CN104155290B - 一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法及其应用，特点是包括将多聚L-赖氨酸溶液与含有0.001？M电化学发光体的DMF溶液按体积比20：1的比例混合，反应2～6小时后，取反应液5μL，滴涂于电极表面，干燥，形成多聚L-赖氨酸膜的步骤；脱氧核酶结合物溶液制备的步骤；最后在多聚L-赖氨酸膜上依次滴加戊二醛溶液、脱氧核酶结合物溶液、牛血清蛋白溶液和亲和素溶液，得到固态电化学发光传感器，优点是准确性和灵敏度高，且能简单快速地检测铅离子。
Description
技术领域
本发明涉及重金属检测技术领域，尤其是涉及一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法及其应用。
背景技术
随着现代工业的发展，重金属污染对环境和人类的危害越发严重。铅（Pb）是最常见的重金属之一，铅离子（Pb2+）是铅在自然界中的主要存在形式之一。铅在工业生产中有广泛应用，随着各种人类活动迁移入环境中和生物体内并长期残留，浓度低至nM级别的铅甚至更低浓度的铅即可对神经系统、血液系统、消化系统等造成严重损害，威胁人类健康。因此，开发准确、灵敏、快速、简单的低浓度铅离子（Pb2+）检测方法，非常必要和重要。
铅离子检测的标准方法主要包括：原子发射光谱法、ICP-MS法、原子吸收光谱法、电化学法、离子色谱法、毛细管电泳法、紫外—可见分光光度法、X射线荧光光谱法等，但这些方法依赖大型仪器，成本比较高，需要熟练的操作人员，样品前处理比较复杂，难以满足实际检测高效低成本的需要。另外近年也有一些新型的铅离子检测方法，如重金属快速测定仪法、试纸条法、比色法等，但灵敏度不高、选择性差，难以准确定量检测低浓度铅离子。
电化学发光是电化学与化学发光相结合的技术，具有灵敏度高、线性范围宽、仪器操作简单、分析成本低等优点。但是，目前，国内外还没有公开任何通过凝胶膜将电化学发光体化学键合后固定在电极表面对铅离子进行检测的固态电化学发光传感器的制备方法及其应用的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种准确度和灵敏度高，且能简单快速地检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法及其应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）多聚L-赖氨酸膜制备
将多聚L-赖氨酸（分子量30万道尔顿以上）溶于0.2 M、pH=8～9的碳酸盐缓冲液中配制1～3 wt%的多聚L-赖氨酸溶液，将多聚L-赖氨酸溶液与含有0.001 M电化学发光体的二甲基甲酰胺（DMF）溶液按体积比20：1的比例混合，反应2～6小时后，取反应得到的混合溶液5 μL，滴涂于电极表面，干燥，即可在电极表面形成均匀的多聚L-赖氨酸膜；所述的电化学发光体的结构式为Ru-P3X2，其中Ru为配合物中心离子，P为配体，3个配体中至少一个为含有N-琥珀酰亚胺酯（NHS）基团的配体，X为一价阴离子；该NHS基团可以和氨基结合，形成酰胺键；
（2）脱氧核酶结合物溶液制备
将100 μM的DNA1溶液与100 μM的DNA2溶液等体积混合均匀，于90℃水浴反应5min，自然冷却至室温后得到50 μM的脱氧核酶结合物溶液，脱氧核酶结合物结构如下：
；
（3）电化学发光传感器制备
在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10 μL的1～3 wt%戊二醛溶液，静置20～40分钟后，用pH7～8的0.01～0.1 M PBS缓冲液清洗；
继续在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10 μL 的浓度为1～10 μM的脱氧核酶结合物溶液，静置30～60分钟，直至脱氧核酶结合物偶联到电极表面，用pH7～8的0.01～0.1 MPBS缓冲液清洗；
再在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10 μL 的浓度为2 wt%的牛血清蛋白（BSA）溶液，静置20～40分钟，封闭非活性位点，用pH7～8的0.01～0.1 M PBS缓冲液清洗；
最后在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10 μL 的0.01～0.1 mg/mL亲和素溶液，孵育5min后，用pH7～8的0.01～0.1 M PBS缓冲液清洗，即得到检测铅离子的固态电化学发光传感器。
步骤（1）中所述的配体为二联吡啶或/和邻菲啰啉。
步骤（1）中所述的一价阴离子为六氟磷酸根离子或者氯离子。
步骤（1）中所述的电极为玻碳电极、石墨电极、ITO电极和贵金属电极中的任一种。
步骤（2）中所述的DNA1的结构式为：NH2-3'-AGTCTACACTAGG rA TATGTG-5'-biotin；所述的DNA2的结构式为：5'-TCAGATGTGATCTCCGAGCCGGTCGAAATACAC-3'。
上述检测铅离子的固态电化学发光传感器的使用方法，包括以下步骤：
（1）以权利要求1所述的检测铅离子的固态电化学发光传感器为工作电极，饱和甘汞电极或者Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；
（2）在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I0，采用的电化学方法：电位阶跃计时电流法；电位阶跃：0 V阶跃至1.6 V；脉冲宽度：0.1 s；测量时间间隔：30 s；
（3）在工作电极表面滴加含Pb2+的待测溶液5 μL，30 min后，用pH7～8的0.01～0.1M PBS缓冲液清洗，在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I1；
（4）计算待测溶液的电化学发光强度的改变值ΔI= I1−I0，根据电化学发光强度的改变值ΔI与Pb2+浓度值之间的定量关系，计算获得含Pb2+的待测溶液中Pb2+的浓度值CPb。
所述的电化学发光测试液为 0.1 M pH7～8的 PBS缓冲液和1M 三丙胺(TPA)溶液按体积比97：3的比例混合而成。
发明原理：Ru-P3X2中含有NHS基团，在碱性缓冲液中可以与多聚L-赖氨酸中的氨基基团发生化学反应，形成稳定的酰胺键，这样就可以把电化学发光体Ru-P3X2稳定地化学键合到多聚L-赖氨酸上，形成信号稳定的固态电化学发光。在戊二醛的交联作用下，脱氧核酶结合物链端的氨基与多聚L-赖氨酸膜表面多余的氨基偶联，从而被组装到多聚L-赖氨酸膜表面。脱氧核酶结合物链另一端的生物素可以与亲和素特异性结合，使得亲和素也被组装到多聚L-赖氨酸膜表面。由于亲和素分子量达到60kD，当亲和素被组装到多聚L-赖氨酸膜表面后，其可以有效地阻碍电子和光的传递，使得该固态电化学发光传感器的电化学发光强度I0很小。当Pb2+存在时，Pb2+在rA处切断脱氧核酶结合物，使得亲和素从多聚L-赖氨酸膜表面脱落，电子和光的传递更加容易，固态电化学发光传感器的电化学发光强度I1增大。Pb2 +浓度越大，在单位时间内切断的脱氧核酶结合物越多，脱落的亲和素越多，发光强度的改变值ΔI= I1−I0也就越大，这就是本固态电化学发光传感器定量检测铅离子的机理。固态电化学发光传感器检测铅离子的原理图如图1所示。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、灵敏度高。本发明采用电化学发光检测技术，该技术是基于暗背景下的光学测量，本身具有极高的灵敏度。本固态电化学发光传感器可定量检测0.01 nM Pb2+。
2、选择性高，准确性高。采用Pb2+与脱氧核酶结合物、生物素和亲和素之间的特异性识别，因此具有很高的选择性和准确性。
3、步骤简单。固态电化学发光传感器制备完成之后，仅需一个反应步骤即可测量。
4、成本低廉。所需试剂量极少。
5、精密度高。采用固态电化学发光，信号稳定，结果精密度高。
附图说明
图1为本发明固态电化学发光传感器检测铅离子的原理图；
图2为不同浓度铅离子对应的电化学发光信号；
图3为本发明固态电化学发光传感器检测铅离子的选择性检测结果图；
图4为发光强度的改变值ΔI与铅离子浓度对数之间的线性关系图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例一
一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）多聚L-赖氨酸膜制备
将多聚L-赖氨酸（分子量30万道尔顿以上）溶于0.2 M、pH=8～9的碳酸盐缓冲液中配制1～3 wt%的多聚L-赖氨酸溶液，将多聚L-赖氨酸溶液与含有0.001 M电化学发光体的二甲基甲酰胺（DMF）溶液按体积比20：1的比例混合，反应2～6小时后，取反应得到的混合溶液5 μL，滴涂于电极表面，干燥，即可在电极表面形成均匀的多聚L-赖氨酸膜；所述的电化学发光体的结构式为Ru-P3X2，其中Ru为配合物中心离子，P为配体，3个配体中至少一个为含有N-琥珀酰亚胺酯（NHS）基团的配体，X为一价阴离子；该NHS基团可以和氨基结合，形成酰胺键；该配体为二联吡啶或/和邻菲啰啉，一价阴离子为六氟磷酸根离子或者氯离子；电极为玻碳电极、石墨电极、ITO电极和贵金属电极中的任一种；
（2）脱氧核酶结合物溶液制备
将100 μM的DNA1溶液与100 μM的DNA2溶液等体积混合均匀，于90℃水浴反应5min，自然冷却至室温后得50 μM的脱氧核酶结合物溶液，脱氧核酶结合物结构如下：
；
上述DNA1的结构式为：NH2-3'-AGTCTACACTAGG rA TATGTG-5'-biotin； DNA2的结构式为：5'-TCAGATGTGATCTCCGAGCCGGTCGAAATACAC-3'；
（3）电化学发光传感器制备
在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10 μL的1～3 wt%戊二醛溶液，静置20～40分钟后，用pH7～8的0.01～0.1 M PBS缓冲液清洗；
继续在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10 μL的浓度为1～10 μM的脱氧核酶结合物溶液（由步骤2的50 μM的脱氧核酶结合物溶液稀释得到），静置30～60分钟，直至脱氧核酶结合物偶联到电极表面，用pH7～8的0.01～0.1 M PBS缓冲液清洗；
再在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10 μL的 浓度为2wt%的牛血清蛋白（BSA）溶液，静置20～40分钟，封闭非活性位点，用pH7～8的0.01～0.1 M PBS缓冲液清洗；
最后在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10 μL 的0.01～0.1 mg/mL亲和素溶液，孵育5min后，用pH7～8的0.01～0.1 M PBS缓冲液清洗，即得到检测铅离子的固态电化学发光传感器。
上述多聚L-赖氨酸膜制备的步骤中：
多聚L-赖氨酸溶液的浓度还可以为1～3 wt%内的任一值；多聚L-赖氨酸溶液与电化学发光体Ru-P3X2的二甲基甲酰胺（DMF）溶液反应时间可以为2、3、4、5或者6小时；电极为玻碳电极、石墨电极、ITO电极和贵金属电极中的任一种。
上述电化学发光传感器制备的步骤中：
戊二醛溶液的浓度可以为1～3 wt%内的任一值，滴加体积为5～10 μL内的任一值，静置时间为20～40分钟内的任一值；
脱氧核酶结合物溶液的浓度可以为1～10 μM内的任一值，滴加体积为5～10 μL内的任一值，静置时间为30～60分钟内的任一值；
BSA溶液滴加体积可以为5～10 μL内的任一值，静置时间可以为20～40分钟内的任一值；
亲和素溶液的浓度可以为0.01～0.1 mg/L内的任一值，滴加体积为5～10 μL内的任一值；
PBS缓冲液的浓度可以为0.01～0.1 M内的任一值，pH可以为7～8内的任一值。
具体实施例二
一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的使用方法，固态电化学发光传感器检测铅离子的原理如图1所示，包括以下步骤：
（1）以上述具体实施例一制备得到的检测铅离子的固态电化学发光传感器为工作电极，饱和甘汞电极或者Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；
（2）在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I0，采用的电化学方法：电位阶跃计时电流法；电位阶跃：0 V阶跃至1.6 V；脉冲宽度：0.1 s；测量时间间隔：30 s；该电化学发光测试液为 0.1 M pH7～8的 PBS缓冲液和1M三丙胺(TPA)溶液按体积比97：3的比例混合而成；
（3）在工作电极表面滴加含Pb2+的待测溶液5 μL，30 min后，用pH7～8的0.01～0.1M PBS缓冲液清洗，在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I1；
（4）电化学发光强度的改变值ΔI= I1−I0，与铅离子浓度对数在0.01～10 nM浓度范围内呈线性关系（不同浓度铅离子对应的电化学发光信号，如图2所示），计算含Pb2+的待测溶液电化学发光强度的改变值ΔI= I1−I0，根据发光强度的改变值ΔI与铅离子浓度对数之间的线性关系图，计算获得含Pb2+的待测溶液中Pb2+的浓度值CPb，单位为nM。
具体实施例三
高选择性和高灵敏性的检测试验
高灵敏性由具体实施例二体现，由于电化学发光强度的改变值ΔI= I1−I0，与铅离子浓度对数在0.01～10 nM浓度范围内呈线性关系，因此，实施例一制备得到的检测铅离子的固态电化学发光传感器可定量检测0.01 nM Pb2+。
高选择性：以上述具体实施例一制备得到的检测铅离子的固态电化学发光传感器为工作电极，以上述具体实施例二同样的实验条件，检测10 μM的常见干扰离子：Hg2+, Mn2 +, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Mg2+，结果如图3所示。
结果表明：0.01 nM Pb2+造成传感器的ΔI为1200左右，而10 μM的常见干扰离子造成传感器的ΔI均小于200，意味着1000000倍的常见干扰离子不影响检测，主要原因为Pb2+与脱氧核酶结合物、生物素和亲和素之间的特异性识别。
具体实施例四
准确度和精密度试验
以上述具体实施例一制备得到的检测铅离子的固态电化学发光传感器为工作电极，以上述具体实施例二同样的实验条件，检测高中低三种浓度的Pb2+标准溶液，结果如下表：
由上表可知，回收率在92.2～101.8%之间，表明准确度良好。RSD在5.2～10.4%之间，表明精密度良好。
具体实施例五
应用实施例1
检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备及其具体应用
（1）多聚L-赖氨酸膜制备
取多聚L-赖氨酸（分子量30万道尔顿以上）0.1 g，溶于0.2 M、pH=8的碳酸盐缓冲液9.9 mL，配制成1 wt%的多聚L-赖氨酸溶液，取1 wt%的多聚L-赖氨酸溶液1 mL与含有0.001 M电化学发光体二(2,2'-二联吡啶)-4,4'-二羰基二联吡啶钌二(N-琥珀酰亚胺酯)二(六氟磷酸盐)的二甲基甲酰胺（DMF）溶液50 μL混合，反应2小时后，取反应得到的混合溶液5 μL，滴涂于玻碳电极表面，干燥，即可在电极表面形成均匀的多聚L-赖氨酸膜；该电化学发光体二(2,2'-二联吡啶)-4,4'-二羰基二联吡啶钌二(N-琥珀酰亚胺酯)二(六氟磷酸盐)的结构式如下：
；
（2）脱氧核酶结合物溶液制备
将100 μM的DNA1溶液与100 μM的DNA2溶液等体积混合均匀，于90℃水浴反应5min，自然冷却至室温后得50 μM的脱氧核酶结合物溶液，脱氧核酶结合物结构如下：
；
（3）电化学发光传感器制备
在多聚L-赖氨酸膜上滴加5 μL的1 wt%戊二醛溶液，静置20分钟后，用pH7的0.01M PBS缓冲液清洗；
继续在多聚L-赖氨酸膜上滴加1 μM的脱氧核酶结合物溶液5 μL，静置30分钟，直至脱氧核酶结合物偶联到电极表面，用pH7的0.01 M PBS缓冲液清洗；
再在多聚L-赖氨酸膜上滴加5 μL 2%BSA溶液，静置20分钟，封闭非活性位点，用pH7的0.01 M PBS缓冲液清洗；
最后在多聚L-赖氨酸膜上滴加5 μL 的0.01 mg/mL亲和素溶液，孵育5 min后，用pH7的0.01 M PBS缓冲液清洗，即得到检测铅离子的固态电化学发光传感器；
（4）取0.1 M pH 7的 PBS缓冲液0.97 mL与1 M 三丙胺(TPA)溶液0.03 mL混合，即得电化学发光测试液，以上述的固态电化学发光传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；将三电极插入电化学发光测试液，测试电化学发光强度I0为565 ± 19，采用的电化学方法：电位阶跃计时电流法；电位阶跃：0 V阶跃至1.6 V；脉冲宽度：0.1 s；测量时间间隔：30 s；
（5）在工作电极表面滴加含0.1 nM Pb2+的待测溶液5 μL，30 min后，用pH7的0.01M PBS缓冲液清洗，在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I1为2984 ± 23；
（6）计算电化学发光强度的改变值ΔI= I1−I0 = 2419，根据线性方程为：ΔI =3621.35 + 1242.28 log CPb (nM) （发光强度的改变值ΔI与铅离子浓度对数之间的线性关系图，如图4所示），计算获得含Pb2+的待测溶液中Pb2+的浓度为0.108 nM。
应用实施例2
方法步骤基本同上述应用实施例1，其区别在于：电化学发光体采用二(2,2'-二联吡啶)-4'-甲基-4-羧基二联吡啶钌N-琥珀酰亚胺酯二(六氟磷酸盐)，其的结构式如下：
在工作电极表面滴加含1 nM Pb2+的待测溶液5 μL，最终计算获得含Pb2+的待测溶液中Pb2+的浓度为1.058 nM。
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (6)
1.一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)多聚L-赖氨酸膜制备
将多聚L-赖氨酸溶于0.2M、pH＝8～9的碳酸盐缓冲液中配制1～3wt％的多聚L-赖氨酸溶液，将多聚L-赖氨酸溶液与含有0.001M电化学发光体的二甲基甲酰胺溶液按体积比20：1的比例混合，反应2～6小时后，取反应得到的混合溶液5μL，滴涂于电极表面，干燥，即可在电极表面形成均匀的多聚L-赖氨酸膜；所述的电化学发光体的结构式为Ru-P3X2，其中Ru为配合物中心离子，P为配体，3个配体中至少一个为含有N-琥珀酰亚胺酯基团的配体，X为一价阴离子；
(2)脱氧核酶结合物溶液制备
将100μM的DNA1溶液与100μM的DNA2溶液等体积混合均匀，于90℃水浴反应5min，自然冷却至室温后得到50μM的脱氧核酶结合物溶液，脱氧核酶结合物结构如下：
其中所述的DNA1的结构式为：
NH2-3'-AGTCTACACTAGG rA TATGTG-5'-biotin；所述的DNA2的结构式为：
5'-TCAGATGTGATCTCCGAGCCGGTCGAAATACAC-3'；
(3)电化学发光传感器制备
在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10μL的1～3wt％戊二醛溶液，静置20～40分钟后，用pH7～8的0.01～0.1M PBS缓冲液清洗；继续在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10μL的浓度为1～10μM的脱氧核酶结合物溶液，静置30～60分钟，直至脱氧核酶结合物偶联到电极表面，用pH7～8的0.01～0.1M PBS缓冲液清洗；再在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10μL的浓度为2wt％的牛血清蛋白溶液，静置20～40分钟，封闭非活性位点，用pH7～8的0.01～0.1M PBS缓冲液清洗；最后在多聚L-赖氨酸膜上滴加5～10μL的0.01～0.1mg/mL亲和素溶液，孵 育5min后，用pH7～8的0.01～0.1M PBS缓冲液清洗，即得到检测铅离子的固态电化学发光传感器。
2.根据权利要求1所述的一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的配体为二联吡啶或/和邻菲啰啉。
3.根据权利要求1所述的一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的一价阴离子为六氟磷酸根离子或者氯离子。
4.根据权利要求1所述的一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的电极为玻碳电极、石墨电极、ITO电极和贵金属电极中的任一种。
5.一种根据权利要求1-4中任一项所述的检测铅离子的固态电化学发光传感器的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以检测铅离子的固态电化学发光传感器为工作电极，饱和甘汞电极或者Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，构建三电极系统；
(2)在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I0，采用的电化学方法：电位阶跃计时电流法；电位阶跃：0V阶跃至1.6V；脉冲宽度：0.1s；测量时间间隔：30s；
(3)在工作电极表面滴加含Pb2+的待测溶液5μL，30min后，用pH7～8的0.01～0.1M PBS缓冲液清洗，在电化学发光测试液中，测试电化学发光强度I1；
(4)计算待测溶液的电化学发光强度的改变值ΔI＝I1-I0，根据电化学发光强度的改变值ΔI与Pb2+浓度值之间的定量关系，计算获得含Pb2+的待测溶液中Pb2+的浓度值CPb。
6.根据权利要求5所述的一种检测铅离子的固态电化学发光传感器的使用方法，其特征在于：所述的电化学发光测试液为0.1M pH7～8的PBS缓冲液和1M三丙胺溶液按体积比97：3的比例混合而成。
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