KR101548261B1 - 돼지 백혈구 항원 sla-dqa, sla-dqb1 및 sla-drb1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법 - Google Patents

돼지 백혈구 항원 sla-dqa, sla-dqb1 및 sla-drb1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101548261B1
KR101548261B1 KR1020140063727A KR20140063727A KR101548261B1 KR 101548261 B1 KR101548261 B1 KR 101548261B1 KR 1020140063727 A KR1020140063727 A KR 1020140063727A KR 20140063727 A KR20140063727 A KR 20140063727A KR 101548261 B1 KR101548261 B1 KR 101548261B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sla
dqb1
dqa
drb1
analyzing
Prior art date
Application number
KR1020140063727A
Other languages
English (en)
Inventor
박찬규
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to KR1020140063727A priority Critical patent/KR101548261B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101548261B1 publication Critical patent/KR101548261B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 지노믹 DNA 멀티플렉스 PCR과 직접적인 시퀀싱을 이용하여 돼지 면역반응과 관련된 3가지 주요 SLA class II 유전자들, SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법과 이에 사용되는 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 다형성이 매우 높은 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1 유전자 좌위를 동시에 증폭할 수 있는 멀티플렉스 PCR 프라이머를 제공함으로써, 다수의 좌위를 동시에 증폭하고 타이핑할 수 있어 각 좌위의 염기서열을 따로 분석하는 방법에 비하여 더 적은 분석 비용, 더 적은 재료의 사용, 시간 단축 등 상당한 이점을 가지고 있을 뿐만 아니라 정확성이 높아 편리성, 효율성을 모두 만족시켜 주는 효과가 있다.

Description

돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법{SIMULTANEOUS GENOTYPING METHOD FOR THREE SLA CLASS 2 GENES, SLA DQA, SLA DQB1 AND SLA DRB1}
본 발명은 지노믹 DNA 멀티플렉스 PCR과 직접적인 시퀀싱을 이용하여 돼지 면역반응과 관련된 3가지 주요 SLA class II 유전자들, SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법과 이에 사용되는 프라이머 세트에 관한 것이다.
주조직 적합성 복합체(MHC; major histocompatibility complex)는 세포의 상호작용 및 자기, 비자기 항원을 구별하는 중요한 역할을 수행하는 유전자들의 집합체로서, 돼지의 MHC인 돼지 백혈구 항원(SLA; swine leukocyte antigen)은 돼지의 지놈에서 가장 다형성이 높은 부위 중 하나로 면역시스템을 조절하고 돼지의 면역학적, 병리학적, 생리학적 특성에 있어 중요한 마커로 작용한다.
돼지는 해부학적, 생리학적, 생화학적으로 인간과 유사하여 인간의 생물 의학 연구에 중요한 실험동물 모델로 이용되고 있으며, 인간의 장기를 대체하기 위한 동물로 돼지의 중요성이 높아짐에 따라 미니돼지를 대상으로 무균돼지의 생산과 더불어 돼지의 면역시스템에 대한 연구가 진행 중에 있다. 이에 SLA 시스템에 대한 체계적인 분석을 위한 기술의 개발이 필요한 실정이다.
SLA 유전자는 돼지 7번 염색체 내 class Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ가 존재하며, IPD-MHC SLA 시퀀스 데이터베이스에 따르면 class Ⅰ에 129개, class Ⅱ에 167개의 대립유전자가 보고되었다.
현재까지 개발된 DNA 기반의 유전자 분석방법으로 PCR-SSP, PCR-RFLP, cDNA based sequencing, pyrosequencing 등이 있으나, PCR-SSP와 PCR-RFLP는 시퀀스 정보가 없는 새로운 대립유전자에 대한 타이핑을 할 수 없고, cDNA based typing의 경우 RNA 샘플이 필요하고 클로닝 단계를 거쳐 상대적으로 복잡하고 시간이 오래 걸리는 단점이 있으며, pyrosequencing은 시퀀스 정보가 없는 새로운 대립유전자에 대한 타이핑을 할 수 없을 뿐만 아니라 많은 비용이 드는 단점이 있다. 또한, 현재까지 개발된 방법들은 모두 대량의 샘플들에 대하여 적용하기에는 어려운 문제점이 있다.
선행기술로 대한민국 등록특허 10-1134121(지노믹 중합효소 연쇄반응을 이용한 돼지 백혈구 항원 유전자형 분석방법), 대한민국 등록특허 10-0834563(돼지 주조직적합성복합체 제 3영역에 존재하는 씨에프비 유전자의 염기변이를 이용한 유전자형 분석방법과 이에 사용되는 프라이머) 등이 있지만, 지노믹 DNA를 기반으로 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1 유전자형을 동시에 분석하는 방법은 개시되어 있지 않으며 돼지의 MHC 유전자들의 다형성에 대한 체계적인 연구를 수행하기 위해 SLA 유전자들에 대한 더 많은 서열정보와 고도의 분석방법이 필요하다.
또한, the International Society for Animal Genetics Nomenclature Committee에 의해 DNA 시퀀싱을 통한 SLA 명명법이 규정되었기 때문에 뉴클레오타이드 변이에 대한 연구 등을 위해 SLA 유전자들의 효과적인 시퀀싱 기반의 유전자형 분석방법(SBT; sequence-based typing)을 필요로 하고 있다.
SLA class Ⅱ 영역 내에 존재하는 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1 유전자의 성공적인 분석을 위해서는 지노믹 DNA를 이용하여 엑손 2 부위의 완전한 분석이 가능하고 다른 대립유전자 간의 동등한 증폭 효율과 모든 알려진 대립유전자의 증폭이 가능해야 한다.
본 발명의 목적은 대립유전자 정보나 클로닝 단계 없이 돼지의 지노믹 DNA를 기반으로 SLA class II 유전자 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1의 엑손 2를 멀티플렉스 PCR로 동시에 증폭하고 직접염기서열 분석방법을 이용하여 각 좌위의 유전자형을 분석할 수 있는 방법 및 이에 사용되는 프라이머 세트를 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1 유전자의 엑손 2를 동시에 증폭하는 서열번호 1 내지 6의 지노믹 DNA 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1 유전자의 엑손 2를 동시에 증폭하는 서열번호 1 내지 6의 지노믹 DNA 멀티플렉스 PCR 프라이머와; 상기 멀티플렉스 PCR 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 서열번호 7 내지 9의 시퀀싱 프라이머를 포함하는 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형 분석용 키트를 제공한다.
상기 유전자형 분석용 키트는 돼지로부터 분리된 지노믹 DNA에 적용가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 (1) 돼지의 지노믹 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리한 지노믹 DNA로부터 서열번호 1 내지 6의 멀티플렉스 PCR 프라이머를 이용하여 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 엑손 2를 동시에 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭한 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계;를 포함하는 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법을 제공한다.
상기 (3)단계에서 증폭한 PCR 산물의 염기서열은 서열번호 7 내지 9의 시퀀싱 프라이머를 이용하여 분석하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 다형성이 매우 높은 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1 유전자 좌위를 동시에 증폭할 수 있는 멀티플렉스 PCR 프라이머를 제공함으로써, 다수의 좌위를 동시에 증폭하고 타이핑할 수 있어 각 좌위의 염기서열을 따로 분석하는 방법에 비하여 더 적은 분석 비용, 더 적은 재료의 사용, 시간 단축 등 상당한 이점을 가지고 있을 뿐만 아니라 정확성이 높아 편리성, 효율성을 모두 만족시켜 주는 효과가 있다.
또한, 대립유전자 정보나 클로닝 단계 없이 간편하게 지노믹 DNA를 기반으로 광범위, 고해상도의 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1 유전자형 분석방법을 제공함으로써, 돼지 육종산업과 이종간 장기이식에 크게 기여할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 멀티플렉스 PCR을 이용한 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1 증폭 결과로서, 다른 SLA class Ⅱ 반수체형을 갖는 샘플로부터 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1에 해당하는 밴드 898, 478, 364 bp가 일관되게 관찰됨. 상기 샘플은 각각 반수체형 Hp-0.2/Hp-0.3, Hp-0.1/Hp-0.13, Hp-0.30/new_Hp-11, Hp-0.4/new_Hp-17, Hp-0.14/new_Hp-13, Hp-0.11/new_Hp-19를 가지며, L은 100 bp의 DNA ladder, N은 PCR의 음성대조군을 의미함.
도 2 및 3은 11개의 SLA-DQB1 대립유전자의 염기서열 배열과 SLA class Ⅱ 멀티플렉스 PCR에서 SLA-DQB1 엑손 2 증폭을 위한 프라이머 위치를 나타냄. 프라이머 DQB1R+295의 5′말단에 14개의 염기 비특이적 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 테일은 가는 점선으로 표시함.
도 4 및 5는 12개의 SLA-DRB1 대립유전자와 DRB1 위유전자 DRB2, DRB3, DRB4, DRB5의 염기서열 배열과 SLA class Ⅱ 멀티플렉스 PCR에서 SLA-DRB1 엑손 2 증폭을 위한 프라이머 위치를 나타냄. 프라이머 DRB1F-22와 DRB1R+284의 5′말단에 각각 18개 및 26개의 염기 비특이적 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머 테일은 가는 점선으로 표시함.
도 6은 52개 DRB1 대립유전자의 계통발생학적 분석 결과. 계통발생 트리는 DRB1 엑손 2의 전체 염기서열과 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average) 방법을 이용하여 구축됨. "*"는 본 발명에 따른 분석방법에 의해 관찰된 대립유전자를 나타내며, 엑손 2 서열은 *0401와 *04ta01, *0402와 *04ga01, *0501와 *05ch01, *0602와 *0603Q, *0801와 *0801hg06, *0901와 *09ta01 DRB1 대립유전자와 같음.
도 7은 37개 DQB1 대립유전자의 계통발생학적 분석 결과. 계통발생 트리는 DQB1 엑손 2의 전체 염기서열과 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average) 방법을 이용하여 구축됨. "*"는 본 발명에 따른 분석방법에 의해 관찰된 대립유전자를 나타내며, 엑손 2 서열은 *0201와 *02kg02, *040101와 *04hg01, *0801와 *08ch01 DQB1 대립유전자와 같음.
도 8은 21개 DQA 대립유전자의 계통발생학적 분석 결과. 계통발생 트리는 DQA 엑손 2의 전체 염기서열과 UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetical Average) 방법을 이용하여 구축됨. "*"는 본 발명에 따른 분석방법에 의해 관찰된 대립유전자를 나타내며, 엑손 2 서열은 *0101와 *01my01, *0201, *020201와 *020202 DQA 대립유전자와 같음.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자는 다형성이 가장 높은 돼지 백혈구 항원 SLA class II 유전자 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1의 각 좌위에 대하여 지노믹 PCR과 직접염기서열분석을 이용한 광범위, 고해상도의 유전자형 분석방법(출원번호 10-2013-0055120, 출원번호 10-2009-0109031, 출원번호 10-2009-0109042)을 개시한 바 있다. 이에, 본 발명은 더 나아가 멀티플렉스 지노믹 PCR을 기반으로 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1 대립유전자의 유전자형을 동시에 정확하고 간편하게 분석할 수 있는 프라이머 세트와 분석방법을 제공하고자 한다.
멀티플렉스 지노믹 PCR 기반의 SLA class II 유전자형 분석방법을 제공하기 위해서는, 높은 시퀀스 상동성을 갖는 몇몇의 위유전자를 제거하고 비특이적 증폭 없이 극도록 다형성이 높은 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1 유전자 좌위를 동시에 증폭할 수 있는 기술적 어려움을 해결해야 한다. 또한, SLA class II 유전자형 분석은 최소한 엑손 2 시퀀스 정보를 필요로 하므로 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1의 엑손 2를 동시에 증폭할 수 있는 프라이머가 필요하다.
본 발명은 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1 유전자의 엑손 2를 동시에 증폭하는 서열번호 1 내지 6의 지노믹 DNA 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1 유전자의 엑손 2를 동시에 증폭하는 서열번호 1 내지 6의 지노믹 DNA 멀티플렉스 PCR 프라이머와; 상기 멀티플렉스 PCR 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 서열번호 7 내지 9의 시퀀싱 프라이머를 포함하는 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형 분석용 키트를 제공하며, 상기 유전자형 분석용 키트는 돼지로부터 분리된 지노믹 DNA에 적용이 가능하다. DNA는 백혈구 세포, 모낭, 귀 절흔 및 근육를 포함하는 모든 조직 공급원으로부터 통상의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 돼지의 지노믹 DNA를 분리하는 단계; (2) 상기 분리한 지노믹 DNA로부터 서열번호 1 내지 6의 멀티플렉스 PCR 프라이머를 이용하여 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 엑손 2를 동시에 증폭하는 단계; 및 (3) 상기 증폭한 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계;를 포함하는 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법을 제공하며, PCR 반응과 PCR 산물의 염기서열 분석 방법은 당해 기술분야에서 이용되고 있는 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다.
이때, 상기 (3)단계에서 증폭한 PCR 산물의 염기서열은 서열번호 7 내지 9의 시퀀싱 프라이머를 이용하여 분석할 수 있다.
구체적으로, PCR은 프라이머, dNTPs, MgCl2, PCR 반응버퍼, 중합체의 농도를 조절하여 열변성, 어닐링, 익스텐션 과정을 거쳐 실시되며, 열변성 과정은 열을 이용하여 2가닥의 DNA의 상보적인 염기의 수소결합을 1가닥으로 떨어뜨리는 과정이고, 어닐링 과정은 한 가닥의 DNA에 시발체가 상보적인 염기서열에 결합하는 과정이다. 마지막으로 익스텐션 과정은 한 가닥의 DNA(주형 DNA)에 시발체가 붙은 다음의 염기에 DNA 중합효소(polymerase)를 이용하여 주형 DNA의 상보적인 염기를 합성하여 두 가닥의 DNA으로 연장시키는 과정이다. 이후 다시 열변성 과정, 어닐링 반응, 익스텐션 반응을 반복하여 DNA를 증폭하게 되며, 중합효소 연쇄반응 1회를 시행하면 유전 물질은 2배로 증폭된다. 따라서 반응의 반복에 의한 기하급수적인 증폭이 가능하고, 중합효소 연쇄반응을 n회를 반복하면 이론상으로 2의 n승배의 유전자가 증폭된다.
또한, PCR 산물의 염기서열 결정법으로는 직접법과 간접법이 있는데, 직접법은 PCR 단편을 그대로 염기서열 결정에 이용하나 간접법은 그 단편을 플라스미드 벡터로 클로닝한 후 염기서열을 결정한다. 직접법의 이점은 PCR 단편을 직접 염기서열 결정하기 때문에 얻어지는 정보가 주형 DNA의 염기배열을 충실하게 반영한다는 점이며, 간접법은 클로닝 단계를 포함하여 Taq polymerase 오독에 의한 2차적인 이상이 아니라는 것을 확인할 필요가 있다. 따라서, 간접법에서는 반드시 여러 개 클론의 염기서열 걸정을 비교하여, 그 변이가 모든 클론에서 존재하는 것을 확인하여야 한다. 직접법에는 동위원소로 말단 표지한 시발체에 의한 사이클 염기서열 결정법과 형광 색소에 의한 자동 DNA 염기서열 결정법이 있다.
Figure 112014050024695-pat00001
상기 표 1에서 n은 a, g, t 또는 c이며, i는 이노신(inosine)이다.
SLA-DQA 관련 프라이머는 SLA-DQA 단독 유전자형 분석방법에서 사용된 프라이머와 동일하나, 멀티플렉스 PCR 조건에서 증폭하고자 하는 모든 유전자 좌위를 특이적으로 동시에 증폭하고 염기서열분석 결과 나타나는 부실한 서열정보와 대립유전자 탈락을 방지하기 위해 나머지 SLA-DQB1과 SLA-DRB1 관련 프라이머는 이전에 공개한 단독 유전자형 분석방법에서 이용된 프라이머와 다른 서열을 갖도록 구축하였다.
그 결과, SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1 각각 단독 PCR 반응을 통해 얻은 특이적 밴드 898, 478, 364 bp가 멀티플렉스 PCR 결과에서도 나타나 성공적인 멀티플렉스 PCR 결과를 확인할 수 있었다(도 1 참조).
표 1에서 보는 바와 같이 엑손 2의 5′말단 부위에 염기 비특이적 뉴클레오타이드 테일을 가짐으로써 서열 시작 부위에서의 정보 손실을 최소화하였으며, SLA-DQB1의 포워드 프라이머 DQB1F-119는 이전의 SLA-DQB1 단독 유전자형 분석방법에서 사용된 프라이머보다 높은 서열 보존부위를 포함하도록 고안되었고, 어닐링 컨트롤 프라이머(ACP)인 리버스 프라이머 DRB1R+284는 DRB1 위유전자 DRB2, DRB3, DRB4, DRB5의 증폭을 제거하여, 도 2 내지 5에서 보는 바와 같이 멀티플렉스 PCR 조건에서 SLA-DQB1, SLA-DRB1의 특이적 증폭을 성공적으로 수행함을 알 수 있다. DRB1 포워드 프라이머는 DRB1 엑손 2 시작 부위의 염기 2개를 포함하고 있어 이 부분에 대한 염기서열분석이 이루어지지 않았음에도 불구하고, 본 발명에 따른 유전자형 분석방법은 상기 두 개의 염기정보 없이 현재 보고된 모든 DRB1 대립유전자 구별이 가능하다. 또한, 새로운 대립유전자를 동정하거나 생략된 두 개의 염기정보 확인이 필요하다면 이전에 보고된 SLA-DRB1 단독 유전자형 분석방법에 의해 정보를 얻을 수 있다.
DQA와 DQB1 관련 프라이머는 DRB1 관련 프라이머보다 높은 증폭 효율을 가지므로, 멀티플렉스 PCR 조건에서 DQA, DQB1 프라이머보다 높은 농도의 DRB1 프라이머를 첨가하여 양적 균형을 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 다형성이 높은 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1의 SLA class Ⅱ 유전자형 분석방법은 알려지지 않은 새로운 대립유전자를 포함하여 대립유전자의 다양성을 결정하는데 이용될 수 있으며, SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1의 반수체형 분석에도 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 지노믹 DNA 분리
돼지 조직으로부터 지노믹 DNA를 분리하기 위해 페놀/클로로포름/아이소아밀알코올이 25:24:1의 부피비로 혼합된 용액을 이용하였다. 조직들을 용해버퍼에 넣고 proteinase K를 첨가한 후 55℃에서 6시간 용해시키고 PCI 용액을 첨가하여 원심분리하였다. 이후, 상층액으로부터 알콜침전을 통해 지노믹 DNA를 침전시키고 그 펠렛을 75% 에탄올로 세척하고 공기로 건조하여 3차 증류수에 녹였다.
실시예 2. 멀티플렉스 PCR
본 발명에 따른 서열번호 4 내지 6에서 n은 a, g, t 또는 c를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서 사용된 프라이머 서열번호 1 내지 9는 다음과 같고, 상기 표 1에서 n으로 기재된 부분의 구체적인 서열은 소문자로 기재하였다.
서열번호 1(DQAi1F3) 5′-CTAGAGACTGTGCCACAGATGAAG-3′,
서열번호 2(DQAe3R5) 5′-ACAGATGAGGGTGTTGGGCTGA-3′,
서열번호 3(DQB1F-119) 5′-GCGGCGGGTTTCAGGTGGATG-3′,
서열번호 4(DQB1R+295) 5′-aaccctcactaaagACCCACTCTCTCYGCGCGGWGTCTC-3′,
서열번호 5(DRB1F-22) 5′-gaatgctgcgactacctgTGGATCATTGCTGTCCACGCAGMG-3′,
서열번호 6(DRB1R+284) 5′-tctaccaggcattcgcttcatiiiiiCYSCSGGCVGCSCA-3′의 멀티플렉스 PCR 프라이머와,
서열번호 7(DQAi1F4) 5′-GTMAAGTTCTCTTGTCAC-3′,
서열번호 8(Sq-mul-DQB1) 5′-AACCCTCACTAAAG-3′,
서열번호 9(Sq-mul-DRB1) 5′-TAGCTGAATTCGAATGCTGCGACTA-3′의 시퀀싱 프라이머를 사용하였다.
프라이머 첨가량과 다른 PCR 구성요소인 dNTPs, MgCl2, PCR 반응버퍼, 중합체의 농도를 멀티플렉스 PCR에 맞도록 조절하였으며, PCR 반응버퍼를 1.2X로 증가시킬 경우 다른 구성요소를 변화시킬 때에 비하여 우수한 효율을 나타냈다.
1.2X PCR 반응버퍼(MgCl2 1.5mM) 내 Super-Therm DNA 중합체(JMR Holdings, Kent, UK) 0.5U, 지노믹 DNA 50ng, DQA 프라이머(DQAi1F3, DQAe3R5) 0.32μM, DQB1 프라이머(DQB1F-119, DQB1R+295) 0.12μM, DRB1 프라이머(DRB1F-22, DRB1R+284) 1μM 및 dNTPs 0.1mM이 함유된 25㎕ 반응 혼합물에 대하여 증폭 반응이 이루어졌다. 증폭 반응은 T3000 Thermocycler(Biometra, Germany)를 이용하여 95℃에서 5분간 초기 변성, 그리고 95℃에서 1분간, 65℃에서 1분간, 72℃에서 1분간 및 72℃에서 5분간 마지막 익스텐션을 35 사이클 반복하였다.
실시예 3. 시퀀싱
PCR 산물의 직접적인 시퀀싱을 위해 5㎕의 증폭된 산물을 4㎕의 exonuclease Ⅰ(Fermentas, Canada)과 8㎕의 shrimp alkaline phosphatase(USB Corporation, USA)로 37℃에서 30분간 1.5× 반응버퍼에서 배양하였다.
시퀀싱 반응은 DQAi1F4, Sq-mul-DQB1, Sq-mul-DRB1 시퀀싱 프라이머로 ABI PRISM BigDye™ Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, USA)를 사용하여 실시하였으며, 자동 DNA 분석기(ABI 3730XL, Applied Biosystems)를 통해 분석하였다.
실험예.
본 발명에 따른 유전자형 분석방법의 정확성과 효율성을 평가하기 위해, 700마리 동물을 이용하여 수행된 종래 단독 유전자형 분석결과로부터 26개의 다른 SLA class Ⅱ 반수체형을 가진 30마리 돼지를 선택하여 본 발명에 따른 유전자형 분석방법에 따라 분석한 결과, 종래 SLA-DQA, SLA-DQB1, SLA-DRB1 각각의 단독 유전자형 분석결과와 동일하게 나타났다(표 2 참조).
본 발명의 실험예에서 사용된 샘플 집단은 정확한 반수체형을 결정하는데 있어서 상대적으로 적으나, 사용된 샘플은 이전에 보고된 본 발명자의 SLA class Ⅱ 유전자형 분석결과로부터 얻은 것이다. 9개의 반수체형은 IPD에 보고된 것과 동일하고 14개의 반수체형은 본 발명자에 의해 이전에 보고된 것과 동일하여 반수체형 분석결과가 정확함을 나타냈으며, 26개의 반수체형 중에서 이전에 보고된 바가 없는 새로운 반수체형 new_Hp-26, new_Hp-27, new_Hp-28은 별도로 한 개체 이상에서 확인하였다(데이터 미도시).
Figure 112014050024695-pat00002
Figure 112014050024695-pat00003
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> konkuk university industrial cooperation corp <120> SIMULTANEOUS GENOTYPING METHOD FOR THREE SLA CLASS 2 GENES, SLA DQA, SLA DQB1 AND SLA DRB1 <130> P14-E150 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ctagagactg tgccacagat gaag 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 acagatgagg gtgttgggct ga 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gcggcgggtt tcaggtggat g 21 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 nnnnnnnnnn nnnnacccac tctctcygcg cggwgtctc 39 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 nnnnnnnnnn nnnnnnnntg gatcattgct gtccacgcag mg 42 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> modified_base <222> (22)..(26) <223> inosine <400> 6 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnncysc sggcvgcsca 40 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtmaagttct cttgtcac 18 <210> 8 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aaccctcact aaag 14 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tagctgaatt cgaatgctgc gacta 25

Claims (5)

  1. 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1 유전자의 엑손 2를 동시에 증폭하는 서열번호 1 내지 6의 지노믹 DNA 멀티플렉스 PCR 프라이머 세트.
  2. 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1 유전자의 엑손 2를 동시에 증폭하는 서열번호 1 내지 6의 지노믹 DNA 멀티플렉스 PCR 프라이머와; 상기 멀티플렉스 PCR 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 서열번호 7 내지 9의 시퀀싱 프라이머를 포함하는 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형 분석용 키트.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 유전자형 분석용 키트는 돼지로부터 분리된 지노믹 DNA에 적용가능한 것을 특징으로 하는 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형 분석용 키트.
  4. (1) 돼지의 지노믹 DNA를 분리하는 단계;
    (2) 상기 분리한 지노믹 DNA로부터 서열번호 1 내지 6의 멀티플렉스 PCR 프라이머를 이용하여 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 엑손 2를 동시에 증폭하는 단계; 및
    (3) 상기 증폭한 PCR 산물의 염기서열을 분석하는 단계;를 포함하는 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 (3)단계에서 증폭한 PCR 산물의 염기서열은 서열번호 7 내지 9의 시퀀싱 프라이머를 이용하여 분석하는 것을 특징으로 하는 돼지 백혈구 항원 SLA-DQA, SLA-DQB1 및 SLA-DRB1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법.








KR1020140063727A 2014-05-27 2014-05-27 돼지 백혈구 항원 sla-dqa, sla-dqb1 및 sla-drb1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법 KR101548261B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140063727A KR101548261B1 (ko) 2014-05-27 2014-05-27 돼지 백혈구 항원 sla-dqa, sla-dqb1 및 sla-drb1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140063727A KR101548261B1 (ko) 2014-05-27 2014-05-27 돼지 백혈구 항원 sla-dqa, sla-dqb1 및 sla-drb1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101548261B1 true KR101548261B1 (ko) 2015-08-31

Family

ID=54062233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140063727A KR101548261B1 (ko) 2014-05-27 2014-05-27 돼지 백혈구 항원 sla-dqa, sla-dqb1 및 sla-drb1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101548261B1 (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3006571B1 (en) Hla gene multiplex dna typing method and kit
US10704095B2 (en) Method and kit for DNA typing of HLA gene
US9920370B2 (en) Haplotying of HLA loci with ultra-deep shotgun sequencing
Koopaee et al. SNPs Genotyping technologies and their applications in farm animals breeding programs
US10494673B2 (en) Simple method and kit for DNA typing of HLA genes by high-throughput massively parallel sequencer
WO2018147438A1 (ja) Ｈｌａ遺伝子のｐｃｒプライマーセット及びそれを用いたシークエンス法
Kuznetsova et al. The effect of the duration of callus culture on the accumulation of genetic alterations in pea Pisum sativum L.
KR101548261B1 (ko) 돼지 백혈구 항원 sla-dqa, sla-dqb1 및 sla-drb1의 유전자형을 동시에 분석하는 방법
CN105899675B (zh) 主要组织相容性复合体单核苷酸多态性
Wang et al. Y chromosomal haplotype characteristics of domestic sheep (Ovis aries) in China
CN112210607B (zh) 与水牛白毛色表型相关的分子标记及应用
KR102001528B1 (ko) 한국 재래돼지 식별용 유전자 마커 및 이의 용도
CN109355366A (zh) Hla-b高分辨基因测序试剂盒
CN110747280A (zh) 与马寒冷适应性相关的te标记及其应用
Simide et al. Evolution of molecular investigations on sturgeon sex determination and most recent developments in DNA methylation with a focus on the Siberian sturgeon
Jaramillo et al. The human leukocyte antigen system: nomenclature and DNA-based typing for transplantation
RU2722564C1 (ru) Молекулярно-генетические маркеры цветовых вариаций американской норки и способ выявления особей, являющихся носителем аллелей, обуславливающих формирование желаемой цветовой вариации
KR101522836B1 (ko) 신규한 프라이머 및 지노믹 pcr 기반의 직접염기서열분석을 이용한 sla-dqa 유전자형 분석방법
CN116042608A (zh) 一种与猪背膘厚相关的snp标记引物对及其应用
CN116121398A (zh) 一种与湖羊体重相关的eccDNA标志物及其检测引物和应用
RU2432398C1 (ru) Способ определения гаплотипического полиморфизма участка аутосомной днк индивидуума
Laprise Laboratory techniques to study the cellular and molecular processes of disorders
KR20190054243A (ko) 노란목도리담비의 개체식별을 위한 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 개체 식별 방법
Wettstein et al. Distributions of single nucleotide polymorphisms in differential chromosome segments of congenic resistant strains that define minor histocompatibility antigens
Yin et al. Identification of two bovine microsatellite markers in a defined region of BTA6.

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180813

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190819

Year of fee payment: 5