)说明书。
试剂盒中的纳米金、汞离子寡核苷酸探针和NaNO3溶液等可以是浓缩液。
我们对已有汞离子寡核苷酸探针的进行了优化设计,去除非特异的环部分(4bp),截取两端的茎部分(9bp),经试验成功获得信噪比更高的汞离子特异性核苷酸探针。原因可能是单链DNA吸附于纳米金的效率与序列的长度有关,即短序列比长序列吸附效率更高,从而能使纳米金在高盐条件下更稳定,这与Huixiang Li等人报道一致。
我们在此基础上成功构建了一种可以快速比色检测Hg2+的纳米生物传感器。该纳米生物传感器通过两条截短MSO吸附的纳米金颜色变化和A650/A522的改变实现对Hg2+的初步检测。相对于现有技术,本发明提供的条两截短的汞离子特异性核苷酸探针(9bp),寡核苷酸探针序列更短、无需标记;纳米生物传感器方法和试剂盒在不使用任何特殊仪器条件下就可以实现对Hg2+可视化便捷分析,操作简便,检测时间短,灵敏度较高,特异性强,对很多非特异性金属离子的响应都非常小,特别适合野外现场大批量样本检测。
附图说明
下面结合附图对本发明做进一步说明。
图1MSO优化设计
图2NaNO3浓度优化
图3A650/A522值随时间变化曲线
图4Hg2+检测灵敏度分析
图5Hg2+检测特异性评价
图6汞离子纳米生物传感器的TEM图(注:a图为阴性对照(×100000);b图为阳性对照(×100000)。
图7比色检测混合溶液
图8比色检测河水模拟标本
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备,其他未注明的实验条件按照常规或以其制造厂商所建议的条件:Varioskan Flash多功能读数仪(美国Thermo Scientific公司);透射电子显微镜H-7500(日本日立株式会);加热磁力搅拌器DF-101S(巩义予华仪器责任有限公司);紫外-可见光光谱分光光度计U-3010(日本日立株式会);5417R小型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);PURELAB Classic超纯水仪(英国ELGA LabWater公司)。
实施例1MSO优化设计
本研究选用的MSO序列见表1,其中MSO1为Lihua Wang等人报道的汞离 子特异性寡核苷酸探针(茎环结构)。为了能够提高汞离子检测的灵敏度,并降低DNA的合成成本,对MSO1进行优化设计,去除非特异的环部分(4bp),截取两端的茎部分(9bp),分别标记为MSO2和MSO3。
表1汞离子特异性寡核苷酸
分别取3.5μLMSO(10μmol/L MS01、20μmol/L MSO2、20μmol/L MSO3或者MSO2和MSO3各10μmol/L混合液),加入3.5μLHg2+(100μmol/L)用超纯水补齐至总体积20μL,室温反应5分钟,然后加入100μL纳米金,室温反应5分钟,最后加入13μLNaNO3。观察颜色变化,并用Varioskan Flash多功能酶标仪记录每孔的A650和A522,同时每组都以超纯水做空白对照,计算不同MSO检测Hg2+的S/N(signal-to-noise,信噪比)。结果如图1:MSO1检测Hg2+的S/N为2.06±0.23;经过优化设计后的MSO2、MSO3和MSO2+3检测Hg2+的S/N都明显比MSO1升高,其中以MSO2+3效果最佳。
实施例2NaNO3浓度优化
分别取13μL不同浓度(0.25,0.5,1,2mol/L)的NaNO3,用上述优化设计的MSO进行比色检测,用Varioskan Flash多功能酶标仪记录每孔的A650和A522,同时每组都以超纯水做空白对照,计算不同NaNO3浓度下检测Hg2+的S/N。图2中我们可以看到NaNO3浓度从0.25增加到0.5mol/L,纳米生物传感器检测Hg2+的S/N也随之增加,达到6.83±0.08。但继续增加NaNO3,S/N反而下降,可能是过高的盐浓度会使空白对照也发生颜色变化,因此选择0.5mol/L的硝酸钠为最佳浓度。
实施例3比色检测Hg2+
我们将汞离子纳米生物传感器分别与Hg2+(1mmol/L)和超纯水反应,绘制A650/A522随时间变化曲线。如图3所示,加入NaNO3后短短5秒,汞离子纳米生物传感器就可以成功地区分Hg2+和超纯水溶液。且随着时间延长,Hg2+(1mmol/L)组的A650/A522也随之增大,在15分钟时达到平衡(A650/A522=1.13);而超纯水组仍仅有0.16左右,可以认为几乎没有变化。
为了进一步分析该纳米生物传感器检测的灵敏度,本研究对一系列不同浓度的Hg2+进行检测。肉眼目测20μmol/L时纳米金颜色开始变化,浓度越大,变化越明显;经比色分析计算,最低可以检测到10μmol/L(如图4,3倍空白标准差),与Lihua Wang等人报道结果(50μmol/L)相比,灵敏度提高了5倍。
利用该纳米生物传感器对500μmol/L K+、Na+、Li+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+和100μmol/L Hg2+等进行重复检测3次,都可以显著地将较低浓度的Hg2+与较高浓度的其它离子区分开来,且A650/A522均只有Hg2+的25%左右,见图5。说明我们制备的纳米生物传感器与测试的其他金属离子均不会发生交叉反应或非特异性反应。
透射电镜扫描观察,图6a为阴性对照,是汞离子纳米生物传感器与Zn2+作用后所得的TEM图,可见纳米金分散性良好;图6b为阳性对照,是汞离子纳米生物传感器与Hg2+作用后所得的TEM图,可见纳米金大量聚集。
实施例4比色检测模拟标本
在Hg2+的检测中,其它金属离子的干扰常常是影响检测特异性和灵敏度的一个重要问题。因此在本研究中,我们又用汞离子纳米生物传感器检测了混合溶液和加Hg2+河水等模拟实际标本。配制三组混合溶液:I组为碱土金属Ca2+,Mg2+,Ba2+的混合溶液;II组为Cu2+,Zn2+,Cd2+的混合溶液;III组为一价金属 离子K+,Na+,Li+的混合溶液,各离子浓度为500μmol/L。配置加Hg2+河水:在河水中加入终浓度为100μmol/L的Hg2+。如图7所示,混合溶液I、II和III组的颜色与未加任何离子的H2O组一致,都未变色,仍为红色,相对应的可见吸收光谱图也几乎重叠在一起;而Hg2+(100μmol/L)组颜色发生明显改变,从红色转变为蓝色,同时在650nm处的吸光度也明显升高。
另外,如图8所示,溶液a(空白对照组)和溶液b(河水组)颜色一致,仍为红色,相对应的可见吸收光谱图也几乎重叠在一起;而溶液c(加Hg2+河水组)从红色转变为蓝色,同时在650nm处的吸光度也明显升高,计算相应的A650/A522为0.68,与上述灵敏度分析试验里的100μmol/L Hg2+计算所得的A650/A522(0.67±0.02)一致。表明无论是浓度为Hg2+浓度50倍的其它金属离子混合液还是实际的河水溶液,都不能使汞离子纳米生物传感器颜色产生变化,不会干扰其对Hg2+的检测。由此可见,该纳米生物传感器具有较高的选择性。
Claims (6)
1.一种利用寡核苷酸和纳米金检测汞离子的比色检测法,其特征在于该方法包括一下步骤:
(1)将寡核苷酸加入到待检测水溶液,寡核苷酸与汞离子特异性结合所形成的稳定的T-Hg2+-T配位化合物;
(2)将纳米金加入到上述溶液中进行反应;
(3)最后加入NaNO3,纳米金颗粒相互聚集,表面等离子吸收峰发生红移,通过颜色的变化即可检测溶液中的汞离子。
2.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和纳米金检测汞离子的比色检测法,其特征在于,步骤(1)所述的特异性汞离子寡核苷酸探针碱基组成为5’-TTGTTTGTT-3’和5’-TTCTTTCTT-3’,浓度都为10μmol/L,室温反应时间为5分钟。
3.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和纳米金检测汞离子的比色检测法,其特征在于,步骤(2)所述纳米金溶液配制方法:将100mL的0.01%的氯金酸水溶液加热至剧烈沸腾后,剧烈搅拌下快速加入3.5mL的1%柠檬酸三钠溶液,继续加热搅拌20min后,停止加热,继续搅拌30min后静置,室温自然冷却,用0.22μm滤膜过滤。
4.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和纳米金检测汞离子的比色检测法,其特征在于,步骤(2)所述纳米金的粒径约15nm,浓度约为2.97nmol/L,室温反应时间为5分钟。
5.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和纳米金检测汞离子的比色检测法,其特征在于,步骤(3)所述NaNO3的浓度为0.5mol/L。
6.根据权利要求1所述的利用寡核苷酸和纳米金检测汞离子的比色检测法,其特征在于,步骤(3)所述NaNO3加入后的最佳反应时间为15分钟。
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