CN103361436A - 耐除草剂转基因棉花mon1445的转化体特异性引物、探针及在实时荧光pcr检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及耐除草剂转基因棉花MON1445的转化体特异性引物、探针及在实时荧光PCR检测中的应用，引物与探针序列如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示，提取待检测样品基因组DNA加入引物扩增可以进行SYBR Green I实时荧光PCR检测，提取待检测样品基因组DNA，加入引物与探针组合扩增进行Taqman探针实时荧光PCR检测。本发明设计的引物与探针序列应用于PCR检测灵敏、准确、简单、可靠。
Description
技术领域
本发明涉及耐除草剂转基因棉花MON1445转化体特异性引物、探针及其在实时荧光PCR检测中的应用，属于分子生物学领域。
背景技术
转基因植物及其产品的PCR检测主要是对转基因植物外源插入片段的选择性扩增。针对外源插入核酸片段不同的位置和元件进行PCR扩增，其特异性及检测范围有很大的区别。根据扩增的目标核酸的位置的不同，PCR检测策略可以分为四种，即筛选PCR检测(ScreenPCR)、基因特异性PCR检测(Gene-Specific PCR)、构建特异性PCR检测(Construct-SpecificPCR)和品系特异性PCR检测(Event-Specific PCR)。品系特异性PCR检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区DNA序列实现的。由于每一个转基因植物品系都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区DNA序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。鉴于上述四种转基因检测策略的优缺点，品系特异性PCR检测已经成为目前转基因检测方法研究的重点，并逐步地为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。
利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带等问题。由于PCR扩增反应具有较高的灵敏度，DNA提取区、PCR体系配制区和凝胶电泳区之间的交叉污染或者加样过程产生的DNA气溶胶或操作失误等往往会导致假阳性结果的出现，PCR扩增产物在进行琼脂糖凝胶电泳时由于嗅化乙锭(EtBr)只能检测到少至10ng的DNA含量，因此即使PCR产物中有少量目的DNA产物也不能观察到，这又会导致假阴性结果。此外，普通PCR最大的不足就是无法对待检样品中转基因成分进行定量分析。为此科研人员发展了不同的定量GMO的PCR检测方法，其中最为常用的是实时荧光PCR。
经过对现有文献的检索发现，存在转基因事件MON1445普通PCR定性检测方法，但未有该转基因事件SYBR Green I和Taqman探针实时荧光PCR检测方法的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种耐除草剂转基因棉花MON1445的转化体特异性引物、探针及在实时荧光PCR检测中的应用，克服了现有方法技术不够先进，灵敏度不够高的缺点。
本发明采取的技术方案为：
耐除草剂转基因棉花MON1445的转化体特异性引物，正向、反向引物序列分别为：
MON1445-qF:5'-AGACGATTCAGATCAAACACTGATAGT-3'；
MON1445-qR:5'-ACAACATGCATCAATCGACCTG-3'，如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示。
耐除草剂转基因棉花MON1445的转化体特异性探针，序列为：
MON1445-qP:5'-FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATC-TAMRA-3'，如SEQID No.3所示。
所述的耐除草剂转基因棉花MON1445的转化体特异性引物与探针在实时荧光PCR检测中的应用。
SYBR Green I（核酸染料）实时荧光PCR检测农作物及其相关产品是否含有耐除草剂转基因棉花MON1445的方法，步骤如下：
(1)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用上述MON1445-qF/MON1445-qR引物组合进行SYBR Green I实时荧光PCR扩增，扩增产物大小为94bp；
(2)实时荧光PCR扩增结束后，以PCR刚好进入指数扩增期来设定荧光信号阈值(一般为仪器缺省设置，为3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍)，并根据仪器噪声情况进行适当调整，该阈值用于定义检测样本的阈值循环数即Ct值，是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，如果检测到的荧光信号超过设定阈值即认为是阳性信号，本发明中，若MON1445特异性序列出现典型扩增曲线且Ct值小于等于36，表明检测样品含有转基因棉花MON1445；若不存在典型扩增曲线，表明检测样品中不含转基因棉花MON1445。
步骤(1)所述的PCR扩增为：扩增反应体积为20μL，2×FastStart Universal SYBR GreenMaster(Rox)(罗氏SYBR Green I染料预混液)10μL，浓度为10μmol L-1的正向引物(MON1445-qF)0.4μL，浓度为10μmol L-1的反向引物(MON1445-qR)0.4μL，ddH2O8.2μL，DNA模板1μL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
Taqman探针法定性检测农作物及其相关产品是否含有耐除草剂转基因棉花MON1445的方法，步骤如下：
(1)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用上述MON1445-qF/MON1445-qR/MON1445-qP引物与探针组合进行Taqman探针实时荧光PCR扩增；引物、探针的扩增产物大小均为94bp；
(2)实时荧光PCR扩增结束后，以PCR刚好进入指数扩增期来设定荧光信号阈值(一般为仪器缺省设置，为3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍)，并根据仪器噪声情况进行适当调整，该阈值用于定义检测样本的阈值循环数即Ct值，是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，如果检测到的荧光信号超过设定阈值即认为是阳性信号，本发明中，若MON1445特异性序列出现典型扩增曲线且Ct值小于等于36，表明检测样品含有转基因棉花MON1445；若不存在典型扩增曲线，表明检测样品中不含转基因棉花MON1445。
步骤(1)所述的PCR扩增为：扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(TaKaRa)(探针酶预混液)10μL，浓度为10μmol L-1的正向引物(MON1445-qF)0.4μL，浓度为10μmol L-1的反向引物(MON1445-qR)0.4μL，浓度为10μmol L-1的探针(MON1445-qP)0.8μL，Rox dey I(背景校准液)0.4μL，ddH2O6μL，DNA模板1μL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
本发明具有的优点和效果如下：
1、利用本发明设计的引物序列，建立了耐除草剂转基因棉花MON1445转化体特异性SYBR Green I实时荧光PCR方法，该方法灵敏(灵敏度均能达到0.01%)、准确、简单、可靠、通用性好，具有广阔的应用价值与市场前景。
2、利用本发明设计的引物与探针序列，建立了耐除草剂转基因棉花MON1445转化体特异性TaqMan探针实时荧光PCR方法，该方法灵敏、准确、简单、可靠、特异性强，比普通PCR更适合复杂样品的检测，具有广阔的应用价值与市场前景。
附图说明
图1为实施例1中MON1445SYBR Green I实时荧光PCR扩增曲线(特异性)。
图2为实施例1中MON1445SYBR Green I实时荧光PCR扩增曲线(灵敏度)；
其中，1-4分别为MON1445含量为1%，0.1%，0.01%，0%的基因组DNA扩增曲线。
图3为实施例2中MON1445TaqMan探针实时荧光PCR扩增曲线(特异性)。
图4为实施例2中MON1445TaqMan探针实时荧光PCR扩增曲线(灵敏度)；
其中，1-4分别为MON1445含量为1%，0.1%，0.01%，0%的基因组DNA扩增曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1SYBR Green I实时荧光PCR检测方法：
引物由大连Takara公司合成，稀释成10μmol L-1备用。合成的引物序列如下：
MON1445-qF:5'-AGACGATTCAGATCAAACACTGATAGT-3'
MON1445-qR:5'-ACAACATGCATCAATCGACCTG-3'；如SEQ ID No.1，SEQ ID No.2所示。
分别提取转基因棉花MON1445(1%,w/w)和转基因玉米Bt176(1%,w/w)、MON810(1%,w/w)、T25(1%,w/w)、TC1507(1%,w/w)，转基因大豆MON87701(1%,w/w)，转基因水稻科丰6号(1%,w/w)，转基因棉花MON531(1%,w/w)基因组DNA，分别用MON1445-qF/MON1445-qR引物组合进行实时荧光PCR扩增。
将提取的转基因棉花MON1445(1%,w/w)基因组DNA依次稀释至1%，0.1%，0.01%，0%以此为模板进行SYBR Green I实时荧光PCR扩增。
扩增反应体积为20μL，2×FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10μL，浓度为10μmol L-1的正向引物0.4μL，浓度为10μmol L-1的反向引物0.4μL，ddH2O8.2μL，DNA模板1μL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。PCR扩增结束后根据扩增曲线判断是否存在扩增产物。
结果：利用所设计的引物以提取的基因组为模板进行PCR扩增，特异性结果如图1所示，只有MON1445基因组成功出现Ct值为30的典型扩增曲线，而其他转基因和非转基因样品模板都没有典型扩增曲线；灵敏度结果如图2，MON1445含量为1%，0.1%，0.01%的DNA模板的Ct值分别为28.4，31.9，35，均小于36，0%的模板无扩增。由此证明，该引物具有较高的特异性和检测灵敏度(0.01%)，适合转基因棉花MON1445转化体特异性的实时荧光PCR检测。
实施例2TaqMan探针实时荧光PCR检测方法：
引物和探针由大连Takara公司合成，稀释成10μmol L-1备用。合成的引物与探针序列如下：
MON1445-qF:5'-AGACGATTCAGATCAAACACTGATAGT-3'
MON1445-qR:5'-ACAACATGCATCAATCGACCTG-3'
MON1445-qP:5'-FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATC-TAMRA-3'；如SEQ IDNo.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示。
分别提取转基因棉花MON1445(1%,w/w)和转基因玉米Bt176(1%,w/w)、MON810(1%,w/w)、T25(1%,w/w)、TC1507(1%,w/w)，转基因大豆MON87701(1%,w/w)，转基因水稻科丰6号(1%,w/w)，转基因棉花MON531(1%,w/w)基因组DNA，分别用MON1445-qF/MON1445-qR/MON1445-qP引物与探针组合进行实时荧光PCR扩增。
将提取的转基因棉花MON1445(1%,w/w)基因组DNA依次稀释至1%，0.1%，0.01%，0%，以此为模板进行Taqman探针实时荧光PCR扩增。
扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(TaKaRa)10μL，浓度为10μmol L-1的Forwardprimer0.4μL，浓度为10μmol L-1的Reverse primer0.4μL，浓度为10μmol L-1的TaqMan probe0.8μL，Rox dey I0.4μL，ddH2O6μL，DNA模板1μL。扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。PCR扩增结束后根据扩增曲线判断是否存在扩增产物。
结果：利用所设计的引物和探针以提取的基因组为模板进行PCR扩增，特异性结果如图3所示，只有MON1445基因组成功出现Ct值为29.8的典型扩增曲线，而其他转基因和非转基因样品模板都没有典型扩增曲线；灵敏度结果如图2，MON1445含量为1%，0.1%，0.01%的DNA模板的Ct值分别为28.5，31.7，34.3，均小于36，0%的模板无扩增。由此证明，该引物具有较高的特异性和检测灵敏度(0.01%)，适合转基因棉花MON1445转化体特异性的实时荧光PCR检测。
以上结果可以证明，本发明建立的耐除草剂转基因棉花MON1445SYBR Green I实时荧光PCR和TaqMan探针实时荧光PCR特异性强，灵敏度高(均能达到0.01%)，为该转基因事件的检测提供了简单、可靠的方法，为转基因标识制度的实施提供了一定的技术参考，为转基因产品的监管与控制提供了有效的技术手段。
Claims (8)
1.耐除草剂转基因棉花MON1445的转化体特异性引物，其特征是，正向、反向引物序列分别为：
MON1445-qF:5'-AGACGATTCAGATCAAACACTGATAGT-3'；
MON1445-qR:5'-ACAACATGCATCAATCGACCTG-3'。
2.权利要求1所述的耐除草剂转基因棉花MON1445的转化体特异性引物在实时荧光PCR检测中的应用。
3.核酸染料实时荧光PCR检测农作物及其相关产品是否含有耐除草剂转基因棉花MON1445的方法，其特征是，步骤如下：
(1)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用权利要求1所述的MON1445-qF/MON1445-qR引物组合进行核酸染料实时荧光PCR扩增，扩增产物大小为94bp；
(2)实时荧光PCR扩增结束后，以PCR刚好进入指数扩增期来设定荧光信号阈值，该阈值用于定义检测样本的阈值循环数即Ct值，是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，如果检测到的荧光信号超过设定阈值即认为是阳性信号，此检测中，若MON1445特异性序列出现典型扩增曲线且Ct值小于等于36，表明检测样品含有转基因棉花MON1445；若不存在典型扩增曲线，表明检测样品中不含转基因棉花MON1445。
4.根据权利要求3所述的核酸染料实时荧光PCR检测农作物及其相关产品是否含有耐除草剂转基因棉花MON1445的方法，其特征是，步骤(1)所述的PCR扩增为：扩增反应体积为20μL，2×FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)10μL，浓度为10μmol L-1的正向引物0.4μL，浓度为10μmol L-1的反向引物0.4μL，ddH2O8.2μL，DNA模板1μL；扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
5.耐除草剂转基因棉花MON1445的转化体特异性引物与探针，其特征是，序列为：
MON1445-qF:5'-AGACGATTCAGATCAAACACTGATAGT-3'；
MON1445-qR:5'-ACAACATGCATCAATCGACCTG-3'；
MON1445-qP:5'-FAM-CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATC-TAMRA-3'。
6.权利要求5所述的耐除草剂转基因棉花MON1445的转化体特异性引物与探针在实时荧光PCR检测中的应用。
7.Taqman探针法定性检测农作物及其相关产品是否含有耐除草剂转基因棉花MON1445的方法，其特征是，步骤如下：
(1)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用权利要求5所述的MON1445-qF/MON1445-qR/MON1445-qP引物与探针组合进行Taqman探针实时荧光PCR扩增；引物、探针的扩增产物大小均为94bp；
(2)实时荧光PCR扩增结束后，以PCR刚好进入指数扩增期来设定荧光信号阈值，该阈值用于定义检测样本的阈值循环数即Ct值，是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，如果检测到的荧光信号超过设定阈值即认为是阳性信号，此检测中，若MON1445特异性序列出现典型扩增曲线且Ct值小于等于36，表明检测样品含有转基因棉花MON1445；若不存在典型扩增曲线，表明检测样品中不含转基因棉花MON1445。
8.根据权利要求7所述的Taqman探针法定性检测农作物及其相关产品是否含有耐除草剂转基因棉花MON1445的方法，其特征是，步骤(1)所述的PCR扩增为：扩增反应体积为20μL，2×Premix Ex Taq(TaKaRa)10μL，浓度为10μmol L-1的正向引物0.4μL，浓度为10μmol L-1的反向引物0.4μL，浓度为10μmol L-1的探针(MON1445-qP)0.8μL，背景校准液0.4μL，ddH2O6μL，DNA模板1μL；扩增反应条件：95℃10min预变性；95℃15s，60℃30s，在60℃收集荧光信号，共计40个循环。
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| US20090269762A1 (en) * | 2000-10-25 | 2009-10-29 | Rangwala Tasneem S | Cotton event PV-GHGT07(1445) and compositions and methods for detection thereof |
-
2013
- 2013-07-25 CN CN2013103172429A patent/CN103361436A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107022646A (zh) * | 2017-06-16 | 2017-08-08 | 中国农业科学院植物保护研究所 | 用于检测棉花mon1445转化体的引物组、试剂盒及方法 |
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