CN110951849A - 一种用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测人类B‑raf基因突变的PCR试剂盒及其应用，该试剂盒包括PCR反应液、引物探针混合液、阳性质控品和阴性质控品，所述引物探针混合液包括多对正反向引物、荧光探针和锁核酸探针，并且对引物探针浓度进行了优化，用于特异性扩增B‑raf基因突变型，突变位点除了V600，还包括非V600的密码子，检测范围更广。本发明结合锁核酸技术和荧光定量PCR技术检测B‑raf基因突变，简便易行，特异性高，灵敏度高达0.1％，对B‑raf基因非V600E突变的研究，为B‑raf基因在恶性肿瘤疗效与预后的临床应用中提供更加全面的依据。

Description

一种用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及一种用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒及其应用。

背景技术

B-raf基因属于RAF家族一员，该基因位于人类7号染色体上，编码RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该蛋白在调节MAPK/ERK信号通路中起作用，影响细胞分裂，分化和分泌。B-raf基因突变出现在多种人类恶性肿瘤中，最常在黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、甲状腺癌、非小细胞肺癌和多毛细胞白血病中发生突变。

在过去的几十年里，随着对各个癌症肿瘤基因突变谱与信号通路研究的不断深人，针对基因变异推出的靶向药物给肿瘤的治疗带来了巨大的进步，在肠癌中抗EGFR、抗VEGF单抗已经成为患者治疗的重要选择。B-raf基因是肠癌中一个新的治疗靶点，且与患者预后有密切的关系，目前有多项BRAF抑制剂的临床研究在进行之中，给患者带来了新的希望。B-raf基因突变主要发生在第11号外显子和第15号外显子上，第15号外显子突变发生率占80％，其中第15号外显子的600位氨基酸密码子GTG突变占第15号外显子突变的90％以上，所以在B-raf基因中既往研究主要集中在突变率最高的V600这个位点，对于其他非V600位点的研究甚少。有研究报道，与B-raf野生型相对，非V600E突变的患者预后更好，然而这方面的实验证据仍然较少。2018年，Matthew等对B-raf基因上发生的突变进行了分类，认为V600E突变为I类突变，其他非V600E突变则根据该突变所可能编码产生的蛋白的活性强度分为II类、III类和IV类突变，这种分类方法加深了我们对B-raf基因突变的理解。对B-raf基因非V600E突变的进一步研究，为B-raf基因在恶性肿瘤疗效与预后的临床应用中提供更加全面的依据。

目前，针对B-raf基因突变检测的主要方法为DNA直接测序法，但是DNA直接测序法存在很多缺点：检测耗时，操作过程复杂，容易导致污染，且灵敏度低，尤其在混合模板时检出率低，同时，检测费用比较高。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种检测位点多、特异性强、灵敏度高的人类B-raf基因突变的PCR检测试剂盒及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种用于检测人类B-raf基因突变的引物探针组合物，包括正向引物1、反向引物1和荧光探针1，所述正向引物1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针1的序列如SEQ ID NO.3所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物探针组合物还包括锁核酸探针1，所述锁核酸探针1的序列如SEQ ID NO.4所示，其3’端连接有PO4基团。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述锁核酸探针1序列的第2、4、6、7、9、12、15、17个碱基进行LAN修饰。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物探针组合物还包括正向引物2、反向引物2和荧光探针2，所述正向引物2的序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述荧光探针2的序列如SEQ ID NO.7所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述引物探针组合物还包括锁核酸探针2，所述锁核酸探针2的序列如SEQ ID NO.8所示，其序列的第3、7、9、10、11、14个碱基进行LAN修饰。

第二方面，本发明提供了一种用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒，包括PCR反应液、引物探针混合液、阳性质控品和阴性质控品，所述引物探针混合液包括第一方面所述的引物探针组合物。

在以上技术方案的基础上，优选的，用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒应用于荧光定量PCR反应，反应体系中所述引物探针混合液中正向引物1、反向引物1、正向引物2和反向引物2的浓度均为0.2-0.4μmol/L，荧光探针1和荧光探针2的浓度均为0.2-0.3μmol/L，锁核酸探针1和锁核酸探针2的浓度均为0.3-0.5μmol/L。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述阳性质控品为含B-raf基因V600、L711、S713、I714和/或E715突变片段的质粒DNA。

第三方面，本发明提供了一种检测人类B-raf基因突变的方法，采用本发明第二方面所述的用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒，以待测样本核酸为模板，进行荧光定量PCR检测。

本发明的用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明设计和合成PCR扩增B-raf基因片段的引物及探针，可以用于检测V600位点突变，还能检测非V600的几个常见突变位点如L711、S713、I714和E715，检测范围更广，降低假阴性概率，为临床用药提供更全面的依据；

(2)利用锁核酸的特性，本发明针对多个突变位点设计合成锁核酸标记的探针，将锁核酸作为探针与DNA链结合的复合体具有很高的热稳定性，但又对碱基错配敏感，一个碱基的错配可使DNA的熔解温度大幅下降，在PCR扩增过程中，锁核酸能够与野生型序列结合，从而阻滞PCR延伸，导致野生型基因PCR扩增失败，而锁核酸不能与突变型序列结合，使得B-raf基因突变型得以扩增富集，从而提高了B-raf基因突变的检出率；

(3)本发明试剂盒中提供的多对特异性引物探针能够高灵敏地检测B-raf基因是否发生突变，将锁核酸探针技术与实时荧光PCR技术结合，可以一次反应把野生型和突变型完全分开，同时，由于直接闭管操作，减少了配胶、电泳以及测序等过程，大大降低了污染几率，降低假阳性率，整个过程简单易行，检测的灵敏度可达0.1％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中B-raf基因V600密码子野生型模板和突变型模板的扩增曲线图。

图2为实施例2中B-raf基因L711、S713、I714和E715密码子野生型模板和突变型模板的扩增曲线图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，可以参考《分子克隆实验指南》(第四版)。实施例中所用的引物和探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例1、用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒

S1、引物探针的设计与合成

用于检测人类B-raf基因V600密码子突变的引物探针，具体包括如下：

正向引物2：5’-TCTACTGTTTTCCTTTACT-3’；

反向引物2：5’-AACTCAGCAGCATCTCA-3’；

荧光探针2：5’-FAM-GGTCCCATCAGTTTGAACA-BHQ1-3’；

锁核酸探针2：5’-TACAGTGAAATCTCG-PO4-3’，其中序列的第3、7、9、10、11、14个碱基进行LAN标记。

用于检测人类B-raf基因L711、S713、I714、E715密码子突变的引物探针，具体包括如下：

正向引物1：5’-TTTCAGGTGCTTTCTTG-3’；

反向引物1：5’-CCTGGATGGGTGTTTT-3’；

荧光探针1：5’-FAM-TACCACCCAGATTTTCATTC-BHQ1-3’；

锁核酸探针1：5’-TCTCGCCTCTATTGAGC-PO4-3’，其中序列的第2、4、6、7、9、12、15、17个碱基进行LAN标记。

S2、其他试剂组成

(1)2×PCR反应液中包含：Tris-HCl缓冲液(pH8.3)20mmol/L，MgCl₂4mmol/L，KCl100mmol/L，dNTPs 2mmol/L，Taq DNA聚合酶0.08U/μL；

(2)阳性质控品为含B-raf基因V600、L711、S713、I714和/或E715突变片段的人工质粒；

(3)阴性质控品为不含核酸的TE缓冲液和含B-raf野生型基因的人工质粒。

实施例2、用荧光定量PCR检测B-raf基因V600密码子的突变

S1、人工质粒合成和抽提

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成含有B-raf基因V600密码子及其上下游250bp同源碱基序列的质粒，同时在质粒中引入V600密码子的1种替换突变(V600E)，最终得到野生型质粒和突变型质粒。用质粒抽提试剂盒(上海生工)按照其操作说明书抽提纯化B-raf野生型和突变型人工质粒。纯化后的质粒用NanoDrop 2000超微量分光光度计定量，并用去离子水稀释至1000拷贝/μL。同时按1:1000的比例混合突变型质粒和野生型质粒，最终得到的混合质粒中突变型质粒含量为是0.1％。

S2、荧光定量PCR

以突变型质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，配制PCR反应体系：2×PCR反应液12.5μL，引物探针组合物2μL，DNA模板2μL，补ddH₂O至25μL。该扩增反应体系中，各正反向引物浓度均为0.2μmol/L，各荧光探针浓度均为0.2μmol/L，各锁核酸探针浓度均为0.3μmol/L。用不含核酸的TE缓冲液和纯的野生型模板作为对照。

在PCR仪上按照表1所示设置PCR反应条件，并完成荧光定量PCR反应。

表1荧光定量PCR反应条件

观察PCR反应结果，如图1所示，以突变型质粒为模板的扩增曲线均呈S型且Ct值在20-30之间，可见能有效扩增出产物；而以不含核酸的TE缓冲液为模板的阴性对照和以纯的野生型质粒为模板的扩增曲线均不呈S型且Ct值大于36，说明均不能有效扩增。说明采用本发明试剂盒可以检测混合液中B-raf基因V600密码子低至0.1％的突变。

实施例3、用荧光定量PCR检测B-raf基因非V600密码子的突变

S1、人工质粒合成和抽提

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成含有B-raf基因L711密码子及其上下游250bp同源碱基序列的质粒，同时在质粒中分别引入L711、S713、I714、E715密码子的1种替换突变(L711H，S713T，I714F，E715*)，最终得到野生型质粒和4种突变型质粒。用质粒抽提试剂盒(上海生工)按照其操作说明书抽提纯化野生型和突变型人工质粒。纯化后的质粒用NanoDrop 2000超微量分光光度计定量，并用去离子水稀释1000拷贝/μL。按1:1000的比例分别混合各突变型质粒和野生型质粒，最终得到的混合质粒中突变型质粒含量为是0.1％。

S2、荧光定量PCR

分别以4种突变型质粒为模板，按照实施例1同样反应体系和PCR反应条件进行荧光定量PCR扩增。

观察PCR反应结果，如图2所示，以4种突变型质粒为模板的扩增曲线均呈S型且Ct值在20-30之间，可见能有效扩增出产物；而以不含核酸的TE缓冲液为模板的阴性对照和以纯的野生型质粒为模板的扩增曲线明显推后且Ct值大于32，说明均不能有效扩增。说明采用本发明试剂盒可以检测混合液中B-raf基因L711、S713、I714、E715密码子低至0.1％的突变。

实施例4、引物探针浓度优化

分别选取实施例2和3中构建的5种突变型重组质粒和野生型质粒作为模板，进行多次荧光定量PCR扩增：当PCR反应体系中各正反向引物、各荧光探针、各锁核酸探针浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L时，突变型质粒扩增结果Ct值为23.56-28.43，野生型质粒扩增结果Ct值均大于36；当PCR反应体系中各正反向引物、各荧光探针、各锁核酸探针浓度分别为0.4μmol/L、0.3μmol/L、0.5μmol/L时，突变型质粒扩增结果Ct值为22.29-28.36，野生型质粒扩增结果Ct值均大于36；当PCR反应体系中各正反向引物、各荧光探针、各锁核酸探针浓度分别为0.3μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L时，突变型质粒扩增结果Ct值为24.85-29.68，野生型质粒扩增结果Ct值均大于36。

实施例5、对新鲜组织样本进行B-raf基因突变检测

S1、组织样本基因组DNA的提取纯化

收集250份黑色素瘤患者新鲜组织标本，用基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)按照其操作说明提取纯化新鲜组织标本中的基因组DNA。纯化后的基因组DNA用NanoDrop 2000超微量分光光度计定量，并用去离子水稀释至浓度为20ng/μL。

S2、荧光定量PCR

按照实施例2步骤S2所述操作方法对提取纯化的组织样本基因组DNA进行检测，以实施例2和实施例3中制备的5种突变型人工质粒中任一作为阳性质控品，以不含核酸的TE缓冲液作为阴性质控品；同时用DNA直接测序法对其进行检测。检测结果如表2所示。

表2不同方法对组织样本的检测结果

检测方法	B-raf突变	B-raf野生型	阳性检出率
				本发明检测方法	184	66	73.6％
DNA测序	177	73	70.8％

如表2可见，采用本发明试剂盒对组织样本阳性检出率为73.6％，高于DNA直接测序，因为实际组织样本中混有野生型DNA，突变型浓度相对较低，会干扰DNA直接测序结果，而采用本发明试剂盒检测，野生型DNA的扩增被抑制，突变型扩增得到富集，提高了检测的灵敏度和特异性。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉光谷联合医学检验所股份有限公司

<120> 一种用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 1

tttcaggtgc tttcttg 17

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

cctggatggg tgtttt 16

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 3

taccacccag attttcattc 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 4

tctcgcctct attgagc 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 5

tctactgttt tcctttact 19

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 6

aactcagcag catctca 17

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 7

ggtcccatca gtttgaaca 19

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 8

tacagtgaaa tctcg 15

Claims (9)

1.一种用于检测人类B-raf基因突变的引物探针组合物，其特征在于：包括正向引物1、反向引物1和荧光探针1，所述正向引物1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物1的序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针1的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于：还包括锁核酸探针1，所述锁核酸探针1的序列如SEQ ID NO.4所示，其3’端连接有PO4基团。

3.如权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于：所述锁核酸探针1序列的第2、4、6、7、9、12、15、17个碱基进行LAN修饰。

4.如权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于：还包括正向引物2、反向引物2和荧光探针2，所述正向引物2的序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物2的序列如SEQ IDNO.6所示，所述荧光探针2的序列如SEQ ID NO.7所示。

5.如权利要求4所述的引物探针组合物，其特征在于：还包括锁核酸探针2，所述锁核酸探针2的序列如SEQ ID NO.8所示，其序列的第3、7、9、10、11、14个碱基进行LAN修饰。

6.一种用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒，包括PCR反应液、引物探针混合液、阳性质控品和阴性质控品，其特征在于：所述引物探针混合液包括权利要求5所述的引物探针组合物。

7.如权利要求6所述的用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒，其特征在于：应用于荧光定量PCR反应中，反应体系中所述引物探针混合液中正向引物1、反向引物1、正向引物2和反向引物2的浓度均为0.2-0.4μmol/L，荧光探针1和荧光探针2的浓度均为0.2-0.3μmol/L，锁核酸探针1和锁核酸探针2的浓度均为0.3-0.5μmol/L。

8.如权利要求6所述的用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为含B-raf基因V600、L711、S713、I714和/或E715突变片段的质粒DNA。

9.一种检测人类B-raf基因突变的方法，其特征在于：采用权利要求6所述的用于检测人类B-raf基因突变的PCR试剂盒，以待测样本核酸为模板，进行荧光定量PCR检测。

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