CN104611406A - B-raf基因V600E突变检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于B-raf基因V600E突变检测的方法，该方法可以检测患者体内分离出的DNA样本中B-raf基因是否存在某个特定的核苷酸变异。属于生命科学和技术领域。本发明的方法包括一个以聚合酶链式反应，反应体系中包含特异性的上游引物和下游引物以及按特定方法处理的一组探针，在特定条件下进行的核苷酸单链的杂交及解链过程，并利用荧光定量PCR仪收集解链时的荧光信号来判断变异的存在与否。

Description

B-raf基因V600E突变检测的方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诊断B-raf基因V600E突变检测的方法，该方法可以检测患者体内分离出的DNA样本中B-raf基因是否存在某个特定的核苷酸变异。属于生命科学和技术领域。
背景技术：
B-raf基因是一种癌基因，与ARAF、RAFl(CRAF)基因同属RAF家族，位于7q34，长约190kb。由其翻译的B-raf蛋白由783个氨基酸组成，有CR1、CR2和CR3三个保守区。B-raf蛋白为丝苏氨酸蛋白激酶raf／mil家族成员，为Ras-Raf-MEK-ERK信号通路中重要调节因子。B-raf蛋白位于MAPK／ERK途径的入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，从而调节细胞的分化、分裂。该通路被异常激活时，可促进细胞增殖、生长，最终导致肿瘤发生。研究表明，在人类的多种肿瘤中存在不同频率的B-raf基因突变，最常见于恶性黑色素瘤(30％-60％)、乳头状甲状腺癌(29％-83％)、结直肠癌(6％-15％)、肺癌(1％-3％)。序列分析B-raf突变形式共有40余种，主要集中在exon11、exon15两个区域，其中主要突变形式为位于1799核苷酸上T→A突变(即V600E突变)，导致谷氨酸取代缬氨酸。B-raf基因V600E突变使B-raf蛋白持续激活导致MAPK激酶信号通路的磷酸激酶活性改变从而影响肿瘤的进展。检测B-raf基因突变，对判断肿瘤的发生和发展以及了解肿瘤的治疗效果具有一定意义：(1)正常人血检中出现B-raf基因异常，提示存在肿瘤易感性；(2)大量研究表明，B-raf基因突变患者对EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(Panitumumab)靶向药物治疗显示无效，B-raf基因野生型肿瘤患者经帕尼单抗和爱比妥治疗疗效明显；(3)良性肿瘤患者若是检出B-raf基因突变，提示有肿瘤恶变的可能。因此，通过检测B-raf基因突变状态可以筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。目前，对B-raf基因V600E突变的检测主要采用DNA直接测序、限制性片段长度多态性(RFLP)等技术，操作繁琐费时且敏感度低。本试剂盒针对B-raf基因V600E突变区，特异性扩增相应突变模板DNA，该方法具有操作简便，灵敏度高，与突变检测“金标准”直接测序结果符合率高，闭关反应污染少等优点，适于在临床中普遍开展，对肿瘤分子分型、肿瘤分子靶向抗肿瘤药物疗效预测及肿瘤患者的临床个体化用药方案将具有重要的指导意义。
研究表明，B-raf基因突变形式共有40余种，主要集中在两个区域：①位于exon11上的的突变，约占10％，常为G463、G465、G468等的点突变；②位于exon15上的激活区突变约占90％，多为位于1799核苷酸上T→A突变(即V600E突变)，导致谷氨酸取代缬氨酸。B-raf基因V600E突变使B-raf蛋白持续激活导致MAPK激酶信号通路的磷酸激酶活性改变从而影响肿瘤的进展。B-raf基因突变患者对EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)靶向药物治疗显示无效，B-raf基因野生型肿瘤患者经帕尼单抗和西妥昔单抗治疗疗效明显。因此，及时检测癌基因B-raf V600E突变发生情况，对肿瘤患者的临床个体化用药方案将具有重要的指导意义。
临床或实验室常用的B-raf突变检测方法主要有DNA直接测序、限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)等，其中DNA直接测序为突变检测的金标准。该方法存在以下缺点：检测的敏感性不够高：如果突变基因的含量占基因组DNA总量的10％以下时，用直接测序法检测不到突变样本的存在；费时，操作过程复杂，对操作人员要求高；非闭管操作，涉及到PCR扩增后的操作，因此易被污染，造成结果的不理想；测序结果的判读主观性强；一次实验检测的样本量有限，最多只能8-24例。本试剂盒采用扩增阻碍突变系统(amplificationrefractory mutation system，ARMS)结合Taqman荧光定量PCR技术，针对B-raf基因V600E突变区特异性扩增相应突变模板DNA。检测敏感性高，与突变检测“金标准”直接测序的结果符合率≥95％。此外本试剂盒还具有快速，操作简单，闭管反应污染少等优点，适于在临床中普遍开展。
基于上述内容，本方法用于肿瘤特异性癌基因B-raf基因V600E突变检测，可用于肿瘤的个体化分子诊断，进而指导肿瘤患者的临床个体化治疗方案。
发明内容：
已知B-raf基因突变主要突变形式为位于1799核苷酸上T→A突变(即V600E突变)，导致谷氨酸取代缬氨酸。临床上需要一种能针对该突变进行检测，尤其是能快速、准确和简便的方法。本方法结合了PGR的高灵敏度和荧光探针的高精确性等优点，具有操作简单，结果直观和无污染的特点。
本方法涉及一种使用特异性探针的检测方法，本方法在同一个PCR反应中进行B-raf基因V600E突变的检测，利用荧光定量PCR仪和荧光探针的简便性和高灵敏度读取结果，判读所检测的样本中是否存在B-raf基因V600E突变。
为达到上述目的，采取的技术方案：
1.使用商业化的试剂盒对组织中的DNA进行提取和纯化。
2.根据本方法的特点设计引物和探针，其中探针的处理方法如表1所示。
表1
引物名称 序列
F primer ATGAAGACCTCACAGTA
R primer ATCCAGACAACTGTTCAAACTGA
General probe TTTTGGTCTAGCTACAGTGAA-BHQ
T probe FAM-ATCTCGATGGAGTGGG-PO4
A probe TET-ATCTCGAAGGAGTGGG-PO4
3.使用的PCR反应程序如表2：
表2
4.根据PCR仪显示的结果，对样本中是否存在B-raf基因V600E突变进行判断。
附图说明：
附图为PCR仪输出的溶解曲线图
具体实施方式：
实施案例：
检测疑似具有B-raf基因V600E突变的肿瘤组织样本。
1.设计合成如表1的引物探针。
表1
引物名称 序列
F primer ATGAAGACCTCACAGTA
R primer ATCCAGACAACTGTTCAAACTGA
General probe TTTTGGTCTAGCTACAGTGAA-BHQ
T probe FAM-ATCTCGATGGAGTGGG-PO4
A probe TET-ATCTCGAAGGAGTGGG-PO4
2.DNA提取：使用商业化的试剂盒对组织中的DNA进行提取和纯化。
3.扩增
3.1PCR扩增体系
按照以下方法配置PCR反应液。
组份 体积
2×PCR Buffer 10ul
F primer 1ul
R primer 1ul
General probe 1ul
T probe 0.5ul
A probe 0.5ul
Taq酶 1ul
H2O 5ul
DNA模板 5ul
共计 25ul
3.2PCR扩增程序
按照以下方法进行PCR扩增
4.结果分析
参照附图，根据溶解峰的位置，判断样本中是否存在B-raf基因V600E突变。例如，如果样本只在野生型峰处出现峰图信号，则表明样本中无B-raf基因V600E突变。如果样本在野生型峰和突变型峰处出现峰图信号，则表明样本中存在B-raf基因V600E突变。

Claims (9)

1.一种B-raf基因V600E突变检测的方法，其特征在于：
该方法含有：
(1)DNA提取：NP-40；chelex100；TRIS-HCL。
(2)DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶(无核酸外切酶活性)。
(3)PCR反应液：dNTPs，引物，DNA聚合酶，PCR Buffer，标记探针。
2.根据权利要求1所述的检测，引物具体信息如表1。
表1
引物名称 序列 F primer ATGAAGACCTCACAGTA R primer ATCCAGACAACTGTTCAAACTGA General probe TTTTGGTCTAGCTACAGTGAA-BHQ T probe FAM-ATCTCGATGGAGTGGG-PO4 A probe TET-ATCTCGAAGGAGTGGG-PO4
3.根据权利要求1所述的检测，所使用的通用探针3’端使用BHQ标记。所使用的分型探针5’端使用FAM或TET标记，3’端最后一个核苷酸进行磷酸化处理。
4.根据权利要求1所述的检测，所使用的通用探针和分型探针全部处于引物的内部，并且无重叠的序列。所使用的分型探针位于通用探针下游第1个核苷酸位置开始。
5.根据权利要求1所述的检测，所使用的两条分型探针，必须存在一个核苷酸不同，并且保证两条分型探针在与野生型或者突变型杂交时，Tm值差异大于3℃以上。
6.根据权利要求1所述的检测，所使用的DNA聚合酶应该为无核酸外切酶活性，包括5’核酸外切酶活性和3’核酸外切酶活性。
7.根据权利要求1中的检测，使用的PCR反应程序如表2：
表2
8.根据权利要求1中的检测，使用的PCR反应程序中PCR循环时的退火温度应该低于引物的Tm值。
9.根据权利要求1中的检测，使用的PCR反应程序中熔解分析时退火温度和解链起始温度应该低于通用探针和分型探针的Tm值。解链结束时的温度应该高于通用探针和分型探针的Tm值。
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