CN107988322A - 一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用 - Google Patents

一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107988322A
CN107988322A CN201711022174.8A CN201711022174A CN107988322A CN 107988322 A CN107988322 A CN 107988322A CN 201711022174 A CN201711022174 A CN 201711022174A CN 107988322 A CN107988322 A CN 107988322A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lead ion
deoxyribozyme
systems
chain
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711022174.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107988322B (zh
Inventor
许文涛
罗云波
黄昆仑
田晶晶
杜再慧
肖冰
董凯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201711022174.8A priority Critical patent/CN107988322B/zh
Publication of CN107988322A publication Critical patent/CN107988322A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107988322B publication Critical patent/CN107988322B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
    • C12Q2326/10—Benzidines
    • C12Q2326/12—3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine, i.e. TMB

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用。所述传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括铅离子脱氧核酶；所述铅离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括氯高铁血红素和显色剂。本发明的传感器，特异性识别铅离子，通过等温指数放大反应进行信号一级的扩大和转化；在氯高铁血红素诱导下形成具有活性的G‑四链体结构，催化显色剂显色，从而产生二级放大与转化，转化成可视化的信号，可以进行高盐环境中的定性和定量的检测。

Description

一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用
技术领域
本发明属于重金属检测技术领域，具体涉及一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用。
背景技术
铅离子是分布广、有蓄积毒性的环境污染物。其性质稳定，可在极低的浓度下对人体产生危害，对神经系统、血液循环系统、消化系统以及泌尿系统等带来多重损伤。环境中的铅化合物主要通过消化道和呼吸道进入人体，但液态铅化合物也可以通过皮肤接触进入人体。被人体吸收的铅率先进入血液中，形成可溶性磷酸铅、甘油磷酸铅等有机铅化合物。铅与蛋白质相结合，在体内循环，可被肝、肾、脑、胰等内脏器官组织吸收。这些器官组织中的铅，以不溶性的三磷酸铅为主要形式转移沉积到骨骼中。除此之外，二价铅离子能抑制乙酰胆碱醋酶、碱性磷酸酶、三磷酸腺苷酶、碳脱水酶和细胞色素氧化酶的活性，扰乱机体正常发育过程中所必需的生化反应和生理活动。人体摄入过量的铅，会引起中枢神经系统损伤，出现疲惫、头疼、痉挛、精神障碍等可损害骨髓造血系统，导致贫血可作用于心血管系统，导致动脉硬化、心肌损害。儿童的神经系统尤其容易受到铅的影响，即便较低浓度的铅暴露都有可能对儿童产生严重的、不可逆的神经损害。
目前金属元素的检测主要采用光谱法，包括原子(吸收、发射、荧光等)光谱、分光光度法等，电化学、声学等方法也有应用。但这些方法依赖于大型仪器和专人操作，在现场和野外检测中受到限制。以醚类、多胺类、环芳烃类等有机小分子为代表的化学传感方法也有一定的发展，目前存在灵敏度低、可重复性差、检测在有机溶剂中进行等不足之处，检测的可靠性和实用性不高。因此迫切需要发展无污染的、简便快速、高灵敏度和高特异性的方法来满足微量金属检测的需要。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供一种能够实现可视化检测、简便快速、高灵敏度和高特异性，基于铅离子核酶、等温指数放大反应(EXPAR)和G-四链体液相传感的铅离子检测的功能核酸显色传感器。
本发明基于的基本原理为：铅离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成、形成特定的二级结构；痕量的铅离子能够特异性识别铅离子脱氧核酶、结合核酶的酶链，并激活核酶、切割核酶的底物链，产生切割产物。在切割产物存在的时候，促发EXPAR发生、放大信号，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列，该序列在氯高铁血红素诱导下形成G-四链体结构、发挥类辣根过氧化物酶(HRP)活性，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色。可以通过手持式光谱检测仪进行检测与定量。
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供的一种铅的耐高盐核酸传感器，括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，
所述分子识别元件包括铅离子脱氧核酶；所述铅离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述信号转换元件包括显色剂和氯高铁血红素；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
上述传感器中，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物；
B体系包括：Bst DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶缓冲溶液。
所述Bst DNA聚合酶缓冲溶液为20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶缓冲溶液为切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mMTris-HCl,10mM MgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
上述传感器中，所述信号转化元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸(2mol/L)；所述显色剂为TMB显色剂。
本发明同时提供了上述传感器在检测铅离子中的应用。
本发明还提供了一种检测铅离子的方法，包括步骤如下：
制备铅离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算铅离子的浓度；
其中铅离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：
(1)制备铅离子脱氧核酶切割产物：将铅离子脱氧核酶底物链与酶链混合、加热、降温得到铅离子脱氧核酶，然后加入不同浓度的铅离子溶液反应，终止反应后，得到不同浓度的铅离子脱氧核酶切割产物溶液；
(2)目标产物的等温扩增：
等温扩增体系由A体系、B体系组成；
所述A体系包括扩增模板、dNTPs、铅离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；
将所述不同浓度的铅离子脱氧核酶切割产物溶液与其他A体系的组成物质混合，制备不同的铅离子浓度的A体系，然后分别与B体系混合，进行等温扩增反应，得到一系列浓度的扩增产物；
(2)G-四链体结构显色物制备
将氯高铁血红素与上述一系列扩增产物分别进行反应，然后加入显色液后进行OD值检测，得到OD值随铅离子浓度变化的标准曲线。
上述方法中，所述铅离子脱氧核酶的制备方法包括：将铅离子脱氧核酶底物链与铅离子脱氧核酶酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降温至25℃。
上述方法中，所述等温扩增反应的步骤为：加入铅离子溶液的A体系在进行等温扩增反应前95℃孵育5min后，A体系和B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应。
上述方法中，氯高铁血红素与扩增产物反应的方法为：将氯高铁血红素与扩增产物混匀后37℃反应30min，加入TMB显色剂，混匀，37℃反应10min，H2SO4终止反应。
本发明同时也提供了一种检测铅离子的试剂盒，包括：铅离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
所述铅离子核酶体系包括底物链、酶链、铅离子标准溶液；
所述等温扩增体系包括A体系、B体系，所述A体系包括扩增模板、dNTPs、铅离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；
所述显色体系包括：氯高铁血红素和显色剂，所述显色剂为TMB显色剂。
上述试剂盒中，优选的，
所述A体系组成:
1μM扩增模板母液：6μL，终浓度0.2μM
2.5mM dNTPs母液:3μL
所述B体系组成：
8U/μL Bst DNA聚合酶母液：0.1μL，终浓度0.02U/μL；
10x(代表10倍量，下同)聚合酶反应缓冲溶液母液：3μL，终浓度1x；
10U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶母液：1.2μL，终浓度0.37U/μL；
10x Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液母液：1.5μL，终浓度0.5x。
本发明还提供了一种铅离子脱氧核酶，所述铅离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链、酶链如下表：
本发明的“倍量”或“x”如无特殊限定，则为体积倍量。
本发明的“终浓度”无特殊限定，则为物质混合后的在总的反应体系的浓度。如1μM扩增模板母液6μL，终浓度为0.2μM，指的扩增模板在等温扩增体系中的浓度。
本发明的有益效果
(1)本发明提供了一种铅的功能性核酸传感器和检测方法，其基于铅离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成、形成特定的二级结构，痕量的铅离子就能够特异性识别铅离子脱氧核酶、结合核酶的酶链，并激活核酶、切割核酶的底物链，产生切割产物。在切割产物存在的时候，促发等温指数放大反应(EXPAR)发生、产生信号的一级放大和转化，并生成大量富含胸腺嘧啶的寡核苷酸序列，在氯高铁血红素诱导下形成具有活性的G-四链体结构，催化过氧化氢与四甲基联苯胺显绿色，硫酸终止反应后显黄色，从而产生二级放大与转化，转化成可视化的信号，可以进行定性的判断。
(2)本发明的传感器经过两次信号的转化，通过手持式光谱检测仪进行就可以进行定量检测通过两次的信号扩大和转化，具有很高的特异性和灵敏度，并且等温指数放大反应迅速，可以快速检测现场环境中的铅离子。
(3)本发明的传感器能够抵抗高盐浓度的干扰，在高盐环境中实现铅离子的检测，可以满足对高盐环境中的铅离子实现定性与定量分析，还能保持较高的特异性和灵敏度，能够检测痕量的铅离子。
附图说明
图1为制备的铅离子脱氧核酶的切割产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；其中数字表示的列为：1-Marker；2-阴性对照：脱氧核酶底物链；3-阴性对照ⅱ：脱氧核酶底物链与酶链，无铅离子；4,5,6-阳性样品：在脱氧核酶底物链与酶链的体系中均添加10nM的氯化铅。
图2为铅离子脱氧核酶切割产物进行等温扩大反应扩增的结果；注：其中数字表示的列为：1-Marker；2-扩增模板；3-阳性样品：铅离子脱氧核酶切割产物进行等温扩大反应的产物；4-阳性对照：扩增产物。
图3为OD450值随铅离子浓度变化的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于此。除特殊说明的之外，各实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。
实施例1铅离子脱氧核酶的制备以及切割产物的产生
针对铅离子设计的脱氧核酶的底物链、酶链以及脱氧核酶切割的产物如下所示：
注：扩增模板D中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列，序列前四个碱基对处(C和A之间)即是合成链切割位点；脱氧核酶切割产物C和扩增产物F都与扩增模板D完全互补；脱氧核酶底物链A末端TTGGGGGGT序列是为了增加与模版结合Tm值而增加的；铅离子切割位点在脱氧核酶底物链A的rA之后。
铅离子脱氧核酶的制备方法：
将4μL的10μM脱氧核酶底物链母液与4μL的10μM脱氧核酶酶链母液用缓冲液(终浓度为50mM HEPES，50mM NaCl，5mM MgCl2，pH7.26)稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢将至25℃，大约耗时45min，得到铅离子脱氧核酶溶液。
在上述铅离子脱氧核酶溶液中加入5μL醋酸铅溶液(1μM母液，缓冲液为1M NaCl溶液，设置高盐环境)，形成40μL体系，于25℃下孵育6分钟，在40μL体系中加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA，2M NaCl,0.5M Tris)，混匀后4摄氏度保存。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，得到铅离子核酶切割后的小片段，证明铅离子核酶的制备与切割成功，如图1所示。
实施例2铅离子脱氧核酶切割产物的扩增
用于等温扩增反应的体系由两部分(A体系和B体系)组成。扩增反应体系组成：30μL体系。
A部分体系组成:24.2μL体系
扩增模板(1μM母液)：6μL(终浓度0.2μM)
dNTPs(2.5mM母液):3μL
铅离子脱氧核酶的切割产物(1μM)：6μL，终浓度0.2μM
超纯水：9.2μL
B部分体系组成：5.8μL
Bst DNA聚合酶(8U/μL母液)：0.1μL(终浓度0.02U/μL)
聚合酶反应缓冲溶液(10x母液):3μL(终浓度1x)
Nt.BstNBI切刻内切酶(10U/μL母液)：1.2μL(终浓度0.37U/μL)
Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液(10x母液):1.5μL(终浓度0.5x)。
所述聚合酶反应缓冲溶液母液为20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液母液为100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
A部分体系在进行等温扩增反应前95℃孵育5min后，A部分体系和B部分体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应。然后放入-20℃备用。利用20％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证铅离子脱氧核酶切割产物进行等温扩大反应扩增的结果，如图2所示，有产物出现。
实施例3 G-四链体功能核酸显色传感器的制备
将80μL酶活缓冲液(100mM Tris、120mM NaCl、10mM MgCl2、100mM KCl，pH8.4)，10μL氯高铁血红素稀释溶液(2μL氯高铁血红素原液(10μM)与1mL酶活缓冲液混合)与10μL待显色物质(即扩增目标产物)混合，混匀后37℃反应30min，使扩增目标产物F结合氯高铁血红素形成G-四链体结构，加入50μL TMB显色液，混匀，37℃反应10min，加入50μL 2M H2SO4，混匀，得到显色的产物，得到G-四链体功能核酸显色传感器。
然后进行酶标仪测定OD450。
实施例4铅离子检测试剂盒的制备
试剂盒，包括：铅离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
所述铅离子核酶体系包括底物链、酶链、铅离子标准溶液；
具体包括：
4μL的10μM脱氧核酶底物链母液；
4μL的10μM脱氧核酶酶链母液；
缓冲液(终浓度为50mM HEPES，50mM NaCl，5mM MgCl2，pH7.26)；
1μM醋酸铅母液(溶解液为1M NaCl溶液)：使用时配制成不同浓度的醋酸铅溶液5μL；
终止液(浓度为0.2M EDTA，2M NaCl,0.5M Tris)。
所述等温扩增体系包括A体系、B体系，
所述A体系组成:
1μM扩增模板母液：6μL，终浓度0.2μM
2.5mM dNTPs母液:3μL
所述B体系组成：
8U/μL Bst DNA聚合酶母液：0.1μL，终浓度0.02U/μL；
10x(代表10倍量，下同)聚合酶反应缓冲溶液母液：3μL，终浓度1x；
10U/μL Nt.BstNBI切刻内切酶母液：1.2μL，终浓度0.37U/μL；
10x Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液母液：1.5μL，终浓度0.5x。
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如实施例1中所示。
所述显色体系包括：10μM氯高铁血红素和TMB显色剂。
实施例5铅离子的检测
1、OD450值随铅离子浓度变化的标准曲线的制备
在根据实施1中的方法制备的铅离子脱氧核酶体系中，加入不同体积醋酸铅母液(溶解液为1M NaCl溶液)和水，形成40μL体系，其中铅离子的终浓度分别为0nM、0.5nM、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM，于25℃下孵育6分钟，在40μL体系中加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA，2M NaCl,0.5M Tris)，混匀后4摄氏度保存。之后根据实施例2中铅离子脱氧核酶切割产物的扩增方法与实施例3中的G-四链体功能核酸显色传感器的制备方法，得到不同铅离子浓度对应的OD450，制备OD450随铅离子浓度变化的标准曲线。结果如图3所示，得到的标准曲线为：y＝0.0568x+0.2551，R2＝0.998。
2、待测样品的检测
根据实施例1中的方法制备铅离子脱氧核酶体系，加入待测样品，形成40μL体系，于25℃下孵育6分钟，在40μL体系中加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA，2M NaCl,0.5MTris)，混匀后4摄氏度保存。之后根据实施例2中铅离子脱氧核酶切割产物的扩增方法与实施例3中的G-四链体功能核酸显色传感器的制备方法，利用酶标仪测定其OD450。测定OD450值为0.6332，带入标准曲线y＝0.0568x+0.2551,得到铅离子浓度为X＝6.6567nM。

Claims (10)

1.一种铅的耐高盐核酸传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，
所述分子识别元件包括铅离子脱氧核酶；所述铅离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述信号转换元件包括氯高铁血红素和显色剂；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
2.根据权利要求1所述的传感器，其特征在于，所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物；
B体系包括：Bst DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶缓冲溶液。
3.根据权利要求1或2所述的传感器，其特征在于，所述信号转换元件还包括终止剂，优选的，所述终止剂为硫酸；所述显色剂为TMB显色剂。
4.权利要求1-3任一项所述传感器在检测铅离子中的应用。
5.一种检测铅离子的方法，其特征在于，包括步骤如下：
制备铅离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸显色光密度值，通过上述标准曲线计算铅离子的浓度；
其中铅离子浓度和G-四链体功能核酸显色光密度关系的标准曲线的步骤包括：
(1)制备铅离子脱氧核酶切割产物：将铅离子脱氧核酶底物链与酶链混合、加热、降温得到铅离子脱氧核酶，然后加入不同浓度的铅离子溶液反应，终止反应后，得到不同浓度的铅离子脱氧核酶切割产物溶液；
(2)目标产物的等温扩增：
等温扩增体系由A体系、B体系组成；
所述A体系包括扩增模板、dNTPs、铅离子脱氧核酶切割产物；
所述B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；
将所述不同浓度的铅离子脱氧核酶切割产物溶液与其他A体系的组成物质混合，然后分别与B体系混合，制备不同的浓度的铅离子脱氧核酶切割产物扩增体系，进行等温扩增反应，得到一系列浓度的扩增产物；
(2)G-四链体结构显色物制备
将氯高铁血红素与上述一系列扩增产物分别进行反应，然后加入显色剂后进行OD值检测，得到OD值随铅离子浓度变化的标准曲线。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述铅离子脱氧核酶的制备方法包括：将铅离子脱氧核酶底物链与铅离子脱氧核酶酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降温至25℃。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述等温扩增反应的步骤为：加入铅离子溶液的A体系在进行等温扩增反应前95℃孵育5min后，A体系和B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，氯高铁血红素与扩增产物反应的方法为：将氯高铁血红素与扩增产物混匀后37℃反应30min，加入TMB显色剂，混匀，37℃反应10min，H2SO4终止反应。
9.一种检测铅离子的试剂盒，其特征在于，包括：铅离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显色体系；
所述铅离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、铅离子标准溶液；
所述等温扩增体系包括A体系、B体系，所述A体系包括扩增模板和dNTPs；
所述B体系包括Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述脱氧核酶底物链、酶链和扩增模板序列如下表：
其中扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列；
所述显色体系包括：氯高铁血红素和显色剂，所述显色剂为TMB显色剂。
10.一种铅离子脱氧核酶，其特征在于，所述铅离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链、酶链如下表：
CN201711022174.8A 2017-10-27 2017-10-27 一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用 Active CN107988322B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711022174.8A CN107988322B (zh) 2017-10-27 2017-10-27 一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711022174.8A CN107988322B (zh) 2017-10-27 2017-10-27 一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107988322A true CN107988322A (zh) 2018-05-04
CN107988322B CN107988322B (zh) 2020-05-22

Family

ID=62030077

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711022174.8A Active CN107988322B (zh) 2017-10-27 2017-10-27 一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107988322B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103695540A (zh) * 2013-12-13 2014-04-02 常熟理工学院 一种基于荧光定量pcr与核酸酶gr-5相结合的铅离子检测方法
CN107012208A (zh) * 2017-03-08 2017-08-04 广东省生态环境技术研究所 一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103695540A (zh) * 2013-12-13 2014-04-02 常熟理工学院 一种基于荧光定量pcr与核酸酶gr-5相结合的铅离子检测方法
CN107012208A (zh) * 2017-03-08 2017-08-04 广东省生态环境技术研究所 一种免标记铅离子可视化检测方法及检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEN ET AL.: "A Sensitive and Label-Free Pb(II) Fluorescence Sensor Based on a DNAzyme Controlled G-Quadruplex/Thioflavin T Conformation", 《SENSORS》 *
赵永席等: "基于核酸切割酶与脱氧核酶的荧光循环放大系统检测铅（II）", 《分析化学》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107988322B (zh) 2020-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Double strand DNA-templated copper nanoparticle as a novel fluorescence indicator for label-free detection of polynucleotide kinase activity
CN109161579B (zh) 基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用
CN105899947A (zh) 分析测试装置、试剂盒和使用方法
CN108192948B (zh) 一种利用α-溶血素纳米孔检测DNA糖基化酶活性的方法
WO2022077687A1 (zh) 一种新型crispr核酸检测方法及应用
CN107966436A (zh) 一种基于镉的功能核酸的可视化传感器及其应用
Wang et al. Target-induced transcription amplification to trigger the trans-cleavage activity of CRISPR/Cas13a (TITAC-Cas) for detection of alkaline phosphatase
CN107976436A (zh) 一种铜的耐高盐核酸传感器及其应用
CN107976435A (zh) 一种基于功能核酸的传感器及其在钠离子检测中的应用
Chen et al. Terminal protection of a small molecule-linked loop DNA probe for turn-on label-free fluorescence detection of proteins
CN111705113A (zh) 一种功能核酸荧光传感器及其在铅离子检测中的应用
Chi et al. CRISPR-Cas14a-integrated strand displacement amplification for rapid and isothermal detection of cholangiocarcinoma associated circulating microRNAs
Zhang et al. Determination of the activity of T4 polynucleotide kinase phosphatase by exploiting the sequence-dependent fluorescence of DNA-templated copper nanoclusters
Zhang et al. DNA/RNA chimera-templated copper nanoclusters for label-free detection of reverse transcription-associated ribonuclease H
CN107064515A (zh) 一种基于点击化学的铜离子检测方法及检测试剂盒
Huang et al. Enzyme-free dual-amplification strategy for the rapid, single-step detection of nucleic acids based on hybridization chain reaction initiated entropy-driven circuit reaction
Schönberger et al. RNA interactomics: recent advances and remaining challenges
CN107988323A (zh) 一种基于铬的功能核酸的传感器及其应用
Li et al. Multi-channel collection of G-quadruplex transducers for amplified signaling of Pax-5 based on target-triggered split-to-intact remodeling of dual-G-rich duplex probe
CN107988318B (zh) 基于电化学电势预处理技术快速检测核酸的方法及应用
CN107988322A (zh) 一种铅的耐高盐核酸传感器及其应用
Zhou et al. Electrochemical detection of the p53 gene using exponential amplification reaction (EXPAR) and CRISPR/Cas12a reactions
CN105950755A (zh) 基于分裂式识别模式结合级联信号放大策略检测microRNA的方法
Huang et al. An intramolecular DNAzyme-based amplification for miRNA analysis with improving reaction kinetics and high sensitivity
CN108949934B (zh) 一种铬离子切割型通用隔断超快扩增可视化传感器

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant