CN111751346A - 一种ota适配体及其互补序列及ota荧光检测方法 - Google Patents

一种ota适配体及其互补序列及ota荧光检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析化学和食品安全技术领域，尤其涉及了一种OTA适配体及其互补序列及OTA荧光检测方法。其中，一种基于适配体的OTA荧光检测方法，包括：利用被其互补核苷酸序列结合的适配体与OTA特异性结合；通过染料对所述适配体与OTA的结合物进行荧光标记；通过光谱荧光强度检测及浓度测定，检测所述结合物的浓度以检测OTA的含量；其中，所述适配体如SEQ ID NO:1所示，所述互补核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明提出的OTA适配体，具有与OTA结合特异性好、结构稳定的特点；其中，互补的核苷酸序列用于提高对OTA的检测精度。基于本发明的OTA适配体及其互补序列的OTA荧光检测方法不但检测准确度较高，且操作过程简单，对操作人员的要求较低，更加利于实际应用。

Description

一种OTA适配体及其互补序列及OTA荧光检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学和食品安全技术领域，尤其涉及了一种OTA适配体及其互补序列及OTA荧光检测方法，用于检测物质中OTA的含量。
背景技术
赭曲霉素A(OTA)是一种由曲霉属和青霉属等不同真菌种类产生的毒素，有研究表明，其具有肾毒性，对人类具有强烈的致畸、神经毒性、免疫毒性和致癌作用。赭曲霉素A会对谷物、小麦、玉米、豆类和葡萄酒等多种农产品造成污染。赭曲霉素A在世界范围内都有检测到，鉴于食品供应的全球化以及赭曲霉素A对人类健康的潜在威胁，开发一种针对赭曲霉素A的检测技术具有积极且重要的意义。
现有技术中也有利用适配体对OTA进行检测的，然而其需要对适配体事先进行标记(在适配体的核苷酸上标记信号分子或纳米材料)，而后再用于与OTA的靶向结合，这就造成了其样品处理过程复杂，且对操作人员的要求较高，从而限制了其OTA检测方法的应用。
发明内容
为解决背景技术中提出的问题，本发明提出了基于一种OTA适配体及其互补核苷酸序列及OTA荧光检测方法。其中，本发明的OTA荧光检测的方法不但检测准确度较高，且操作简单，更加利于实际应用。
首先，本发明提出了一种OTA适配体，适配体的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
其次，本发明还提出了一种OTA适配体的互补核苷酸序列，互补核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
此外，本发明还提出了一种基于适配体的OTA荧光检测方法，包括：利用被其互补核苷酸序列结合的适配体与OTA特异性结合；通过染料对适配体与OTA的结合物进行荧光标记；通过光谱荧光强度检测及浓度测定，检测结合物的浓度以检测OTA的含量；其中，适配体如SEQ ID NO:1所示，互补核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一个或多个实施例中，OTA荧光检测方法还包括：配置TE缓冲液，用于溶解适配体及其互补核苷酸序列；其中，TE缓冲液的成分包括：10mM/LKCl、10mM/L Tris-HCl缓冲溶液、1mM/L乙二胺四乙酸钠，且TE缓冲液的PH为7.4。
在一个或多个实施例中，OTA荧光检测方法还包括：利用TE缓冲液分别溶解适配体及其互补核苷酸序列，获得适配体溶液以及互补核苷酸序列溶液，4℃保存。
在一个或多个实施例中，利用被其互补核苷酸序列结合的适配体与OTA特异性结合，包括：将适配体溶液与互补序列核苷酸溶液按1:2的体积混合，82℃下孵育10分钟，自然冷却至室温，4℃保存，作为存储液；将10μL存储液与10μL与含有OTA的样本溶液均匀混合，孵育10分钟后，形成第一混合物。
在一个或多个实施例中，通过染料对适配体与OTA的结合物进行荧光标记，包括：将第一混合物依次加入170μL 50mM/L的HEPES缓冲溶液以及10μL 2μM/L的硫黄素T溶液，95℃下加热5分钟后在冰水中冷却10分钟退火，形成第二混合物。
在一个或多个实施例中，通过光谱荧光强度检测及浓度测定，检测结合物的浓度以检测OTA的含量，包括：取三份第二混合物的样本，利用波长为425nm的激发光源以100nm/min的扫描速度响应2s，并在25℃的温度下，以及200～600nm波长范围内测量光谱的荧光强度，取三次测量光谱的荧光强度的平均值。
在一个或多个实施例中，通过光谱荧光强度检测及浓度测定，检测结合物的浓度以检测OTA的含量，还包括：预先通过OTA荧光检测方法获得OTA标准溶液的OTA荧光强度曲线，利用OTA荧光强度曲线以及三次测量光谱的荧光强度的平均值进行浓度测定，以获得第二混合物中OTA的物质的量浓度。
本发明的有益效果包括：本发明提出了一种OTA适配体，其具有与OTA结合特异性好、结构稳定的特点；此外，本发明还给出了与该OTA适配体互补的核苷酸序列，用以提高对OTA的检测精度。基于本发明的OTA适配体及其互补序列的OTA荧光检测方法不但检测准确度较高，且操作过程简单，对操作人员的要求较低，更加利于实际应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1所为本发明的OTA荧光检测方法示意图；
图2为本发明的OTA荧光检测操作流程图；
图3为本发明的光谱荧光强度分布曲线图；
图4为本发明的OTA荧光强度曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明实施例进一步详细说明。
需要说明的是，本发明实施例中所有使用“第一”和“第二”的表述均是为了区分两个相同名称非相同的实体或者非相同的参量，可见“第一”“第二”仅为了表述的方便，不应理解为对本发明实施例的限定，后续实施例对此不再一一说明。
以下结合具体实施例对发明的技术方案做进一步说明，但其不应理解为对本发明的限制：
首先，本发明提出了一种OTA适配体，该适配体具有与OTA特异性结合稳定的特点，其序列号如SEQ ID NO:1所示：
SEQ ID NO：1为：
5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGA-3’。
其次，本发明提出了一种OTA适配体的互补核苷酸序列，更具体的为部分互补核苷酸序列，其特点是与OTA适配体特异性结合的稳定性弱于OTA适配体与OTA特异性结合的稳定性，其序列号如SEQ ID NO:2所示：
SEQ ID NO:2为：
5’-GCCCACACCCACCGC-3’。
基于上述OTA适配体(以下简称为适配体)及其互补核苷酸序列，本发明提出了一种OTA荧光检测方法，该方法无需事先对适配体进行标记，再利用该适配体与OTA特异性结合，而仅需要在适配体与OTA特异性结合后，对结合物进行荧光标记即可，相比于对适配体进行标记，荧光标记过程更简单且更易操作。此外，本发明的OTA荧光检测方法不但对OTA的检测精度较高，还降低了对操作人员的要求，从而更加利于实际应用。以下将通过具体的附图进行更加详细的说明。
如图1所示，为本发明的OTA荧光检测方法示意图。其中，OTA荧光检测方法，包括：利用被其互补核苷酸序列结合的适配体与OTA特异性结合；通过染料对适配体与OTA的结合物进行荧光标记；通过光谱荧光强度检测及浓度测定，检测结合物的浓度以检测OTA的含量；其中，适配体如SEQ ID NO:1所示，互补核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明通过设计了一种OTA适配体及其互补核苷酸序列实现对OTA的荧光检测。其中，OTA适配体与OTA特异性结合稳定，互补核苷酸序列的加入又减少了对荧光检强度检测的干扰，从而使得本发明的OTA检测方法的准确度较高。然而，本申请OTA荧光检测方法的准确性还体现在更具体的操作步骤中，以下通过更具体的操作步骤进行详细说明。
如图2所示，为本发明的OTA荧光检测操作流程图。在本实施例中，操作流程包括：步骤1、配置TE缓冲液。可选的，TE缓冲液的成分包括：10mM/L NaCl、10mM/L Tris-HCl缓冲溶液、1mM/L乙二胺四乙酸钠，且TE缓冲液的PH为7.4；优选的，TE缓冲液的成分包括：10mM/LKCl、10mM/L Tris-HCl缓冲溶液、1mM/L乙二胺四乙酸钠，且TE缓冲液的PH为7.4。其中，KCl相比于NaCl更加有益于后续步骤中适配体与OTA结合的稳定性。
步骤2、制作适配体溶液以及互补核苷酸序列溶液。具体的，利用步骤1中的TE缓冲液分别溶解适配体及其互补核苷酸序列，获得适配体溶液以及互补核苷酸序列溶液，4℃保存。其中，适配体在溶解过程中会发生构型变化，并且，其构型能够与某些染料结合从而被荧光标记，若在加入相应染料后进行荧光检测会有一定强度的荧光信号产生。因此，这种构型变化若不抑制将对后续步骤中的荧光检测精度造成影响。
步骤3、利用适配体溶液以及互补核苷酸序列溶液配置存储液。为了抑制步骤2中适配体的构型变化，并得到可以长时间保存的存储液，具体的，将适配体溶液与互补核苷酸序列溶液按1:2的体积混合，82℃下孵育10分钟，自然冷却至室温，4℃保存。在此步骤中，适配体将与其互补核苷酸序列特异性结合，从而形成更稳定的双链结构，进而抑制适配体构型变化的发生；其中，已经发生构型变化的适配体也将会因与其互补核苷酸序列特异性结合而失去与相应染料的结合能力(即无法被荧光标记)，从而降低了对后续步骤中荧光检测的干扰，用以提升对OTA的检测精度。其中，可选的，存储液中适配体的浓度为1μM/L；优选的，存储液中适配体的浓度为2μM/L。
步骤4，提取OTA样本并制作样本溶液。具体的，由于OTA在自然界中广泛分布，针对不同的样本，对OTA的提取方式也将有所不同，本步骤中，将通过溶解有OTA的乙醇溶液作为OTA的样本溶液。
步骤5、按比例均匀混合存储液与OTA样本溶液。本实施例中将按等体积混合存储液与OTA样本溶液。具体的，将10μL存储液与10μL与含有OTA的样本溶液均匀混合，孵育10分钟后，形成第一混合物。在该步骤中，由于适配体与OTA的特异性结合的稳定性要强于适配体与其互补核苷酸序列的稳定性，前步中已经与其互补核苷酸序列结合的、具有双链结构的适配体将与其互补核苷酸序列解链，并与OTA结合，从而产生G-四联体结构。
步骤6、对OTA与适配体的结合物进行荧光标记。即对OTA与适配体结合后产生的G-四联体结构进行荧光标记，其具体利用了DNA与染料之间的荧光能量转移现象。具体的，将第一混合物依次加入170μL 50mM/L的HEPES缓冲溶液以及10μL 2μM/L的硫黄素T溶液，95℃下加热5分钟后在冰水中冷却10分钟退火，形成第二混合物。其中，G-四联体结构与硫黄素T的结合可以产生较为明显的荧光信号。
步骤7、对荧光标记后的结合物进行光谱荧光强度测量。具体的，为了进一步保证测试精度，降低误差，取三份第二混合物的样本，利用波长为425nm的激发光源以100 nm/min的扫描速度响应2s，并在25℃的温度下，以及200～600 nm波长范围内测量光谱的荧光强度，取三次测量光谱的荧光强度的平均值。
步骤8、通过光谱荧光强度检测及浓度测定，检测OTA的含量。具体的，预先通过前述OTA荧光检测方法获得OTA标准溶液的OTA荧光强度曲线，利用OTA荧光强度曲线以及三次测量光谱的荧光强度的平均值进行浓度测定，以获得第二混合物中OTA的物质的量浓度。其中，可选的，所述OTA标准溶液的浓度分别为：配制0M/L、1.0×10-8M/L、2.0×10-8M/L、4.0×10-8M/L、6.0×10-8M/L、8.0×10-8M/L以及1.0×10-7M/L。
需说明的是，步骤1到步骤4为准备工作，其操作顺序并不对本发明的方法起到限定作用，如可以按照步骤1、步骤2和步骤3的方法提前配置好存储液，且配置存储液的过程与步骤4提取OTA样本并制作样本溶液的操作也无先后顺序之分。
在本发明的另一个实施例中给出了步骤7中光谱的荧光强度分布曲线，具体如下所示：
如图3所示，为本发明的光谱荧光强度分布曲线图。其中，横轴显示为波长、纵轴显示为荧光强度。由图2可以看出，利用本发明的OTA荧光检测方法产生荧光信号的波长集中在450nm到600nm之间，并以波长为500nm附近的荧光强度最为突出。因此，本发明在200～600nm波长范围内测量光谱的荧光强度，足以保证对荧光强度检测的准确性，进而保证后续步骤中对OTA含量检测的精确度。
在本发明的另一个实施例中，还给出了基于标准OTA样品溶液测量出的OTA荧光强度曲线，如下所示：
如图4所示，为本发明的OTA荧光强度曲线图。其中，横轴显示为OTA样品的浓度，纵轴显示为在200～600nm波长范围内光谱的荧光强度。由图2可以看出，利用本发明的OTA荧光检测方法检测出的荧光强度与OTA的浓度的具有近似线性的关系，由于OTA被检测到的前提是与本发明的适配体特异性结合从而产生G-四联体结构，进而与染料结合，因此，该荧光强度曲线图也从侧面反映出了本发明的OTA适配体与OTA特异性结合的优异表现。
在该实施例中，本发明测量出的OTA浓度与荧光强度的回归线性方程为：
Y＝133.56+47.157X，R2＝0.9915，其中R2为回归系数。
在本发明的另一个施例中，还进行了OTA回收率的测定，具体过程包括：
以玉米粉为原料，加入不同浓度的OTA样本溶液，用60％(v/v)甲醇提取。之后以10000转/分的速度离心10分钟，取10μL上清液并利用本发明的OTA荧光检测方法进行检测，并测定回收率。
回收率测定利用了标准加入法，其实质上是一种特殊的内标法，是在选择不到空白基质的前提下，以欲测组分的纯物质为内标物，加入到待测样品中，然后在相同的色谱条件下，测定加入欲测组分纯物质前后，欲测组分的峰面积或峰高，从而计算欲测组分在样品中的含量的方法。通过标准加入法测量出的OTA的回收率如表1所示。
表1标准加入法测定赭曲霉素A
Figure BDA0002574614800000081
由上述OTA回收率的测定实验可以看出，由于在本发明的荧光检测方法中采用了多步有利于检测精度的过程，从而使得本发明的OTA荧光检测方法的准确度较高。
以上是本发明公开的示例性实施例，但是应当注意，在不背离权利要求限定的本发明实施例公开的范围的前提下，可以进行多种改变和修改。根据这里描述的公开实施例的方法权利要求的功能、步骤和/或动作不需以任何特定顺序执行。此外，尽管本发明实施例公开的元素可以以个体形式描述或要求，但除非明确限制为单数，也可以理解为多个。
应当理解的是，在本文中使用的，除非上下文清楚地支持例外情况，单数形式“一个”旨在也包括复数形式。还应当理解的是，在本文中使用的“和/或”是指包括一个或者一个以上相关联地列出的项目的任意和所有可能组合。
上述本发明实施例公开实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明实施例公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明实施例的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上的本发明实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明实施例的保护范围之内。
<110> 苏州健雄职业技术学院
<120> 一种OTA适配体及其互补序列及OTA荧光检测方法
<130> 无
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> OTA（赭曲霉素A）适配体
<400> 1
gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cgga 34
<110> 苏州健雄职业技术学院
<120> 一种OTA适配体及其互补序列及OTA荧光检测方法
<130> 无
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<223> OTA（赭曲霉素A）适配体的互补核苷酸序列
<400> 1
gcccacaccc accgc

Claims (9)

1.一种OTA适配体，其特征在于，所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种OTA适配体的互补核苷酸序列，其特征在于，所述互补核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种基于适配体的OTA荧光检测方法，其特征在于，包括：
利用被其互补核苷酸序列结合的适配体与OTA特异性结合；
通过染料对所述适配体与OTA的结合物进行荧光标记；
通过光谱荧光强度检测及浓度测定，检测所述结合物的浓度以检测OTA的含量；
其中，所述适配体如SEQ ID NO:1所示，所述互补核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.如权利要求3所述的OTA荧光检测方法，其特征在于，所述OTA荧光检测方法还包括：
配置TE缓冲液，用于溶解所述适配体及其互补核苷酸序列；其中，所述TE缓冲液的成分包括：
10mM/L KCl、10mM/L Tris-HCl缓冲溶液、1mM/L乙二胺四乙酸钠，且所述TE缓冲液的PH为7.4。
5.如权利要求4所述的OTA荧光检测方法，其特征在于，所述OTA荧光检测方法还包括：
利用所述TE缓冲液分别溶解所述适配体及其互补核苷酸序列，获得适配体溶液以及互补核苷酸序列溶液，4℃保存。
6.如权利要求5所述的OTA荧光检测方法，其特征在于，所述利用被其互补核苷酸序列结合的适配体与OTA特异性结合，包括：
将所述适配体溶液与所述互补序列核苷酸溶液按1:2的体积混合，82℃下孵育10分钟，自然冷却至室温，4℃保存，作为存储液；
将10μL所述存储液与10μL与含有OTA的样本溶液均匀混合，孵育10分钟后，形成第一混合物。
7.如权利要求6所述的OTA荧光检测方法，其特征在于，所述通过染料对所述适配体与OTA的结合物进行荧光标记，包括：
将所述第一混合物依次加入170μL 50mM/L的HEPES缓冲溶液以及10μL 2μM/L的硫黄素T溶液，95℃下加热5分钟后在冰水中冷却10分钟退火，形成第二混合物。
8.如权利要求7所述的OTA荧光检测方法，其特征在于，所述通过光谱荧光强度检测及浓度测定，检测所述结合物的浓度以检测OTA的含量，包括：
取三份所述第二混合物的样本，利用波长为425nm的激发光源以100nm/min的扫描速度响应2s，并在25℃的温度下，以及200～600nm波长范围内测量光谱的荧光强度，取三次测量所述光谱的荧光强度的平均值。
9.如权利要求8所述的OTA荧光检测方法，其特征在于，所述通过光谱荧光强度检测及浓度测定，检测所述结合物的浓度以检测OTA的含量，还包括：
预先通过所述OTA荧光检测方法获得OTA标准溶液的OTA荧光强度曲线，利用所述OTA荧光强度曲线以及所述三次测量光谱的荧光强度的平均值进行浓度测定，以获得所述第二混合物中OTA的物质的量浓度。
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