TW201534720A - 大豆基因轉殖品系ｍｏｎ８７７５１及偵測與使用其之方法 - Google Patents

大豆基因轉殖品系ｍｏｎ８７７５１及偵測與使用其之方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種基因轉殖大豆(Glycine max)品系MON87751、包含品系MON87751之植物、植物細胞、種子、植物部分、後代植物及商品產品。本發明亦提供對品系MON87751特異的多核苷酸、包含用於品系MON87751之多核苷酸的植物、植物細胞、種子、植物部分及商品產品。本發明亦提供與品系MON87751有關的方法。

Description

大豆基因轉殖品系MON87751及偵測與使用其之方法 [相關申請案之參考]
本申請案主張2013年6月14日申請之美國臨時申請案第61/834,899號之權益，該臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。
序列表之併入
序列表包含在名稱為MONS357US.txt之檔案中，該檔案為44千位元組(在Microsoft Windows®中量測之大小)，且係於2013年6月13日創建，藉由電子提交方式隨本案一起申請且以引用之方式併入本文中。
本發明係關於一種稱為MON87751之基因轉殖大豆(Glycine max，soybean)品系。該品系藉由提供先前於大豆植物中不可利用的殺蟲毒素蛋白質之獨特組合來提供對大豆之鱗翅類昆蟲感染的兩種不同抗性作用模式。此等殺蟲毒素蛋白質之組合對控制大豆植物之鱗翅類昆蟲物種感染特徵為高度有效的。本發明亦係關於大豆植物、植物部分、植物種子、植物細胞、後代植物、農產品及與品系MON87751有關的方法，且提供核苷酸分子，該等核苷酸分子對該品系而言為獨特的，係隨基因轉殖DNA於大豆(Glycine max，soybean)細胞基因組中之插入來產生，且適用於偵測含有大豆核酸之生物樣本中此品系之存在。
大豆(Glycine max)在世界許多地區都是重要的作物，並且已對此種作物應用生物技術方法以便產生已經具有所要特性之大豆品種。一個此種所要特性為抗蟲性。抗蟲性轉殖基因於植物中之表現可將抗蟲性之所要特性賦予植物，但轉殖基因之表現可受許多不同因素的影響，該等因素包括驅動轉移至植物染色體之個別基因之表達的基因盒之定向及組成、染色體位置及轉殖基因插入之基因組結果。例如，已在植物中觀察到，個別品系中轉殖基因表現之程度及型式存在變化，該等個別品系之不同在於轉殖基因之染色體插入位點，而其他方面皆相同。品系之間亦存在不合需要及/或所要的表現型或農藝差異。因此，常常必需產生及分析大量個別植物細胞轉型品系以便選擇具有適用於達成商業成功的所要特性及最佳表現型及農業特徵之品系。選擇較佳基因轉殖品系需要廣泛的分子表徵以及溫室及田間試驗，許多品系歷經多年、發生於多個位置且處於各種條件之下。收集大量的效力、表現型及分子資料，且隨後藉由科學家及農藝師以選擇一或多個商業適合品系為目標來分析所得資料及觀察結果。此品系一經選擇隨即用於使用植物育種方法進行所要基因轉殖特性於其他遺傳背景中之趨中雜交，因此產生大量不同作物品種，其含有所要特性且適合地適於特定地方農藝條件。
由於害蟲發展對毒素之抗性的可能性增加，因而依賴於單一毒素之表現來達成對昆蟲感染之殺蟲控制的基因轉殖大豆可存在有限耐久性之風險。類似地，含有不提供多個獨特作用模式之毒劑的基因轉殖大豆亦可存在有限耐久性之風險。產生對鱗翅類昆蟲之蛋白質毒性的第一種可利用大豆含有單一毒素蛋白質Cry1Ac。已揭示最近的大豆基因轉殖品系含有Cry1Ac及Cry1F毒素蛋白質。若對Cry1Ac之抗性發生，則Cry1Ac及Cry1F基因轉殖品系將僅剩下Cry1F毒素作為其效力來源。因此，必需提供一種大豆植物，其具有兩種或兩種以上控制 由Cry1Ac所控制之害蟲的毒劑，其中該等毒劑無一者結合藉由Cry1Ac所結合之標靶昆蟲中腸(midgut)中的相同或大體上相同受體。本文所述之發明提供一種基因轉殖大豆品系MON87751，其藉由提供對鱗翅類昆蟲害蟲物種有毒性的兩種或兩種以上藥劑來克服以上就先前技術所述之大豆基因轉殖品系來描述的耐久性問題，其中兩種毒劑皆未在先前納入任何大豆植物中來達成控制大豆之鱗翅類昆蟲害蟲的目標。
為製造含有單一轉型品系之基因轉殖植物，將重組DNA構築體之一部分轉移至大豆細胞之基因組中，且隨後使大豆細胞長成植物。使獲品系初始轉移之大豆細胞再生來產生R0世代。可就任何所要特性來測試R0植物及R0植物之後代植物，但品系之有效性可受相對於轉型品系中整合位點之順式及/或反式因子影響。藉由該品系所賦予之表現型亦可受DNA構築體之大小及設計的影響，該DNA構築體可因表現基因盒中遺傳元件之組合、轉殖基因之數目、表現基因盒之數目及此等元件與此等基因盒之組態而改變。識別具有所要特性之品系可進一步因如下因素而複雜化：轉殖基因表現之植物發育型式、晝行性型式、時間型式或空間型式；或外來因子，例如環境植物生長條件、水可利用性、氮可利用性、熱或應力。因此，獲得賦予一組所要表現型特性之品系的能力不可容易預測。
本發明提供包含品系MON87751之基因轉殖大豆植物，其相較於現存基因轉殖大豆植物及並行構建的新品系而言顯示優異性質及效能。大豆品系MON87751在插入大豆基因組之單一基因座處含有兩個經連接表現基因盒，該等基因盒獨立地賦予對鱗翅類昆蟲害蟲之抗性特性。在大豆品系MON87751中組合兩個經連接表現基因盒提供針對鱗翅目昆蟲害蟲物種的兩種作用模式，該等害蟲物種包括錁夜蛾屬 (Chrysodeixis spp.)、夜盜蛾屬(Spodoptera spp.)、鈴夜蛾屬(Helicoverpa spp.)、Crocidosema spp.、灰夜蛾屬(Rachiplusia spp.)、干煞夜蛾屬(Anticarsia spp.)、玉米苗斑螟屬(Elasmopalpus spp.)及Plathypena spp.。雙重作用模式提供針對鱗翅類昆蟲害蟲物種之冗餘殺蟲控制，且顯著地減少發展對害蟲控制特性之抗性的可能性。
品系MON87751之特徵為適用於偵測樣本中該品系之存在的特異獨特DNA區段。樣本欲指為大體上純大豆DNA之組合物或含有大豆DNA之組合物。在任一狀況下，樣本為生物樣本，亦即，其含有生物材料，包括但不限於自包含品系MON87751之大豆基因組直接或間接獲得或來源於其之DNA。「直接」係指熟練技藝人士藉由碎裂大豆細胞(或藉由獲得含有碎裂大豆細胞之大豆樣本)且暴露基因組DNA而從大豆基因組直接獲得DNA來達到偵測目的之能力。「間接」係指熟練技藝人士藉由除經由碎裂大豆細胞或獲得含有碎裂大豆細胞之大豆樣本之直接方式外的方式獲得標靶或特定參考DNA之能力，該標靶或特定參考DNA亦即本文所述的對特定樣本中品系MON87751的存在有診斷性之新穎及獨特接頭區段。此等間接方式包括但不限於：擴增含有藉由設計來以特異性結合至標靶序列之特定探針靶向的DNA序列之DNA區段，或擴增可量測及表徵之DNA區段，亦即該DNA區段可經由諸如瓊脂糖或丙烯醯胺凝膠或類似物之一些有效基質與DNA之其他區段分離來量測，或藉由擴增子之直接序列分析或將擴增子選殖至載體中且對存在於此載體內之經插入擴增子直接定序來表徵。或者，相應於基因轉殖DNA插入大豆染色體中的大豆染色體內位置且可用於定義品系MON87751之DNA區段可藉由各種方式來選殖，且隨後對其於特定樣本或特定大豆基因組中之存在進行識別及表徵。此等DNA區段稱為接頭區段或序列，且可為任何長度的經插入DNA及相鄰(側接)大豆染色體DNA，只要經插入DNA與大豆基因組之間的接合點包括於 該區段中即可。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：10及此等序列每一者之反向補體為此等區段之代表者。
本文中所識別之特定序列可唯一地存在於品系MON87751或其中所包含之構築體中，且當此等序列存在於特定大豆胚質或基因組及/或存在於含有大豆DNA之特定生物樣本中時，無論藉由直接序列分析、藉由偵測結合至此等序列之探針抑或藉由觀測本文所述之特定擴增子之大小及或許組成，對此等序列之識別皆對此樣本中品系MON87751或其中所包含之構築體的存在有診斷性。已知的是，側接基因組區段(亦即，具有鄰近於經插入基因轉殖DNA之DNA序列的大豆基因組區段)經受輕微可變性，且因而參考大豆基因組之間的此等異常或多形性而言存在至少99%或較大一致性的限制。相較於本文提及之特定診斷序列而言，跨於其長度完全互補之核苷酸區段意欲涵蓋於本發明之範疇內。
本發明之核苷酸區段相對於彼此及於大豆基因組內之位置例示於圖1中，且每一核苷酸區段之核苷酸序列係如SEQ ID NO：10所列來例示。表徵品系MON87751且對樣本中品系MON87751或其中所包含之構築體的存在有診斷性的核苷酸區段包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26。當樣本含有大豆組織及因此含有大豆DNA時，此等核苷酸序列之一或兩者或兩個以上者於此樣本中之存在對該樣本中品系MON87751或其中所包含之構築體的存在有診斷性。
意欲藉由使用「來源於」一詞指示特定DNA分子處於大豆植物 基因組中，或能夠於大豆植物DNA中獲偵測。「能夠獲偵測」係指特定DNA區段將獲擴增且其大小及或序列將藉由DNA序列分析表徵或闡明之能力，且亦可指探針特異地結合至特定DNA區段(亦即標靶DNA區段)之能力，及偵測該探針與該標靶結合之後續能力。本發明之特定DNA區段或標靶DNA區段存在於含有插入品系MON87751之大豆內。
就大豆而言，大豆細胞、大豆種子、大豆植物部分及大豆植物意欲涵蓋於本發明之範疇內，只要各實施例含有可偵測量的相應於本文所述對大豆品系MON87751 DNA的存在有診斷性之區段中任一者、兩者或兩個以上者的DNA即可。大豆植物部分包括細胞；花粉；胚珠；花；莢果；種子；根組織；莖組織；及葉組織。自其中包含可偵測量的本文所述對品系MON87751的存在有診斷性之DNA區段的大豆製得之商品產品涵蓋於本發明之範疇內。此等商品產品可包括完整或經處理大豆種子、大豆油、大豆蛋白質、大豆粕、大豆粉、大豆薄片、大豆麩皮、豆漿、豆腐乳、大豆酒、包含大豆之動物飼料、包含大豆之紙、包含大豆之乳油、大豆生物質及使用大豆植物及大豆植物部分生產的燃料產品。
大豆品系MON87751之DNA可存在於含有該品系之大豆植物、大豆種子及大豆組織之一個染色體上的每一細胞及每一基因組中。當大豆基因組以孟德爾方式傳遞至後代時，若大豆植物對品系MON87751插入而言為同型接合的，則每一後代大豆植物及細胞將於含有品系MON87751插入且藉由後代自親代承繼之親本染色體之每一對偶基因上含有品系DNA。然而，若含有品系MON87751 DNA之大豆基因組為異型接合或雜種親代，則參與雜種親代交配的約五十百分比之花粉及約五十百分比之胚珠將含有大豆品系MON87751 DNA，從而產生含有品系MON87751 DNA之混合後代族群，且自此等雜種雜交產生的具 有傳遞至此後代的品系MON87751 DNA的此後代之百分比可在約五十百分比至約七十五百分比之任何範圍變化。
本發明之DNA分子對經插入基因轉殖品系MON87751 DNA任一末端上之兩個獨立的接頭及鄰近於(亦即側接)MON87751經插入DNA之每一末端之大豆基因組DNA而言可為獨特的，或對大豆品系MON87751經插入DNA而言為獨特的。當此等分子存在於藉由本文所述之方法使用探針、引子及在一些狀況下使用DNA序列分析來分析的特定樣本中時，該等分子可對該樣本中一定量的品系MON87751大豆的存在有診斷性。對大豆品系MON87751 DNA而言獨特的此等DNA分子可以許多方式來識別及表徵，包括藉由使用設計來特異地結合至獨特DNA分子之探針核酸分子，接著偵測此等探針與該獨特DNA之結合，以及藉由使用至少兩種不同DNA分子之熱擴增方法，該等DNA分子充當探針，但此等分子之序列可比上述探針特異性稍小。熟練技藝人士應理解，在適當雜交條件下使特定標靶DNA與探針或引子接觸將產生探針或引子與標靶DNA區段之結合。
本發明之DNA分子可為DNA之標靶區段，其能夠擴增，且在偵測為藉由特定樣本之擴增方法所獲得的具有所表示長度之一或多個擴增子時，該等標靶區段對此樣本中品系MON87751或其中所包含之構築體的存在有診斷性。此等DNA分子或多核苷酸區段可具有如以下每一者中所列之核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且其進一步定義於本文及以下實例中。引子分子及/或探針可連同必要試劑(包括對照)一起以套組形式提供，且與使用說明書一起 包裝。
本發明之重組DNA分子可存在於微生物內或來源於微生物。微生物意欲包括任何微觀細胞，無論原核生物抑或真核生物還是在基因組或染色體或更通常稱為質體或載體之染色體外DNA結構內含有DNA。在一實施例中，微觀有機體可包括細菌(原核生物)及相應於高級生命形式(真核生物)之細胞，其在一般人之可視範圍以下，通常在五十立方微米以下，且更通常在十立方微米以下。細菌為普通的微觀微生物，其可含有載體或質體，該載體或質體含有本發明之新穎DNA區段之一或多者或全部，包括如SEQ ID NO：9中所列存在的各別表現基因盒之每一者。本發明之植物細胞及尤其大豆植物細胞可含有本發明之新穎DNA區段之任一者、兩者或兩個以上者或全部。
用於本文中之探針可包含DNA分子或多核苷酸區段，其具有足夠長度來在如本文所定義之嚴格雜交條件下起作用以與特定標靶DNA區段結合，亦即與樣本中品系MON87751 DNA內存在的且對該品系MON87751 DNA的存在有診斷性的獨特DNA區段結合。此探針可設計來僅結合至僅存在於大豆品系MON87751 DNA中之單一接頭或其他新穎序列。或結合至兩個或兩個以上此等單一接頭區段。對此探針與疑似含有大豆DNA之特定樣本中DNA分子之結合的偵測對樣本中大豆品系MON87751的存在有診斷性。
引子可包含成對的適用於擴增特定DNA標靶區段之熱擴增反應的不同寡核苷酸或多核苷酸區段。該對中之每一引子係設計來結合至用於擴增的所關注DNA區段內或附近的相當特異DNA區段。引子以此方式結合以使得此等引子隨即充當核酸序列聚合之局部區，從而引起一或多個擴增子(DNA之擴增標靶區段)之產生。在本發明中，使用設計來結合至特定生物樣本中大豆品系MON87751 DNA之獨特區段的引子，及擴增含有本文所述之接頭區段之一或多者的特定擴增子，以 及在完成或終止聚合酶反應之後偵測及/或表徵此等擴增子，對特定樣本中大豆品系MON87751的存在有診斷性。熟練技藝人士十分熟悉此擴增方法且在此無需闡述擴增之具體細節。
本發明之大豆植物、大豆植物細胞、大豆植物組織及大豆種子可對鱗翅類昆蟲害蟲之感染有抗性，該等鱗翅類昆蟲害蟲包括但不限於錁夜蛾屬、夜盜蛾屬、鈴夜蛾屬、Crocidosema spp.、灰夜蛾屬、干煞夜蛾屬、玉米苗斑螟屬及Plathypena spp.。對鱗翅類昆蟲物種感染之抗性係隨兩個不同DNA區段之表現而產生，該等DNA區段編碼可操作地及共價地連接於經插入基因轉殖DNA內的兩種不同殺蟲蛋白質：Cry2Ab蛋白質，其由表現基因盒在經插入基因轉殖DNA之5’近端處表現，如SEQ ID NO：10中所列及圖2中所例示；及Cry1A.105蛋白質，其由表現基因盒在經插入基因轉殖DNA之3’端處表現，如SEQ ID NO：10中所列及圖2中所例示。Cry2Ab蛋白質由At.Act2啟動子表現，而Cry1A.105蛋白質由At.RbcS4啟動子表現。Cry2Ab及Cry1A.105蛋白質為對鱗翅類昆蟲害蟲物種有毒性的藥劑。
用於產生大豆品系MON87751之構築體具有驅動Cry2Ab及Cry1A.105蛋白質之表現的啟動子，其以相對的串連轉錄定向來定位，以使得各別Cry蛋白質自每一啟動子之表現係於相同方向上進行，但每一蛋白質係來自其獨立的各別啟動子(參見圖2)。所評估的其他構築體在使用表現元件之組合上有所不同，該等表現元件亦即強化子(E)、啟動子(P)、引導序列(L)、內含子(I)、葉綠體靶向肽(CTP)及3’UTR(T)。此外，構築體含有兩種Cry蛋白質(Cry2Ab及Cry1A.105)之載體堆疊，或含有單一Cry蛋白質，亦即Cry2Ab或Cry1A.105。表現構築體之另一變化為用於Cry蛋白質之兩個基因盒於載體堆疊構築體中之相對定向。具體而言，兩個基因盒呈串連轉錄定向，或兩個基因盒呈趨異定向以便兩種Cry蛋白質自每一啟動子之表 現遠離兩個啟動子之間的中心點，亦即，每一表現基因盒之轉錄在相反方向上進行且不會合。編碼Cry1A.105之DNA序列在一些構築體中相對於插入品系MON87751中之轉殖基因的序列而言為序列多樣化的。最終，在構築體中具有於反向轉錄定向上定向的兩個Cry表現基因盒之兩個構築體中，轉錄強化子定位於趨異啟動子之間(參見圖2)。
品系MON87751係基於比較以下者來選擇：數千次不同的獨立基因轉殖品系，每一品系皆由含有如圖2中所例示之T-DNA區段的構築體之一來轉型；及品系MON87701及/或品系GM_A19478(與MON87701同時產生，且兩者皆表現Cry1Ac)；基因轉殖品系40-3-2(賦予對除草劑草甘膦之耐性)；及非基因轉殖對照大豆(A3555或A5547)。以下實例中所例示之結果展示：品系MON87751由於Cry2Ab及Cry1A.105蛋白質之表現而顯示優越性質。使用用於產生品系MON87751之構築體產生的複數個基因轉殖品系每一次比用其他構築體產生之其他品系更可能顯示對鱗翅類昆蟲害蟲之有效控制。
各自含有相應於品系MON87751之DNA的大豆植物及其部分(包括種子)涵蓋於本發明之範疇內。此等植物及其部分(包括種子)對鱗翅類昆蟲感染有抗性。在某些實施例中，此等植物及種子包括雜種及自交種，以及僅含有一個品系MON87751對偶基因之植物及種子，該對偶基因亦即參考相應於品系MON87751 DNA之基因座而言表徵為異型接合的基因組。此等雜種可根據商業品種開發方法之部分藉由用所要胚質來育種包含品系MON87751及大豆之其他農業上所要性質之植物來產生。雜種可藉由大量方法來產生，但較佳方法係利用在插入品系MON87751 DNA之基因座處兩個染色體上含有品系MON87751特異對偶基因之第一自交(同型接合)親代，且將該第一自交種連同不含有MON87751 DNA之第二自交種一起育種。兩個親本自交品種將具有後 代種子(亦即雜種種子)所要之一或多種有利性質，且此等雜種種子對品系MON87751對偶基因而言為異型接合的。
對含有品系MON87751 DNA之植物賦予一些額外之基因轉殖性質或對偶基因可為合乎需要的。賦予所要特性之其他此類基因轉殖對偶基因可包括除草劑耐性：GTS 40-3-2、MON87708、MON89788、A2704-12、A2704-21、A5547-35、A5547-127、BPS-CV127-9、DP356043、GU262、W62、W98、DAS-44406-6、DAS-68416-4、FG72、BPS-CV127-9、SYHT04R、SYHT0H2、3560.4.3.5、EE-GM3、pDAB4472-1606、pDAB4468-0416、pDAB8291.45.36、127、AAD-12；抗蟲性：MON87701、DAS-81419-2；增加的增強油組合物：DP-305423、G94-1、G94-19、G168、OT96-15、MON87705、MON87769；增加的產率：MON 87712，或固氮特性、調變水使用之特性、對真菌感染之抗性、對線蟲感染之抗性，及類似特性。非基因轉殖性質(例如QTL或成熟度群)亦可賦予所要特性，且熟習此項技術者將知曉如何育種大豆來含有此非基因轉殖特性及品系MON87751 DNA。
本發明之前述及其他態樣將自以下詳細描述而變得更加明白。
圖1為以下者的圖解表示：異源基因轉殖DNA區段、側接基因組DNA、任意指定之5’及3’基因組/經插入DNA接頭之相對位置，以各水平線例示；以及異源基因轉殖DNA內對品系MON87751為獨特的序列之相對位置，該序列可用於識別大豆品系MON87751；標記為[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]及[26]之水平線分別相應於SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26；帶粗線條之水平線表示插入品系MON87751中之異源基因轉殖DNA(SEQ ID NO：9)與5’及3’側接基因組DNA二者的複合物，且為含有SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：8之SEQ ID NO：10的表示；指定為SQ26901、SQ20267、SQ25826及SQ27115之粗水平箭頭分別相應於SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：14；細水平箭頭表示品系MON87751之異源基因轉殖插入DNA之兩個獨立的表現基因盒的相對組織，P表示啟動子元件，L表示引導序列，P-L表示啟動子及引導序列，I表示內含子，CTP表示葉綠體轉運肽，Cry2Ab表示用於Cry2Ab蛋白質之編碼區，T=3’轉錄終止及多腺苷酸化元件(3’UTR)，且Cry1A.105表示Cry1A.105蛋白質之編碼區。
圖2例示用於在選擇大豆品系MON87751期間產生所評估的基因轉殖大豆品系之十一種轉型構築體中的編碼Cry蛋白質表現基因盒之T-DNA區段，及各構築體內每一Cry蛋白質表現基因盒之組成。
圖3為相較於非基因轉殖大豆系(A3555)而言用構築體1、構築體2及構築體3產生之品系中Cry蛋白質表現之ELISA分析結果之圖形表示。圖面A.展示在植物生長之R1及R3階段收集的葉組織中的Cry2Ab蛋白質含量。圖面B.展示在植物生長之R1及R3階段收集的葉組織中的Cry1A.105蛋白質含量。
圖4為相較於非基因轉殖大豆系(A3555)而言用構築體1、構築體5、構築體6及構築體4產生之品系中Cry蛋白質表現之ELISA分析結果之圖形表示。圖面A.展示在來自兩個獨立的網室試驗中生長之植物的植物生長之R3階段收集的葉組織中的Cry2Ab蛋白質含量。圖面B.展示在來自兩個獨立的網室試驗中生長之植物的植物生長之R3階段收 集的葉組織中的Cry1A.105蛋白質含量。
圖5為對在植物生長之R3及R5階段收集的葉樣本用構築體1、構築體2、構築體3、構築體4、構築體5、構築體6、構築體9、構築體7及構築體11產生之品系中Cry2Ab蛋白質表現之ELISA分析結果之圖形表示。
圖6為對在植物生長之R3及R5階段收集的葉樣本用構築體1、構築體2、構築體3、構築體4、構築體5、構築體6、構築體9、構築體7及構築體11產生之品系中Cry21A.105蛋白質表現之ELISA分析結果之圖形表示。圖面A Y軸以0-5000ppm乾重繪製且圖面B Y軸以0-500ppm乾重繪製以在圖面B中較好地例示R3階段之資料。
序列表簡單說明
SEQ ID NO：1為表示大豆基因組DNA之5’接頭區及整合基因轉殖表現基因盒之二十核苷酸序列。SEQ ID NO：1定位於SEQ ID NO：10之核苷酸位置1325-1344處。
SEQ ID NO：2為表示大豆基因組DNA之3’接頭區及整合基因轉殖表現基因盒之二十核苷酸序列。SEQ ID NO：2定位於SEQ ID NO：10之核苷酸位置11444-11463處。
SEQ ID NO：3為表示大豆基因組DNA之5’接頭區及整合基因轉殖表現基因盒之六十核苷酸序列。SEQ ID NO：3定位於SEQ ID NO：10之核苷酸位置1305-1364處。
SEQ ID NO：4為表示大豆基因組DNA之3’接頭區及整合基因轉殖表現基因盒之六十核苷酸序列。SEQ ID NO：4定位於SEQ ID NO：10之核苷酸位置11424-11483處。
SEQ ID NO：5為表示大豆基因組DNA之5’接頭區及整合基因轉殖表現基因盒之一百核苷酸序列。SEQ ID NO：5定位於SEQ ID NO：10之核苷酸位置1285-1384處。
SEQ ID NO：6為表示大豆基因組DNA之3’接頭區及整合基因轉殖表現基因盒之一百核苷酸序列。SEQ ID NO：6定位於SEQ ID NO：10之核苷酸位置11404-11503處。
SEQ ID NO：7為表示5’側接大豆基因組序列至基因組DNA與基因轉殖插入DNA之接頭且包括該接頭之1626核苷酸序列，且該核苷酸序列包括側接基因組DNA之(5’至3’)1334及經插入基因轉殖DNA之任意指定5’端之292核苷酸。
SEQ ID NO：8為表示側接大豆基因組序列至基因組DNA與基因轉殖插入DNA之接頭且包括該接頭之1452核苷酸序列，且該核苷酸序列包括經插入基因轉殖DNA之任意指定3’端之(5’至3’)265核苷酸及3’側接基因組DNA之1187核苷酸。
SEQ ID NO：9為相應於插入大豆品系MON87751之基因組中的基因轉殖DNA之10119核苷酸序列。
SEQ ID NO：10為相應於插入品系MON87751中之基因轉殖基因組DNA及5’側接基因組DNA核苷酸序列及3’側接基因組DNA核苷酸序列之複合核苷酸序列的12640核苷酸序列，且包括SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：8。
SEQ ID NO：11為相應於用於識別樣本中之大豆品系MON87751 DNA的稱為SQ20267之熱擴增引子的27核苷酸序列，且與相應於SEQ ID NO：10之位置11400至11426之核苷酸序列一致。
SEQ ID NO：12為相應於用於識別樣本中之大豆品系MON87751 DNA的稱為SQ25826之熱擴增引子的26核苷酸序列，且與相應於SEQ ID NO：10之位置11454至11479之核苷酸序列的反向補體一致。
SEQ ID NO：13為相應於用於識別樣本中之大豆品系MON87751 DNA的稱為PB10263之探針的19核苷酸序列，且與相應於SEQ ID NO：10之位置11428至11446之核苷酸序列一致。
SEQ ID NO：14為相應於用於識別樣本中之大豆野生型對偶基因DNA及/或大豆品系MON87751 DNA之存在的稱為SQ27115之熱擴增引子的24核苷酸序列，且與相應於SEQ ID NO：10之位置11458至11481之核苷酸序列的反向補體一致。
SEQ ID NO：15為相應於在用於識別來源於大豆之樣本中野生型對偶基因DNA之存在的接合子型式測定法中使用的稱為SQ26901的熱擴增引子之30核苷酸序列，且與相應於SEQ ID NO：10之位置1288至1317之核苷酸序列一致。
SEQ ID NO：16為相應於稱為PB11254的探針之18核苷酸序列，且其在用於識別來源於大豆之樣本中野生型對偶基因DNA之存在的接合子型式測定法中使用。
SEQ ID NO：17為相應於插入大豆品系MON87751中之基因轉殖DNA(SEQ ID NO：9)的獨特核苷酸序列之112核苷酸序列，且與SEQ ID NO：9中之位置36-147及與SEQ ID NO：10中之位置1370-1481一致。
SEQ ID NO：18為相應於插入大豆品系MON87751中之基因轉殖DNA(SEQ ID NO：9)的獨特核苷酸序列之52核苷酸序列，且與SEQ ID NO：9中之位置1305-1356及與SEQ ID NO：10中之位置1639-1690一致。
SEQ ID NO：19為相應於插入大豆品系MON87751中之基因轉殖DNA(SEQ ID NO：9)的獨特核苷酸序列之283核苷酸序列，且與SEQ ID NO：9中之位置1561-1843及與SEQ ID NO：10中之位置2895-3177一致。
SEQ ID NO：20為相應於插入大豆品系MON87751中之基因轉殖DNA(SEQ ID NO：9)的獨特核苷酸序列之486核苷酸序列，且與SEQ ID NO：9中之位置2340-2825及與SEQ ID NO：10中之位置3674-4159一致。
SEQ ID NO：21為相應於插入大豆品系MON87751中之基因轉殖 DNA(SEQ ID NO：9)的獨特核苷酸序列之179核苷酸序列，且與SEQ ID NO：9中之位置3326-3504及與SEQ ID NO：10中之位置4660-4838一致。
SEQ ID NO：22為相應於插入大豆品系MON87751中之基因轉殖DNA(SEQ ID NO：9)的獨特核苷酸序列之106核苷酸序列，且其適用於識別樣本中之品系MON87751 DNA，且與SEQ ID NO：9中之位置3749-3854及與SEQ ID NO：10中之位置5083-5188一致。
SEQ ID NO：23為相應於插入大豆品系MON87751中之基因轉殖DNA(SEQ ID NO：9)的獨特核苷酸序列之60核苷酸序列，且其適用於識別樣本中之品系MON87751 DNA，且與SEQ ID NO：9中之位置9320-9379及與SEQ ID NO：10中之位置10654-10713一致。
SEQ ID NO：24為相應於插入大豆品系MON87751中之基因轉殖DNA(SEQ ID NO：9)的獨特核苷酸序列之66核苷酸序列，且其適用於識別樣本中之品系MON87751 DNA，且與SEQ ID NO：9中之位置9620-9685及與SEQ ID NO：10中之位置10954-11019一致。
SEQ ID NO：25為相應於插入大豆品系MON87751中之基因轉殖DNA(SEQ ID NO：9)的獨特核苷酸序列之156核苷酸序列，且其適用於識別樣本中之品系MON87751 DNA，且與SEQ ID NO：9中之位置9720-9875及與SEQ ID NO：10中之位置11054-11209一致。
SEQ ID NO：26為相應於編碼在大豆品系MON87751中表現的Cry2Ab蛋白質之開放閱讀框架的1905核苷酸序列。
本發明人已識別基因轉殖大豆品系MON87751，其顯示對農業上重要的鱗翅類昆蟲目害蟲之商業上可接受的抗性，該等害蟲諸如秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)(秋行軍蟲，FAW)、亞熱帶夜蛾(Spodoptera eridania)(亞熱帶黏蟲，SAW)、甜菜葉蛾(Spodoptera exigua)(甜菜夜蛾，BAW)、黃條黏蟲(Spodoptera ornithogalli)(黃條行軍蟲，YSAW)、Crocidosema aporema(大豆梢蛾，BSM)、向日葵尺蠖(Rachiplusia nu)(向日葵尺蠖，SFL)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(黧豆毛蟲，VBC)、黃豆銀紋夜蛾(Chrysodeixis includens)(大豆尺蠖，SBL)、棉鈴蟲(Helicoverpa zea)(大豆卷蛾，SPW)、Helicoverpa gelotopeon(南美螟蛉)、小玉米秸螟(Elasmopalpus lignosellus)(小玉米莖蛀蟲)、鹽澤燈蛾(Estigmene acrea)(棉黑紋燈蛾)及苜蓿綠夜蛾(Plathypena scabra)(苜蓿綠夜蛾)，以及其他。該品系提供兩種不同可操作連接表現基因盒，一種編碼Cry2Ab殺蟲蛋白質且另一種編碼Cry1A.105殺蟲蛋白質，且提供用於使大豆抵抗鱗翅類昆蟲感染之兩種不同作用模式。此項技術中已知其他基因轉殖大豆品系，亦即MON 88701，其表現Cry1Ac蘇力菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)毒素蛋白質(MacRae等人2005,Fischhoff & Perlak 1995)。MON88701提供用於大豆的主要鱗翅類昆蟲害蟲之單一抗性作用模式，儘管針對夜盜蛾屬之效力不為重要的。將為較佳的是，提供表現兩種或兩種以上顯示對大豆之主要害蟲之效力且包括控制夜盜蛾屬之不同殺蟲蛋白質的基因轉殖大豆。本發明人以大豆品系MON87751形式提供對此問題之至少一個解決方案，該大豆品系MON87751在大豆基因組內之一個基因座中組合兩個共價連接的表現基因盒，此等基因盒賦予擴展的鱗翅類昆蟲物種抗性特性，且本發明人另外對大豆細胞、大豆組織、大豆葉、大豆莢果、大豆種子及大豆植物提供一種以上的作用模式來防止或延遲鱗翅類昆蟲物種中抗性之發展。
大豆品系MON87751係藉由用質體構築體1對大豆分生組織進行土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導之轉型方法來產生。此種質體構築體含有兩個區，其各自由土壤桿菌屬邊界區段(T-DNA區段)限界。第一 T-DNA區段含有兩個經連接植物表現基因盒，一個表現基因盒編碼可選擇標記物且一個表現基因盒編碼可評分標記物。第二T-DNA區段含有兩個經連接植物表現基因盒，其具有對在大豆植物細胞中表現兩種不同殺蟲蛋白質Cry2Ab及Cry1A.105而言必需的調節遺傳元件。由於質體構築體1中之兩個T-DNA區段，含有選擇/可評分標記基因之T-DNA區段隨機插入大豆基因組中且處於與含有Cry2Ab及Cry1A.105表現基因盒之T-DNA區段的整合位點分離的位點處，因此允許在自我及/或逆代雜交之方法(例如篩選R1及高級基因轉殖植物世代)期間，兩個T-DNA區段於轉型大豆植物基因組內之分離。將轉型大豆細胞再生於完整大豆植物中，且自展示編碼Cry2Ab及Cry1A.105蛋白質之第二T-DNA區段之完整性的植物族群選擇個別植物。在R1及後續世代中，基於編碼Cry2Ab及Cry1A.105蛋白質之第二T-DNA區段之完整性，且基於編碼可選擇/可評分標記物基因盒之第一T-DNA區段之不存在(亦即分離)來選擇不含有任何質體主鏈序列之植物的品系。Cry2Ab及Cry1A.105殺蟲毒性蛋白質於具有大豆品系MON87751之細胞中的表現在將具有品系MON87751之該等大豆細胞提供於昆蟲飼料中時賦予對鱗翅類昆蟲害蟲之抗性。
插入大豆品系MON87751之基因組中的質體DNA藉由詳細的分子分析來表徵。此等分析包括：基因轉殖插入DNA之插入次數(大豆基因組內之整合位點數目)、基因組插入位置(大豆基因組中發生插入之特定位點)、複本數目(T-DNA於一個基因座內之複本數目)及完整性。含有插入大豆基因組中產生品系MON87751之兩個經連接表現基因盒之質體構築體含有多個區段(介於元件之間的用於建構或構築若干表現基因盒之接頭序列)，尚不知曉該等區段天然地出現於大豆基因組中亦不天然地出現於其他載體或大豆之基因轉殖品系或其他者中(例如，該等區段為SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26中所列之序列)。另外，在品系MON87751中產生經插入基因轉殖DNA之轉型品系在本文表徵為於大豆基因組中之單一基因座中的插入，從而在所插入DNA與大豆基因組DNA之間得到兩個新基因座或接頭序列。本文中亦表徵額外獨特序列，該等額外獨特序列位於插入具有品系MON87751之大豆基因組中的異源DNA內，且具有足夠長度以便僅對包含品系MON87751 DNA之大豆基因組而言為獨特的。此等接頭序列適用於偵測大豆細胞、大豆組織、大豆種子及大豆植物或大豆植物產品(大豆商品產品)中品系MON87751 DNA之存在。本文描述DNA分子探針及引子對，其已獲開發來用於識別含有或疑似含有包含品系MON87751 DNA之大豆細胞、大豆種子、大豆植物部分或大豆植物組織之生物樣本中此等各種接頭區段之存在。資料展示，品系MON87751含有具有一個經插入基因轉殖DNA複本的單一T-DNA插入物。除根癌土壤桿菌左邊界區及右邊界區中用於基因轉殖DNA自植物轉型質體轉移至大豆基因組之部分外，在品系MON87751 DNA中尚未識別出來自轉型構築體1之額外元件。最終，執行產生對樣本中此品系MON87751 DNA的存在有診斷性之特定擴增子的熱擴增及DNA序列分析，以便測定任意指定之5’及3’插入物至植物基因組接頭，證實該插入物內元件之組織，且測定大豆品系MON87751中經插入轉殖基因DNA(SEQ ID NO：9)之完整DNA序列。
使用用於產生基因轉殖大豆品系MON87751之轉型構築體1產生數十次基因轉殖品系，且產生及使用十種額外轉型構築體來產生數十次其他基因轉殖大豆品系，將該等其他基因轉殖大豆品系與大豆品系 MON87751及相似大豆品系比較。藉由ELISA測定法測試此等品系中兩種殺蟲蛋白質Cry2Ab及Cry1A.105於葉組織中之表現。在小批量網室試驗中測試由每一轉型及大多數構築體產生之品系子集中用於控制鱗翅類昆蟲害蟲之效力。經測定，植物表現元件及Cry2Ab及Cry1A.105表現基因盒於轉型構築體1中之相對定向提供具有針對所測試廣泛範圍鱗翅類昆蟲害蟲之最佳效力的品系。
除非本文另有指明，否則術語欲根據相關技術一般技藝人士之習知用法來理解。分子生物學中普通術語之定義亦可見於Rieger等人，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，第5版，Springer-Verlag：紐約，1991；及Lewin,Genes V,Oxford University Press：紐約，1994中。如本文所使用，術語「大豆(soybean)」意指大豆(Glycine max)且包括可用含有品系MON87751 DNA之大豆植物育種的所有植物品種，包括野生大豆物種以及屬於大豆屬(genus Glycine)的允許在物種之間育種之彼等植物。如本文所使用，術語「包含」意指「包括但不限於」。
本發明提供基因轉殖植物，其已用含有至少兩個表現基因盒之DNA構築體轉型；第一表現基因盒表現毒性量的殺蟲蛋白質Cry2Ab，且第二表現基因盒表現毒性量的殺蟲蛋白質Cry1A.105。毒性量意指為有效量、殺蟲量、有效殺蟲量、殺蟲有效量、標靶昆蟲抑止量、有效殺害蟲量、在鱗翅類昆蟲目之昆蟲飼料中為殺蟲性的量，及將根據相關技術一般技藝人士之習知用法來理解之其他類似術語。根據本文揭示之方法及DNA構築體來轉型之大豆植物對鱗翅類昆蟲害蟲有抗性。相關聯農藝特性提供在育種族群中共同維持此等特性之容易性，且比僅含有賦予對鱗翅類昆蟲害蟲之抗性的單一基因(亦即Cry1Ac)之植物顯示對更廣範圍鱗翅類昆蟲害蟲之抗性。
基因轉殖「植物」係藉由以下方式產生：用異源DNA，亦即包 括大量所關注有效特徵之多核酸構築體來轉型植物細胞；使由轉殖基因於植物細胞之基因組中之插入所產生的植物再生，且選擇特徵為插入特定基因組位置中之特定植物及再生基因轉殖植物之有效特徵數目。術語「品系」係指來自包含經插入DNA及直接鄰近於該經插入DNA之側接基因組序列的原始轉型體之DNA。此DNA為獨特的，且預期由於包括經插入DNA(例如，原始轉型體及由自我雜交產生的後代)之一親本系及不含有該經插入DNA之親本系的有性雜交而轉移至接收包括所關注轉殖基因之該經插入DNA的後代。本發明亦提供原始轉型體植物及包括異源DNA之轉型體之後代。此後代可藉由在包含該品系之植物與其中後代包括異源DNA之另一植物之間的有性異交來產生。甚至在重複逆代雜交至輪迴親本之後，該品系仍存在於雜交後代之相同染色體位置處。本發明係關於基因轉殖品系、包含MON87751之大豆植物、其後代及其中所含有之DNA組合物。
「探針」為一種分離核酸，其可附接有習知可偵測標記或報導分子，例如放射性同位素、配位體、化學螢光劑或酶。此探針與標靶核酸鏈互補，在本發明之狀況下，係與來自MON87751之DNA鏈互補，無論來自含有MON87751之植物抑或來自包括MON87751 DNA之樣本。根據本發明之探針不僅包括去氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括聚醯胺及其他探針材料，其特異地結合至標靶DNA序列且可用於偵測該標靶DNA序列之存在。
DNA引子為分離多核酸，其藉由核酸雜交退火成互補標靶DNA鏈以在引子與標靶DNA鏈之間形成雜種，隨後藉由例如DNA聚合酶之聚合酶沿標靶DNA鏈延伸。本發明之DNA引子對或DNA引子組係指適用於例如藉由聚合酶鏈反應(PCR)或其他習知多核酸擴增方法擴增標靶核酸序列之兩個DNA引子。
DNA探針及DNA引子之長度可為11個多核苷酸或11個以上多核 苷酸，或可為18個多核苷酸或18個以上多核苷酸、24個多核苷酸或24個以上多核苷酸，或30個多核苷酸或30個以上多核苷酸。此等探針及引子經選擇以具有足夠長度來在高嚴格性雜交條件下特異地雜交至標靶序列。較佳地，根據本發明之探針及引子具有與標靶序列完全的序列相似性，儘管可藉由習知方法來設計不同於標靶序列的保留雜交至標靶序列之能力的探針。
本文揭示之基於側接基因組DNA及插入序列的引子及探針可用於藉由習知方法，例如藉由對此等DNA分子再選殖及定序來證實(且必要時校正)所揭示之DNA序列。
本發明之核酸探針及引子在嚴格條件下雜交至標靶DNA分子。任何習知核酸雜交或擴增方法可用於識別樣本中來自基因轉殖植物之DNA之存在。多核酸分子亦稱為核酸區段或其片段，其能夠在某些情況下特異地雜交至其他核酸分子。如本文所使用，若兩個分子能夠形成反平行雙鏈核酸結構，則兩個多核酸分子係描述為能夠彼此特異地雜交。若核酸分子顯示完全互補性，則其中一核酸分子係描述為另一核酸分子之「補體」。如本文所使用，當該等分子之一的每一核苷酸與另一者之核苷酸互補時，該等分子係描述為顯示「完全互補性」。若兩個分子可在至少習知「低嚴格性」條件下以足夠穩定性彼此雜交以允許其保持彼此退火，則該等分子係描述為「最小互補的」。類似地，若分子可在習知「高嚴格性」條件下以足夠穩定性彼此雜交以允許其保持彼此退火，則該等分子係描述為「互補的」。習知嚴格性條件由Sambrook等人，1989及Haymes等人，於：Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press，華盛頓，DC(1985)描述。因此可允許偏離完全互補性，只要此等偏離不完全排除該等分子形成雙鏈結構之能力即可。為使核酸分子用作引子或探針，其僅需要在序列中為足夠互補的，以便能夠在所使用之特定溶劑及鹽濃度下形 成穩定雙鏈結構。
如本文所使用，大體上同源序列為在嚴格性條件下特異地雜交至所比較核酸序列之補體的核酸序列。熟習此項技術者知曉促進DNA雜交之適當嚴格性條件，例如在約45℃下使用6.0 x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、接著在50℃下用2.0 x SSC洗滌，或該等嚴格性條件可見於Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。例如，洗滌步驟中之鹽濃度可選自在50℃下約2.0 x SSC之低嚴格性至在50℃下約0.2 x SSC之高嚴格性。另外，洗滌步驟中之溫度可自在室溫下、約22℃下的低嚴格性條件增加至在約65℃下的高嚴格性條件。可改變溫度及鹽二者，或可使溫度或鹽濃度保持恆定而使另一變數變化。在一較佳實施例中，本發明之多核酸將在適中嚴格條件下，例如在約2.0 x SSC及約65℃下特異地雜交至SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、17、18、19、20、21、22、23或24中所列之核酸分子之一或多者或其補體或任一者之片段。在一尤其較佳實施例中，本發明之核酸將在高嚴格性條件下特異地雜交至SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、17、18、19、20、21、22、23或24中所列之核酸分子之一或多者或其補體或任一者之片段。在本發明之一態樣中，本發明之較佳標記核酸分子具有SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：8，或SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：10；或SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：19，或SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：21，或SEQ ID NO：22，或SEQ ID NO：23中所列之核酸序列，或其補體或任一者之片段。探針與標靶DNA分子之雜交可藉由熟習此項技術者所知的大量方法來偵測，此等方法可包括但不限於螢光標籤、放射性標籤、基於抗體之標籤及化學螢光標籤。
關於使用特定擴增引子對(例如藉由PCR)擴增標靶核酸序列，「嚴格條件」為允許引子對僅雜交至標靶核酸序列之條件，其中具有相應野生型序列(或其補體)之引子將結合該標靶核酸序列且較佳在DNA熱擴增反應中產生獨特擴增產物，即擴增子。
術語「對(標靶序列)特異」指示探針或引子在嚴格雜交條件下僅雜交至包含標靶序列之樣本中的該標靶序列。
如本文所使用，「擴增DNA」或「擴增子」係指對為多核酸模板之部分的標靶多核酸分子進行的多核酸擴增方法之產物。例如，為測定由有性雜交產生的大豆植物是否含有來自包含本發明之品系MON87751之大豆植物的基因轉殖植物基因組DNA，可使自大豆植物組織樣本提取之DNA經受使用引子對之多核酸擴增方法，該引子對包括來源於側接品系MON87751之異源插入DNA的區中之基因組DNA序列的第一引子，且該第一引子在經插入DNA之5'至3'方向上藉由聚合酶伸長。來源於異源插入DNA分子之第二引子在得到第一引子之側接基因組DNA的5'至3'方向上藉由聚合酶伸長。擴增子之長度範圍可為以下組合長度：引子對加一個核苷酸鹼基對，或加約五十個核苷酸鹼基對，或加約兩百五十個核苷酸鹼基對，或加約四百五十個核苷酸鹼基對或加四百五十以上核苷酸鹼基對。或者，引子對可來源於經插入異源DNA兩側上之基因組序列，以便產生包括整個插入多核苷酸序列之擴增子(例如，自SEQ ID NO：10之5’端上的基因組部分分離的前向引子及自SEQ ID NO：10之3’端上的基因組部分分離的反向引子，其將包含本文在含品系MON87751基因組中識別的經插入異源DNA序列(SEQ ID NO：9)之DNA分子擴增)。來源於鄰近於經插入基因轉殖DNA之植物基因組序列的引子對之成員位於離該經插入DNA序列一定距離，這距離可在一個核苷酸鹼基對至多約二萬個核苷酸鹼基對之範圍內變化。術語「擴增子」之使用特定地排除可在DNA熱擴增反應中形 成的引子二聚物。
就實際目的而言，應設計產生有限大小範圍(例如100個鹼基至1000個鹼基之間)之擴增子的引子。較小(較短多核苷酸長度)大小擴增子一般而言更可靠地產生於熱擴增反應中，允許較短循環時間，且可容易分離及在瓊脂糖凝膠上視覺檢查，或適於在終點TAQMAN®類測定法中使用。較小擴增子可藉由DNA擴增子偵測技術中已知之方法來產生及偵測。另外，使用引子對產生之擴增子可選殖至載體中，繁殖，分離及定序，或可直接用此項技術中已確立之方法定序。來源於SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9之組合或SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9之組合的適用於DNA擴增方法以產生對包含MON87751之植物或其後代有診斷性之擴增子的任何引子對為本發明之態樣。包含SEQ ID NO：7之至少15個鄰接核苷酸或其補體的適用於DNA擴增方法以產生對包含MON87751之植物或其後代有診斷性之擴增子的任何單一分離DNA多核苷酸引子分子為本發明之態樣。包含SEQ ID NO：8之至少15個鄰接核苷酸或其補體的適用於DNA擴增方法以產生對包含MON87751之植物或其後代有診斷性之擴增子的任何單一分離DNA多核苷酸引子分子為本發明之態樣。包含SEQ ID NO：9之至少15個鄰接核苷酸或其補體的適用於DNA擴增方法以產生對包含MON87751之植物或其後代有診斷性之擴增子的任何單一分離DNA多核苷酸引子分子為本發明之態樣。
多核酸擴增可伴隨此項技術中已知的各種多核酸擴增方法之任何方法，包括聚合酶鏈反應(PCR)。擴增方法在此項技術中為已知的且尤其描述於美國專利第4,683,195號及第4,683,202號中以及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人編，Academic Press,San Diego,1990。PCR擴增方法已發展至擴增基因組DNA之至多22kb(千鹼基)及噬菌體DNA之至多42kb(Cheng等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 91：5695-5699,1994)。DNA擴增技術中已知之此等方法以及其他方法可用於實踐本發明。來自大豆品系MON87751之異源DNA插入物之序列或側接基因組DNA序列可藉由使用來源於本文提供之序列的引子擴增來自含有品系MON87751 DNA之大豆種子或自含有品系MON87751之大豆種子生長的大豆植物的此類DNA分子，接著對PCR擴增子或其經選殖DNA片段進行標準DNA定序來驗證(及必要時校正)，該含有品系MON87751之大豆種子係以入藏登錄號PTA-120166由ATCC寄存。
藉由此等方法產生之診斷擴增子可藉由複數種技術來偵測。一種此類方法為遺傳位元分析(Genetic Bit Analysis)(Nikiforov，等人Nucleic Acid Res.22：4167-4175,1994)，其中DNA寡核苷酸係設計來使相鄰側接基因組DNA序列及經插入DNA序列二者重疊。使寡核苷酸固定於微量滴定板之孔中。在所關注區之PCR(在插入序列中使用一引子且在相鄰側接基因組序列中使用一引子)之後，可使單鏈PCR產物雜交至固定寡核苷酸，且充當用於單鹼基延伸反應之模板，該單鹼基延伸反應使用DNA聚合酶及對預期下一鹼基特異之經標記二去氧核苷酸三磷酸鹽(ddNTP)。基於螢光或ELISA進行讀出。信號指示轉殖基因/基因組序列由於成功擴增、雜交及單鹼基延伸而存在。
另一方法為Winge描述之焦磷酸定序技術(Innov.Pharma.Tech.00：18-24,2000)。在此方法中，寡核苷酸係設計來使相鄰基因組DNA及經插入DNA接頭重疊。使寡核苷酸雜交至來自所關注區之單鏈PCR產物(在插入序列中使用一引子且在側接基因組序列中使用一引子)，且於DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、螢光素酶、雙磷酸酶(apyrase)、腺苷5’磷醯硫酸鹽及螢光素存在下孵育。單獨地添加DNTP且該併入產生所量測之光信號。光信號指示轉殖基因/基因組序列由於成功擴增、雜交及單鹼基或多鹼基延伸而存在。
藉由Chen，等人，(Genome Res.9：492-498,1999)描述之螢光極化為可用於偵測本發明之擴增子之方法。使用此方法中，寡核苷酸係設計來使基因組側鏈及經插入DNA接頭重疊。使寡核苷酸雜交至來自所關注區之單鏈PCR產物(在經插入DNA中使用一引子且在側接基因組DNA序列中使用一引子)，且於DNA聚合酶及螢光標記ddNTP存在下孵育。單鹼基延伸引起ddNTP併入。可使用螢光計將併入量測為極化之變化。極化之變化指示轉殖基因/基因組序列由於成功擴增、雜交及單鹼基延伸而存在。
Taqman®(PE Applied Biosystems,Foster City,CA)係描述為偵測及定量DNA序列存在之方法，且根據製造商提供之說明書而完全理解。簡言之，FRET寡核苷酸探針係設計來使基因組側鏈及經插入DNA接頭重疊。使FRET探針及PCR引子(在經插入DNA序列中使用一引子且在側接基因組序列中使用一引子)於熱穩定聚合酶及dNTP存在下循環。FRET探針之雜交引起螢光部分之分裂且釋放該螢光部分遠離FRET探針上之淬滅部分。螢光信號指示轉殖基因/基因組序列由於成功擴增及雜交而存在。
已描述適用於序列偵測之分子信標，如Tyangi，等人(Nature Biotech.14：303-308,1996)中所述。簡言之，FRET寡核苷酸探針係設計來使側接基因組及經插入DNA接頭重疊。FRET探針之獨特結構使其含有二級結構，該二級結構將螢光部分及淬滅部分緊鄰地保持。使FRET探針及PCR引子(在經插入DNA序列中使用一引子且在側接基因組序列中使用一引子)於熱穩定聚合酶及dNTP存在下循環。在成功PCR擴增之後，FRET探針與標靶序列之雜交產生探針二級結構之移除及螢光部分與淬滅部分之空間分離。螢光信號產生。螢光信號指示側接/轉殖基因插入序列由於成功擴增及雜交而存在。
基於DNA擴增方法之DNA偵測套組含有DNA引子分子，該等引 子分子在適當反應條件下特異地雜交至標靶DNA且擴增診斷擴增子。該套組可提供瓊脂糖凝膠基偵測方法或此項技術中已知的偵測診斷擴增子之大量方法。DNA偵測套組可使用本文揭示之組合物來開發，且適用於識別樣本中之大豆品系MON87751 DNA，且可用於育種含有品系MON87751 DNA之大豆植物的方法。含有與SEQ ID NO：10中所列之大豆基因組區之任何部分及與SEQ ID NO：10中所列之經插入基因轉殖DNA之任何部分同源或互補的DNA引子之套組為本發明之目標。DNA分子可用於DNA擴增方法(PCR)或用作多核酸雜交方法、亦即南方分析、北方分析中之探針。
接頭序列可由來自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26組成之群的序列表示。例如，接頭序列可由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所提供之核苷酸序列任意地表示。或者，接頭序列可由SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所提供之核苷酸序列任意地表示。或者，接頭序列可由SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6所提供之核苷酸序列任意地表示。此等核苷酸藉由磷酸二酯鍵聯來連接且在大豆品系MON87751中作為重組植物細胞基因組之部分存在。對來源於大豆植物、大豆種子或大豆植物部分之樣本中的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26之一或多者的識別對自大豆品系MON87751獲 得之DNA有判定性，且對含有來自大豆品系MON87751之DNA的樣本的存在有診斷性。本發明因此提供含有如以下者提供的核苷酸序列之至少一者的DNA分子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。來源於基因轉殖大豆品系MON87751之DNA的足以包括如以下者提供的序列之至少一者的任何區段在本發明之範疇內：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26。另外，包含與本段落內描述之序列中任何者互補的序列之任何多核苷酸在本發明之範疇內。
本發明提供示範性DNA分子，其可用作引子或探針以用於偵測樣本中來源於包含品系MON87751 DNA之大豆植物之DNA的存在。此等引子或探針對標靶核酸序列為特異的，且因而適用於藉由本文所述的本發明之方法識別大豆品系MON87751核酸序列。
「引子」可為高度純化的分離多核苷酸，其係設計來適用於涉及熱擴增之特定退火或雜交方法。一對引子可在諸如聚合酶鏈反應(PCR)之熱擴增中與諸如大豆基因組DNA之樣本的模板DNA一起使用以便產生擴增子，其中由此反應產生之擴增子將具有相應於位於引子雜交至模板的兩個位點之間的模板DNA之序列的DNA序列。如本文所使用，「擴增子」為已使用擴增技術合成的DNA段或片段之複製物。本發明之擴增子可包含如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所提供 之序列之至少一者。引子係通常設計來雜交至互補標靶DNA鏈以在該引子與該標靶DNA鏈之間形成雜種，且引子之存在為聚合酶之識別點，以便使用標靶DNA鏈之模板來開始引子之延伸(亦即額外核苷酸聚合成加長核苷酸分子)。如本發明所使用之引子對意指使用結合雙鏈核苷酸區段之相反鏈的兩個引子，以便通常在熱擴增反應或其他習知核酸擴增方法中，在經靶向用於藉由引子對之個別成員結合的位置之間線性地擴增多核苷酸區段。適用作引子之示範性DNA分子如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15所提供。如SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12所提供之引子對適用作第一DNA分子及不同於該第一DNA分子之第二DNA分子，且兩者各自具有SEQ ID NO：10之足夠長度的鄰接核苷酸以便用作DNA引子，該等引子在使用來源於大豆品系MON87751之模板DNA的熱擴增反應中共同使用時，產生對樣本中之大豆品系MON87751 DNA有診斷性之擴增子。
「探針」為與標靶核酸鏈互補的分離核酸。根據本發明之探針不僅包括去氧核糖核酸或核糖核酸，而且包括特異地結合至標靶DNA序列之聚醯胺及其他探針材料，且對此結合之偵測可適用於診斷、區別、判定或確認彼標靶DNA序列於特定樣本中之存在。探針可附接至習知可偵測標記或報導分子，例如放射性同位素、配位體、化學螢光劑或酶。適用作探針之示範性DNA分子如SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16所提供。
根據本發明之探針及引子可具有與標靶序列完全的序列一致性，儘管可藉由習知方法來設計不同於標靶序列的保留優先雜交至標靶序列之能力的引子及探針。為使核酸分子用作引子或探針，其僅需要在序列中為足夠互補的，以便能夠在所使用之特定溶劑及鹽濃度下形成穩定雙鏈結構。任何習知核酸雜交或擴增方法可用於識別樣本中來自大豆品系MON87751之基因轉殖DNA之存在。探針及引子之長度 通常為至少約11個核苷酸、至少約18個核苷酸、至少約24個核苷酸或至少約30個核苷酸或30個以上核苷酸。此等探針及引子在嚴格雜交條件下特異地雜交至標靶DNA序列。習知嚴格性條件由Sambrook等人，1989及Haymes等人，於：Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press，華盛頓，DC(1985)描述。
熟習此項技術者熟知的大量方法可用於分離及操縱本發明中揭示之DNA分子或其片段，該等方法包括熱擴增方法。DNA分子或其片段亦可如通常藉由使用自動化寡核苷酸合成器所實踐，藉由其他技術，諸如藉由直接由化學方法合成片段來獲得。
本文提供之DNA分子及相應核苷酸序列因此尤其適用於識別大豆品系MON87751、選擇包含大豆品系MON87751之植物品種或雜種、偵測樣本中來源於基因轉殖大豆品系MON87751之DNA之存在，以及監視樣本存在及/或不存在大豆品系MON87751或來源於包含品系MON87751之大豆植物的植物部分。
本發明提供大豆植物、大豆植物細胞、大豆種子、大豆植物部分(諸如花粉、胚珠、莢果、花組織、根組織、莖組織及葉組織)、大豆後代植物、大豆油、大豆酒、豆漿、大豆蛋白質及大豆商品產品。此等大豆植物、大豆植物細胞、大豆種子、大豆植物部分、大豆後代植物、大豆油、大豆酒、豆漿、大豆蛋白質及大豆商品產品含有可偵測量的本發明之多核苷酸，亦即諸如具有如以下所提供之序列之至少一者的多核苷酸：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26。本發明之大豆植物、植物細胞、種子、植物部分及後代植物 亦可含有一或多種額外轉殖基因。此額外轉殖基因可為編碼賦予所要特性之蛋白質或RNA分子的任何核苷酸序列，該所要特性包括但不限於增加的抗蟲性、增加的水使用效率、增加的產量效能、增加的抗旱性、增加的種子品質、改良的營養品質及/或增加的除草劑耐性，其中該所要特性係相對於缺乏此額外轉殖基因之大豆植物來量測。
本發明提供來源於含有品系MON87751 DNA之基因轉殖大豆植物的大豆植物、大豆植物細胞、大豆種子、大豆植物部分(諸如花粉、胚珠、莢果、花組織、根組織、莖組織及葉組織)、大豆後代植物。含有品系MON87751 DNA之大豆種子之代表性樣本已根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)由美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC®)寄存。ATCC儲存庫已對含有品系MON87751 DNA之種子指定專利寄存名稱PTA-120166。
本發明提供一種微生物，其基因組中包含具有選自以下者的至少一個序列的DNA分子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。此微生物之實例為基因轉殖植物細胞。諸如本發明之植物細胞之微生物適用於許多工業應用，包括但不限於：(i)用作科學探究或工業研究之研究工具；(ii)用於培養物中來產生內源或重組碳水化合物、脂質、核酸或蛋白質產物，或可用於後續科學研究或用作工業產品的小分子；及(iii)與現代植物組織培養技術一起使用來產生可用於農業研究或生產的基因轉殖植物或植物組織培養物。諸如基因轉殖植物細胞之微生物的產生及使用係利用現代微生物技術及人類介入來產生人造、獨特微生物。在此方法中，將重組DNA插入植物細胞基因組 中以便產生與天然存在植物細胞分離且獨特的基因轉殖植物細胞。此基因轉殖植物細胞可隨後更類似於細菌及酵母細胞一樣使用現代微生物學技術來培養，且可以未分化、單細胞狀態存在。基因轉殖植物細胞之新遺傳組成及表現型為藉由將異源DNA整合於細胞基因組中所產生的技術效果。本發明之另一態樣為使用本發明之微生物之方法。使用本發明之微生物(諸如基因轉殖植物細胞)之方法包括(i)藉由將重組DNA整合至細胞基因組中且隨後使用此細胞得到擁有相同異源DNA之額外細胞來產生基因轉殖細胞之方法；(ii)使用現代微生物學技術培養含有重組DNA之細胞的方法；(iii)自培養細胞產生及純化內源或重組碳水化合物、脂質、核酸或蛋白質產物之方法；及(iv)使用現代植物組織培養技術用基因轉殖植物細胞產生基因轉殖植物或基因轉殖植物組織培養物之方法。
本發明之植物可將品系MON87751 DNA(包括插入大豆品系MON87751中之轉殖基因)傳遞至後代。如本文所使用，「後代」包括任何植物、種子、植物細胞及/或可再生植物部分，其包含來源於祖先植物之品系MON87751 DNA及/或包含具有選自由以下組成之群的至少一個序列的DNA分子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。植物、後代及種子對轉殖基因而言可為同型接合或異型接合的。後代可生長自藉由含有大豆品系MON87751之植物產生之種子，及/或生長自藉由以來自含有大豆品系MON87751之植物的花粉授精的植物所產生之種子。
後代植物可為自花受粉的(亦稱為「自我授粉」)，以便產生純品 系之植物，亦即，對轉殖基因而言為同型接合之植物。適當後代之自我授粉可產生對兩個添加的外源基因而言為同型接合之植物。
或者，後代植物可為異交的，例如，用另一無關植物育種以便產生變種或雜種種子或植物。另一無關植物可基因轉殖或非基因轉殖的。本發明之變種或雜種種子或植物可因此藉由使缺乏大豆品系MON87751之特定及獨特DNA之第一親代與包含大豆品系MON87751之第二親代有性雜交來得到，從而產生包含該大豆品系MON87751之特定及獨特DNA之雜種。每一親代可為雜種或自交種/變種，只要雜交或育種產生本發明之植物或種子即可，亦即，產生具有至少一個含有大豆品系MON87751之DNA的對偶基因及/或具有選自以下者之至少一個序列的DNA分子之種子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。兩種不同基因轉殖植物可因此雜交來產生雜種子代，其含有兩個獨立分離的、添加的外源基因。例如，含有賦予大豆雙重抗蟲性作用模式之Cry2Ab及Cry1A.105之MON87751可與其他基因轉殖大豆植物雜交來產生具有兩種基因轉殖親代之特徵的植物。該雜交之一實例為含有賦予大豆雙重抗蟲性作用模式之Cry2Ab及Cry1A.105之MON87751與具有諸如除草劑耐性(例如大豆品系MON89788或大豆品系MON 87708)及/或昆蟲控制(例如大豆品系MON 88701)之一或多個額外特性之植物的雜交，從而產生具有對鱗翅類昆蟲害蟲之雙重抗性作用模式且具有至少一個或多個額外特性之後代植物或種子。亦根據營養繁殖而涵蓋逆代雜交至親本植物及與非基因轉殖植物之異交。常用於不同特性及作物之其他育種方法的描述可見於若干參考文獻之 一，例如，Fehr,in Breeding Methods for Cultivar Development,Wilcox J.編，American Society of Agronomy,Madison WI(1987)。
本發明提供一種來源於包含品系MON87751之大豆植物的植物部分。如本文所使用，「植物部分」係指植物之任何部分，其由來源於包含品系MON87751之大豆植物的材料組成。植物部分包括但不限於花粉、胚珠、莢果、花、根或莖組織、纖維及葉。植物部分可為有活力、無活力、可再生及/或不可再生的。
本發明提供一種商品產品，其來源於包含品系MON87751之大豆植物且含有可偵測量的對品系MON87751特異之核酸。如本文所使用，「商品產品」係指包含來源於含有大豆品系MON87751 DNA之大豆植物、完整或經處理大豆種子、一或多個植物細胞及/或植物部分的材料之任何組合物或產品。商品產品可出售至消費者且可為有活力或無活力的。無活力商品產品包括但不限於無活力種子；完整或經處理種子、種子部分及植物部分；大豆油、大豆蛋白質、大豆粕、大豆粉、大豆薄片、大豆麩皮、豆漿、豆腐乳、大豆酒、包含大豆之動物飼料、包含大豆之紙、包含大豆之乳油、大豆生物質及使用大豆植物及大豆植物部分生產的燃料產品。有活力商品產品包括但不限於種子、植物及植物細胞。包含品系MON87751之大豆植物可因此用於製造通常自大豆獲得的任何商品產品。來源於包含品系MON87751之大豆植物的任何此種商品產品可含有至少可偵測量的相應於大豆品系MON87751之特異及獨特DNA，且可特定地含有可偵測量的包含具有選自以下者的至少一個序列的DNA分子之多核苷酸：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。可使用偵測核苷酸分子之任何標準方法，包括本文揭示之偵測方法。若商品產品中存在任何可偵測量的具有選自以下者的至少一個序列的DNA分子，該商品產品即在本發明之範疇內：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。
本發明之植物、後代、種子、植物細胞、植物部分(諸如花粉、胚珠、莢果、花、根或莖組織及葉)以及商品產品因此尤其適用於使植物生長，以便產生用於農業目的的包含大豆品系MON87751之種子及/或植物部分，產生用於植物育種及研究目的的包含大豆品系MON87751之後代，與用於工業及研究應用之微生物技術一起使用，以及出售給消費者。
提供用於產生抗昆蟲大豆植物之方法，該抗昆蟲大豆植物包含對本發明之品系MON87751特異且獨特的DNA序列。用於此等方法中之基因轉殖植物對轉殖基因而言可為同型接合或異型接合的。藉由此等方法產生之後代植物可為變種或雜種植物；可生長自藉由含有大豆品系MON87751之植物產生之種子，及/或生長自藉由以來自含有大豆品系MON87751之植物的花粉授精的植物所產生之種子；且對轉殖基因而言可為同型接合或異型接合的。後代植物可隨後自花受粉以產生純品系之植物，亦即，對轉殖基因而言為同型接合之植物，或替代地，可經異交，例如，用另一無關植物育種以產生變種或雜種種子或植物。
提供偵測樣本中來源於包含大豆品系MON87751之大豆細胞、大 豆組織、大豆種子或大豆植物的DNA之存在的方法。一種方法由以下組成：(i)自至少一個大豆細胞、大豆組織、大豆種子或大豆植物提取DNA樣本，(ii)使DNA樣本與能夠在適合於DNA定序之條件下產生對品系MON87751 DNA特異之DNA序列的至少一個引子接觸，(iii)執行DNA定序反應，且隨後(iv)確認核苷酸序列包含對品系MON87751或其中所包含之構築體特異之核苷酸序列，諸如選自由以下者組成之群的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。另一種方法由以下組成：(i)自至少一個大豆細胞、大豆組織、大豆種子或大豆植物提取DNA樣本，(ii)使DNA樣本與能夠在適合於DNA擴增之條件下自品系MON87751 DNA產生擴增子之引子對接觸，(iii)執行DNA擴增反應，且隨後(iv)偵測擴增子分子及/或確認該擴增子之核苷酸序列包含對品系MON87751特異之核苷酸序列，諸如選自由以下者組成之群的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO：6。擴增子應為對品系MON87751特異之擴增子，諸如包含SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5，或SEQ ID NO：6之擴增子。偵測擴增子中對品系MON87751特異之核苷酸序列對樣本中大豆品系MON87751特異DNA的存在為判定性及/或診斷性的。能夠在適合於DNA擴增之條件下自品系MON87751 DNA產生擴增子之引子對之實例如SEQ ID NO：11及SEQ ID NO：12所提供。其他引子對可容易藉由熟習此項技術者設計，且將產生包含SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：5，或 SEQ ID NO：6之擴增子，其中此引子對包含位於側接該插入物之基因組區內的至少一個引子及位於該插入物內的第二引子。偵測樣本中來源於包含大豆品系MON87751之大豆細胞、大豆組織、大豆種子或大豆植物的DNA之存在的另一種方法由以下組成：(i)自至少一個大豆細胞、大豆組織、大豆種子或大豆植物提取DNA樣本，(ii)使DNA樣本與對品系MON87751 DNA特異之DNA探針接觸，(iii)允許探針及DNA樣本在嚴格雜交條件下雜交，且隨後(iv)偵測探針與標靶DNA樣本之間的雜交。對品系MON87751 DNA特異之DNA探針序列之實例如SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16所提供。其他探針可容易藉由熟習此項技術者設計，且將包含側接插入物之基因組DNA之至少一個片段及插入DNA之至少一個片段，諸如但不限於提供於以下者中之序列：SEQ ID NO：I、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：10。偵測探針與DNA樣本之雜交對樣本中大豆品系MON87751特異DNA的存在有診斷性。不存在雜交替代地對樣本中大豆品系MON87751特異DNA的不存在有診斷性。
提供DNA偵測套組，其適用於識別樣本中之大豆品系MON87751 DNA，且亦可用於育種含有適當品系DNA之大豆植物的方法。此等套組含有包含以下者之片段的DNA引子及/或探針：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。此套組之一實例包含具有SEQ ID NO：10之足夠長度的鄰接核苷酸之至少一個DNA分子以便用作DNA探針，該DNA探針適用於偵測樣本中來源於包含品系 MON87751之基因轉殖大豆植物的DNA之存在及/或不存在。來源於包含品系MON87751之基因轉殖大豆植物的DNA將包含具有選自以下者之至少一個序列的DNA分子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。足以用作適用於判定、偵測或診斷樣本中大豆品系MON87751 DNA之存在及/或不存在的DNA探針之DNA分子如SEQ ID NO：13所提供。其他探針可容易藉由熟習此項技術者設計，且應包含SEQ ID NO：10之至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個、至少30個、至少31個、至少32個、至少33個、至少34個、至少35個、至少36個、至少37個、至少38個、至少39個或至少40個鄰接核苷酸，且對大豆品系MON87751 DNA足夠獨特以便識別來源於品系之DNA。另一類型之套組包含適用於產生擴增子之引子對，該擴增子適用於偵測樣本中來源於基因轉殖大豆品系MON87751的DNA之存在及/或不存在。此套組將使用包含以下之方法：使標靶DNA樣本與如本文所述之引子對接觸，隨後執行核酸擴增反應，其足以產生包含具有選自以下者的至少一個序列的DNA分子之擴增子：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且隨後偵測該擴增子之存在及/或不存在。 此方法亦可包括對擴增子或其片段定序，該擴增子或其片段對標靶DNA樣本中大豆品系MON87751特異DNA的存在為判定性，亦即有診斷性。其他引子對可容易藉由熟習此項技術者設計，且應包含提供於但不限於以下者中之序列的至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個或至少30個鄰接核苷酸：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且對大豆品系MON87751 DNA足夠獨特以便識別來源於品系之DNA。
本發明之套組及偵測方法尤其適用於識別大豆品系MON87751、選擇包含大豆品系MON87751之植物品種或雜種、偵測樣本中來源於基因轉殖大豆品系MON87751之DNA之存在，以及監視樣本存在及/或不存在包含品系MON87751之大豆植物或來源於包含品系MON87751之大豆植物的植物部分。
來自大豆品系MON87751之異源DNA插入物之序列、接頭序列或側接序列可藉由使用來源於本文提供之序列的引子擴增來自該品系之此等序列，接著對擴增子或經選殖DNA進行標準DNA定序來驗證(及必要時校正)。
包括以下實例以證明本發明之某些較佳實施例之實例。熟習此項技術者應瞭解在以下實例中揭示之技術表示由本發明人發現在實踐本發明中很好地起作用之技術，且因此可認為該等技術構成實踐本發明較佳模式之實例。然而，根據本揭示案，熟習此項技術者應瞭解可在不脫離本發明之精神及範疇之情況下對所揭示之具體實施例進行許 多改變且仍獲得相似或類似之結果。
寄存資訊
含有品系MON87751 DNA之大豆種子之代表性樣本的寄存已在2013年2月28日根據布達佩斯條約，由地址為10801 University Boulevard,Manassas,Virginia USA，郵遞區號20110之美國菌種保存中心(ATCC)進行，且指定ATCC入藏登錄號PTA-120166。在申請案待決期間，專利及商標委員會委員以及由委員決定的有權人士可根據請求對寄存物進行取用。在頒與專利之後，將不可撤銷地移除對公眾可利用性的所有限制。寄存物將在寄存庫中保持30年之時期，或自上一次請求後5年之時期，或專利之有效期，無論何者較長，且將在該時期期間按需要加以替換。
實例1
本實例描述大豆品系MON87751之轉型及選擇。外來基因於植物中之表現受其染色體位置的影響，此或許歸因於染色質結構(例如異染色質)或接近於整合位點之轉錄調節元件(例如強化子)之接近性(Weising,1988)。由於這個原因，常常必需篩選大量品系以便識別藉由經引入之所關注基因的最佳表現所表徵的品系。例如，已在植物及其他有機體中觀察到：各品系之間，經引入基因之表現程度可存在廣泛變化。表現之空間型式或時間型式亦可存在差異，例如，各種植物組織中轉殖基因之相對表現的差異，該相對表現可不相應於對經引入基因構築體中存在的轉錄調節元件所預期之型式。由於此等原因，產生十一種不同的表現載體且在選擇品系MON87751期間在轉型大豆中加以測試。
在植物中轉型且測試十一種不同的表現構築體。個別表現構築體在使用表現元件之組合上有所不同，該等表現元件亦即強化子(E)、啟動子(P)、引導序列(L)、內含子(I)、葉綠體靶向肽(CTP)及3’ 轉錄終止及多腺苷酸化信號(T)。此外，T-DNA區段含有兩個編碼兩種Cry蛋白質(Cry2Ab及Cry1A.105)之表現基因盒，或含有一個編碼單一Cry蛋白質(亦即Cry2Ab或Cry1A.105)之表現基因盒。具有含有Cry2Ab及Cry1A.105表現基因盒二者的T-DNA區段之表現構築體的另一變化為編碼該等Cry蛋白質之兩個基因盒之相對定向。具體而言，兩個Cry蛋白質表現基因盒以相對的串連轉錄定向來定位，以使得各別Cry蛋白質自每一啟動子之表現係於相同方向上進行，但每一蛋白質係來自其獨立的各別啟動子(參見圖2)，或兩個Cry蛋白質表現基因盒呈反向定向以便兩種Cry蛋白質自每一啟動子之表現遠離兩個啟動子之間的中心點，亦即，每一Cry蛋白質表現基因盒之轉錄在相反方向上進行且不會合(參見圖2)。編碼Cry1A.105之DNA序列在構築體4、6、7、8及9中相較於構築體1及3而言為序列多樣化的。在另一變型中，在具有於反向轉錄定向上定向的兩個Cry表現基因盒之兩個構築體中，轉錄強化子定位於趨異啟動子之間(參見圖2)。
將十一種表現構築體在三個獨立的時間藉由對大豆分生組織進行土壤桿菌屬介導轉型來轉型。該方法描述於美國專利第8,030,544號中，其允許在不利用癒傷組織(callus)情況下產生轉型植物。簡言之，自發芽A3555大豆種子(Asgrow,St Louis,MO)之胚芽切除分生組織。構築體1包含兩個獨立的T-DNA區段，其各自由土壤桿菌屬邊界序列(T-DNA區段)限界。轉型構築體之第一T-DNA區段含有兩個表現基因盒，其中第一表現基因盒編碼來自大腸桿菌(Escherichia coli)之Tn7腺苷酸轉移酶基因區(其賦予觀黴素(spectinomycin)及鏈黴素(streptomycin)抗性；aadA-SPR)且用於選擇；且第二表現基因盒編碼來自根癌土壤桿菌菌株C58之蔗糖磷酸化酶基因區(其催化蔗糖向果糖及葡萄糖-1-磷酸之轉化；STR+OriRi)且用作可評分標記物。不同轉型構築體之第二T-DNA區段含有一個僅編碼Cry2Ab之表現基因盒(構 築體2、5、10或11)或一個僅編碼Cry1A.105之表現基因盒(構築體3或6)；或不同轉型構築體之第二T-DNA區段含有一個編碼Cry2Ab之表現基因盒及一個編碼Cry1A.105之表現基因盒(構築體1、4、7、8或9)(例示於圖2中)。因為轉型構築體之每一T-DNA區段係由獨立的土壤桿菌屬邊界序列限界，所以包含選擇及可評分標記物基因盒之T-DNA區段可整合於大豆細胞基因組中、位於不同於編碼Cry2Ab及/或Cry1A.105表現基因盒之T-DNA區段之整合位點的位點處。因此，可就選擇及可評分標記物序列之分離及損失來篩選品系。就不存在主鏈及不存在選擇/可評分標記物基因盒序列來選擇所有品系。在用運載轉型構築體之土壤桿菌屬共培養之後，將分生組織置放於含有觀黴素、卡本西林(carbenicillin)二鈉鹽、頭孢噻肟鈉鹽及替卡西林(ticarcillin)二鈉鹽/克拉維酸鉀混合物之選擇培養基上，以便抑制未轉型植物細胞及過量土壤桿菌屬之生長。隨後，將分生組織置放於有助於枝及根發育之培養基中。選擇具有正常表現型特徵之生根植物(R0)且將其轉移至土壤以供生長及進一步評鑑。
用於產生品系MON87751之表現構築體1含有編碼兩種不同Cry蛋白質之T-DNA區段，其以5'至3'相對次序包含以下植物表現元件(有或無介入序列)：來源於阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)肌動蛋白2基因(P-At.Act2)之啟動子、引導序列及第一內含子；包含來源於阿拉伯芥屬5-烯醯丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因之N端葉綠體轉運肽編碼序列與編碼來自蘇力菌(Bt)且核苷酸經修飾以供植物表現的Cry2Ab之基因(其編碼賦予抗蟲性之蛋白質)的同框融合物之嵌合編碼序列(CTP2-Cry2Ab)；來源於稻(Oryza sativa)金屬硫蛋白樣蛋白質基因(T.OsMth)之3’轉錄終止及多腺苷酸化元件(3’UTR)；在第一Cry蛋白質表現基因盒與第二Cry蛋白質表現基因盒之間的介入序列；來源於阿拉伯芥屬核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶小次單元1A基因(P-At.RbcS4)之 啟動子及引導序列，此啟動子-引導序列連接至包含來源於阿拉伯芥屬核酮糖1,5-雙磷酸羧化酶小次單元1A蛋白質基因(CTP1)之葉綠體轉運肽編碼序列與編碼Cry1A.105之基因(其編碼賦予抗蟲性之蛋白質)的同框融合物之嵌合編碼序列，該葉綠體轉運肽編碼序列亦含有編碼轉運肽分裂位點及來自成熟蛋白質的3個胺基酸之重複序列的編碼序列，該編碼Cry1A.105之基因包含編碼來自蘇力菌(Bt)且核苷酸經修飾以供植物表現的Cry1Ab1(域I&II)、Cry1Fa1(域III)及Cry1Ac1(原毒素域)之基因區段；來源於蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)磷酸鹽運輸蛋白1基因之3’UTR(T-Mt.Pt1)。在構築體1表現基因盒中，含有兩個獨立Cry2Ab及Cry1A.105表現基因盒之T-DNA基因盒在任意指定5’端上具有土壤桿菌屬右邊界，其處於Cry2Ab基因盒之5’方向；及在任意指定3’端上具有土壤桿菌屬左邊界，其處於Cry1A.105基因盒之3’方向。Cry2Ab基因盒(啟動子至終止子)在SEQ ID NO：9之位置123-3785處，且Cry1A.105基因盒(啟動子至終止子)在SEQ ID NO：9之位置3831-9754處。
用於構築體2(Cry2Ab)及用於構築體3(Cry1A.105)之T-DNA基因盒含有單一Cry蛋白質編碼基因盒，其具有在構築體1中使用的用於各別Cry蛋白質編碼基因之相同元件，參見圖2。
構築體4、5及6在元件定向上分別相似於構築體1、2及3，但具有用於兩個Cry2Ab及Cry1A.105基因盒之不同啟動子-引導序列-內含子及葉綠體轉運肽。在所有表現構築體1至11中，用於相應Cry蛋白質基因盒(Cry2Ab使用T-Os.Mth，或Cry1A.105使用T-Mt.Pt1)之終止子均相同(參見圖2)。
用於構築體7至11中每一者之Cry2Ab及Cry1A.105基因盒二者的啟動子-引導序列-內含子及葉綠體轉運肽、Cry蛋白質編碼序列及終止子皆與使用構築體4、5及6中之彼等者相同。然而，對構築體7、8 及9而言，Cry2Ab基因盒及Cry1A.105基因盒之定向相對於彼此反轉或反向，且轉錄定向處於反向方向上，各方向係自其各別啟動子起算，參見圖2。構築體7、8及9不同之處在於在兩個基因盒之間不存在強化子(構築體7)，或存在強化子；構築體8具有強化子1(E1)，或構築體9具有強化子2(E2)，參見圖2。構築體10及構築體11為具有E1(構築體10)或E2(構築體11)之單一Cry2Ab基因盒。
轉型且轉移(R0)品系至土壤之後，進行廣泛分子、農藝及表現型分析來選擇用於進一步測試之品系。另外，品系為自花受粉的，且來自所選擇品系之所得種子用於田間及額外分子測試。
分子測試包括以下：測定複本數目之測定法、測定兩個含有Cry蛋白質之表現基因盒(構築體1、4、7、8及9)之完整性、Cry蛋白質編碼T-DNA基因盒(單一Cry蛋白質表現基因盒(構築體2、3、6、10或11)或兩個Cry蛋白質表現基因盒(構築體1、4、7、8或9))之存在的測定法；如藉由ELISA進行量測來測定蛋白質表現之測定法，及測定T-DNA表現基因盒之分離比率(1：2：1或1：3)之測定法。包括農藝測定法(就自構築體1、2及3產生之R0品系而言，藉由葉圓片生物測定法測定對兩個害蟲物種(黎豆夜蛾(黧豆毛蟲，VBC)及黃豆銀紋夜蛾(大豆尺蠖，SBL)之昆蟲效力)。R0植物生長至成熟，品系為自花受粉的，且測定每一品系之種子集(seed set)。
藉由用11個個別構築體轉型產生且轉移至土壤之R0品系的數目改變，且範圍在420個品系至大於5000個品系(參見表1)。對產生品系MON87751的用構築體1之轉型而言，總共1102個R0植物栽根至土壤中，自此等植物中，僅281個品系通過初始分子分析。藉由用構築體1之轉型產生的此等281個品系之額外分子、農藝及表現型分析僅產生經評估用於額外溫室分析之29個R1品系。
表1. 由十一種轉型構築體產生之R0品系，展示轉移至土壤之品
對自用構築體1之轉型產生且經評估用於進一步分析之29個R1品系而言，將R1種子種植在溫室中用於以測定法分析R1品系，該等測定法包括：(a)R1發芽(100%發芽)；(b)識別同型接合植物；(c)確認PCR分析，其中同型接合植物不再含有選擇/可評分標記物序列(其已獨立地分離)；(d)如藉由葉圓片生物測定法來測定對黃豆銀紋夜蛾(SBL)之昆蟲效力；及(e)如藉由葉圓片生物測定法來測定對秋夜盜蛾(秋行軍蟲，FAW)之昆蟲效力，(f)藉由對V7階段葉組織之ELISA分析之蛋白質表現，進階品系具有之Cry2Ab及Cry1A.105蛋白質含量超過>4ppm。除分子分析及昆蟲葉圓片生物測定法結果之外，收集來自四次選擇/品系之農藝表現型觀測結果及種子集。基於此等資料之全體，在農藝田間試驗及效力網室試驗中評估來自藉由用構築體1之轉型產生的R1品系中21個品系之R2種子。
實例2
農藝田間試驗係設計來評估表現Cry2Ab及Cry1A.105之大豆品系相較於對照A3555(親本背景)之表現型特徵及產率。在此等農藝田間試驗中，對照及品系為相對成熟度群3(RM3)之大豆品種A3555。在 隨機完整田塊設計(randomized complete block design,RCBD)下，歷經四季及兩個地理位置來實施試驗。在一地理位置中，在25個田間位點，在每一季節進行農藝田間試驗，且在第二地理位置中，在14個田間位點，在每一季節進行農藝田間試驗。所有試驗之種植及資料收集皆遵循標準農藝實踐規範。所收集資料包括露出分級、苗木活力、花期、花色觀測結果、表現型觀測結果、長軟毛顏色、成熟度、倒伏、植物高度、落粒評分、收穫日期、種子重量/試驗小區、種子水分/試驗小區及以每英畝蒲式耳數(bu/ac)計的產率。
對資料分析而言，由於收穫前品質問題(亦即，靜水、不足的土壤水分、露出不良、歸因於雹暴之晚季莢果落粒)而捨棄一些位置，或由於15%以上的變異係數(CV)及/或高位置品質指數(LQI)而捨棄一些位置。
跨於所有受測試位置，所獲取的表現型量測值指示：品系之農藝分級在對照A3555之正常範圍內。並未在所有位點獲取所有觀測結果，且例如露出量之一些資料可已獲收集，但產率未做測定，因為由於在收集早期表現型資料之後發生的問題而捨棄該位置。
對農藝田間試驗而言，藉由構築體1、2、3、4、5或6產生且在兩個地理位置中每一田間試驗所測試的品系之數目，及所測試之大豆品系世代(亦即R3、R4、R5、R6或R7)展示於表2中。
跨於每一季節、每一地理位置所測試之品系的農藝田間試驗及每一田間試驗測試平均產率(bu/acre)之統合分析(meta analysis)證明，品系MON87751產率相較於對照A3555之統計顯著增加(表2)。僅表現Cry2Ab之品系在產率上不具有相較於對照A3555之統計顯著差異，參見表3。僅表現Cry1A.105之品系在產率上具有相較於對照A3555之統計顯著降低，參見表3。
實例3
進行效力網室試驗來評估實驗性大豆品系抵抗網室包體中所含鱗翅類昆蟲害蟲族群之人工感染的效力，該實驗性大豆品系自具有兩個表現基因盒之單一構築體之T-DNA段插入物表現兩種Cry蛋白質(亦即，Cry2Ab及Cry1A.105二者)或表現單一Cry蛋白質(亦即，僅為Cry2Ab或僅為Cry1A.105)。單基因品系與雙基因品系之比較係用於測定每一單一Cry蛋白質對雙基因表現構築體品系中觀察到之效力的相對貢獻。網室試驗在兩個地理位置中多個季節期間進行。在一個地理位置中，測試5種標靶害蟲物種：黎豆夜蛾(黧豆毛蟲，VBC)、黃豆銀紋夜蛾(大豆尺蠖，SBL)、亞熱帶夜蛾(亞熱帶黏蟲，SAW)、秋夜 盜蛾(秋行軍蟲，FAW)及棉鈴蟲(大豆卷蛾，SPW)。在第二地理位置中，測試3種標靶害蟲物種：Crocidosema aporema(大豆梢蛾，BSM)、向日葵尺蠖(向日葵尺蠖，SFL)及秋夜盜蛾(秋行軍蟲，FAW)。
在此等網室試驗中測試之品系(亦即，條目)係自用獨立轉型構築體中每一者之轉型產生。在網室試驗中評估R2世代中自構築體1、2或3產生之轉型品系，且包括二十個表現兩種蛋白質之品系(自用構築體1之轉型產生之品系)、六個僅表現Cry2Ab之品系(自用構築體2之轉型產生之品系)及六個僅表現Cry1A.105之品系(自用構築體3之轉型產生之品系)。此等品系中，在網室試驗中評估R3世代中12個具有Cry2Ab及Cry1A.105二者之品系(構築體1)、兩個僅具有Cry2Ab之品系(構築體2)及三個僅具有Cry1A.105之品系(構築體3)。在R4世代網室試驗中進一步評估具有Cry2Ab及Cry1A.105二者之品系中的十一個品系(構築體1)。在R5、R6及R7網室試驗中評估三個具有Cry2Ab及Cry1A.105二者之品系(構築體1)、一個僅具有Cry2Ab之品系(構築體2)及一個僅具有Cry1A.105之品系(構築體3)。在網室試驗中評估R3世代中十個表現Cry2Ab及Cry1A.105之品系(自用構築體4之轉型產生之品系)、三個僅Cry2Ab品系(自用構築體5之轉型產生之品系)及三個僅Cry1A.105品系(自用構築體6之轉型產生之品系)。在R4網室試驗中評估兩個具有Cry2Ab及Cry1A.105二者之品系、一個僅具有Cry2Ab之品系及一個僅具有Cry1A.105之品系，且在R5網室試驗中評估各類品系中之一品系。在網室試驗中評估R2世代中三個在相反5’至3’定向上利用強化子情況下表現Cry2Ab及Cry1A.105二者之品系(自用構築體8之轉型產生之品系)、3個在相反5'至3'定向上不利用強化子情況下表現Cry2Ab及Cry1A.105二者之堆疊品系(自用構築體7之轉型產生之品系)，及2個僅Cry2Ab品系(自用構築體10之轉型產生之品系)。正的基 因轉殖大豆對照包括MON87701或品系GM_A19478(與MON87701同時產生)，且二者皆表現Cry1Ac。將非基因轉殖大豆系A3555(用於MON87751品系之親本背景，相對成熟度3(RM3))及A5547(用於MON87701及GM_A19478之親本背景，RM5)作為負對照納入所有網室及田間試驗中。在一些試驗中非基因轉殖大豆系AG3705係作為白花檢查物(white flower check)納入。
遵循標準實踐規範來建立及進行網室試驗。在每一感染之後於對負檢查物達到最大破壞時(通常為將蛹置放於網室內之後3至4週)對試驗小區評估一次。在每次評估時，記錄以下農藝觀測結果：植物生長之日期及階段。另外，對食葉昆蟲而言，記錄每一試驗小區中的所估計食葉百分比。對C.aporema而言，在每一試驗小區中隨機選擇十株植物，且記錄損傷植物之數目。在一些狀況下，亦記錄活幼蟲之數目。
使食葉資料經受ANOVA以便測定品系間可變性之顯著來源，且在每一位置以0.05概率度(P)對每一昆蟲進行重複。使用Tukey-Kramer檢定(Kramer 1956)以P=0.05來測定平均值間之顯著差異。
在第二地理位置中，在一個季節期間使用向日葵尺蠖及C.aporema進行感染來三個小試驗小區網室試驗。試驗設計包括隨機完整田塊設計(RCBD)測試塊，每個品系或對照進行三次重複，所測試品系展示於表4中。一個試驗用C.aporema在大豆生長之中間營養階段期間感染，且再次在大豆生長之早期生殖階段進行感染。兩個試驗用向日葵尺蠖在大豆生長之中間營養階段期間感染。
對C.aporema試驗而言，達成極高壓力。重複不為損傷可變性之顯著來源(F=0.8794；df=2、69；P=0.4196)，但品系為高度顯著的(F=11.9398；df=23、48；P<0.0001)。在負檢查物中損傷植物之最大百分比(表4)平均為83-100%，但Cry1Ac正對照中不存在損傷植物。自 轉型構築體1產生且表現Cry2Ab及Cry1A.105之品系顯示0-13%之損傷植物，而僅表現Cry2Ab或僅Cry1A.105之彼等品系分別顯示10-17%及10-13%之損傷植物。雖然為顯著的，但在此試驗中記錄為損傷之少數植物可歸因於在記錄損傷分級時由個人使用之準則。
對向日葵尺蠖試驗而言，在一個網室試驗中達成高壓力。重複不為食葉可變性之顯著來源(F=0.203；df=2、69；P=0.8176)，但品系為高度顯著的(F=20.2461；df=23、48；P<0.0001)。在負檢查物中最大食葉量(表4)平均為60-63%，但Cry1Ac正對照及自表現Cry2Ab+Cry1A.105之轉型構築體1產生之品系或僅表現Cry2Ab之轉型構築體2產生之品系中不存在食葉。自僅表現Cry1A.105之轉型構築體3產生之品系顯示輕微較高的食葉量(4-10%)。在評估向日葵尺蠖之第二網室試驗中達成中等高壓力。在任一試驗中重複不為食葉可變性之顯著來源(F=0.2542；df=2、69；P=0.7763)，但品系為高度顯著的(F=16.1793；df=23、48；P<0.0001)。在負檢查物中最大食葉量(表4)平均為38-40%，但在Cry1Ac正對照中食葉量可忽略(4%)，且在用構築體1產生且表現Cry2Ab+Cry1A.105之品系或用構築體2產生且僅表現Cry2Ab之品系中不存在食葉量。用構築體3產生且僅表現Cry1A.105之品系顯示輕微較高的食葉量(2-7%)。
在此等網室試驗中，大豆品系MON87751顯示無歸因於害蟲C.aporema或向日葵尺蠖之感染的損傷植物，此相較於同一試驗中之對照的損傷及/或食葉量而言為顯著的(表4)。
在第二地理位置中進行的後續季節之小試驗小區網室試驗中，使用向日葵尺蠖、C.aporema及秋夜盜蛾之地方實驗室族群進行感染。用於進行試驗之協定基本上如上所述，且所測試之品系及對照展示於表5中。
對用C.aporema感染之試驗而言，達成高壓力。重複不為損傷可變性之顯著來源(F=0.2742；df=2、33；P=0.7619)，但品系為高度顯著的(F=8.2313；df=11、24；P<0.0001)。在負檢查物中每個植物之最大損傷平均為4.2-5.5個損傷點，其中80-100%之植物顯示損傷，但在正對照及所有測試品系中為可忽略的(表5)。
對用向日葵尺蠖感染之試驗而言，達成中等高壓力。重複不為損傷可變性之顯著來源(F=0.041；df=2、33；P=0.9599)，但品系為高度顯著的(F=143.5526；df=11、24；P<0.0001)。在負檢查物中最大損傷平均為33.3-40.0%食葉量(遠遠高於經濟閾限)，且在正對照及所有測試品系中不存在損傷或損傷可忽略，藉由用僅表現TIC105之構築體6的轉型產生之品系例外(表5)。
對用秋夜盜蛾感染之試驗而言，達成輕微壓力。重複不為損傷可變性之顯著來源(F=0.1187；df=2、33；P=0.8884)，但品系為高度顯著的(F=12.8602；df=11、24；P<0.0001)。在負檢查物中最大損傷平均為7.5-15.0%食葉量-恰好達到經濟閾限。亦在藉由用構築體2或構築體5之轉型產生的僅表現Cry2Ab之品系中注意到一些損傷，但在正對照及所有其他測試品系中不存在損傷或損傷可忽略(表5)。
在此等網室試驗中，大豆品系MON87751顯示無歸因於害蟲C.aporema、向日葵尺蠖或秋夜盜蛾之感染的損傷植物，此在相較於對同一試驗中之負對照的損傷時為顯著的(表5)。當相較於藉由用僅表現Cry1A.105之構築體6的轉型產生之基因轉殖大豆品系時，大豆品系MON87751具有來自向日葵尺蠖之顯著較少損傷(表5)，儘管注意到：在藉由用構築體6的轉型產生之品系中存在Cry1A.105蛋白質之較低表現。此等結果亦第一次證明對害蟲秋夜盜蛾之擴展範圍的控制。
在第一地理位置中，使用棉鈴蟲之實驗室族群感染來進行一個小試驗小區網室試驗。試驗設計包括隨機完整田塊設計(RCBD)測試塊，每個品系進行三次重複，所測試品系及對照展示於表6中。存在兩次棉鈴蟲感染，且在第一感染之感染後19至27天(大豆生長之R2-R3階段)且在第二感染之感染後25至28天(大豆生長之R5階段)評鑑食葉。來自測試害蟲棉鈴蟲之網室試驗之結果如下：達成高壓力。重複不為食葉可變性之顯著來源(F=0.326；df=2、105；P=0.7225)，但品系為高度顯著的(F=13.8864；df=35、72；P<0.0001)。在負檢查物中最大食葉量(表6)平均為32-33%，但Cry1Ac正對照(1%)及用構築體1產生且表現Cry2Ab+Cry1A.105之品系中食葉量可忽略(2-4%)。在用表現 Cry2Ab+Cry1A.105之構築體4產生之品系(5-12%)中，在用僅表現Cry2Ab之構築體5產生之品系中(13-17%)，或在用僅表現Cry1A.105之構築體6產生之品系(8-12%)中觀察到稍微較高的食葉量。
大豆品系MON87751在此網室試驗中顯示相較於同一試驗中之負對照的破壞時顯著較少的損傷。對棉鈴蟲之此種控制程度在對該大豆害蟲物種之可接受商業控制程度內。另外，在此網室試驗中，大豆品系MON87751具有相較於用僅表現Cry2Ab之構築體5產生之基因轉殖大豆品系而言顯著較少損傷(表6)，證明擴展的控制程度。然而，Cry2Ab之表現在用構築體5產生之品系中比在用構築體2產生之品系中低，且用僅表現Cry2Ab之構築體5產生之品系的顯著食葉量可指示：用構築體5產生之Cry2Ab對棉鈴蟲之效力可降低。
在第一地理位置中進行的另一季節之小試驗小區網室試驗中，測試對來自害蟲亞熱帶夜蛾(第一齡蟲或第三齡蟲)、黎豆夜蛾(第一齡蟲)及黃豆銀紋夜蛾(第一齡蟲)之實驗室族群的感染之抗性。來自此等試驗之結果如下：以第一齡蟲亞熱帶夜蛾達成極端壓力，且以黎豆夜蛾達成中等壓力。黎豆夜蛾(第一齡蟲)及亞熱帶夜蛾(第一齡蟲)幼蟲引起之最大食葉百分比(平均值±S.E.)報導於表7。
對測試黃豆銀紋夜蛾(第一齡蟲)及亞熱帶夜蛾(第三齡蟲)之試驗而言，兩種害蟲皆達成極端壓力。在此等人工感染網室中黃豆銀紋夜蛾(第一齡蟲)幼蟲及亞熱帶夜蛾(第三齡蟲)幼蟲引起之最大食葉百分比(平均值±S.E.)報導於表8。
此等網室試驗之結果展示：大豆品系MON87751在相較於對同一試驗中之負對照的損傷時顯示亞熱帶夜蛾(第一齡蟲或第三齡蟲)、黎豆夜蛾(第一齡蟲)或黃豆銀紋夜蛾(第一齡蟲)引起之顯著較少損傷(表7及表8)。另外，在此等網室試驗中，大豆品系MON87751在相較於表現Cry1Ac之基因轉殖大豆品系時具有亞熱帶夜蛾(第一齡蟲及第三齡蟲)幼蟲引起之顯著較少損傷(表7及表8)，證明品系MON87751較用於鱗翅類昆蟲害蟲控制之當前可利用基因轉殖大豆品系而言的擴展效能。另外，在此等網室試驗中，大豆品系MON87751在相較於[1]用構築體4、5或6產生之品系(第三齡蟲幼蟲)或用僅表現Cry1A.105品系之構築體6產生之品系(第一齡蟲幼蟲)或用僅表現Cry1A.105品系之構築體3產生之品系(第一齡蟲幼蟲及第三齡蟲幼蟲)中任何品系時，且[2] 在相較於在無強化子情況下用表現Cry2Ab及Cry1A.105之構築體7產生之品系(第一齡蟲及第三齡蟲幼蟲)時具有亞熱帶夜蛾幼蟲引起之顯著較少損傷，證明品系MON87751較用構築體4、5、6或7產生之品系優異效能(表7及表8)。
實例4
進行敞田效力試驗來評估實驗性大豆品系MON87751及使用不同轉型構築體1、2、3、4、5及6產生之品系對鱗翅類昆蟲害蟲族群之天然田間感染之效力。使用對用構築體2或5產生之品系(僅表現Cry2Ab)及用構築體3或6產生之品系(僅表現Cry1A.105)與用構築體1或4產生之品系(表現Cry1Ab及Cry1A.105二者)的比較來測定每一單一Cry蛋白質(亦即僅Cry2Ab或僅Cry1A.105)對自單一構築體表現兩種Cry蛋白質(亦即Cry2Ab及Cry1A.105)之品系中觀察到的效力之相對貢獻。歷經多個季節、在多個田間試驗位點及在三個地理位置中進行地方性大豆害蟲之天然族群之效力田間試驗。
在一個地理位置中進行的初始效力田間試驗中，所評估之品系(亦即，條目)包括十二個藉由構築體1產生且表現兩種Cry蛋白質Cry2Ab及Cry1A.105之品系(且包括品系MON87751)、兩個藉由構築體2產生且僅表現Cry2Ab之品系，及三個藉由僅表現Cry1A.105之構築體3產生之品系。在第二地理位置中進行的初始效力田間試驗中，評估藉由構築體1、2及3產生之品系且該等品系包括11個表現兩種Cry蛋白質Cry2Ab及Cry1A.105之品系(自用構築體1之轉型產生且包括品系MON87751)、兩個僅表現Cry2Ab之品系(自用構築體2之轉型產生之品系)，及三個僅表現Cry1A.105之品系(自用構築體3之轉型產生之品系)。在3個地理位置中進行的第二季節效力田間試驗中，所評估之品系(亦即，條目)包括三個表現兩種Cry蛋白質Cry2Ab及Cry1A.105之品系(自用構築體1之轉型產生且包括品系MON87751之品系)、一個僅表 現Cry2Ab之品系(自用構築體2之轉型產生之品系)，及一個僅表現Cry1A.105之品系(自用構築體3之轉型產生之品系)。在敞田效力試驗中評估之品系包括世代R3至R7。
對每一效力田間試驗位點而言，耕植測試田塊且允許發生標靶鱗翅類昆蟲昆蟲之天然害蟲族群之天然感染。測試田塊保持不用用於標靶害蟲(鱗翅類昆蟲)之殺蟲劑處理。然而，測試田塊可已獲噴灑來防止非標靶害蟲之顯著損傷。所有實驗性品系為相對成熟度群3(RM3)之大豆胚質背景A3555。試驗中之其他條目包括正對照MON87701(表現Cry1Ac)或GM_A19459(RM5)；負親本檢查物A3555(紫花，RM3)；及負商業檢查物A5547(白花，MG5)或CMA5805(白花，RM5)。
遵循標準實踐規範來建立及進行敞田效力試驗。以標靶鱗翅類昆蟲攻擊活動開始且在標靶鱗翅類昆蟲活動停止或植物達到R7生長階段時結束，週期性地(亦即每5至14天)記錄鱗翅類昆蟲害蟲之幼蟲發生率、食葉量及植物生長階段。自第1及4列收集害蟲發生率資料，以便避免第2及3列中植物之損傷，該第2及3列中之植物係收穫來獲得產率資料。如下監視及記錄所發生之害蟲發生率資料：使用罩布或垂直拍打布單(beating sheet)監視食葉鱗翅類昆蟲(亦即黎豆夜蛾、黃豆銀紋夜蛾、向日葵尺蠖、夜盜蛾屬)，其中每個試驗小區至少兩個罩布或四個垂直拍打布單樣本。對遇到的每一標靶物種而言，記錄所遇到每一標靶物種之幼蟲總數及每一試驗小區內樣本之數目，該記錄以每m列之平均幼蟲數目(幼蟲總數÷樣本數目÷以公尺計算的布/床單長度)來實施。以在每一試驗小區之同一區域中避免重複取樣之方式來進行後續取樣。在一個地理位置處進行的效力田間試驗中，亦藉由隨機選擇20或33株植物/位置及記錄幼蟲取食損傷數目來記錄兩個試驗位點處藉由棉鈴蟲引起之機會性損傷之資料。在第二地理位置處，藉 由每個試驗小區隨機選擇10株植物及記錄每株植物之莢果總數及損傷數目來就棉鈴蟲而言對一個試驗進行機會性分級。
藉由計算每一試驗小區中具有歸因於幼蟲取食之損傷(枯萎、垂死或死亡)的植物總數來記錄小玉米秸螟引起之感染資料。當注意到最大損傷時，在單一時間點獲取針對此昆蟲之損傷資料。
除標靶害蟲之外，藉由在測試田塊內之隨機選擇位置處的掃網、改進掃網或地布週期性地監視非標靶害蟲，即主要為具有超過經濟閾限之潛力的彼等害蟲(例如臭蟲)，且進行評鑑以測定其是否達到或接近經濟損害程度
在試驗成熟度下，收穫每一試驗小區之第2及3列之整體長度，且記錄每一試驗小區之總重量及水分百分比二者。在收穫期間，注意到所收穫列中顯著的間隙(植物未彼此觸碰)，且記錄此等間隙之總長度。在將種子重量校正至13%水分之後計算產率。使幼蟲發生率、食葉量及產率資料經受ANOVA以便測定品系間可變性之顯著來源，且對每一位置以0.05概率度(P)進行重複。使用Tukey-Kramer檢定(Kramer 1956)以P=0.05來測定平均值間之顯著差異。
在田間試驗位點1處進行的敞田試驗中，首先在R3生長階段遇到食葉毛蟲，且在R6生長階段時增加至中等損傷程度。所遇到的物種包括黎豆夜蛾(98%)、向日葵尺蠖(2%)及夜盜蛾屬(1%)。重複不為幼蟲發生率可變性(F=0.0435；df=2、57；P=0.9575)、食葉可變性(F=0.0807；df=2、57；P=0.9226)或產率可變性(F=0.0213；df=2、57；P=0.979)之顯著來源，但品系對所有三者而言為高度顯著的(幼蟲發生率：F=69.6956；df=19、38；P<0.0001；食葉量：F=25.9918；df=19、40；P<0.0001；產率：F=3.357；df=19、38；P=0.0007)。在負檢查物中累積幼蟲發生率(表9)達到每m列139-189只幼蟲，而事實上在基因轉殖條目之任何條目中未遇到幼蟲。在負檢查物中最大食葉 量(表9)平均為21-27%，且在所有基因轉殖條目中不存在食葉。在兩個負檢查物中產率(表9)相對於所有基因轉殖條目而言減少，儘管產率可變性減小此等減少量之顯著性。
品系MON87751具有相較於非基因轉殖對照時顯著較小的食葉鱗翅類昆蟲幼蟲發生率(季節累積值)及顯著較小的食葉百分比(季節最大值)。
在田間試驗位點2處進行的另一敞田試驗中，首先在生長之晚期營養階段遇到食葉毛蟲，且在R3生長階段時增加至高度損傷程度。所遇到的物種包括黎豆夜蛾(53%)、「尺蠖」(可能為黃豆銀紋夜蛾，但也可能為向日葵尺蠖)(44%)及夜盜蛾屬(3%)。重複不為幼蟲發生率可變性(F=0.0085；df=2、57；P=0.9915)或食葉可變性(F=0.0027；df=2、57；P=0.9973)之顯著來源，但品系對兩者而言為高度顯著的(幼蟲發生率：F=19.644；df=19、40；P<0.0001；食葉量：F=671.3147；df=19、40；P<0.0001)。在負檢查物中累積幼蟲發生率(表10)達到每m列43-50只幼蟲，而在基因轉殖條目中遇到可忽略數目之幼蟲。在負檢查物中最大食葉量(表10)平均為87-90%，而所有基因轉殖條目中觀察到不超過痕量級之食葉量。
品系MON87751具有相較於非基因轉殖對照時顯著較小的食葉鱗翅類昆蟲幼蟲發生率(季節累積值)及顯著較小的食葉百分比(季節最大值)。
在田間試驗位點3處進行的另一敞田試驗中，重複不為每株植物之總莢果可變性(F=0.312；df=2、24；P=0.7349)或損傷莢果可變性(F=0.0438；df=2、24；P=0.9572)或產率可變性(F=0.2221；df=2、24；P=0.8025)之顯著來源。然而，品系為每株植物之總莢果可變性(F=4.3643；df=8、18；P=0.0045)及損傷莢果可變性(F=34.5288；df=8、18；P<0.0001)之顯著來源，儘管不為產率可變性(F=0.6237，df=8、18，P=0.7475)之顯著來源。負檢查物平均每株植物25.0-26.0個莢果，其中30.8-31.0%為損傷莢果，而包括品系MON87751之測試品 系平均每株植物28.9-38.9個莢果，其中<2%為損傷莢果(表11)。在負檢查物中每株植物之數目較少的莢果或許為藉由卷蛾損傷引起之過早莢果脫落的結果，因為在負檢查物(而非測試品系)中觀察到許多損傷莢果落在植物之下的地面上(表11)。
在田間試驗位點4處進行的敞田試驗中，在R3生長階段遇到食葉毛蟲，且在R6-R7生長階段時增加至高度損傷程度。所遇到的物種包括黎豆夜蛾(77%)、苜蓿綠夜蛾(Plathypena scabra)(苜蓿綠夜蛾(green cloverworm))(17%)及黃豆銀紋夜蛾(6%)。重複不為幼蟲發生率可變性(F=0.0219；df=2、69；P=0.9783)、食葉可變性(F=0.0007；df=2、69；P=0.9993)或產率可變性(F=1.1477；df=2、69；P=0.3233)之顯著來源。品系對所有三者為顯著至高度顯著的(幼蟲發生率：F=96.9673；df=23、48；P<0.0001；食葉量：F=363.8854；df=23、48；P<0.0001；產率：F=1.7814；df=23、48；P=0.046)。在 負檢查物中累積幼蟲發生率(表12)達到每m列117-123只幼蟲，而事實上在基因轉殖條目中任何條目中未遇到幼蟲。在負檢查物中最大食葉量(表12)平均為68-83%，且在包括品系MON87751之所有基因轉殖條目中不存在食葉。
在田間試驗位點5處進行的另一敞田試驗中，首先在R2生長階段遇到食葉毛蟲，且在R5-R6生長階段期間增加至高度損傷程度。所遇到的物種包括黎豆夜蛾(93%)、黃豆銀紋夜蛾(5%)及黃條黏蟲(2%)。重複不為幼蟲發生率可變性(F=0.0206；df=2、69；P=0.9796)、食葉可變性(F=0.0054；df=2、69；P=0.9946)或產率可變性(F=0.2379； df=2、69；P=0.7889)之顯著來源。品系對所有三者為高度顯著的(幼蟲發生率：F=122.46；df=23、48；P<0.0001；食葉量F=623.0217；df=23、48；P<0.0001；產率：F=2.9366；df=23、48；P=0.0008)。在負檢查物中累積幼蟲發生率(表13)達到每m列76-137只幼蟲，而事實上在基因轉殖條目中任何條目中未遇到幼蟲。在負檢查物中最大食葉量(表13)平均為82-88%，且在包括品系MON87751之所有基因轉殖條目中不存在食葉。
在田間試驗位點6處進行的另一敞田試驗中，在R6生長階段期間 遇到食葉毛蟲(主要為棉鈴蟲及黃豆銀紋夜蛾)，但始終未達到高度顯著數目。然而，在季節早期，在邊界、緩衝帶及負檢查中發生小玉米秸螟引起的對植物之實質損傷，從而在R5-R6生長階段時導致枯萎、垂死及死亡植物，在該時間記錄損傷資料。重複不為小玉米秸螟引起之植物損傷之顯著來源(F=0.3431；df=2、69；P=0.71)。品系對小玉米秸螟引起之植物損傷而言為高度顯著的：F=16.7555；df=23、48；P<0.0001)。在負檢查物中小玉米秸螟引起之植物損傷百分比(表14)平均為10-28%，而包括品系MON87751之任何基因轉殖條目中之植物未顯示損傷。
在田間試驗位點7處進行的另一敞田試驗中，首先在R1-R2生長 階段遇到食葉毛蟲，且在R4-R6生長階段時增加至高度損傷程度。所遇到的物種包括黃豆銀紋夜蛾(54%)、甜菜葉蛾(43%)及鹽澤燈蛾(2%)。重複不為幼蟲發生率可變性(F=0.0866；df=2、69；P=0.9172)或食葉可變性(F=0.1129；df=2、69；P=0.8934)之顯著來源。品系對兩者而言為高度顯著的(幼蟲發生率：F=69.918；df=23、48；P<0.0001；食葉量：F=21.6603；df=23、48；P<0.0001)。在負檢查物中累積幼蟲發生率(表15)達到每m列152-166只幼蟲，而事實上在Cry1Ac正對照或用表現Cry2Ab及/或Cry1A.105之構築體1、2或3產生之品系中未遇到幼蟲。在負檢查物中之最大食葉量(表15)平均為24%，但用表現Cry2Ab及/或Cry1A.105之構築體1、2或3產生的包括品系MON87751之品系或Cry1Ac正對照中食葉量不超過痕量級。
在田間試驗位點8處進行的另一敞田試驗中，在R4-R6生長階段期間發生食葉毛蟲黃豆銀紋夜蛾(41%)、黎豆夜蛾(38%)、秋夜盜蛾(13%)及黃條黏蟲(8%)引起之中等壓力。重複不為幼蟲發生率可變性(F=0.0924；df=3、52；P=0.9639)或食葉可變性(F=0.372；df=3、52；P=0.7735)之顯著來源。品系為幼蟲發生率可變性(F=40.008，df=13、42，P<0.0001)及食葉可變性(F=11.9356，df=13、42，P<0.0001)之顯著來源。在負檢查物中累積幼蟲發生率及最大食葉量分別平均為每m列9.1-13.9只幼蟲及31-35%(後者適度地高於經濟閾限)，但在正對照及包括品系MON87751之所有測試品系中不超過痕量(表16)。在試驗中未注意到非標靶害蟲之顯著發生。
在田間試驗位點6處進行的第二季節敞田試驗期間，在R3-R5生長階段期間發生棉鈴蟲引起之極高壓力。重複不為損傷莢果可變性之顯著來源(F=0.0280；df=3、52；P=0.9936)。品系為損傷莢果可變性 之顯著來源(F=15.4758，df=13、42，P<0.0001)。負檢查物平均為64-78%損傷莢果，而在包括品系MON87751之測試品系的任何品系中事實上未發生損傷(表17)。
此實例中描述之多個敞田試驗之結果與多個網室試驗(實例3中所述)之結果組合進一步確認：對藉由構築體1、2或3跨於五個植物世代(R2至R7)產生之基因轉殖大豆品系所遇到的所有鱗翅類昆蟲大豆害蟲之幼蟲族群的有效、季節長期抑止，暗示世代內及跨世代之穩定轉殖基因表現。
組合結果證明：在所有四種主要標靶害蟲(一個地理位置中為黎豆夜蛾及黃豆銀紋夜蛾，且第二地理位置中為相同標靶害蟲加向日葵尺蠖及Crocidosema aporema)之以上閾限壓力條件下，用構築體1、2或3產生的包括品系MON87751之基因轉殖品系之效力等效於表現 Cry1Ac及先前已證明控制大豆之鱗翅類昆蟲害蟲之基因轉殖品系。用構築體2或3產生且分別僅表現Cry2Ab蛋白質或僅表現Cry1A.105蛋白質之品系亦證明：與表現Cry1Ac蛋白質之基因轉殖品系等效的效力，暗示品系MON87751中兩種Cry2Ab及Cry1A.105蛋白質之表現已經由改良抗蟲性管理而改良Cry1Ac基因轉殖品系之耐久性。
用構築體1產生的包括品系MON87751之品系間的等效效力亦已證明抵抗許多次要標靶害蟲，包括三個行軍蟲物種(甜菜葉蛾、秋夜盜蛾及亞熱帶夜蛾)、兩種heliothine卷蛾(棉鈴蟲及H.gelotopeon)、一種鑽柄昆蟲(小玉米秸螟)及一種食葉蟲(苜蓿綠夜蛾)。
實例5
此實例描述品系MON87751之分子表徵，其包括蛋白質表現及廣泛分子表徵。對在農藝田間試驗、效力網室試驗及效力田間試驗中測試的品系並行地完成此分子表徵。
對品系MON87751之分子表徵而言，使用南方分析及終點TAQMAN®測定法之組合來測定轉殖基因插入序列(包含Cry2Ab及Cry1A.105基因盒二者，SEQ ID NO：9)之複本數目。分子分析確認：僅存在單一插入物(含有用於Cry2Ab及Cry1A.105蛋白質二者之表現基因盒且由SEQ ID NO：9表示的T-DNA表現基因盒)，未偵測到載體主鏈，且未偵測到含有選擇/可評分標記物序列之T-DNA基因盒。品系MON87751基因組DNA中單一插入物(SEQ ID NO：9)之完整序列確認：該序列與轉型構築體之序列一致。
對蛋白質表現而言，自植物收集對品系MON87751對偶基因而言為同型接合之葉樣本，且自凍乾樣本製備提取物，按量測Cry2Ab或Cry1A.105之蛋白質含量的標準協定，用分別對Cry2Ab或Cry1A.105特異之抗體進行ELISA，且結果表示為乾重百萬分率(ppm)。在植物生長之R1及R3階段，就藉由用構築體1、2或3之轉型產生之品系及非 基因轉殖對照A3555來收集葉樣本。ELISA結果指示：自構築體1及構築體2產生之品系的Cry2Ab含量在約20ppm至約50ppm乾重之範圍內變化，品系8例外(其經測定具有來自可選擇/可評分標記物T-DNA之經連接病毒啟動子，但無其他序列，且未進一步評估品系8)，且無來自用構築體3(僅表現Cry1A.105)產生之品系或非基因轉殖對照的Cry2Ab表現(圖3A)。另外，R1及R3生長階段之Cry2Ab蛋白質表現程度大致相等。ELISA結果指示：自構築體1及構築體3產生之品系的Cry1A.105含量在約150ppm至800ppm乾重之範圍變化，且無來自用構築體2(僅表現Cry2Ab)產生之品系或非基因轉殖對照的Cry1A.105表現(圖3B)。另外，R3生長階段相較於R1生長階段，葉樣本之Cry1A.105蛋白質表現程度變化範圍更高。
額外ELISA結果展示：來自用構築體1產生之品系的Cry2Ab蛋白質含量相對於用構築體5或構築體4產生之品系較高，且如預期，對非基因轉殖對照或用構築體6(僅表現Cry1A.105)產生之品系未偵測到Cry2Ab(圖4A)。在同一組葉樣本中，ELISA結果展示：在相較於用構築體6或構築體4產生之品系時，用構築體1產生之品系存在兩倍或更高程度的Cry1A.105表現，MON87751表現大致高四倍，且如預期，對非基因轉殖對照或用構築體5(僅表現Cry2Ab)產生之品系未偵測到Cry1A.105表現(圖4B)。對此等ELISA而言，自在兩個獨立的效力網室試驗位置每一者處生長之植物的R3生長階段收集葉樣本。
另外，ELISA結果展示：來自用構築體1產生之品系及用構築體2產生之品系的提取物中之Cry2Ab蛋白質含量a)相對於用構築體4、構築體5或構築體7產生之品系較高；b)相對於用構築體9或構築體11產生之品系大致相同或稍微較低；及c)如預期，對非基因轉殖對照(未圖示)或用構築體3或構築體6(僅表現Cry1A.105)產生之品系未偵測到Cry2Ab(圖5)。對此等ELISA而言，在R3及R5生長階段收集葉樣本， 且對用構築體1及構築體2產生之品系而言，R5生長階段之Cry2Ab含量較高，且用構築體9及構築體11產生之品系中之Cry2Ab含量較高(圖5)。在同一組葉樣本中，ELISA結果展示：來自用構築體1及構築體3產生之品系的提取物中之Cry1A.105蛋白質含量相對於用構築體4、構築體6、構築體9或構築體7產生之品系顯著較高，且如預期，對非基因轉殖對照(未圖示)或用構築體2或構築體5(僅表現Cry2Ab)產生品系未偵測到Cry1A.105(圖6)。對此等ELISA而言，在R3及R5生長階段收集葉樣本，且對用構築體1及構築體3產生之品系而言，在R5生長階段之Cry1A.105含量相較於用構築體4、構築體6、構築體9或構築體7產生之品系大約在較高量值，參見圖6A以0-5000ppm乾重繪製的Y軸及圖6B以0-500ppm乾重繪製的Y軸。ELISA資料指示：在用構築體1產生之品系中存在相較於用構築體4、構築體7或構築體9產生之品系的較高Cry2Ab及Cry1A.105表現，且全部含有兩個Cry蛋白質表現基因盒-一個表現基因盒編碼Cfy2Ab且一個表現基因盒編碼Cry1A.105。另外，應注意，用構築體1(包括品系MON87751)、構築體2及構築體3產生之品系中相對高的蛋白質表現歷經至少4個大豆世代(R0、R1、R2及R3)為穩定的，且在R3至R5生長階段，就同型接合品系收集之葉組織中Cry1A.105蛋白質含量增加。
實例6
此實例描述適用於識別大豆樣本中品系MON87751 DNA之存在的方法。一對PCR引子及探針係設計來達成識別於基因組DNA與品系MON87751之經插入DNA之任意指定3’端(亦即3’接頭)之間形成的獨特接頭之目的，且涵蓋於SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6。
寡核苷酸前向引子SQ20267之序列(SEQ ID NO：11)與相應於SEQ ID NO：10之位置11400至11426，及SEQ ID NO：8之位置212至238，及 SEQ ID NO：9之位置10066至10092之核苷酸序列一致。寡核苷酸反向引子SQ25826之序列(SEQ ID NO：12)與相應於SEQ ID NO：10之位置11454至11479，及SEQ ID NO：8之位置266至291，及SEQ ID NO：6之位置51至76，及SEQ ID NO：4之位置31至56之核苷酸序列的反向補體一致。寡核苷酸探針PB10263之序列(SEQ ID NO：13)與相應於SEQ ID NO：10之位置11428至11446，及SEQ ID NO：9之位置10094至10112，及SEQ ID NO：8之位置240至258，及SEQ ID NO：6之位置25至43，及SEQ ID NO：4之位置5至23之核苷酸序列一致。PCR引子SQ20267(SEQ ID NO：11)及SQ25826(SEQ ID NO：12)在品系MON87751之右接頭處擴增具有獨特基因組/插入DNA之80個核苷酸擴增子。具有可經螢光標記(例如6FAMTM螢光標記)之探針PB10263(SEQ ID NO：13)的此相同引子對可用於終點TaqMan® PCR測定法來識別樣本中來源於品系MON87751之DNA的存在。
除SQ20267(SEQ ID NO：11)、SQ25826(SEQ ID NO：12)及PB10263(SEQ ID NO：13)之外，熟習此項技術者應明白：其他引子及/或探針可設計來擴增及/或雜交SEQ ID NO：10內之序列，該等序列對樣本中來源於品系MON87751之DNA的存在為獨特的且適用於偵測其存在。
遵循標準分子生物學實驗室實踐規範，開發用於偵測樣本中品系MON87751 DNA之用於品系識別的PCR測定法。標準PCR測定法或TaqMan® PCR測定法之參數係利用用於偵測樣本SQ20267(SEQ ID NO：11)、SQ25826(SEQ ID NO：12)及PB10263(SEQ ID NO：13)中來源於品系MON87751之DNA的存在的每一組引子對及探針(亦即用諸如6FAMTM之螢光標記來標記的探針)來最佳化。用於PCR反應之對照包括內部對照引子及內部對照探針(例如經VICTM標記)，其對大豆基因組中單一複本基因為特異的。熟習此項技術者將知曉如何設計對大豆 基因組中單一複本基因為特異的。通常，就偵測樣本中品系MON87751 DNA來最佳化的參數包括引子及探針濃度、模板DNA之量及PCR擴增循環參數。模板DNA樣本及對照如下：[1]自欲分析之葉樣本或單一種子樣本提取的DNA；[2]負對照DNA(非基因轉殖大豆DNA)；[3]負水對照(無模板)；及[4]正對照MON87751 DNA。熟習此項技術者已知的產生識別樣本中品系MON87751 DNA之擴增子的其他方法在此項技術之技藝水平內。
接合子型式測定法適用於測定包含品系之植物：是否對在染色體對之每一染色體上之相同位置中包含外源DNA之品系DNA為同型接合的；或是否對在染色體對之僅一個染色體上包含外源DNA之品系DNA為異型接合的；或是否缺少品系DNA，亦即是否為野生型。終點TAQMAN®熱擴增方法係用於開發用於品系MON87751之接合子型式測定法。對此測定法而言，三個引子及兩個探針與用於測定法之樣本一起混合。三個引子為：SQ20267(SEQ ID NO：11)，其雜交經插入外源DNA之3'區且自其特異地延伸；引子SQ27115(SEQ ID NO：14)，其雜交側接經插入外源DNA之3'側之大豆基因組DNA雜交且自其特異地延伸；及引子SQ26901(SEQ ID NO：15)，其雜交側接經插入外源DNA之5'側之大豆基因組DNA且自其特異地延伸。引子SQ20267及SQ27115及探針PB10263(SEQ ID NO：13)(經6-FAMTM標記)在模板DNA中存在經插入外源DNA之複本(亦即品系MON87751)時有診斷性。引子SQ26901及SQ27115及探針PB11254(SEQ ID NO：16)(經VICTM標記)在基因組DNA中不存在經插入外源DNA之複本(亦即野生型)時有診斷性。當三個引子及兩個探針在PCR反應中與自對品系MON87751為同型接合之植物提取的DNA一起混合時，存在僅來自6-FAMTM標記之探針PB10263的螢光信號，其指示對品系MON87751為同型接合之植物且對該植物有診斷性。當三個引子及兩個探針在PCR 反應中與自對品系MON87751為異型接合之植物提取的DNA一起混合時，存在來自6-FAMTM標記之探針PB10263及VICTM標記之探針PB11254的螢光信號，其指示對品系MON87751為異型接合之植物且對該植物有診斷性。當三個引子及兩個探針在PCR反應中與自缺少品系MON87751之植物(亦即野生型)提取的DNA一起混合時，存在僅來自VICTM標記之探針PB11254的螢光信號，其指示缺少品系MON87751之植物(亦即野生型)且對該植物有診斷性。模板DNA樣本及對照如下：[1]自欲分析之葉樣本或單一種子樣本提取的DNA；[2]負對照DNA(非基因轉殖大豆DNA)；[3]負水對照(無模板)；及[4]來自已知異型接合樣本之正對照MON87751基因組DNA；及[5]來自已知同型接合樣本之正對照MON87751基因組DNA。
實例7
以下實例描述可如何識別使用大豆品系MON87751之任何育種活動之後代內的MON87751品系。
DNA品系引子對係用於產生對大豆品系MON87751有診斷性之PCR擴增子。對MON87751有診斷性之擴增子包含至少一個接頭序列，如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所提供。產生用於MON87751之診斷擴增子之引子對包括基於側接序列及經插入表現基因盒(SEQ ID NO：9)的引子對。為獲得其中存在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5之診斷擴增子，將設計基於SEQ ID NO：7之鹼基1至1334的前向引子分子及基於經插入表現基因盒DNA序列(SEQ ID NO：9之位置1至10119)之反向引子分子，其中引子分子具有足夠長度的鄰接核苷酸以便特異地雜交至SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：9。為獲得其中存在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6之診斷擴增子，將基於經插入表現基因盒DNA序列(SEQ ID NO：9之位置1至10119)之前向引子分子 及基於3’側接序列(SEQ ID NO：8之位置266至1452)之反向引子分子，其中引子分子具有足夠長度的鄰接核苷酸以便特異地雜交至SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：9。
用於此分析之擴增條件之實例例示於實例4中。然而，此等方法之任何修改或產生對MON87751有診斷性之擴增子的DNA引子之使用在此項技術之範圍內，該等DNA引子與SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或MON87751之轉殖基因插入物(SEQ ID NO：9)中含有的遺傳元件之DNA序列同源或互補。診斷擴增子包含與至少一個轉殖基因/基因組接頭DNA(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6)或其實質部分同源或互補的DNA分子。或者，診斷擴增子包含與至少一個獨特轉殖基因序列(SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23)同源或互補的DNA分子。
用於品系MON87751植物組織樣本之分析應包括來自品系MON87751之正組織對照、來自不為品系MON87751(例如但不限於A3555)之大豆植物之負對照，及不含有大豆基因組DNA之負對照。將擴增內源大豆DNA分子之引子對將充當用於DNA擴增條件之內部對照。額外引子序列可藉由熟習DNA擴增方法之技術者選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，且藉由實例4中所示之方法來選擇用於產生擴增子之條件可不同，但皆產生對品系MON87751 DNA有診斷性之擴增子。使用此等DNA引子序列並利用對實例4之方法的修改在本發明之範疇內。藉由來源於SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之至少一個DNA引子序列產生的對MON87751有診斷性之擴增子為本發明之態樣。
含有至少一個具有來源於SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9之足夠長度的鄰接核苷酸之DNA引子的DNA偵測套組為本發明 之態樣，該DNA偵測套組在用於DNA擴增方法中時產生用於MON87751或其後代之診斷擴增子。當在DNA擴增方法中測試時產生對MON87751有診斷性之擴增子的MON87751大豆植物、植物部分、植物細胞、種子或商品產品為本發明之態樣。用於MON87751擴增子之測定法可藉由使用Applied Biosystems GeneAmp® PCR系統9700(以最大速度運作)或MJ Research DNA Engine PTC-225熱循環器或可用於如實例4所示產生對MON87751有診斷性之擴增子的任何其他擴增系統來執行。
實例8
為產生包含增強農藝、殺蟲或除草性質之大豆植物或其植物部分，含有品系MON87751之大豆植物與含有可能任何其他大豆品系之大豆植物或其組合雜交，且評估表現型來測定後代植物之所得性質。賦予由此植物育種產生之後代植物之性質可擴展品系MON87751之鱗翅類昆蟲抗性範圍，包括但不限於地上害蟲控制、除草劑耐性、殺線蟲性質、抗旱性、抗病毒性、抗真菌控制、抗細菌性、雄不孕性、寒冷耐性、耐鹽性、增加的產率、增強的油組合物、增加的含油量、增強的營養物使用效率或改變的胺基酸含量。具有改良農藝特性之基因轉殖品系之實例為此項技術中所熟知的。以下為可能的基因轉殖大豆系之非限制性清單，其可用於以品系MON87751育種來在大豆植物、植物部分、種子或商品產品中賦予增強性質。育種可包括以下者之任何及所有組合：除草劑耐性：大豆GTS 40-3-2、MON87708、MON89788、A2704-12、A2704-21、A5547-35、A5547-127、BPS-CV127-9、DP356043、GU262、W62、W98、DAS-44406-6、DAS-68416-4、FG72、BPS-CV127-9、SYHT04R、SYHT0H2、3560.4.3.5、EE-GM3、pDAB4472-1606、pDAB4468-0416、pDAB8291.45.36.、127、AAD-12；抗蟲性：MON87701、DAS- 81419-2；增加的增強油組合物：DP-305423、G94-1、G94-19、G168、OT96-15、MON87705、MON87769；增加的產率：MON 87712。
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<223> 包含大豆基因組序列及轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大豆基因組序列及轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 2
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大豆基因組序列及轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 3
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大豆基因組序列及轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 4
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大豆基因組序列及轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 5
<210> 6
<211> 100
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大豆基因組序列及轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 6
<210> 7
<211> 1626
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大豆基因組序列及轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 7
<210> 8
<211> 1452
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大豆基因組序列及轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 8
<210> 9
<211> 10119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 9
<210> 10
<211> 12640
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含大豆基因組序列及轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 10
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成的寡核苷酸PCR引子
<400> 11
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成的寡核苷酸PCR引子
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成的寡核苷酸PCR探針
<400> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成的寡核苷酸PCR引子
<400> 14
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成的寡核苷酸PCR引子
<400> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成的寡核苷酸PCR探針
<400> 16
<210> 17
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 17
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<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
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<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 19
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<211> 486
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 20
<210> 21
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 21
<210> 22
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 22
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 23
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 24
<210> 25
<211> 156
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 25
<210> 26
<211> 1905
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含轉殖基因序列之人工DNA序列
<400> 26

Claims (25)

  1. 一種在含有大豆DNA之一樣本中為可偵測的重組DNA分子，其中該分子之核苷酸序列：a)選自由以下組成之群：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10；或b)與(a)完全互補的核苷酸序列，其中此DNA分子之存在對該樣本中之大豆品系MON87751 DNA有診斷性。
  2. 如請求項1之重組DNA分子，其中該重組DNA分子係來源於大豆品系MON87751，包含大豆品系MON87751之種子的一代表性樣本已以ATCC入藏登錄號PTA-120166寄存。
  3. 一種DNA分子，其包含具有足夠長度以用作DNA探針之多核苷酸區段，該DNA分子在嚴格雜交條件下特異地與一樣本中之大豆品系MON87751 DNA雜交，其中偵測該DNA分子於該等雜交條件下之雜交對該樣本中之大豆品系MON87751 DNA有診斷性。
  4. 如請求項1之重組DNA分子，其中該樣本包含一大豆植物、大豆植物細胞、大豆種子、大豆植物部分、大豆後代植物、大豆油、大豆蛋白質或大豆商品產品。
  5. 一種DNA分子對，其包含第一DNA分子及不同於該第一DNA分子之第二DNA分子，該等DNA分子在一擴增反應中與含有大豆品系MON87751模板DNA之一樣本共同使用時用作DNA引子，以便產生對該樣本中之該大豆品系MON87751 DNA有診斷性之擴增子，其中該擴增子包含選自由以下組成之群的核苷酸序列： SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26。
  6. 一種偵測一樣本中對大豆品系MON87751 DNA有診斷性之DNA區段的存在之方法，該方法包含：a)使該樣本與如請求項3之DNA探針接觸；b)使該樣本及該DNA探針經受嚴格雜交條件；及c)偵測該DNA探針與該樣本之雜交，其中該偵測步驟對該樣本中該大豆品系MON87751 DNA的該存在有診斷性。
  7. 一種偵測一樣本中對大豆品系MON87751 DNA有診斷性之DNA區段的存在之方法，該方法包含：a)使該樣本與如請求項5之DNA分子對接觸；b)執行一擴增反應以足以產生DNA擴增子，及c)偵測該反應中該DNA擴增子之存在，其中該DNA擴增子包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且其中該偵測該擴增子之該存在對該樣本中之大豆品系MON87751 DNA有診斷性。
  8. 一種包含重組多核苷酸分子之大豆植物、大豆植物部分或其大豆細胞，該重組多核苷酸分子包含選自由以下組成之群的核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：10。
  9. 如請求項8之大豆植物、大豆植物部分或其大豆細胞，其中該大豆植物或大豆植物部分或大豆細胞在提供於鱗翅類昆蟲害蟲之飼料中時為殺蟲的。
  10. 如請求項9之大豆植物、大豆植物部分或其大豆細胞，其中該鱗翅類昆蟲害蟲係選自由以下組成之群：錁夜蛾屬(Chrysodeixis spp.)、夜盜蛾屬(Spodoptera spp.)、鈴夜蛾屬(Helicoverpa spp.)、Crocidosema spp.、灰夜蛾屬(Rachiplusia spp.)、干煞夜蛾屬(Anticarsia spp.)、玉米苗斑螟屬(Elasmopalpus spp.)及Plathypena spp.。
  11. 如請求項8之大豆植物、大豆植物部分或其大豆細胞，其中該大豆植物進一步定義為包含該大豆品系MON87751之大豆植物的任何世代之後代。
  12. 一種保護大豆植物以免昆蟲感染之方法，其中該方法包含在大豆之鱗翅類昆蟲害蟲之飼料中提供殺蟲有效量的包含品系MON87751之大豆植物之細胞或組織。
  13. 如請求項12之方法，其中該鱗翅類昆蟲害蟲係選自由以下組成之群：錁夜蛾屬、夜盜蛾屬、鈴夜蛾屬、Crocidosema spp.、灰夜蛾屬、干煞夜蛾屬、玉米苗斑螟屬及Plathypena spp.。
  14. 一種產生抗昆蟲大豆植物之方法，其包含：a)將兩個不同大豆植物與包含基因轉殖大豆品系MON87751 DNA之兩個不同大豆植物中之至少一者有性交叉； b)對來自該交叉之後代之種子或組織取樣；c)偵測來自步驟b)之該樣本中對大豆品系MON87751有診斷性之DNA區段的存在，以便識別包含大豆品系MON87751 DNA之後代；及d)選擇包含大豆品系MON87751 DNA之該後代，其中該後代為包含基因轉殖大豆品系MON87751 DNA之抗昆蟲大豆植物。
  15. 一種大豆種子，其包含可偵測量的選自由以下組成之群的核苷酸序列或其完全補體：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：10。
  16. 一種無生命大豆植物材料，其包含可偵測量的如請求項1之重組DNA分子。
  17. 一種微生物，其包含可偵測量的如請求項1之重組DNA分子。
  18. 如請求項17之微生物，其中該微生物為植物細胞。
  19. 一種大豆商品產品，其包含可偵測量的對品系MON87751獨特的DNA分子，其中該分子包含如請求項1之重組DNA分子。
  20. 如請求項19之大豆商品產品，其進一步定義為選自由以下組成之群的商品產品：完整或經處理大豆種子、大豆油、大豆蛋白質、大豆粕、大豆粉、大豆薄片、大豆麩皮、豆漿、豆腐乳、大豆酒、包含大豆之動物飼料、包含大豆之紙、包含大豆之乳油、大豆生物質及使用大豆植物及大豆植物部分生產的燃料產品。
  21. 一種大豆植物、大豆植物部分或其大豆種子，其包含在產生對品系MON87751 DNA的存在有診斷性的擴增子之DNA擴增方法中測試時用作模板之DNA。
  22. 一種測定包含品系MON87751之大豆植物或大豆種子之接合子型 式的方法，該方法包含：a)使包含大豆DNA之一樣本與引子組接觸，該引子組能夠產生對品系MON87751有診斷性之第一擴增子及對不包含品系MON87751之天然大豆基因組DNA有診斷性之第二擴增子；i)用該樣本及該引子組執行核酸擴增反應；及ii)在該核酸擴增反應中偵測對品系MON87751有診斷性之該第一擴增子，或對不包含品系MON87751之天然大豆基因組DNA有診斷性之該第二擴增子；其中僅存在該第一擴增子對該樣本中同型接合品系MON87751 DNA有診斷性，且該第一擴增子及該第二擴增子之存在對就品系MON87751對偶基因而言為異型接合的大豆植物有診斷性；或b)使包含大豆DNA之一樣本與探針組接觸，該探針組含有特異地雜交至品系MON87751 DNA之至少一個第一探針及特異地雜交至大豆基因組DNA且不雜交至品系MON87751 DNA之至少一個第二探針，該大豆基因組DNA由具有品系MON87751之異源DNA之插入物中斷，i)將該探針組與該樣本在嚴格雜交條件下雜交，其中偵測到僅該第一探針在該等雜交條件下雜交對該樣本中品系MON87751 DNA之同型接合對偶基因有診斷性，且其中偵測到該第一探針及該第二探針在該等雜交條件下雜交對該樣本中品系MON87751 DNA之異型接合對偶基因有診斷性。
  23. 如請求項22之方法，其中該引子組包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15。
  24. 如請求項22之方法，其中該探針組包含SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：16。
  25. 如請求項10之大豆植物或其大豆植物部分，其中該大豆植物進 一步包含選自由以下組成之群的基因轉殖品系：MON87751、MON89788、MON87708、MON87701、MON87712、MON87769、MON87705、MON87754、GTS 40-3-2、A2704-12、A2704-21、A5547-35、A5547-127、BPS-CV127-9、DP-305423、DP356043、G94-1、G94-19、G168、GU262、OT96-15、W62、W98、DAS-444Ø6-6、DAS-68416-4、FG72、BPS-CV127-9大豆、SYHT04R、pDAB4472-1606、pDAB4468-0416、pDAB8291.45.36.2、pDAB9582.814.19.1、SYHT0H2、3560.4.3.5、EE-GM3及品系127。
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