CN108796100B - 基于惰性真杆菌预测艾滋病人haart治疗效果的引物 - Google Patents

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种基于惰性真杆菌预测艾滋病人HAART治疗效果的引物。本发明提供了用于鉴定惰性真杆菌的物质在制备用于预测艾滋病人HAART治疗效果的产品中的应用。本发明对HIV病人经过HAART治疗后的效果差异跟肠道菌群结构之间做关联性研究，进而找到HAART治疗效果不同的两组人之间的菌株——惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)，并设计得到特异性鉴定引物。本发明对于帮助HIV患者及时调整治疗方案，找到更加有效地治疗方法具有重要意义。本发明还对指导患者通过服用益生菌、益生元等来调整患者的肠道微生物的组成来更好地促进HAART治疗的效果具有重要意义。

Description

基于惰性真杆菌预测艾滋病人HAART治疗效果的引物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于惰性真杆菌预测艾滋病人HAART治疗效果的引物。
背景技术
近年来，肠道微生物成为了热门研究领域之一。随着研究的日益深入，研究者发现肠道微生物作为人体的一个“器官”，通过其代谢产物、影响宿主的免疫系统等方式来影响宿主的健康。比如，Ⅱ型糖尿病、癌症、高血压、神经系统退行性疾病等都已经被证明与肠道微生物有着密切的关系。
人类免疫缺陷病毒(HIV)，即艾滋病(AIDS)病毒，是造成人类免疫系统缺陷的病毒。它能够通过破坏人体的T淋巴细胞，进而阻断细胞免疫和体液免疫过程，导致免疫系统瘫痪，从而使各种疾病在人体内蔓延，最终导致艾滋病。随着1996年美籍华裔科学家何大一提出鸡尾酒疗法，HIV患者机体的免疫功能部分甚至全部恢复，病程进展得以延缓，寿命延长，生活质量提高。
高通量测序作为肠道微生物研究的重要技术手段，在疾病与肠道微生物的关联性研究中起到了非常重要的作用。高通量测序和生物信息技术的结合已经被广泛应用于人体肠道样本的微生物的研究当中。通过两种技术手段，我们可以发现肠道微生物在不同的条件下的结构的不同，从而发现其中在物种水平和基因水平的生物标志物，通过生物标志物将两组不同的人通过肠道微生物的生物标记物加以区分。
基于肠道微生物能够调节机体的免疫系统，促进机体免疫细胞的增殖、分化的认识，近年来逐渐有研究将注意力转移到肠道微生物与艾滋病之间的关系上。但是这些研究只是针对不同的人群去分析HIV感染的病人和健康人之间在肠道微生物的多样性、结构和丰度的差异。但是这些研究只是机械地告诉人们HIV病人的肠道微生物和健康人之间的差别，并不能给临床的治疗提供任何参考，相应的临床应用价值也不明确。目前没有关于HIV病人经过HAART治疗后的效果差异跟肠道菌群结构之间做关联性研究。
发明内容
本发明的目的是对HIV病人经过HAART治疗后的效果差异跟肠道菌群结构之间做关联性研究，进而找到HAART治疗效果不同的两组人之间的菌株，针对相应的菌株进行检测来预测HAART治疗效果的不同。
第一方面，本发明要求保护用于鉴定惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)的物质在制备用于预测艾滋病人HAART治疗效果的产品中的应用。
其中，所述用于鉴定惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)的物质可为用于鉴定肠道中惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)的物质，进一步可为能够鉴定待测DNA样品中是否含有SEQ ID No.1的第832-1087位所示DNA片段的物质；所述待测DNA样品为来自于艾滋病人的粪便样本中的基因组DNA(不仅仅包含了细菌，还有真菌，病毒和宿主的DNA)。
进一步地，所述用于鉴定惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)的物质可为如下引物对或含有所述引物对的试剂或试剂盒：
(a)由SEQ ID No.2所示的单链DNA和SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物对；
(b)由将SEQ ID No.2和SEQ ID No.3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链DNA分子组成的，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对；
(c)由经SEQ ID No.1所示核苷酸序列设计所得的引物对，且与(a)中所述引物对功能相同的引物对。
第二方面，本发明要求保护一种用于预测艾滋病人HAART治疗效果的产品。
本发明所提供的用于预测艾滋病人HAART治疗效果的产品，为前文所述的能够鉴定所述待测DNA样品中是否含有SEQ ID No.1的第832-1087位所示DNA片段的物质或者为前文所述的引物对或试剂或试剂盒。
进一步地，所述产品中还含有记载有下文所述方法(“一种预测艾滋病人HAART治疗效果的方法”或者“一种比较预测不同艾滋病人HAART治疗效果的方法”)的可读性载体。
第三方面，本发明要求保护一种预测艾滋病人HAART治疗效果的方法。
本发明所提供的预测艾滋病人HAART治疗效果的方法，可包括如下步骤：对待测艾滋病人的肠道微生物进行检测，如果所述待测艾滋病人的肠道微生物中含有惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)，则所述待测艾滋病人的HAART治疗效果不好或可能不好，如果所述待测艾滋病人的肠道微生物中不含惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)，则所述待测艾滋病人的HAART治疗效果好或可能好。
进一步地，所述待测艾滋病人的HAART治疗效果不好是指所述待测艾滋病人经HAART治疗两年后，外周血的CD4+细胞计数小于200个/μL；所述待测艾滋病人的HAART治疗效果不好是指所述待测艾滋病人经HAART治疗两年后，外周血的CD4+细胞计数大于等于200个/μL。
第四方面，本发明要求保护一种比较预测不同艾滋病人HAART治疗效果的方法。
本发明所提供的比较预测不同艾滋病人HAART治疗效果的方法，可包括如下步骤：对不同待测艾滋病人的肠道微生物分别进行检测，肠道微生物中不含的惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)的所述待测艾滋病人HAART治疗效果好于或候选好于肠道微生物中含有惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)的所述待测艾滋病人HAART治疗效果。
在第三方面和第四方面中，对所述待测艾滋病人的肠道微生物进行检测可按照包括如下步骤的方法进行：
(1)提取所述待测艾滋病人的待测样品中的基因组DNA(不仅仅包含了细菌，还有真菌，病毒和宿主的DNA)；所述待测样品为粪便样本；
(2)以步骤(1)中提取的基因组DNA为模板，采用前文所述的引物对或试剂或试剂盒进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)如果所述扩增产物中含有大小为256bp的目的片段，则所述待测艾滋病人的肠道微生物中含有或候选含有惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)；如果所述扩增产物中不含有大小为256bp的目的片段，则所述待测艾滋病人的肠道微生物中不含有或候选不含有惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)。
进一步地，步骤(2)中，进行所述PCR扩增时采用的退火温度具体可为55℃。步骤(3)中，所述大小为256bp的目的片段具体为SEQ ID No.1的第832-1087位所示DNA片段。
第五方面，本发明要求保护惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)或SEQ ID No.1的第832-1087位所示DNA片段在作为预测HAART治疗效果的生物标记物中的应用。
本发明对HIV病人经过HAART治疗后的效果差异跟肠道菌群结构之间做关联性研究，进而找到HAART治疗效果不同的两组人之间的菌株——惰性真杆菌(Eubacteriumsiraeum)。本发明对于帮助HIV患者及时调整治疗方案，找到更加有效地治疗方法具有重要意义。本发明还对指导患者通过服用益生菌、益生元等来调整患者的肠道微生物的组成来更好地促进HAART治疗的效果具有重要意义。
附图说明
图1为13个HAART治疗效果不好的HIV病人和10个HAART治疗效果良好的HIV病人粪便样本的细菌进行LEfSe分析的结果。B代表HAART治疗效果不好的HIV病人，C代表HAART治疗效果好的HIV病人。
图2为7个粪便样本在引物SEQ ID No.2和SEQ ID No.3扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M：marker；1-7：样本编号(1-4为治疗效果不好的病人样本，5-7为治疗效果好的病人样本)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、可作为HIV HAART治疗效果评价的生物标志物的筛选
1、人体肠道样本的收集和元基因组提取
样本来自于13个HAART治疗两年且效果不好(外周血中CD4+细胞计数小于200个/μL)的HIV病人和10个HAART治疗两年且效果良好(外周血中CD4+细胞计数大于等于200个/μL的HIV病人的粪便样本。收集到的样本取一小勺(约黄豆粒大小)放入PSP Spin Stool DNAKit(德国Stratec公司产品，货号为JB180010)提供的收集管并储存于-20℃冰箱中，直到样品基因组DNA提取时取出。肠道样本中细菌基因组是利用PSP Spin Stool DNA Kit试剂盒提取并略有改进。为了有效的破坏细胞壁，尤其是革兰氏阳性菌的细胞壁，在均质步骤中加入了300mg玻璃珠(直径0.1mm)，用BeadBeater预破碎2min。其它步骤与PSP Spin StoolDNA Kit说明书中一致。将提取出的DNA用Nanodrop对浓度和纯度进行分析确保260/280在1.8-2.0之间，260/230在1.0以上。同时，将所提取的DNA样本在1.0％的琼脂糖上电泳(100V，60min)，确定提取的DNA的完整性以及没有小片段的污染。
2、文库的构建
分别以上述步骤1中获得的基因组为模板，取3mg的基因组到80μL的TE溶液中，用Diagenode公司的BIORUPTOR将其打断成300-500bp的片段(需电泳确认片段区间是否在300-500bp之间。NEXTflex Rapid DNA-Seq Kit试剂盒参照说明进行文库的建立，建库完成后用HiSeq X Ten测序平台进行测序，测序的深度为5GB。
3、生物信息学分析
将测得的数据通过生物信息的方法进行分析，得到各个细菌种属的相对丰度，然后用LEfSe进行分析，找到相应的生物标志物。通过对两组病人的粪便样本进行分析，找到相应的生物标志物，如图1所示。总共发现了11种细菌可以作为区分两组病人粪便样本的生物标志物，它们分别是副百日咳博得特氏菌(Bordetella parapertussis),链球菌属(Streptococcus sp 2_1_36FAA),索氏志贺菌(Shigella Sonnei)，Oscillibactervalericigenes,二路普雷沃氏菌(Prevotella bivia),嵴链球菌(Streptococcuscristatus),Oribacterium sp oral_taxon_108,干酪乳杆菌(Lactobacillus casei),细长真杆菌(Eubacterium dolichum),Bachnospiraceae bacterium 1_456FAA,惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)。结合它们的实际相对丰度，选取了惰性真杆菌(Eubacteriumsiraeum)作为生物标记物来判断粪便样本的DNA来源。
实施例2、引物的设计与验证
通过查找并与NCBI数据库进行比对，找到惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)的特异性序列如SEQ ID No.1所示。
针对两段特异性序列用NCBI在线设计软件设计引物，如表1。
表1惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)的鉴定特异引物序列
Figure BDA0001702518420000051
理论扩增产物为SEQ ID No.1的第832-1087位(256bp)。
将所设计的引物在NCBI Primer-BLAST进行比对，发现所设计的引物只能扩增惰性真杆菌(Eubacterium siraeum)，虽然能够与Echinostoma caproni相匹配，但是有四个碱基不同且所扩增的产物大小为61bp，与目标扩增条带大小不一致。
实施例3、引物的实际检测
1、人体肠道样本的收集和元基因组提取
参照实施例1中元基因组提取方法对样本的DNA进行提取。样本为临床上判断为HAART治疗两年且效果不好(外周血中CD4+细胞计数小于200个/μL)的病人的粪便样本4个，HAART治疗两年且效果良好(外周血中CD4+细胞计数大于等于200个/μL的病人的粪便样本3个。将提取出的DNA用Nanodrop对浓度和纯度进行分析，确保260/280在1.8-2.0之间，260/230在1.0以上。
为了避免假阴性情况的出现，将提取出的DNA样本稀释到10-100ng/μL后作为PCR模板。
2、利用设计的两对引物进行PCR扩增
用表1中的引物扩增提取出的DNA模板，检测粪便样本中是否有相应的菌种存在。
PCR反应总体系20μL：包括模板DNA 2μL；正向和反向引物各0.5μM，TaKaRa TaqVersion 2.0plus dye 10μL，补充ddH2O到20μL。
PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃7min。
3、琼脂糖凝胶电泳
电泳采用1.5％琼脂糖凝胶电泳，条件为100V，60min，7个样本的PCR产物电泳结果见图2。目标条带大小为256bp(SEQ ID No.1的第832-1087位)。图2所示结果表明，治疗效果不好的四个病人的粪便样本DNA没有扩增出目标片段，而治疗效果好的三个病人的粪便样本DNA扩增出目标片段。
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 基于惰性真杆菌预测艾滋病人HAART治疗效果的引物
<130> GNCLN181233
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1283
<212> DNA
<213> Eubacterium siraeum
<400> 1
cgtttactac ttgaaaaaaa tcggaattag tgttatactg tattggatta tgacagcggt 60
taccgcttaa agaaaggttg acacataaat gaaacttgga atggtcggtc tgccgaacgt 120
aggcaaaagc accttattca atgcacttac aaacgcagga gcagaatctg caaactaccc 180
tttctgcaca attgagccta atgtgggaat agtatccgtt cccgatgaac gtcttgacgc 240
actcgctaag atgtacaacc ccgaaaaatt cacacccgca actctcgaat tcgttgacat 300
tgcaggtctt gtgaagggcg catccaaggg tgaaggactc ggcaacaagt tcttgtcgaa 360
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tatgcgtgac ggtgacgttg tactgttcag attcaacgta taataagtta aatcgaagca 1200
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
actgccgcaa gccataagat 20

Claims (3)

1.用于鉴定惰性真杆菌的物质在制备用于预测艾滋病人HAART治疗效果的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述用于鉴定惰性真杆菌的物质为能够鉴定待测DNA样品中是否含有SEQ ID No.1的第832-1087位所示DNA片段的物质；所述待测DNA样品为来自于艾滋病人的粪便样本中的基因组DNA。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述用于鉴定惰性真杆菌的物质为由SEQ ID No.2所示的单链DNA和SEQ ID No.3所示的单链DNA组成的引物对。
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