CN116731709A - 一种基于DON控制的双色复合探针对DON和miR-34a同时细胞成像的方法 - Google Patents
一种基于DON控制的双色复合探针对DON和miR-34a同时细胞成像的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于DON控制的双色复合探针对DON和miR‑34a同时细胞成像的方法，可用于可视化评估DON毒性，属于荧光成像和生物传感技术领域。本发明利用EDC/NHS介导的酰胺反应将红色发光的R‑Au NCs和绿色发光的G‑Au NCs分别与氨基功能化的发卡结构H1和H2偶联，MoS2纳米片既作为荧光淬灭剂，也作为将核酸递送进入细胞的载体；在细胞内，DON与适配体的结合，DON刺激产生的miR‑34a会与H1 *的足点序列结合，最终导致荧光恢复，从而实现对DON和miR‑34a同时细胞成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于DON控制的双色复合探针对DON和miR-34a同时细胞成像的方法，可用于可视化评估DON毒性，属于荧光成像和生物传感技术领域。
背景技术
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名呕吐毒素，属于B型单端孢霉烯族真菌毒素，经食物链富集暴露于人和动物会产生急性毒性、肠道毒性、细胞毒性等危害作用。因此，深入研究DON的毒性作用和毒理机制，有助于采取有效措施以减少自身暴露风险以及提供真菌毒素靶标性干预防治策略。近年来，有研究表明DON的作用可引起生物体小RNA(microRNA，miRNA)表达量发生变化。例如，对暴露于DON的母猪肝脏、升结肠和降结肠中miRNA表达谱进行分析，结果发现暴露于DON可使得升结肠和降结肠中miR-34a的表达量上调，而miR-34a的过表达可以降低Bcl-2的表达，导致细胞生长阻滞和细胞凋亡。因此，对miRNA表达量进行监测，有助于我们了解它在细胞凋亡过程中的调控作用。
目前，miRNA的检测方法主要包括Northern印记法、微阵列法、qRT-PCR等。但是，这些方法存在着操作繁琐、耗时长、效率低等不足，并且都需要裂解细胞以提取miRNA，而在一系列操作过程中容易造成miRNA的损失。因此，基于miRNA作为DON毒性通路中的关键生物标志物，开发一种有效检测miRNA的方法以评估DON毒理作用具有重要的意义。
荧光成像技术可以利用荧光探针与靶标特异性结合引起的荧光变化，实现对活细胞或组织内不同生物分子进行检测和成像，具有灵敏度高、成本低、无损、原位可视化等优势，为实现细胞内生物标志物的无损原位可视化检测提供了一个机会。但是，在荧光成像技术的应用研究中，大多数只采集单一、静态指标来衡量细胞内生物分子的信息和状态，对于多重靶点的同时识别示踪和随时间-空间的连续动态变化缺乏深入了解，故难以全面的反映多靶标分子在细胞内转化过程和相互作用关系。真菌毒素在细胞内的代谢和毒性作用是多分子参与的负载动态过程，单一静态指标的采集无法全面系统的进行毒性评估和毒理机制分析。因此在细胞内同时精准识别多个靶标分子，并且进行多个荧光通道的实时动态成像监测，进而更好地解析多靶标之间的时空特征和应答关系，对全面系统开展真菌毒素的细胞毒理学具有重要意义。
此外，细胞内miRNA的检测仍然面临着挑战，例如，细胞内miRNA的表达水平较低且具有高度的序列同源性。因此，常常需要将一些信号放大策略与细胞成像技术相结合，以提高检测的灵敏度，例如，滚环扩增(RCA)、杂交链式反应(HCR)、催化发卡自组装(CHA)等。其中，HCR是一种简单的无酶等温扩增过程，具有反应原理简单、反应条件温和、不需要昂贵的设备等优势。通常情况下，HCR由两个或多个发卡DNA参与，在起始目标链的作用下，通过与toehold结合，引发替代反应，形成长的双链DNA，发挥信号放大作用。近年来，HCR主要面临着一个挑战，即在无起始链的情况下，发夹DNA也能够自发诱导渗漏杂交，从而导致假阳性结果，严重降低生物传感器应用性能。因此，对发卡链的序列进行合理设计以避免系统背景渗漏具有重要意义。
发明内容
[技术问题]
真菌毒素在细胞内的代谢和毒性作用是多分子参与的负载动态过程，而现有荧光成像技术的应用，大多数只采集单一、静态指标来衡量细胞内生物分子的信息和状态，对于多重靶点的同时识别示踪和随时间-空间的连续动态变化缺乏深入了解，故单一静态指标的采集难以全面地反映真菌毒素与对应生物标志物在细胞内的转化过程和相互作用关系，无法全面系统地进行毒性评估和毒理机制分析。
[技术方案]
本发明开发了一种双色金纳米簇复合探针应用于在细胞中监测DON和DON诱导产生的miR-34a以评估DON的毒性作用的方法，该方法具有探针制备简单、选择性好、灵敏度高等优势。在本发明方法中，荧光成像技术可以利用荧光探针与靶标特异性结合引起的荧光变化，实现对活细胞或组织内不同生物分子进行检测和成像，具有灵敏度高、成本低、无损、原位可视化等优势，该技术可用于实时追踪活细胞中DON和DON诱导产生的miR-34a，探究DON与miR-34a之间的内在应答关系，评估DON的细胞毒性。
本发明披露一种制备双色金纳米簇复合探针的方法，所述双色金纳米簇复合探针用于对DON和miR-34a进行同时细胞成像，所述方法包括以下步骤：
(1)双色金纳米簇的制备
①红色荧光金纳米簇(R-Au NCs)的制备：将牛血清白蛋白(BSA)分散于超纯水，之后向上述溶液中加入HAuCl4溶液，搅拌，然后缓慢加入碱溶液，调节得到pH值为9-12的混合溶液，孵育；之后，利用透析袋对金纳米簇进行纯化，以去除未反应的杂质，得到红色荧光金纳米簇溶液，低温避光保存；
②绿色荧光金纳米簇(G-Au NCs)的制备：将6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶(ATT)分散于碱溶液中，待6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶彻底溶解后，加入到HAuCl4溶液中，混合均匀，得到混合溶液，于室温避光搅拌得到金纳米簇；利用超滤管对金纳米簇进行纯化，以去除未反应的杂质，得到绿色荧光金纳米簇溶液，低温避光保存；
(2)双色金纳米簇与DNA的偶联
首先，吸取H1 *和DON适配体，加入缓冲液，混合均匀后加热并冷却至室温以形成发卡结构H1；同时，吸取H2，加入缓冲液，混合均匀后加热并冷却至室温以形成发卡结构H2；
之后，将缓冲液分别与红色荧光金纳米簇溶液和绿色荧光金纳米簇溶液混合均匀后，分别加入EDC/NHS，第一次孵育以活化金纳米簇表面的羧基；之后，分别加入发卡结构H1和发卡结构H2，混合均匀后第二次孵育；第二次孵育完成后，用超滤管纯化以去除未反应的H1和H2，分别得到R-Au NCs-H1溶液和G-Au NCs-H2溶液，低温避光保存；
(3)双色金纳米簇复合探针的制备
分别吸取R-Au NCs-H1溶液和G-Au NCs-H2溶液加入离心管内，得到混合溶液，加入RNase抑制剂，然后加入MoS2溶液，室温振荡孵育，得到双色金纳米簇复合探针溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)使用的双色金纳米簇除了绿色、红色，也可以是其它颜色。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)①中BSA与HAuCl4的质量比例为(1-1.5)：1，具体可选1.27：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)①中所述碱溶液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化镁溶液。具体可选氢氧化钠，氢氧化钠在混合溶液中浓度为0.01-0.1M，具体可选0.05M。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)①中所述搅拌的时间为1-5min，具体可选2min；孵育时间为10-15h，具体可选12h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)①中调节得到pH值为11的混合溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)②中ATT与HAuCl4的质量比例为(1-1.5)：1，具体可选1.15：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)②中所述碱溶液包括氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化镁溶液。具体可选氢氧化钠，氢氧化钠在混合溶液中浓度为0.05-0.2M，具体可选0.1M。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)②中所述于室温避光搅拌是于室温搅拌时间为1-3h，具体可选1h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中H1 *的序列为TGTCTTAGCTGGTTGTCAAAGTACAACCAGCTAAGACACTGCCACTTCACACGATA C；H2的序列为NH2-ACTTTGACAACCAGCTAAGACATGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT；DON适配体的序列为NH2-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGG AGGCGGTATCGTGTGAAGTGCT，其中H1 *和DON适配体中的下划线部分为互补结合位点，H1 *中加粗斜体部分为miR-34a的toehold序列。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述EDC/NHS的物质的量的比例为(1-3)：1，具体可选2：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中H1 *和DON适配体的物质的量比例为1：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述缓冲液是PBS缓冲溶液(10mM，pH7.4，137mM NaCl)、SPSC缓冲液(0.75M NaCl,50mM Na2HPO4,pH 7.4)中的一种。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述第一次孵育、第二次孵育的温度为25-37℃，具体可选37℃；第一次孵育时间为0.5-2h，具体可选1h；第二次孵育时间为10-15h，具体可选12h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述R-Au NCs-H1溶液和G-Au NCs-H2溶液的体积比例为1:1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述RNase抑制剂在混合溶液中的终浓度为2-8U，具体可选4U。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中加入MoS2溶液后，MoS2的终浓度为0.1-0.4mg/mL，具体可选0.2mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述孵育的时间为30-90min，具体可选60min。
本发明披露了应用所述双色金纳米簇复合探针同时监测活细胞内DON和DON诱导产生的miR-34a以进行可视化评估DON细胞毒性的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测细胞接种于激光共聚焦培养皿中，孵育使细胞贴壁生长；
(2)向步骤(1)得到的贴壁生长的细胞添加含有双色金纳米簇复合探针溶液的基本培养基进行孵育；
(3)步骤(2)孵育完成后，
一组，吸去含有双色金纳米簇复合探针溶液的基本培养基，PBS清洗，接着分别加入一系列含有已知不同浓度(例如1-20μM，具体可选1、5、10、20μM)的DON的基本培养基，继续孵育，孵育结束后，吸去培养基，PBS清洗，用固定液固定后置于高分辨激光共聚焦显微镜下进行荧光成像；空白对照组不加入DON，以空白对照组的激光共聚焦成像图的像素强度为A0，以不同浓度的DON刺激时所得激光共聚焦成像图的像素强度为A，以A/A0表示共聚焦成像图相应的相对像素强度；
另外一组中，吸去含有双色金纳米簇复合探针溶液的基本培养基，PBS清洗，接种加入含有DON浓度为20μM的基本培养基，继续孵育不同时间(例如1-12h，具体可选0、1、2、4、8、12h)，孵育结束后，吸去培养基，PBS清洗，用固定液固定后置于高分辨激光共聚焦显微镜下进行荧光成像；空白对照组DON刺激时间为0h，以空白对照组所得激光共聚焦成像图的像素强度为A0，以不同时长的DON刺激时所得激光共聚焦成像图的像素强度为A，以A/A0表示共聚焦成像图相应的相对像素强度。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞包括人宫颈癌细胞Hela、人结直肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞QSG-7701中的一种。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)的孵育时间为2-8h，具体可选4h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中双色金纳米簇复合探针的终浓度为62μM(以MoS2计)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述固定液是4％多聚甲醛、丙酮、95％乙醇、甲醛中的一种，具体可选4％多聚甲醛。
本发明应用所述双色金纳米簇复合探针同时监测活细胞内DON和DON诱导产生的miR-34a以进行可视化评估DON细胞毒性的的原理为：
利用EDC/NHS介导的酰胺反应将红色发光的R-Au NCs和绿色发光的G-Au NCs分别与氨基功能化的发卡结构H1和H2偶联，其中，发卡H1是由H1 *和DON适配体杂交组成，H1 *中miR-34a的识别足点(toehold)序列被DON适配体所封闭，这可以阻止在没有DON的情况下足点介导的HCR反应的发生；MoS2纳米片既作为荧光淬灭剂，也作为将核酸递送进入细胞的载体；(2)R-Au NCs-H1和G-Au NCs-H2与MoS2共孵育制得双色Au NCs复合探针，其中，R-AuNCs-H1和G-Au NCs-H2通过范德华力吸附在MoS2纳米片表面，双色Au NCs与MoS2纳米片之间的FRET效应使得双色Au NCs的荧光被淬灭，然后，MoS2纳米片作为载体，通过胞吞作用将复合探针送入细胞；(3)DON与适配体的结合使适配体发生构象变化，削弱适配体与MoS2纳米片之间的范德华力，引起R-Au NCs荧光恢复，同时释放H1 *；同时，DON刺激产生的miR-34a会与H1 *的足点序列结合，通过链置换反应打开发夹结构H1 *，而新暴露的H1 *中的单链DNA序列与H2的足点序列结合，触发HCR反应；最后，H1 *和H2继续交替互补杂交，直到耗尽，形成一个长而开口的dsDNA，其中包含许多G-Au NCs，而杂化链产物与MoS2纳米片之间的范德华力显著减弱，导致G-Au NCs荧光恢复。通过检测细胞内R-Au NCs和G-Au NCs的荧光变化，可以实现活细胞内DON和miR-34a的同时细胞成像，为DON的细胞毒性评估提供一种新的策略。
[有益效果]
(1)本发明方法制备了一种双色金纳米簇复合探针，可同步可视化监测细胞内DON和DON诱导产生的miR-34a的变化，揭示DON与细胞凋亡标志物miR-34a之间的应答响应关系，进一步验证了DON诱导细胞凋亡的毒理机制。
(2)针对miRNA在细胞内表达量低的问题，本发明方法将HCR反应与细胞成像技术相结合，实现miR-34a的信号放大，提高灵敏度，具有反应原理简单、反应条件温和等优势。
(3)本发明方法涉及了一种DON控制的HCR级联反应过程，以实现在活细胞内只对DON诱导的miR-34a的成像，避免了细胞内内源性miR-34a的干扰。
实现DON控制的HCR级联反应这一过程的难点在于：设计合适的H1 *和H2的序列，一方面使DON适配体序列能够封闭H1 *中miR-34a的toehold位点，实现HCR反应的DON控制启动，另一方面避免在无起始链时发夹DNA的自发杂交组装而产生的背景渗漏。首先，依据miR-34a的序列和HCR的反应原理，初步设计了两种发卡DNA。之后，利用分子对接分析DON和其适配体的结合位点，并依据分子对接结果(图1)和适配体序列对包含miR-34a的toehold位点的发卡DNA进一步设计实现toehold序列的封闭。最后，利用软件分析了两个发卡结构的二级结构和热力学参数，以确保DNA的发卡结构的形成及无引发链存在时不会发生背景泄露。
本发明通过合理序列设计，克服了上述难点。
(4)本发明基于双色复合探针的细胞成像方法灵敏度高，成本低，放射性低，能原位、便捷实时、可视化监测DON诱导的细胞凋亡，丰富了DON毒性的评估手段，为食品安全提供了早期预警手段。
附图说明
图1为DON与其适配体的分子对接结果
图2为基于双色复合探针对DON和miR-34a同步细胞成像原理图
图3为实施例1中双色金纳米簇成功偶联DNA的Zeta电位表征图，偶联DNA后Zeta电位值负值显著增加(左：红色；右：绿色)
图4为实施例1中HCR可行性验证图
图5为实施例1中制备的双色复合探针的可行性验证图
图6为实施例2中双色复合探针制备条件优化
图7为实施例3中双色复合探针对DON和miR-34a的时间响应优化图
图8为实施例3中DON和miR-34a的定量检测标准曲线图
图9为实施例4中不同浓度双色复合探针处理后HepG2细胞的细胞存活率
图10为实施例5中不同浓度DON刺激下双色复合探针标记的HepG2细胞共聚焦图
图11为实施例5中不同浓度DON刺激下HepG2细胞内的相对像素亮度图
图12为实施例5中双色复合探针标记的HepG2细胞随DON刺激时间的共聚焦图
图13为实施例5中DON刺激下HepG2细胞不同时间下胞内的相对像素亮度图
图14为实施例6中DON的细胞毒性验证
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。下述实施例中所用基本培养基是仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，购自赛默飞世尔科技公司，货号：11995073，所用完全培养基是基本培养基添加10％的胎牛血清、1％青链霉素双抗后的培养基。涉及的激光共聚焦成像仪器为德国Zeiss LSM880高分辨率激光共聚焦显微镜。
实施例1双色金纳米簇复合探针的制备
第一步、双色金纳米簇的制备
红色荧光金纳米簇(R-Au NCs)的制备：称取0.5g牛血清白蛋白分散于19.0mL超纯水，之后向上述溶液中加入1.0mL HAuCl4(100mM)，在37℃条件下剧烈搅拌2min。接着，缓慢加入1.0mL NaOH溶液(1.0M)，使溶液的pH值达到11。之后，将上述溶液置于37℃孵育12h。之后，利用30kDa的透析袋对合成的Au NCs进行纯化，以去除未反应的杂质。制备得到的红色荧光金纳米簇溶液置于4℃避光保存。
绿色荧光金纳米簇(G-Au NCs)的制备：称取34.36mg ATT分散于3mL 0.2M的NaOH溶液中，彻底溶解后，加入至3mL 10mg/mL的HAuCl4溶液中，混合均匀，置于室温避光搅拌1h。反应结束后，利用50kDa的超滤管对合成的金纳米簇进行纯化，以去除未反应的杂质。制备得到的绿色荧光金纳米簇溶液置于4℃避光保存。
第二步、双色金纳米簇与DNA偶联
首先，吸取10μL H1 *(100μM)和10μL DON适配体(100μM)，加入80μL PBS(pH 7.4，10mM，137mM NaCl)溶液，混合均匀后置于95℃加热5min，缓慢冷却至室温以形成发卡结构H1。同时，吸取10μL H2(100μM)加入90μL PBS溶液，按照上述操作方法制备发卡结构H2。之后，分别将200μL PBS缓冲液与20μL红色金纳米簇和20μL绿色金纳米簇混合均匀后，分别吸取20μL EDC(0.2M)/NHS(0.1M)加入上述混合溶液，37℃震荡孵育1h，以活化金纳米簇表面的羧基。之后，分别加入20μL H1和20μL H2溶液至上述混合溶液，混合均匀后在37℃孵育12h。孵育完成后，将上述反应液吸取至30kDa的超滤管，8000r/min离心5min，以去除未反应的H1和H2。制备得到的R-Au NCs-H1和G-Au NCs-H2置于4℃避光保存。通过Zeta电位来表征双色金纳米簇与DNA的偶联，结果如图3所示，R-Au NCs和G-Au NCs的电位值分别为-3.9mV和-5.2mV，而R-Au NCs-H1和G-Au NCs-H2的电位值分别转变为-11.85mV和-12.35mV，证实发卡DNA与双色Au NCs的成功偶联。
其中，H1 *的序列为TGTCTTAGCTGGTTGTCAAAGTACAACCAGCTAAGACACTGCCACTTCACACG ATA C；H2的序列为NH2-ACTTTGACAACCAGCTAAGACATGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT；DON适配体的序列为NH2-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGGAGGCGGTATCGTGTGAAGTGCT，其中H1 *和DON适配体中的下划线部分为互补结合位点，H1 *中加粗斜体部分为miR-34a的toehold序列。
第三步、双色金纳米簇复合探针的制备
分别吸取50μL R-Au NCs-H1和50μL G-Au NCs-H2溶液加入离心管内，加入4URNase抑制剂，然后加入MoS2溶液，使MoS2的终浓度为0.2mg/mL，室温振荡孵育60min。
双色金纳米簇复合探针的可行性验证：
首先，利用Mfold软件分析了两个发卡结构的二级结构和热力学参数，结果如图4A和图4B所示，二级结构显示两个DNA均呈现发卡结构，焓变、吉布斯自由能、和熵变等相关参数表明，所设计的发卡结构在没有靶标miR-34a的情况下可以共存，且很少出现其他二级结构。之后，利用非变性聚丙烯酰胺电泳对DON启动的HCR反应的可行性进行验证。如图4C所示，当DON适配体和H1 *等比例混合时，可以成功组装成发卡结构H1(图4C，lane 4)。当H1和H2单独存在时，两者能够共存而不发生自组装(图4C，lane 6)。当DON不存在而miRNA存在时，H1和H2并不能与miRNA进行HCR反应(图4C，lane 7)，只有当DON和miRNA同时存在时，才能诱导HCR反应的发生，形成长链DNA结构(图4C，lane 8)。
此外，利用荧光分光光度计和紫外-可见分光光度计来评估同时检测DON和miR-34a的可行性(图5)。如图5A所示，R-Au NCs和G-Au NCs的发射光谱与MoS2的吸收光谱具有良好的重叠，表明双色金纳米簇与MoS2之间发生FRET效应的可行性。由图5B可见，单纯R-AuNCs-H1具有较高的荧光强度；当与MoS2共孵育后，FRET效应导致它们的荧光被淬灭，而未与H1偶联的单纯R-Au NCs与MoS2共孵育后，它们的荧光强度降低并不显著，排除了物理遮蔽作用促使荧光强度的降低这一原因；当加入DON后，混合体系在650nm处的荧光强度得到了恢复，而520nm处荧光强度并未明显变化(图9C)；当进一步加入miR-34a后，引发链(miR-34a)与H1*的toehold序列结合而引发HCR反应，促使复合体系在520nm处的荧光强度显著提高(图5C)。
实施例2双色金纳米簇复合探针制备条件优化
第一步、双色金纳米簇的制备
参照实施例1。
第二步、双色金纳米簇与DNA偶联
参照实施例1。
第三步、双色金纳米簇复合探针的制备
(1)MoS2纳米片浓度优化
分别吸取50μL R-Au NCs-H1和50μL G-Au NCs-H2溶液加入离心管内，加入4URNase抑制剂，然后加入不同体积的MoS2溶液，使MoS2的终浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL，室温振荡孵育，反应结束后，分别测量双色纳米簇的荧光光谱，考察不同浓度MoS2纳米片对双色纳米簇的荧光淬灭效果，以确定MoS2纳米片的最佳浓度。激发波长：R-Au NCs：375nm；G-Au NCs：420nm。图6A和图6B为MoS2纳米片的浓度优化结果。当MoS2纳米片的浓度0.2mg/mL和0.15mg/mL时，R-Au NCs-H1和G-Au NCs-H2的荧光强度达到最低，浓度进一步提高时，荧光强度变化不显著。为了确保R-Au NCs-H1和G-Au NCs-H2的荧光均被淬灭完全，选择0.2mg/mL作为MoS2纳米片的最优浓度。
(2)MoS2纳米片孵育时间优化
分别吸取50μL R-Au NCs-H1和50μL G-Au NCs-H2溶液加入离心管内，加入4URNase抑制剂，然后加入MoS2溶液，使MoS2的终浓度分别为0.2mg/mL，室温振荡孵育0、15、30、45、60、75min，反应结束后，分别测量双色纳米簇的荧光光谱，考察MoS2纳米片不同孵育时间对双色纳米簇的荧光淬灭效果，以确定MoS2纳米片的最佳孵育时间。激发波长：R-Au NCs：375nm；G-Au NCs：420nm。图6C和图6D为MoS2纳米片的孵育时间优化结果，在孵育时间为60min时，R-Au NCs-H1和G-Au NCs-H2的荧光强度达到了最低，孵育时间进一步延长时，荧光强度变化不显著。因此，选择60min作为MoS2纳米片的最佳孵育时间。
实施例3双色金纳米簇复合探针的性能表征
(1)双色金纳米簇复合探针对DON和miR-34a的时间响应优化实验
测试仪器：日立F-7000荧光分光光度计；
实验方法：参照实施例1制备双色金纳米簇复合探针，向制备好的双色金纳米簇复合探针溶液中加入200ng/mL的DON标准溶液和10nM的miR-34a标准溶液，混合均匀后在室温下分别孵育0、15、30、45、60、120、180、240、300、360min，反应结束后，分别测量双色纳米簇的荧光光谱。激发波长：R-Au NCs：375nm；G-Au NCs：420nm。
图7A和图7B为双色复合探针对DON和miR-34a的时间响应优化结果，在最开始的30min内，R-Au NCs-H1的荧光显著恢复，但是由于HCR反应是一个时间依赖的过程，因而这个阶段内G-Au NCs-H2的荧光恢复情况并不明显；R-Au NCs-H1的荧光强度在靶标孵育时间为45min时达到最高值，而G-Au NCs-H2的荧光正逐步恢复；当孵育时间进一步延长时，R-AuNCs-H1的荧光强度变化并不显著，而G-Au NCs-H2的荧光强度开始显著提高；G-Au NCs-H2的荧光强度在孵育时间为300min时达到最大值，进一步延长孵育时间荧光强度的变化并不显著。
(2)双色金纳米簇复合探针对DON和miR-34a的灵敏度实验
测试仪器：日立F-7000荧光分光光度计；
实验方法：参照实施例1制备G-Au NCs-H1和R-Au NCs-H2，分别吸取50μL R-AuNCs-H1和50μL G-Au NCs-H2溶液加入离心管内，加入4U RNase抑制剂，然后加入MoS2溶液，使MoS2的终浓度为0.2mg/mL，室温振荡孵育60min，加入终浓度分别为0、1、10、50、100、200ng/mL的DON溶液，混合均匀后在室温下孵育300min。孵育完成后，检测溶液体系中R-AuNCs的荧光强度值变化，激发波长：R-Au NCs：375nm；G-Au NCs：420nm。
miR-34a的定量检测与DON的操作基本相同。参照实施例1制备R-Au NCs-H1和G-AuNCs-H2，分别吸取50μL R-Au NCs-H1和50μL G-Au NCs-H2溶液加入离心管内，加入4URNase抑制剂，然后加入MoS2溶液，使MoS2的终浓度为0.2mg/mL，室温振荡孵育60min，加入200ng/mL的DON溶液，同时，往上述混合溶液中加入不同浓度的miR-34a溶液，使其最终浓度分别为0、0.01、0.1、1、5、10nM，混合均匀后在室温下孵育300min。孵育完成后，检测G-Au NCs的荧光强度值变化。激发波长：R-Au NCs：375nm；G-Au NCs：420nm。
图8结果显示双色金纳米簇复合探针对DON和miR-34a的定量曲线。随着DON浓度的提高，溶液体系中R-Au NCs的荧光不断恢复(图8A)，表明复合探针在溶液体系中对DON具有良好的应答响应，在1ng/mL～200ng/mL范围内，650nm处相对荧光强度与DON浓度的对数具有良好的线性关系(图8B)，拟合方程为y＝137.14lgCDON+129.11(R2＝0.9807)，LOD为0.42ng/mL(3σ/k)。随着miR-34a浓度的提高，溶液体系G-Au NCs的荧光也不断恢复(图8C)，在0.01nM～10nM的范围内，520nm处相对荧光强度与miR-34a浓度的对数值具有良好的线性关系(图8D)，拟合方程为y＝287.99lgCmiR-34a+934.29(R2＝0.9894)，LOD为6pM(3σ/k)。
实施例4双色金纳米簇复合探针的细胞毒性检测
本实施例所用双色金纳米簇复合探针(即双色金纳米簇复合探针)的制备方法参照实施例1：分别吸取50μL R-Au NCs-H1和50μL G-Au NCs-H2溶液加入离心管内，加入4URNase抑制剂，然后加入MoS2溶液，使MoS2的终浓度为0.2mg/mL，室温振荡孵育60min，得到双色金纳米簇复合探针。
利用CCK-8法来评价双色金纳米簇复合探针的细胞毒性。将消化好的HepG2细胞调整为8×104个/mL的细胞悬液，每孔接种100μL至96孔细胞培养板，于37℃，5％ CO2条件下培养24h。待细胞完全贴壁生长时，吸去完全培养基，用PBS清洗三次，之后加入分别含有0、6、12、31、62、125、250、375、500μM的双色复合探针(以MoS2浓度计算)的基本培养基，继续孵育12h。之后，分别往每孔中加入10μL CCK-8试剂，孵育2h，然后在酶标仪上测定各孔在450nm处吸光值。每组设置5个重复。细胞活性计算公式为：细胞活性(％)＝(实验孔吸光值-空白孔吸光值)/(对照孔吸光值-空白孔吸光值)×100％。
图9为不同浓度双色复合探针处理后HepG2细胞的细胞存活率结果，当双色复合探针的浓度较低(6μM～62μM)时，代偿性增值使得细胞活性比对照组细胞活性高；在双色复合探针浓度为375μM时细胞仍表现出约87％的细胞活力，证实该探针具有一定的生物相容性。
实施例5应用双色金纳米簇复合探针在细胞中实时监测DON和DON诱导产生的miR-34a，从而评估DON的毒性
本实施例所用双色复合探针(即双色金纳米簇复合探针)的制备方法参照实施例1：分别吸取50μL R-Au NCs-H1和50μL G-Au NCs-H2溶液加入离心管内，加入4U RNase抑制剂，然后加入MoS2溶液，使MoS2的终浓度为0.2mg/mL，室温振荡孵育60min，得到双色复合探针。
按照5×104/皿的密度接种500μL HepG2单细胞悬液于激光共聚焦小皿中，于37℃，5％CO2条件下培养24h。之后，吸去完全培养基，加入含有双色复合探针浓度为62μM的基本培养基，继续孵育4h。孵育完成后，吸去含有双色复合探针的基本培养基，PBS清洗多次，接着分别加入含有DON浓度为0、1、5、10、20μM的基本培养基，继续孵育12h。孵育结束后，吸去培养基，PBS溶液清洗三次，用4％多聚甲醛固定液固定15min后置于高分辨激光共聚焦显微镜下进行荧光成像；空白对照组不加入DON，以空白对照组的激光共聚焦成像图的像素强度为A0，以不同浓度的DON刺激时所得激光共聚焦成像图的像素强度为A，以A/A0表示共聚焦成像图相应的相对像素强度。另外一组中，在含有双色复合探针的基本培养基共孵育4h后，吸去含有双色复合探针的基本培养基，用含有DON浓度为20μM的DON的基本培养基，分别继续孵育0、1、2、4、8、12h。孵育结束后，吸去培养基，PBS溶液清洗三次，用4％多聚甲醛固定液固定15min后置于高分辨激光共聚焦显微镜下进行荧光成像；空白对照组DON刺激时间为0h，以空白对照组所得激光共聚焦成像图的像素强度为A0，以不同时长的DON刺激时所得激光共聚焦成像图的像素强度为A，以A/A0表示共聚焦成像图相应的相对像素强度。图10为不同浓度DON刺激下双色复合探针标记的HepG2细胞共聚焦图。空白对照组(DON浓度为0μM)的细胞内几乎没有观察到荧光，随着DON浓度的不断提高，细胞内红色荧光逐渐增强。同时，在DON刺激下，活细胞内miR-34a的表达量上调，miR-34a与H1 *上的足点序列结合而打开发夹结构H1 *，而新暴露的H1 *中的单链DNA序列与H2的足点序列结合，触发HCR反应，细胞内绿色荧光也随之恢复，且荧光强度值随着DON浓度的提高而增加。
结合图11可见，以空白对照组细胞内荧光强度作为基准，定义为1，当DON刺激浓度分别为1、5、10、20μM时，R-Au NCs通道的相对像素亮度分别为1.39±0.21、1.97±0.10、2.49±0.26、4.30±0.14，G-Au NCs通道的相对像素亮度分别为1.36±0.24、2.30±0.3、5.12±0.16、7.77±0.11。随着DON浓度的增加，R-Au NCs和G-Au NCs的相对荧光强度均增加。
图12为双色复合探针标记的HepG2细胞随DON刺激时间的共聚焦图。随着DON刺激时间的增加，细胞内R-Au NCs和G-Au NCs的荧光逐渐恢复。
结合图13可见，以空白对照组细胞内荧光强度作为基准，定义为1，当DON刺激时间分别为1、2、4、8、12h时，R-Au NCs通道的相对像素亮度分别为1.37±0.15、2.53±0.24、4.69±0.31、4.72±0.35、4.74±0.19，G-Au NCs通道的相对像素亮度分别为1.13±0.18、2.08±0.21、3.36±0.34、7.06±0.25、7.09±0.19。R-Au NCs的荧光强度在4h后基本趋于稳定，而G-Au NCs的荧光强度在8h时达到最高值。
实施例6DON的细胞毒性验证
通过CCK-8细胞活性试剂盒对DON处理后的细胞活性进行检测，以验证DON的细胞毒性。由图14可见，与对照组(DON浓度为0μM)相比，不同浓度DON(1、5、10、20μM)处理后，细胞活性分别为70.74±3.01％、60.28±2.13％、55.12±1.81％、47.57±2.46％。随着DON处理浓度的提高，细胞活性逐渐降低，这一结果与实施例5细胞内成像的荧光强度变化结果一致。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种制备双色金纳米簇复合探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)双色金纳米簇的制备
分别制备第一色荧光金纳米簇、第二色荧光金纳米簇；第一色、第二色分属不同的颜色；
(2)双色金纳米簇与DNA的偶联
首先，吸取H1 *和DON适配体，加入缓冲液，混合均匀后加热并冷却至室温以形成发卡结构H1；同时，吸取H2，加入缓冲液，混合均匀后加热并冷却至室温以形成发卡结构H2；
H1 *的序列为TGTCTTAGCTGGTTGTCAAAGTACAACCAGCTAAGACACTGCCACTTCACACGATA C；H2的序列为NH2-ACTTTGACAACCAGCTAAGACATGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT；DON适配体的序列为NH2-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTAGGGGGGATCGTTAAGGAAGTGCCCGG AGGCGGTATCGTGTGAAGTGCT；
之后，将缓冲液分别与第一色荧光金纳米簇和第二色荧光金纳米簇混合均匀后，分别加入EDC/NHS，第一次孵育以活化金纳米簇表面的羧基；之后，分别加入发卡结构H1和发卡结构H2，混合均匀后第二次孵育；第二次孵育完成后，去除未反应的H1和H2，分别得到第一色-Au NCs-H1溶液和第二色-Au NCs-H2溶液，低温避光保存；
(3)双色金纳米簇复合探针的制备
分别吸取第一色-Au NCs-H1溶液和第二色-Au NCs-H2溶液，混合得到混合溶液，加入RNase抑制剂，然后加入MoS2溶液，室温振荡孵育，得到双色金纳米簇复合探针溶液。
2.根据权利要求1所述的一种制备双色金纳米簇复合探针的方法，其特征在于，
所述第一色荧光金纳米簇是红色荧光金纳米簇，制备方法如下：
红色荧光金纳米簇的制备：将牛血清白蛋白分散于超纯水，之后向上述溶液中加入HAuCl4溶液，搅拌，然后缓慢加入碱溶液，调节得到pH值为9-12的混合溶液，孵育；之后，利用透析袋对金纳米簇进行纯化，以去除未反应的杂质，得到红色荧光金纳米簇溶液，低温避光保存；
所述第二色荧光金纳米簇是绿色荧光金纳米簇，制备方法如下：
绿色荧光金纳米簇的制备：将6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶分散于碱溶液中，待6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶彻底溶解后，加入到HAuCl4溶液中，混合均匀，得到混合溶液，于室温避光搅拌得到金纳米簇；利用超滤管对金纳米簇进行纯化，以去除未反应的杂质，得到绿色荧光金纳米簇溶液，低温避光保存。
3.根据权利要求1所述的一种制备双色金纳米簇复合探针的方法，其特征在于，步骤(2)中所述EDC/NHS的物质的量的比例为(1-3)：1。
4.根据权利要求1所述的一种制备双色金纳米簇复合探针的方法，其特征在于，步骤(2)中所述第一次孵育、第二次孵育的温度为25-37℃，第一次孵育时间为0.5-2h，第二次孵育时间为10-15h。
5.根据权利要求1所述的一种制备双色金纳米簇复合探针的方法，其特征在于，步骤(3)中加入MoS2溶液后，MoS2的终浓度为0.1-0.4mg/mL。
6.根据权利要求5所述的一种制备双色金纳米簇复合探针的方法，其特征在于，MoS2的终浓度为0.2mg/mL。
7.根据权利要求1或5或6所述的一种制备双色金纳米簇复合探针的方法，其特征在于，步骤(3)中所述孵育的时间为30-90min。
8.根据权利要求1～7任一项所述方法制备得到的双色金纳米簇复合探针。
9.应用权利要求8所述双色金纳米簇复合探针同时监测活细胞内DON和DON诱导产生的miR-34a的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测细胞接种于激光共聚焦培养皿中，孵育使细胞贴壁生长；
(2)向步骤(1)得到的贴壁生长的细胞添加含有双色金纳米簇复合探针溶液的基本培养基进行孵育；
(3)步骤(2)孵育完成后，
一组，吸去含有双色金纳米簇复合探针溶液的基本培养基，PBS清洗，接着分别加入一系列含有已知不同浓度的DON的基本培养基，继续孵育，孵育结束后，吸去培养基，PBS清洗，用固定液固定后置于高分辨激光共聚焦显微镜下进行荧光成像；空白对照组不加入DON，以空白对照组的激光共聚焦成像图的像素强度为A0，以不同浓度的DON刺激时所得激光共聚焦成像图的像素强度为A，以A/A0表示共聚焦成像图相应的相对像素强度；
另外一组中，吸去含有双色金纳米簇复合探针溶液的基本培养基，PBS清洗，接种加入含有DON浓度为20μM的基本培养基，继续孵育不同时间，孵育结束后，吸去培养基，PBS清洗，用固定液固定后置于高分辨激光共聚焦显微镜下进行荧光成像；空白对照组DON刺激时间为0h，以空白对照组所得激光共聚焦成像图的像素强度为A0，以不同时长的DON刺激时所得激光共聚焦成像图的像素强度为A，以A/A0表示共聚焦成像图相应的相对像素强度。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待测细胞包括人宫颈癌细胞Hela、人结直肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞QSG-7701中的一种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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