CN101831499B - 一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时pcr方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法，它涉及一种定殖数量检测的方法。本发明解决了现有检测产甲酸草酸杆菌数量的方法存在的费时费力，结果误差较大、获得结果的周期长的问题。方法：一、确定检测的粪便中产甲酸草酸杆菌是第一亚组还是第二亚组；二、实时PCR检测、三、根据公式进行计算即得到粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量。本发明的检测方法操作简单，误差小，便于推广，获得结果的周期短，与现有的方法相比较，时间缩短了80％以上，且本发明所得到结果准确，误差小。
Description
技术领域
本发明涉及一种定殖数量检测的方法。
背景技术
产甲酸草酸杆菌(Oxalobacter formigenes)是一种以草酸作为唯一的碳源和能源的专性厌氧的革兰氏阴性菌。它是Milton J.Alison于1985年在绵羊的瘤胃中首先发现的(Allison MJ，Cook HM，Miline DB，Gallagher S，Clayman RV.Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans.J.Nutr.(1986)116：455-460.Allison MJ，Dawson KA，Mayberry WR，Foss JG.Oxalobacterformigenes gen.nov.，sp.nov.：oxalate-degrading anaerobes that inhabit thegastrointestinal tract.Arch Microbiol 1985；141：1-7.)，并进一步又在猪、大鼠和人等肠道或粪便内被分离到。草酸是一种人体内主要由肝脏行成的代谢终产物，也广泛存在于包括菠菜、巧克力、茶等食物和饮料中。这一物质是人的草酸钙肾结石中的主要成分。草酸在人的尿中的浓度高低对肾结石形成与否起着重要作用。现有研究表明产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)不仅能够通过降解食物中的草酸以减少肠道对食物中草酸向血液中的吸收，并且能够与肠道黏膜相互作用导致血液中过高的草酸向肠道反向转运，达到降低血液中的草酸的浓度，进而降低尿中草酸的浓度。然而，很多研究显示产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)在肾结石病患者的肠道内的定殖率明显低于在健康人的肠道内的定值率，这说明该菌株的定殖与否是肾结石形成的主要因素之一。更重要的是，现已发现肾结石疾病的再发率同样与产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)的定殖有重要的关系，研究表明二者成显著的负相关性。产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)已经被用于治疗高草酸症疾病的研究中。研究显示该菌株作为益生菌剂口服进入该病患者体内，能够显著改善患者尿中草酸的含量。因此，产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)在肠道内定殖数量对于肠道内草酸含量以及血液中草酸含量降低至关重要，对于该菌株数量的检测在产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)在预防和治疗肾结石疾病以及与草酸有关的疾病如高草酸症的治疗中的应用必将具有深远的重要意义。
现有检测粪便中产甲酸草酸杆菌数量的方法有Roll-Tube法、QT-PCR法、实时PCR法。现有的这些产甲酸草酸杆菌检测方法还存在以下的缺点和不足：
1、Roll-Tube法：Roll-Tube法主要是利用稀释培养法，在一种叫Roll-Tube的管中，将含产甲酸草酸杆菌的粪便样品与培养基先稀释再混合培养一定时间(一般为4-5天)，计算管壁上透明圆圈的数量即为所检测的菌数。该方法的缺点是不得不使用大量的厌氧设备，而且不得不大量配制培养基。在菌落计数过程中，是以计算在Roll-Tube管壁上透明圆圈，而制备培养基时极容易产生气泡，这就导致了很大程度的误差。概括起来，该方法最大的缺点是费时费力，获得结果周期长。
2、QT-PCR法：Sidhu等(1999)为了解决Roll-Tube法费时费力的缺点，发明了QT-PCR法。QT-PCR法是将所有粪便样品提取DNA，然后设计引物做常规PCR，在琼脂糖凝胶电泳上检测PCR产物的亮度，与事先测得的产甲酸草酸杆菌的PCR产物的标准曲线比较，计算后获得菌数。该方法快速、但它存在致命的缺陷是PCR产物的浓度不能完全代表原始PCR模板的浓度(即所要测试的产甲酸草酸杆菌的DNA浓度)，当模板浓度过大或过小，该方法不能真实反映实际所要测试的产甲酸草酸杆菌的定殖数量，最终导致检测结果误差较大。
3、实时PCR法：目前，该方法是用于检测原始DNA浓度的最有效、最准确的方法。Surgey Prokopovich等2007首先引入该方法用于测试产甲酸草酸杆菌的定殖数量，为的是解决QT-PCR法测试原始DNA不准确的弊端。具体内容是提取粪便样品的DNA，然后利用实时PCR法通过测试PCR进行时在对数期开始的循环数(CT数)，达到检测样品产甲酸草酸杆菌的原始DNA浓度。方法快速，但是现有的实时PCR方法所使用的引物仅对第一亚组的甲酸草酸杆菌有效，而且引物本身专一性也不好，设计引物无法完全匹配有些产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)的序列，这导致实时PCR运行时，CT开始时间滞后，导致计数结果与实际数据相比明显偏低，检测结果不准确。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有检测产甲酸草酸杆菌数量的方法存在的费时费力，结果误差较大、获得结果的周期长的问题，而提供了一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法。
本发明检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法按照以下步骤进行：一、提取待检测的粪便样品的基因组DNA，然后分别用第一亚组的引物和第二亚组的引物进行PCR扩增，电泳检测即确定出待检测的粪便中产甲酸草酸杆菌是第一亚组还是第二亚组，其中，这两组PCR反应体系25μl均由0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶、100ng粪便样品的基因组DNA、1.25μM的上游引物、1.25μM的下游引物、1×PCR缓冲液和余量的去核酸酶的纯净水组成，第一亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第一亚组的下游引物为5′-AAAACGCTGACCGTCATCTT-3′；第二亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第二亚组的下游引物为5′-GAACTTCTGACCATCCTGTT-3′；二、待检测的粪便样品中产甲酸草酸杆菌为第一亚组，则以第一亚组代表菌HC-1作为标准品进行实时PCR检测粪便样品中产甲酸草酸DNA的质量；待检测的粪便样品中产甲酸草酸杆菌的为第二亚组，则以第二亚组代表菌OxK作为标准品进行实时PCR检测粪便样品中产甲酸草酸DNA 的质量；以上实时PCR 的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，下游引物为5′-GCCAGGTTCGTGATAGGAAT-3′；其中，实时PCR具体步骤为：将标准品的DNA稀释为0.00002ng/μl、0.0002ng/μl、0.002ng/μl、0.02ng/μl、0.2g/μl和2ng/μl六个不同浓度梯度，然后将待检测的粪便样品基因组DNA和这六个浓度的标准品DNA加入到实时PCR反应体系中，实时PCR反应体系为25μL由1×QuantiTect SYBR Green PCR kit(Qiagen，Inc.)、1.25μM上游引物、1.25μM下游引物、100ng的样品和余量的去核酸酶的纯净水组成；三、将实时PCR测得的粪便样品DNA中的产甲酸草酸杆菌DNA的质量代入如下公式：产甲酸草酸杆菌的菌数＝产甲酸草酸杆菌的DNA的质量(ng)×4.82×105个菌数/ng，即得到了粪便中产甲酸草酸杆菌的定殖数量。
本发明的检测方法在国内外首次使用PCR法快速地鉴定出人的粪便中产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)属于哪一亚组的实际问题，而后再针对是哪一亚组使用实时PCR法准确地进行检测人的粪便中产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)的定殖数量。本发明的检测方法操作简单，误差小，便于推广，获得结果的周期短，与现有的方法相比较，时间缩短了80％以上，且本发明所得到结果准确，误差小。
附图说明
图1为具体实施方式一中第一亚组引物和第二亚组引物用于鉴定标准品的电泳图，图中1泳道表示第一亚组代表菌HC-1用第一亚组引物进行PCR扩增的结果，2泳道表示第一亚组代表菌HC-1用第二亚组引物进行PCR扩增的结果，3泳道表示第二亚组代表菌OxK用第一亚组引物进行PCR扩增的结果，4泳道表示第二亚组代表菌OxK用第二亚组引物进行PCR扩增的结果，5泳道表示第一亚组代表菌HC-1和第二亚组代表菌OxK混合用第一亚组引物进行PCR扩增的结果，6泳道表示第一亚组代表菌HC-1和第二亚组代表菌OxK混合用第二亚组引物进行PCR扩增的结果；图2为具体实施方式一中第一亚组引物和第二亚组引物用于鉴定含有第一亚组产甲酸草酸杆菌粪便样品的电泳图，图中1泳道表示第一亚组样品Ⅰ用第一亚组引物进行PCR扩增的结果，2泳道表示第一亚组样品Ⅰ用第二亚组引物进行PCR扩增的结果，3泳道表示第一亚组样品Ⅱ用第一亚组引物进行PCR扩增的结果，4泳道表示第一亚组样品Ⅱ用第二亚组引物进行PCR扩增的结果，5泳道表示表示第一亚组样品Ⅲ用第一亚组引物进行PCR扩增的结果，6泳道表示表示第一亚组样品Ⅲ用第二亚组引物进行PCR扩增的结果；图3为具体实施方式一中第一亚组引物和第二亚组引物用于鉴定含有第二亚组产甲酸草酸杆菌粪便样品的电泳图，图中1泳道表示第二亚组样品Ⅰ用第一亚组引物进行PCR扩增的结果，2泳道表示第二亚组样品Ⅰ用第二亚组引物进行PCR扩增的结果，3泳道表示第二亚组样品Ⅱ用第一亚组引物进行PCR扩增的结果，4泳道表示第二亚组样品Ⅱ用第二亚组引物进行PCR扩增的结果，5泳道表示表示第二亚组样品Ⅲ用第一亚组引物进行PCR扩增的结果，6泳道表示表示第二亚组样品Ⅲ用第二亚组引物进行PCR扩增的结果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法按照以下步骤进行：一、提取待检测的粪便样品的基因组DNA，然后分别用第一亚组的引物和第二亚组的引物进行PCR扩增，电泳检测即确定出待检测的粪便中产甲酸草酸杆菌是第一亚组还是第二亚组，其中，这两组PCR反应体系25μl均由0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶、100ng粪便样品的基因组DNA、1.25μM的上游引物、1.25μM的下游引物、1×PCR缓冲液和余量的去核酸酶的纯净水组成，第一亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第一亚组的下游引物为5′-AAAACGCTGACCGTCATCTT-3′；第二亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第二亚组的下游引物为5′-GAACTTCTGACCATCCTGTT-3′；二、待检测的粪便样品中产甲酸草酸杆菌为第一亚组，则以第一亚组代表菌HC-1作为标准品进行实时PCR检测粪便样品中产甲酸草酸DNA的质量；待检测的粪便样品中产甲酸草酸杆菌的为第二亚组，则以第二亚组代表菌OxK作为标准品进行实时PCR检测粪便样品中产甲酸草酸DNA 的质量；以上实时PCR 的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，下游引物为5′-GCCAGGTTCGTGATAGGAAT-3′；其中，实时PCR具体步骤为：将标准品的DNA稀释为0.00002ng/μl、0.0002ng/μl、0.002ng/μl、0.02ng/μl、0.2g/μl和2ng/μl六个不同浓度梯度，然后将待检测的粪便样品基因组DNA和这六个浓度的标准品DNA加入到实时PCR反应体系中，实时PCR反应体系为25μL由1×QuantiTect SYBR Green PCR kit(Qiagen，Inc.)、1.25μM上游引物、1.25μM下游引物、100ng的样品和余量的去核酸酶的纯净水组成；三、将实时PCR测得的粪便样品DNA中的产甲酸草酸杆菌DNA的质量代入如下公式：产甲酸草酸杆菌的菌数＝产甲酸草酸杆菌的DNA的质量(ng)×4.82×105个菌数/ng，即得到了粪便中产甲酸草酸杆菌的定殖数量。
本实施方式步骤一中提取粪便样品基因组DNA的提取是采用Qiagenstool DNA kit(Qiagen Inc.)完成的，方法按照说明书进行，其中使用BeckmanDU640测定基因组DNA的浓度，然后将所有样品DNA浓度稀释或浓缩到20ng/μl备用。
本实施方式步骤一中以第一亚组代表菌株HC-1和第二亚组代表菌株OxK的DNA作正对照。
本实施方式步骤二中在进行实时PCR时，每个待测的粪便样品或标准品均重复三次。
本实施方式步骤二中待检测的粪便样品基因组DNA和这六个浓度的标准品DNA分别以5μl/(样品或标准品DNA)加入到实时PCR反应体系中。
本实施方式步骤二中实时PCR反应体系中的样品为待检测的粪便样品基因组DNA或标准品DNA。
本实施方式步骤二中的第一亚组代表菌HC-1和第二亚组代表菌OxK记载于Milton J.Alison教授发表的文章中(Allison MJ，Cook HM，Miline DB，Gallagher S，Clayman RV.Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria fromhumans.J.Nutr.(1986)116：455-460.Allison MJ，Dawson KA，Mayberry WR，Foss JG.Oxalobacter formigenes gen.nov.，sp.nov.：oxalate-degrading anaerobesthat inhabit the gastrointestinal tract.Arch Microbiol 1985；141：1-7.)、HarmeetSidhu教授发表的文章中(Sidhu H，Enatska L，Ogden S，Williams WN，AllisonMJ and Peck AB.Evaluating children in the Ukraine for colonization with theintestinal bacterium Oxalobacter formigenes using polymerase chainreaction-based detection system.Mol.Diagn.(1997)2：89-97.Sidhu H，Holmes RP，Allison MJ and Peck AB.Direct quantification of the enteric bacteriumOxalobacter formigenes in human fecal samples by quantitativecompetitive-template PCR.(1999)37：1503-1509.)和Ross P.Holmes教授发表的文章中(Prokopovich S，Knight J，Assimos DG and Holmes RP.Variability ifOxalobacter formigenes and oxalate in stool samples.J.Urology(2007)178：2186-2190.Sidhu H.Holmes RP，Allison MJ and Peck AB.Direct quantification oftheenteric bacterium Oxalobacter formigenes in human fecal samples byquantitative competitive-template PCR.(1999)37：1503-1509.)，第一亚组代表菌HC-1和第二亚组代表菌OxK可从Milton J.Alison教授、Harmeet Sidhu教授或Ross P.Holmes教授处获得。其中关于第一亚组和第二亚组的分离方法也记载于Milton J.Alison教授发表的文章中。
本实施方式步骤三中的4.82×105是经实验测得的1ng产甲酸草酸杆菌DNA所对应的菌数。
本实施方式步骤三中实时PCR使用的仪器为ABI Prsim 7000。
本实施方式的检测方法操作简单，便于推广，获得结果的周期短，且得到结果准确，误差小。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中PCR(第一亚组引物和第二亚组引物)反应条件为94℃预变性10min、30个循环的94℃变性30sec、60℃复性30sec和72℃延伸30sec，最后在72℃延伸10min。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤三中实时PCR反应条件：95℃预变性15min，45个循环的94℃变性30sec、53℃复性30sec和72℃延伸1min。其它步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
本实施方式中实时PCR仪在每个延伸反应后30sec进行SYBR Green荧光定量分析并记录定量结果。
具体实施方式四：本实施方式检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法按照以下步骤进行：一、提取待检测的粪便样品的基因组DNA，然后分别用第一亚组的引物和第二亚组的引物进行PCR扩增，电泳检测即确定出待检测的粪便中产甲酸草酸杆菌是第一亚组还是第二亚组，其中，这两组PCR反应体系25μl均由0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶、100ng粪便样品的基因组DNA、1.25μM的上游引物、1.25μM的下游引物、1×PCR缓冲液和余量的纯净水组成，第一亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第一亚组的下游引物为5′-AAAACGCTGACCGTCATCTT-3′；第二亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第二亚组的的下游引物为5′-GAACTTCTGACCATCCTGTT-3′；二、待检测的粪便样品中产甲酸草酸杆菌的为第一亚组产甲酸草酸杆菌，则以第一亚组甲酸草酸杆菌HC-1作为标准品进行实时PCR测得的粪便样品中产甲酸草酸DNA的质量；待检测的粪便样品中产甲酸草酸杆菌的为第二亚组产甲酸草酸杆菌，则第二亚组甲酸草酸杆菌OxK作为标准品进行实时PCR测测得粪便样品中产甲酸草酸DNA的质量；实时PCR的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，下游引物为5′-GCCAGGTTCGTGATAGGAAT-3′；其中，实时PCR方法为：将标准品稀释为0.00002ng/μl、0.0002ng/μl、0.002ng/μl、0.02ng/μl、0.2g/μl和2ng/μl六个不同浓度梯度，然后将所待测定的粪便样品和这六个浓度的标准品以5μl/样品加入到实时PCR反应体系中，实时PCR反应体系为25μL由1×QuantiTect SYBRGreen PCR kit(Qiagen，Inc.)、1.25μM上游引物、1.25μM下游引物、100ng的样品和余量的纯净组成；三、将实时PCR测得的粪便样品DNA中的产甲酸草酸DNA的质量代入如下公式：产甲酸草酸杆菌的菌数＝产甲酸草酸杆菌的DNA的质量(ng)×4.82×105个菌数/ng，即得到了粪便中产甲酸草酸杆菌的定殖数量；其中步骤一中第一亚组引物和第二亚组引物的反应条件均为94℃预变性10min、30个循环的94℃变性30sec、60℃复性30sec和72℃延伸30sec，最后在72℃延伸10min；步骤三中实时PCR反应条件：95℃预变性15min，45个循环的94℃变性30sec、53℃复性30sec和72℃延伸1min。
本实施方式步骤一中提取粪便样品的基因组DNA的提取是采用Qiagenstool DNA kit(Qiagen Inc.)完成的，方法按照说明书进行，其中使用BeckmanDU640测定基因组DNA的浓度，然后将所有样品DNA浓度稀释或浓缩到20ng/μl备用。
本实施方式步骤一中以第一亚组代表菌株HC-1和第二亚组代表菌株OxK的DNA作正对照。
本实施方式步骤二和步骤三中的纯净水均为去核酸酶的纯净水。
本实施方式步骤二中每个待测的粪便样品和标准品均重复三次实时PCR。
本实施方式步骤二中待检测的粪便样品基因组DNA和这六个浓度的标准品DNA分别以5μl/(样品或标准品DNA)加入到实时PCR反应体系中。
本实施方式步骤二中实时PCR反应体系中的样品为待检测的粪便样品基因组DNA或标准品DNA。
本实施方式步骤三中的4.82×105是经实验测得的1ng产甲酸草酸杆菌DNA所对应的菌数。
本实施方式步骤三中实时PCR使用的仪器为ABI Prsim 7000。
本实施方式随机选取来自20个确认是产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)定殖的受测试人的新鲜的粪便样品用于粪便基因组DNA的提取。基因组DNA的提取是采用Qiagen stool DNA kit(Qiagen Inc.)完成的。最终常规PCR的产物在0.7％琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，以第一亚组的代表菌HC-1和第二亚组的代表菌OxK作为正对照，结果显示所有20个结果与实际通过生理生化方法鉴定的基因型(即属于哪个亚组)的结果完全一致，由此可知，本实施方式步骤一中检测方法结果100％准确。
本实施方式随机选取确认是20个产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)定殖的受测试人的新鲜的粪便样品，其中有10个确定是第一亚组的产甲酸草酸杆菌，有10个确定是第二亚组的产甲酸草酸杆菌。经本实施方式步骤二检测后，所得到的电泳图如图1～图3所示，图1～图3中只显示每亚组各三个样品的结果，其它样品所得结果一样，所以没有显示，有PCR产物的为阳性，无PCR产物为阴性。阳性结果表明所测试的样品属于所使用的引物代表的亚组。
使用现有的Roll-Tube计数法与本实施方式的方法进行比较，比较结果如表1和表2所示，其中待测的样品是随机选取来自20个确认是产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)定殖的受测试人的新鲜的粪便样品，这20个样品中有10个样品中为第一亚组产甲酸草酸杆菌，另外10个样品中为第二亚组产甲酸草酸杆菌。
表1
表2
从表1和表2可以看出，20个样品的实时PCR法技术结果与以前的Roll-Tube计数法非常接近。证明该方法非常有效，但比之Roll-Tube计数法快速、简洁，鉴定周期缩短了85％以上。
使用现有的实时PCR法(Surgey Prokopovich等使用)与本实施方式的方法进行比较，比较结果如表3所示。
表3
| 受测试者的样品 | HC-1标准品与现有的实时PCR方法的实时PCR引物 | HC-1标准品与具体实施方式的实时PCR引物 | OxK标准品与具体实施方式的实时PCR引物 |
| A 50* | 0.41×107±0.07×107 | 11.00×107±1.62×107 | 55.20×107±7.70×107 |
| A250* | 0.40×107±0.04×107 | 15.60×107±0.10×107 | 95.50×107±0.80×107 |
| A750* | 0.12×108±0.01×108 | 3.59×108±0.18×108 | 17.70×108±0.85×108 |
| B 50 | 0.09×107±0.03×107 | 3.84×107±0.78×107 | 20.00×107±3.87×107 |
| B 250 | 0.35×107±0.04×107 | 11.30×107±1.74×107 | 56.60×107±8.28×107 |
| B 750 | 0.98×107±0.34×107 | 22.70×107±2.70×107 | 114.00×107±12.60×107 |
| C 50 | 11.40×107±0.60×107 | 11.40×107±0.60×107 | 5.47×107±0.30×107 |
| C 250 | 19.40×1078±9.98×107 | 31.00×107±1.01×107 | 154.00×107±4.80×107 |
| C 750 | 5.54×108±1.72×108 | 5.45×108±0.07×108 | 26.10×108±3.14×108 |
注：HC-1第一亚组的对照菌株，OxK第二亚组的对照菌株，A和C第一亚组受测试人B第二亚组受测试人，*表示受测试者食用的不同草酸含量(50-750mg)的食物，产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)与食物草酸含量呈正比。表中数据显示只有受测试人C的计数结果是正确的。
通过对表3的数据分析可知，现有的实时PCR方法无法准确地鉴定第一亚组部分样品和第二亚组全部样品。为了进一步分析具体原因，我们对所检测的20个样品及两个亚组代表菌标准品的oxc基因(常规PCR和实时PCR引物的模板)的前500bp进行扩增，结果显示现有的实时PCR方法所使用的引物仅对部分第一亚组的样品有效，而且引物本身专一性也不好，设计引物无法完全匹配有些产甲酸草酸杆菌(O.formigenes)的序列，这导致实时PCR运行时，CT开始时间滞后，导致计数结果与实际数据相比明显偏低(数据未显示)。而本实施方式所使用的引物是针对上述测序结果设计的，如表3所示不仅对第一亚组的样品有效，对第二亚组的样品同样有效，本实施方式的方法不仅操作便捷，且准确度高。
序列表
<110>东北农业大学
<120>一种检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一亚组的上游引物
<400>1
atgtagagtt gactgatggc 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第一亚组的下游引物
<400>2
aaaacgctga ccgtcatctt 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二亚组的上游引物
<400>3
atgtagagtt gactgatggc 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>第二亚组的下游引物
<400>4
gaacttctga ccatcctgtt 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实时PCR的上游引物
<400>5
atgtagagtt gactgatggc 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>实时PCR的下游引物
<400>6
gccaggttcg tgataggaat 20
Claims (3)
1.PCR引物在制备用于检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法的试剂中的用途，其特征在于所述PCR引物由第一亚组的引物和第二亚组的引物以及实时PCR的引物组成，第一亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第一亚组的下游引物为5′-AAAACGCTGACCGTCATCTT-3′；第二亚组的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第二亚组的下游引物为5′-GAACTTCTGACCATCCTGTT-3′；实时PCR的上游引物为5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，实时PCR的下游引物为5′-GCCAGGTTCGTGATAGGAAT-3′；所述检测粪便中产甲酸草酸杆菌定殖数量的实时PCR方法按照以下步骤进行：一、提取待检测粪便样品的基因组DNA，然后分别用第一亚组的引物和第二亚组的引物进行PCR扩增，电泳检测即确定出待检测粪便中产甲酸草酸杆菌第一亚组还是第二亚组，其中，这两组的PCR反应体系25μl均由0.2mM dNTP、0.5U Taq DNA聚合酶、100ng粪便样品的基因组DNA、1.25μM的上游引物、1.25μM的下游引物、1×PCR缓冲液和余量的去核酸酶的纯净水组成；二、待检测粪便样品中产甲酸草酸杆菌为第一亚组，则以第一亚组代表菌HC-1作为标准品进行实时PCR检测粪便样品中产甲酸草酸杆菌DNA的质量；待检测粪便样品中产甲酸草酸杆菌为第二亚组，则以第二亚组代表菌OxK作为标准品进行实时PCR检测粪便样品中产甲酸草酸杆菌DNA的质量；实时PCR的具体步骤为：将标准品的DNA稀释为0.00002ng/μl、0.0002ng/μl、0.002ng/μl、0.02ng/μl、0.2g/μl和2ng/μl六个不同浓度的梯度，然后将待检测粪便样品的基因组DNA和这六个浓度的标准品DNA加入到实时PCR反应体系中，其中，实时PCR的反应体系为25μl由1×QuantiTect SYBRGreen PCR kit、1.25μM上游引物、1.25μM下游引物、100ng的样品和余量的去核酸酶的纯净水组成；三、将实时PCR测得的粪便样品DNA中的产甲酸草酸杆菌DNA的质量代入如下公式：产甲酸草酸杆菌的菌数＝产甲酸草酸杆菌DNA的质量ng×4.82×105个菌数/ng，即得到了粪便中产甲酸草酸杆菌的定殖数量。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于步骤一中PCR的反应条件为94℃预变性10min，30个循环的94℃变性30sec、60℃复性30sec和72℃延伸30sec，最后在72℃延伸10min。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于步骤二中实时PCR反应条件：95℃预变性15min，45个循环的94℃变性30sec、53℃复性30sec和72℃延伸1min。
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